MXPA01010500A - Metodos para encontrar proteasas que separan especificamente sustratos unidos a membranas. - Google Patents

Abstract

Es objeto de la invencion un procedimiento para encontrar proteasas que separan especificamente sustratos unidos as membranas, asi como las proteinas de fusion recombinantes necesarias para ello.

Description

MÉTODOS PARA ENCONTRAR PROTEASAS QUE SEPARAN ESPECÍFICAMENTE SUSTRATOS UNIDOS A MEMBRANAS Sector técnico Es objeto de la invención un procedimiento para encontrar proteasas que separan específicamente sustratos unidos a membranas, así como las proteínas de fusión recombinantes necesarias para ello.

Estado de la técnica Las proteasas juegan un importante papel en muchos procesos fisiológicos tales como, por ejemplo, la transcripción, apoptosis, el desarrollo y la transducción de señales (Whiteside, S.T. et al. J. Biol. Chem., 269, 1994: 27059) . Es también conocido que las proteasas adoptan un papel clave en toda una serie de enfermedades tal como, por ejemplo, en el caso de enfermedades neurodegenerativas que abarcan, por ejemplo, también la enfermedad de Alzheimer en el hombre. Las proteasas conocidas y todavía desconocidas, implicadas en cuadros patológicos de este tipo, representan un importante punto de partida para el desarrollo de nuevos procedimientos terapéuticos.

El hallazgo de proteasas y la detección de su actividad proteolítica y especificidad se basa en la detección y la caracterización de un producto de separación. Se remite en este punto a los procedimientos de Smith y Kohorn (Smith, T.A. y Koho.n, B.D. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88, 1991: 5159) y Dasmahapatra et al. ( Dasmahapa t ra , B. et al. PNAS 89(9), 1992:4159-4162) . Smith y Kohorn describen un procedimiento para encontrar las proteasas eucarióticas de ADNcs, que separan una secuencia de aminoácidos predeterminada. Para la detección de una actividad proteolítica específica se expresó en este caso, de forma recombinante en levaduras, una proteína de fusión a partir de una secuencia de separación de proteasas conocida y del factor de transcripción GAL4, así como la propia proteasa específica para ello. La separación de la secuencia separadora de proteasas por parte de la proteasa específica separa los dominios activadores de la transcripción de los dominios de unión a ADN, que en esta proteína de fusión estaban funcionalmente unidos por la secuencia de separación. La detección de la reacción específica de proteasas se efectúa por la inactivación de la actividad de Gal4.

También Dasmahapatra et al. utilizan el sistema informador de GAL4 de idéntica manera por inserción de una proteasa que se separa por autolisis entre lí - porciones funcionales del sistema informador de GAL4. La pérdida de la actividad de Gal4 sirve también en este caso para la detección de la actividad aut opro t eol í t ica de la secuencia de inserción. Los dos procedimientos están limitados a encontrar proteasas localizadas en el citosol o que se separan en el citosol, ya que los sustratos o las proteínas de fusión recombinantes descritos están localizados en el citosol. Algunos procesos fisiológicos, pero también algunos procesos patológicos tales como las enfermedades neurológicas ya antes mencionadas se basan en la separación proteolítica de sustratos unidos a membranas. La patología de la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad neurodegenerativa que se manifiesta más frecuentemente en el hombre, está asociada con la activación proteolítica del péptido amiloide ß (Aß) neurotóxico e implica al menos dos actividades proteolíticas, ambas de las cuales presuponen un sustrato unido a la membrana (Haass, C. y Selkoe, D.J. Cell, 75, 1993:1039; Selkoe, D.J.

J. Biol. Chem., 271, 18295; Citrón M. et al. Neuron, 14, 1995:661; Tischer, E. y Cordell, B. J. Biol. Chem. 271, 1996:21914) . Mientras que la ß-secretasa genera el extremo N en el lumen de compartimiento de la membrana, la ?-secretasa separa el extremo C de los dominios amiloides (Haass, C. et al. Nature, 359, 1992:325; M. Shoj i et al. Science, 258, 1992:126; Busciglio, J. et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90, 1993:2092) . También las dos proteínas presenilina (PS) homologas implicadas en la patología Alzheimer, que probablemente activan la ?-secretasa (DeStrooper, B. et al. Nature, 391, 1998:391) están unidas a la membrana y son procesadas proteolíticamente por preseni 1 inasas y caspasas todavía desconocidas (Thinakaran, G. et al. Neuron, 17, 1996:181; Podlisny, M. et al. Neurobiology of Disease, 3, 1997:325; Mercken, M. et al. FEBS Letters, 389, 1996:297; Tomita, T. et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 94, 1997:2025; Capell, A. et al. J. Biol. Chem., 273, 1998:32050; Thinakaran, G. et al. Neurobiol. Disease, 4, 1998:438; Yu, G. et al. J. Biol. Chem. 273:1998:16740; Kim, T.- . et al. Science, 277, 1997:373; Loetscher, H. et al. J. Biol. Chem. 272, 1997:20655; Vito, P. et al. J. Biol. Chem. 272, 1997:28315; Grünberg, J. et al. Biochemistry, 37, 1998 : 2263) . Actualmente, con los métodos de la técnica es imposible identificar y aislar proteínas, incluso de actividad proteolítica conocida, de sustratos unidos a membranas. La identificación de proteasas de este tipo tales como, por ejemplo, de la ?-secretasa antes mencionada, de las preseni 1 inasas y caspasas ayudaría considerablemente a la comprensión molecular de enfermedades patológicas y haría avanzar de forma decisiva el desarrollo de inhibidores de proteasas muy específicos para la terapia. La purificación de estas actividades proteolíticas conocidas por métodos convencionales, con empleo de sustratos solubles, es muy difícil, si no incluso imposible, ya que estas proteasas requieren sustratos unidos a membranas para el re onocimiento de su secuencia diana (Citrón M. et al. Neuron, 14, 1995:661; Tischer, E. y Cordell, B. J. Biol. Chem. 271, 1996:219145) . En el documento DE 196 41 180 Al se describe la expresión de proteínas de fusión que poseen lugares de reconocimiento para APP a- o ß-secretasa, una secuencia de anclaje a la transmembrana adecuada y una porción de proteína informadora. Las proteínas de fusión se utilizan para la identificación de moduladores de a- o ß-secretasa. A la vista de lo que antecede, es misión de la invención, por consiguiente, la puesta disposición de un procedimiento para encontrar proteasas que separan sustratos asociados a membranas .

Representación de la invención y formas de realización preferidas El problema en el que se basa la solicitud se pudo resolver con la presente invención en el marco de la memoria descriptiva y las rei indicaciones, poniendo a disposición un procedimiento para encontrar proteasas que separen sustratos asociados a membranas, que está caracterizado porque. I. una proteína de fusión recombinante, consistente en al menos una porción de informador y en una secuencia separadora de proteasas, se expresa en un sistema celular adecuado, que esta asociado con una membrana y II. otra proteína se expresa en el mismo sistema celular y III. se detecta la presencia de la porción de informador separada. Una proteasa, en el sentido de la invención, es cualquier proteína o macromol écula con una porción peptídica que está en condiciones de separar enlaces peptídicos. Por una proteína de fusión, el experto en la materia ha de entender una proteína que se expresa de forma recombinante en un sistema celular adecuado y que presenta al menos dos porciones funcionales, una porción de informador y una secuencia separadora de proteasas. Por proteínas de fusión asociadas a membranas, en el sentido de la presente invención, se han de entender proteínas que se encuentran en proximidad espacial con una membrana arbitraria dentro de la célula o de la membrana celular. Las membranas de la célula y las organelas de la célula o bien compartimientos de la célula son óptimamente conocidos por el experto en la materia en el campo de la biología celular y no se detallan aquí en par t i cul ar . Por otra proteína que, junto a la proteína de fusión recombinante de acuerdo con la invención, se expresa en el mismo sistema celular se ha de entender, en el sentido de la invención, tanto una proteína presente de forma endógena como también una proteína recombinante o el fragmento de una proteína endógena o recombinante de este tipo, de la que se supone que presenta una actividad proteolítica. En el caso de una secuencia separadora de proteasas se trata de una secuencia de péptidos que se conoce como secuencia separable por proteasas o que se supone que es una secuencia de este tipo. Para la localización de la proteína de fusión recombinante resultan tres posibilidades. Por una parte, la secuencia separadora asociada a la membrana puede estar localizada, total o parcialmente, dentro de la membrana. En una forma de realización preferida, la invención abarca, por lo tanto, procedimientos que están caracterizados porque la secuencia separadora de proteasas está localizada, total o parcialmente, dentro de la membrana celular. Junto a la posibilidad rara, pero que no se ha de excluir, de que la secuencia separadora asociada a la membrana sobresalga fuera de la membrana celular en el medio extracelular, existe también la posibilidad de que la secuencia separadora de proteasas asociada a la membrana esté localizada, parcial o totalmente, en el citosol. Incluso un sustrato de proteasas asociado a la membrana de este tipo, que está totalmente localizado en el citosol, no se debe considerar, condicionado por la proximidad espacial inmediata de membranas, citosólico, sino que se ha de considerar como asociado a las membranas, ya que la accesibilidad de este sustrato para una proteasa que se separa puramente en el citosol está espacialmente limitada en medida considerable. En otra forma de realización preferida, la invención abarca, por lo tanto, procedimientos que están caracterizados porque la secuencia separadora de proteasas esté localizada, parcial o totalmente, dentro del citosol. Cuando ni la secuencia separadora de proteasas ni la porción de informador, ni otra parte de la proteína de fusión permitan una asociación a la membrana, entonces la proteína de fusión puede estar provista de una porción de anclaje funcional adicional. Por lo tanto, la invención abarca, en otra forma de realización preferida, también procedimientos que están caracterizados porque la proteína de fusión esta anclada en la membrana mediante una porción de anclaje adicional.

También es posible anclar la proteína de fusión en la membrana mediante una correspondiente secuencia separadora adecuada. En el caso de sustratos de proteasas naturales localizados en la membrana se ha de esperar una propiedad de este tipo. Por ejemplo, en este punto se puede mencionar la secuencia separadora que es separada por la ?-secretasa. Por lo tanto, la invención abarca, en una forma de realización particularmente preferida, también procedimientos que están caracterizados porque la proteína de fusión está anclada en la membrana mediante la propia secuencia separadora de pro teas as . La proteína de fusión recombinante, en el sentido de la invención, puede contener, junto a las porciones funcionales tales como la secuencia separadora, la secuencia de informador y, opcionalmente, una secuencia de anclaje adicional, también puros distanciadores. En el caso de los distanciadores, en el sentido de la invención, se trata de péptidos que separan o bien unen entre sí porciones funcionales. Su utilidad consiste en la separación espacial de las porciones funcionales que, en algunos casos, posibilitan el ejercicio sin impedimentos de su función. Por lo tanto, la solicitud abarca, en una forma de realización particularmente preferida, procedimientos que están caracterizados porque la secuencia separadora de proteasas y/o la porción de informador y/o la porción de anclaje de la proteína de fusión están unidas mediante distanciadores. También es posible unir las secuencias señal, directamente o a través de un di s t anci ador , con la proteína de fusión. Un ejemplo de una secuencia señal para células de levadura es la secuencia señal invertasa para levaduras (Moir y Dumas, Gene 56, 1987:209) . Una secuencia señal o una porción de señal, en el sentido de la presente invención, dirige en los correspondientes sistemas de expresión el transporte de la proteína de fusión a la membrana. Por lo tanto, la presente invención abarca, en una forma de realización particularmente preferida, procedimientos que están caracterizados porque la proteína de fusión recombinante de acuerdo con la invención contiene una porción de señal que dirige la proteína de fusión de acuerdo con la invención a la membrana deseada de un sistema celular adecuado para ello. Para la realización del procedimiento de acuerdo con la invención son especialmente adecuados sistemas celulares que no expresan proteasas endógenas, que separan la secuencia separadora de proteasas de la proteína de fusión de acuerdo con la invención y que posibilitan la expresión de la proteína de fusión y de otra proteína o fragmento de la misma, así como la asociación de la proteína de fusión con membranas. La presente invención hace posible encontrar proteasas de cualquier origen que separan sustratos asociados a membranas. Las proteasas pueden ser de origen procariótico, eucariótico, animal o vegetal. Para encontrar proteasas relevantes para la terapia en mamíferos, se adecúan especialmente bien sistemas de expresión eucarióticos. Por lo tanto, la presente invención abarca, en una forma de realización particularmente preferida, procedimientos que están caracterizados porque el sistema de expresión adecuado es un sistema de expresión eucariótico. Son muy particularmente preferidos sistemas de expresión en levaduras, ya que éstos son fáciles de manejar y, a menudo, están exentos de proteasas de mamíferos endógenas. Además, se encuentra a disposición una pluralidad de herramientas recombinantes para levaduras. Por lo tanto, en otra forma de realización particularmente preferida, la invención abarca procedimientos que están caracterizados porque el sistema de expresión adecuado es un sistema de expresión en levaduras. Para la realización de la invención son también posibles sistemas de expresión a partir de células de mamíferos o animales transgénicos. Sin embargo, en este caso, se ha de tener particularmente en cuenta la presencia y, a ser posible, la inactivación de proteasas endógenas que puedan influir sobre el procedimiento. Por lo tanto, la invención abarca también procedimientos que están caracterizados porque el sistema de expresión adecuado es un sistema de expresión en mamíferos. La porción de informador de una proteína de fusión de acuerdo con la invención puede ser cualquier proteína o péptido arbitrario expresable de forma recombinante, cuya liberación de la proteína de fusión mediante separación proteolítica desencadena una señal detectable. Por una parte, la porción de informador puede ser detectada entonces en forma de proteína o de péptido en el citosol, por ejemplo por unión de anticuerpos, específica de la porción de informador, en el citosol después de la separación de la fracción de membrana. Sin embargo, entran en consideración también todos los tipos de factores de transcripción solubles. La liberación de factores de transcripción solubles puede desencadenar entonces señales dispuestas a continuación. Elementos reguladores de la transcripción adecuados son habituales para el experto en la materia por el estado de la técnica y contienen moléculas señal tal como Gal4 (Laughan, A. y Gesteland, : R. Molec. Cell Biol., 4, 1984:260-267), VP16 (Goff, - Stephen P. et al. Current Opinión in Biotechnology, 6, 1995:59-64) y LexA (véase Goff et al.) . El activador de la transcripción Gal4 se adecúa especialmente bien para sistemas de expresión en levaduras.. También son adecuadas formas activas acortadas de1 Gal4 tales como, por ejemplo, Gal4-1-147/768-881 ly Gal 4 - 1 - 238 / 768 - 881 (Jun Ma y Mark Ptashne, Cell 48, 1998:847-853) . Por lo tanto, la invención abarca, en una forma de realización particularmente preferida, también procedimientos que están .caracterizados porque la porción de informador dé la proteína de fusión es el activador de la transcripción de levaduras Gal4. Genes informadores; típicos, que están dispuestos a continuación de activadores de la transcripción, son CAT (Alton ,y Vapnek, Nature 282, 1979:864-869), luciferasa !(de et et al. Mol. Cell Biol., 7, 1987:725-737; Engebrecht y Silverman, PNAS 1, 1984:4154-4158), ß-galactosidasa (véase antes, Goff et al.) y fosfatasa alcalina (Toh et al. Eur. J. Biochem. 182¿ 1989, 231-238) . Como porción de anclaje en el sentido de la invención entran en consideración todas las secuencias de péptidos que se asocian con membranas. Aquí se remite, en particular, a las regiones de transmembrana de proteínas localizadas en la membrana. Eh especial, se adecúan regiones de transmembrana del tipo 1. Presenilina (Sherrington et al., Nature 325, 754), por ejemplo los dominios TMl de presenilina 1 y ßAPP (Kang et al, Nature 325: 733), contienen regiones de transmembrana preferidas. Por lo tanto, la invención abarca también procedimientos que están caracterizados porque la porción de anclaje de la proteína de fusión es el' dominio TMl de presenilina. En una forma de realización muy particularmente preferida, la presente invención i abarca una ; proteína de fusión que, junto a la secuencia separadora a investigar, dispone como porción de anclaje del dominio TMl de presenilina, cuya porción de informador es el factor de transcripción en levaduras Gal4 y que está unida con I una porción de señal de la membrana adecuada.

Para el experto en la materia es habitual toda una serie de técnicas que inhiben la expresión de proteínas endógenas en sistemas celulares. En caso necesario, el experto en la materia está, por lo tanto, eri condiciones de eliminar o de inactivar proteasas in'deseadas, propias del sistema, a partir de sistemas de expresión adecuados. Son I particularmente adecuados procedimientos que están I caracterizados porque el sistema de expresión adecuado no 'contiene proteasas propias del sistema que separan sustratos asociados a membranas. El procedimiento de acuerdo con la invención se adecúa para todas las secuencias separadoras de proteasas. i Se prefieren muy particularmente procedimien os que están caracterizados porque en el caso de la , secuencia separadora de proteasas se trata de una secuencia de aminoácidos que es ! separada po¡r al menos una de las siguientes proteasas : i ?-secretasa (Selkoe, J. Biol. Chem. 271, I 1996 : 18259) ,' proteasa NOTCH (Schroeter et al. Nature I 393, 1998:3 d|2), proteasa presenilina (Thinakaran et al. Neuron 17, 1998: 181), caspasas (Nicholson, D.W. y Thornberry, N.A. Trends Biochem. Sci., 22, i 1997 : 299) .

En otra forma de realización muy particularmente preferida, la presente invención da ¡ a conocer procedimientos que están caracterizados porque la secuencia separadora de proteasas es la proteína precursora ß-amiloide (ßAPP) humana o una parte de la misma. En otra forma de real i zación muy particularmente preferida, la presente invención da a conocer procedimientos que están caracterizados porque la secuencia separadora de proteasas i corresponde ' a una de las secuencias parciales, I representadas en las figures 5 6 6, de la proteína precursora ß-amiloide (ßAPP) humana. El pirocedimient o de acuerdo con la invención es particularmente adecuado para identificar proteasas y! sus genes a partir de genotecas. Tan i pronto como ¡se presenta un sistema celular adecuado con una protieína de fusión recombinante adecuada con una secuencia separadora de proteasas establecida, solo se debe expresar en el mismo sistema de expresión eí otro gen a partir de una genoteca a I investigar t¡an pronto como el experto en la materia I haya establecido un sistema celular adecuado con una proteína de j fusión recombinante de acuerdo con la invención, que contiene una secuencia separadora de interés, dicho experto tendrá sólo que expresar en el mi smo s istema de expresión otra proteína o fragmento de1 la misma a partir de una genoteca a invest igar , con el fin de encontrar proteínas o partes de las mismas con una correspondiente actividad proteolítica específica en la genoteca a inves t igar . Muy particularmente pre fer idos son procedimientos de acuerdo con la invención para encontrar la I1 ?-secretasa, o la presenilinasa o la proteína NÓTCH o las caspasas que separan presenilina a partir de genotecas. Otro aspecto de la presente invención se refiere a l s proteínas de fusión recombinantes que son necesarias para poner en práctica los procedimientos antes, descritos. Proteinas de fusión i de este tipo se pueden asociar con una membrana i celular y consisten en al menos una porción de informador y; una secuencia separadora de proteasas. Si una proteína de fusión recombinante de este tipo, consistente en una porción de informador I y una secuencia separadora de proteasas, no se pueden asocijar por si mismas con las membranas del i sistema de ¡ expresión, entonces una proteína de I I fusión de este tipo ha de contener una porción de anclaje a la.membrana adicional. También puede ser ventajoso separar las porciones funcionales antes mencionadas de la proteína de' fusión de acuerdo con la invención mediante distanciadores adicionales y, así, aumentar ¡ el espacio libre estérico de porciones funcionales ¡ indi iduales1 o modificar su localización en o junto a la membrana . Además, puede ser ventajoso agregar a la proteína de • fusión recombinante de acuerdo con la invención un.a porción de señal adicional con el fin del transporjte dirigido a la membrana de un sistema ! de expresión'. I Como! I forma de realización particularmente ventajosa s¡e ha acreditado, para sistemas de expresión en levaduras, la molécula de informador activador de' transcripción en levaduras Gal4. Otra; forma de realización particularmente ventajosa de' la proteína de fusión de acuerdo con la i invención Contiene como porción de anclaje el I dominio TMl ;de presenilina. Como 1 porción de señal en sistemas Ide expresión en levaduras, una forma de realización , particular de la invención contiene proteínas de. fusión, cuya porción de señal se ha tomado de la invertasa de levaduras (véase antes) . I En calidad de secuencias separadoras de ¡ proteasas las proteínas de fusión de acuerdo con la ! invención contienen, en una forma de realización muy particular, j al menos una de las secuencias de aminoácidos que son separadas específicamente por la ?-secretasa, \ o la preseni 1 inasa , o la proteasa NOTCH o las caspasás que separan presenilina. i En ' una forma de realización muy particularmente preferida, la proteína de fusión de acuerdo con ,1a invención contiene, como porción de i informador, ;el activador de la transcripción en levaduras Gail4, como porción de anclaje el dominio TMl de presienilina 1 y una supuesta secuencia separadora de proteasas. En ; una forma de realización muy particularmente preferida, la proteína de fusión de acuerdo con ¡la invención contiene, como porción de i informador, el activador de la transcripción en i levaduras Gal4, el dominio TMl de presenilina 1 como porción de ¡ anclaje, la secuencia señal de la | invertasa d e ] levaduras como porción de señal y una i supuesta secuencia separadora de proteasas.

Se ¡ prefieren proteínas de fusión recombinantes de acuerdo con la invención que se caracterizan, porque la secuencia separadora de proteasas es la proteína precursora ß-amiloide (ßAPP) humana 1 o una parte de la misma. Se prefieren particularmente proteínas de fusión recombinantes de acuerdo con la invención que I se caracterizan porque la secuencia separadora de ¡ proteasas corresponde a una de las secuencias parciales, representadas en las figuras 5 ó 6, de la i proteína precursora ß-amiloide (ßAPP) humana. I Se prefieren muy particularmente proteínas I de fusión re;combinantes de acuerdo con la invención i que se caracterizan porque contienen una secuencia i señal según la figura 3, una secuencia separadora de proteasas co: distanciadores según la figura 5 y una porción de informador según la figura 8. Se prefieren muy particularmente proteínas de fusión recombinantes de acuerdo con la invención que se caracterizan porque contienen una secuencia I señal según ¡la figura 3, una secuencia separadora de proteasas con distanciadores según la figura 6 y una I porción de informador según la figura 8. En otro aspecto, la presente invención se refiere al ? pleo de una de las proteínas de fusión de acuerdo don la invención antes descritas en uno de los procedimientos de acuerdo con la invención antes descritos. i La .invención se muestra, a título de ejemplo, en una proteína de fusión recombinante (ssTMlGal4; jss representa la secuencia señal según la figura 3 ,¡ pero sin metionina en el extremo, TMl ¡ representa la secuencia de aminoácidos según la figura 4, Jj Gal4 representa la secuencia de aminoácidos según la figura 8; entre TMl y Gal4 se i encuentra el distanciador o bien el lugar de clonación según la figura 7), en la que el activador de la transcripción Gal4 se unió en el extremo C con el dominio TMl del gen PSI (todas las construcciones de Gal4 aquíi utilizadas se derivaron de pCll (Fields S. y Song O Í Nature, 340, 1989:245) y contienen un i cásete de expresión del gen Gal4 que se encuentra bajo el conitrol de las secuencias de promotor y terminador ADHl) . Este cásete se incorporó por i clonación en YCplac22 (Gietz, R.D. y Sugino, A.

Gene, 74, 19)88:527) para la preparación del plásmido j parental ssTM1Ga14 y sus derivados. La proteína de fusión ssTMlGal4 se compone de la secuencia señal de la invertasa de levaduras (aminoácidos (aa) 1-19, i Moir, D.T. y! Dumais, D.R. Gene, 56, 1987:209) que se fusionó en el extremo N del PS1 humano, que alcanza hasta el primer dominio de la transmembrana (aa 3-aa 101), y al que se une una región de espaciador (RPH) de 3 aa que dispone de los lugares de restricción Stul y Ndel, así como Gal4 de levadura (aa 1 - aa 881) . SsTMlGal4 se preparó por amplificación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa) de las correspondientes regiones que codifican ADNc con empleo de técnicas de clonación convencionales (Ausubel, F.M. et al. Current Protocols in Molec. Biol. (Greene, Nueva York, 1992) . Las proteínas de fusión ssTMl-DEVDG-Gal4 y s sTMl -DEVNG-Gal se prepararon , por inserción de oligonucleótidos hibridantes, que codifican DEVDG o DEVNG, en construcciones ssTMlGal4 cortadas con Stul y Ndel) .

Para la finalidad de dirigir a membranas en células de levadurals, una secuencia diana, a saber la i secuencia señal de la invertasa de levaduras (Dumais y Moir, véase antes) , se unió con el extremo N del dominio TMl. Después de la expresión en SFY526 (se utilizaron métodos convencionales (Ausubel et al., véase antes)' para la introducción de los plásmidos en la cepa de levaduras SFY256 (MATa, ura3-52, his3- 200, ade2-101, lys2-801, trpl-901, leu2-3, 112, can®, gal4-542, gal80-538, URA3 : : Gal 1 - 1 acZ ) (Barter, P.L. et al. BioTechniques, 14, 1993:920), así como para la preparaci n de extractos de proteínas y ensayos ! con ß-gal) no se podía detectar ninguna actividad de ß-galactosidasa. La expresión de la misma porción de i Gal4, pero soluble, por sí sola condujo a una fuerte actividad ¡de ß-galactosidasa. Después del fraccionamiento de las células de levadura se podía detectar ssTMlGal4 en la fracción de membrana. La i ! asociación a la membrana de ssTMl-Gal4 se logró, además, mediante extracción con carbonato. La extracción cpn carbonato de la fracción de membrana ! no condujo a| la liberación de la proteína de fusión. SsTMl-Gal4 se comporta, por lo tanto, como una protelna de membrana integral. í Para! la detección de la capacidad de i separación de secuencias separadoras de proteasas como componente de ssTMlGal4 se preparó ssTMl-DEVDG- Gal4, una proteína de fusión, cuyos componentes | ssTMl y Gal4 están unidos por la secuencia separadora de proteasas DEVDG (Nicholson, D.W. y Thornberry, ; N.A., Trends Biochem. Sci., 22, 1997:229, 'DEVDG representa un lugar de í reconocimiento para caspasa-3 (Lazebnik, Y. . et al., Nature '371, 1994:346); Fernandes-Alnemr i , T. et ¡ al., J. Biol. Chem. 269, 1994:30761; Te ari, M. et al., Cell, 81, 1995:801; Nicholson, D.W. et al., Nature 376, 1995:37; Nicholson, D.W. y Thornberry, N.A., Trends Biochem. Sci., 22, 1997:299) . La expresión de s sTMl -DEVDG-Gal 4 en células de levadura SFY526 n^ determinó ninguna actividad de ß-galactosidasa. La co-expresión de caspasa-3 humana junto con s sTMl -DEVDG-Gal 4 en células de levadura SFY526 determinó una fuerte actividad de ß-galactosidasa. Todo el ADNc de la caspasa-3 humana ( Fernandes-Alnemri , T. et al., J. Biol. Chem. 269, 1994:30761; Tewari, M. et al., Cell, 81, 1995:801; Nicholson, D.W. et al., Nature 376, 1995:37) se incorporó po¡r clonación en un derivado de pVTlOO-U i (Vernet, T. et al., Gene, 52, 1997:225) en el que el gen URA3 se había reemplazado por el gen LEU2. En i esta construcción, la expresión de caspasa-3 se encuentra bajo el control de las secuencias de promotor y terminador ADHl . La actividad de la i expresión e caspasa-3 se confirmó mediante I separación de PARPC radiomarcado con 35S (un derivado de PARP truncado en el extremo C), traducido in I vitro, mediante un extracto citosólico de células de i levadura ¡transformadas con caspasa-3. La i inmuno trans férenci a con anticuerpos anti-Gal4 demostró que' s s TMl -DEVDG-Gal 4 , sin la co-expresión, está presente como proteína total unida a la membrana. La co-expresión con caspasa-3 condujo a í porciones dé Gal4 separadas solubles. También era i detectable lá subunidad de 12 kDa de la caspasa-3. Para! la detección de la especificidad, la proteína de j fusión s sTMl -DEVNG-Gal 4 asociada a la membrana se ' co-expresó en células de levadura con caspasa-3. El intercambio del aminoácido aspartato en la secuencia separadora original por asparagina no dio comoi resultado ninguna separación de la proteína de ; fusión y, por consiguiente, ninguna actividad de¡ ß-galactosidasa. i Los ! ensayos antes mencionados demuestran claramente que la expresión de una proteasa, en este caso caspasaj-3 humana, puede determinar eficazmente ! la separación de proteínas de fusión asociadas a i membranas de acuerdo con la invención y la liberación ide las porciones de señal unidas a membranas, |en este caso del activador de la transcripción Gal4. Por consiguiente, un procedimiento de acuerdo con la invención de este tipo, con empleo de las construcciones de acuerdo con la invención, se manifiesta muy específico y i sensible bajo condiciones in vivo.

En otros dos ejemplos de realización específicos 'se prepararon proteínas de fusión de acuerdo con la invención sin porción de anclaje en sistemas de ¡ expresión adecuados. Una proteína de I fusió. , ssMC¡l-55-Gal4 contiene una secuencia señal (ss) según I¡ la figura 3, una metiona (M), una j secuencia de' aminoácidos según la figura 4 (Cl-55) y la porción de informador (Gal4) según la figura 8. La otra proteína de fusión, s sMC 1 - 99-Gal 4 contiene una secuencia señal (ss) según la figura 3, una i metiona (M) ,Í la secuencia de aminoácidos según la i figura 5 (Cl-99) y la porción de informador (Gal4) según la fig ¡ura 8. Las dos proteínas de fusión se asocian sin ¡una porción de anclaje adicional y se I adecúan espeScialment e para encontrar la ?-secretasa de genotecas, que separa específicamente las secuencias separadoras de proteasas en las figuras 5 y 6. ! Leyendas de las figuras Fig.1. Representación esquemática del procedimiento La figura 1 describe esquemáticamente el funcionamiento del procedimiento de acuerdo con la invención pdra la identificación de proteasas, que i reconocen sebuencias separadoras de proteasas, en el ejemplo de una proteína de fusión recombinante de acuerdo con la invención (I + II + III) que contiene i una molécula señal (III) y una porción de anclaje a la membrana ' (I), así como una secuencia separadora de proteasas (II) que une estas porciones funcionales ' en el caso de la expresión de una supuesta proteasa (V) en un sistema celular adecuado, resultan las dos posibles secuencias a) o b) para el sistema celular. a) La supuesta proteasa (V) no separa la secuencia separadora de proteasas (II) predeterminada. La porción' de señal de la proteína de fusión queda i unida cpn la membrana y no puede ser detectada I ni directamente en el citosol ni indirectamente mediante un gen informador (VIA/B) presente en el núcleo de la célula, que es influenciado en su transcripción por la porción de señal (III) .

El gen' informador queda sin verse afectado (VIIA) . b) La supuesta proteasa (V) separa la secuencia separadora de proteasas (II) predeterminada y puede ser entonces detectada directamente en el citosol, (VI) o bien indirectamente mediante la influencia de la transcripción de un gen informador (VIB) en el núcleo de la célula. El gen informador induce entonces una modificación detectable de la célula.

Fig. 2. Representación esquemática del modo de acción de ssTMl-DEVDG-Gal4 i La figura 2 describe esquemáticamente el funcionamiento del procedimiento de acuerdo con la invención pa Ira la identificación de proteasas. En esta forma de realización especial, la transformación del ADNc de CPP32 conduce a dos posibles secuencias de reacción a) o b) dentro del sistema celular. a) La supuesta proteasa (V) CPP32 no separa la secuencia separadora de proteasas (lia) DEVN predeterminada (IV) . La proteína de fusión recombinante , consiste en el activador de la transcripción Gal4 (III) que está unido, a través de dos distanciadores (la, Illa) y la secuencia separadora de proteasas (lia), con una porción de anclaje a la membrana (I) procedente del dominio TMl de pr eseni 1 iµal , conteniendo I, adicionalmente, una porción de señal de la invertasa de levaduras. La porción de señal de la construcción queda unida con la membrana y no puede detectarse ni directamente en el citosol ni i indirectamente por un gen informador (Gall-lacz) aprésente en el núcleo de la célula. No es posible una tinción de las colonias mediante la actividad de ß-galactosidasa. b) La supuesta proteasa (V) CPP32 separa (VI) la secuencia Reparadora de proteasa." (DEVD, 11 ) predeterminada y accede entonces, través del citosol, al núcleo de la célula (VIB), en donde, como activador de la transcripción, posibilita la expresión de! la ß-galactosidasa y, por consiguiente, la tinción de azul de las colonias (VIIB) .

Fig. 3 Secuencia señal (Suc2p-1-19 de levadura) más I metionina MLLQAFLFLLAGFAAKISA + M i Fig. 4 Distanciadores y dominios de transmembrana (APP695597 - 65Í1 humano , C l - 55 ) ! DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIATVI VITLVMLKKK Fig. 5 Distanciadores, dominios de transmembrana y dominios citosólicos (APP69s597 - 695 humano, Cl-99) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIATVI VITLVMLKKKQYTSIHHGVVEDAAVTPEERHLSKMQQNGYENPTY i KFFEQMQN Fig. 6 Distanciadores y dominios de transmembrana (presenilina 1 humana, aminoácidos 3-101) E L PAP L S Y FQNAQMS E DNHL S NTVRS Q JDNRE RQE HNDRR S L GH P EPLSNGRPQGNNSRQVVEQDEEEDEELTLKYGAKHVIMLFVPVTL CMVVVVATIK Fig. 7 Distanciadores con lugar de clonación RPH Fig. 8 Molécula señal (Gal4p-1-881 de levadura) MKLLSSIEQACDICRLKKLKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAH TEVES RLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALLTGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMP LTLRQHRISATS;SSEESSNKGQRQLTVSIDSAAHHDNSTIPLDFMPRDALHGFDWSEED DMSDGLPFLKTDPNNNGFFGDGSLLCILRSIGFKPENYGNSNVNRLPTMITDRYGLASR STTSRLLQSYLMNFHPYCPIVHSPTLMMLYNNQIEIASKDQWQILFNCILAIGAWCIEGES TDIDVFYYQNAKSHLTSKVFESGSIILVGA HLLSRYTQWRQKTNTSYNFHSFSIRMAISL GLNRDLPSSFSDSSILEQRRRIWWSVYSWEIQLSLLYGRSIQLSQNTISFPSSVDDVQR TTTGPTIYHGIIETARLLQVFTKIYELDKTVTAEKSPICAKKCLMICNEIEEVSRQAPKFLQ MDÍSTGALTNLLKEHPW SFTRFELK KQLSLIIYVLRDFFTNFTQKKSQLEQDQNDHQ SYEVKRCSIMLSDAAQRTVMSVSSYMDNHNVTPYFAWNCSYYLFNAVLVPIKTLLSNSK SNAENNETAQIJLQQINTVLMLLKKLATFKIQTCEKYIQVLEEVCAPFLLSQCAIPLPHISY NNSNGSAIKNIVGSATIAQYPTLPEENVNNISVKYVSPGSVGPSPVPLKSGASFSDLVKL LSNRPPSRNSPVTIPRSTPSHRSVTPFLGQQQQLQSLVPLTPSALFGGANFNQSGNJAD SSLSFTFRNSS GPNLITTQTNSQALSQPIASSNVHDNFMNNEITASKLDDGNNSKPLSP GWTDQTAYNAFGITTGMFNTTTMDDVYNYLFDDEDTPPNPKKE E j emplos Ejemplo 1: preparación de las proteínas de fusión ssTMl-Gal4, ssTMl-DEVDG-Gal4 , ssTMl -DEVNG-Gal4 asociadas a membranas Todas las proteínas de fusión Gal4 se derivan del! plásmido pCLl (S. Fields y 0. Song, Nature, 340,! 245 (1989)), que contiene el gen GAL4 en un cásete de expresión, que se compone del promotor ADHJ y del terminador ADH1. Este cásete de ! expresión se clonó en el vector de expresión en levaduras Ycplac22 (R.D. Gietz y A. Sugino, Gene, 74, 527 ¡(1988) ) . La construcción resultante ( Ycplac22 : : G'al4 ) es el vector de partida para ssTMl- Gal4 y sus ¡derivados. La proteína de fusión ssTMl- i Gal4 se compone de la secuencia señal de la invertasa de levaduras (aal-aal9 (D.T. Moir y D.R. i Dumais, Gene, 56, 209 (1987)), seguida del extremo N i de PSI humano (hasta el primer dominio de la t ransmembranía ( aa3-aal 01 ) ) , seguida de una región dis tanciadora (RPH) de tres aminoácidos de longitud que contiene lugares de corte por restricción para Stul y Ndel!I, seguida de Gal4 de levaduras (aal-aaddl) . SsTMlGal4 se preparó mediante amplificación por PCR de , las correspondientes regiones de ADNc mediante té nicas de clonación convencionales (F. Me Ausubel et 'al., Current Protocols in Molecular Biology (Greene, Nueva York, (1992)) . Las proteínas de fusión ssTMl-DEVDG-Gal 4 y s sTMlDEVNG-Ga 14 se prepararon mediante la inserción de oligonucleótidos de doble cadena que codifican la secuencia de aminoácidos DEVDG o DEVNG en la construcción ssTMl- ? Gal4 cortada ¡con Stul y Ndell.

Ejemplo 2: cjetección de la unión a la membrana de las proteínas de fusión ssTMl-Gal4 y ssTMl-DEVDG-Gal4 asociadas a la membrana Se utilizaron métodos convencionales para el f accionamiento de células de levaduras (Guthrie, C. I y Fink, G . R¡. (1991) Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Academic Press, San Diego) . I I SsTMl-Gal4 era detectable en la fracción de membrana. La, asociación a la membrana de ssTMl-Gal4 se detectó, además, mediante la resistencia frente a I la extraccióln alcalina (Y. Fujiki et al., J. Cell Ejemplo 3: preparación de la caspasa-3 humana El 'ADNc de la caspasa-3 humana (T. Fernandes-Alnemri et al., J. Biol. Chem. 269, 30761 (1994); M. Tewari et al., Cell, 81, 801 (1995); D.W.

Nicholson et al., Nature 376, 37 (1995)) se clonó en un derivado del vector de expresión en levaduras pVTlOO-U (2626, T. Vernet et al., Gene 52, 225 (1997) ) , en ,el que el gen URA3 fue reemplazado por el gen LEU2 J En está construcción, la expresión de la caspasa-3 se efectúa bajo el control de las secuencias de promotor y terminador ADH1. La caspasa-3 ¡ se separa en las subunidades I características de la enzima proteolíticamente activa. El mecanismo de la activación de caspasa-3 en células de levaduras, que ni muestran apoptosis ni contienen' homólogos de caspasa (The Yeast Genome I Directory, Al supplement to Nature 387, n° 6632) es desconocido, pero podría efectuarse por auto-activación en virtud de una sobre- exprés ion .

Ejemplo 4: detección de la capacidad de separación de ssTMl-DEVDG-Gal4 en células de levadura SFY526 que se expresan en caspasa-3 Se emplearon métodos convencionales (Guthrie, Cl y Fink, G.R. (1991) Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Academic Press, San Diego; F.M. ' Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Greene, Nueva York, (1992)) para introducir los vectores de expresión para Gal4, ssTMl-Gal4, s sTMl -DEVDG-Ga 14 , s s TMl - DEVNG-Ga 14 y caspasa-3 en la cepa de levaduras SFY526 (MATa, ura3-52, his3-200, ade2-101, lys2-801, trpl-901, leu2-3,112, can®, gal4-542, gal80-538, URA3::Gall-lacZ) (P.L. Bartel et al., BioTechniques, 14, 920 (1993) ) . La preparación de extractos de proteínas y ensayos de ß-gal siguió métodos convencionales I (Guthrie, C. y Fmk, G.R. (1991) Guide to Yeast I i Genetics and Molecular Biology, Academic Press, San Diego; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Greene, Nueva York, (1992) , .

Claims (33)

RE IVIND I CACIONE S

1. Procedimiento para la identificación de proteasas, ¡que separan sustratos asociados a membranas, caracterizado porque I. una proteína de i fusión recombinante, consistente en al menos una I porción de informador y en una secuencia separadora de proteasas, se expresa en un sistema celular adecuado, qu¡e está asociado con una membrana y II. otra ' roteíná se expresa en el mism sistema celular y III. se detecta la presencia de la porción de informador separada.

2. rocedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia separadora de proteasas está localizada, total o parcialmente, dentro de la'membrana celular.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia separadora de proteasas está localizada, total o parcialmente, dentro del citosol.

4. ; Procedimiento según una de las i reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la proteína de fusión está anclada en la membrana mediante una porción de anclaje adicional

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la proteína de- fusión está anclada en la membrana mediante la secuencia separadora de proteasas asociada a la membrana.

6. ' Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la secuencia separadora de proteasas asociada a la membrana y/o; la porción de informador y/o la porción de anclaje de la proteína de fusión están unidas mediante un di s t anciador .

7. ¡ Procedimiento según una de las i reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la proteína de, fusión de acuerdo con la invención contiene una secuencia señal que dirige a la proteína de fusión hacia la membrana de un sistema celular adecuado para ello.

8. Procedimiento según una de las i reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el sistema de expresión adecuado es un sistema de expresión eucariótico.

9. i Procedimiento según una de las I reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el sistema de expresión adecuado es un sistema de expresión en, levaduras.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el sistema de expresión adecuado es un sistema de expresión en < mamí f eros . I !

11. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque la porción de informador de la proteína de fusión es el activador de la 1 transcripción en levaduras Gal4.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4 y 6 a 11, caracterizado porque la porción de anclaje de la proteína de fusión es el dominio TMl de presenilina 1.

13. Procedimiento según una de las i reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la secuencia separadora a investigar está unida con una porción de anclaje según la rei indicación 12 y una porción de informador según la reivindicación 11 y una porción de señal adecuada.

14. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el sistema de expresión adecuado no contiene proteasas propias del ¡sistema que separan sustratos asociados a membranas . '

15. ' Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque en el caso de la secuencia separadora de proteasas se trata de una secuencia de aminoácidos que es 1 separada por' la ?-secretasa o por la proteasa NOTCH o por la proteasa presenilina o por caspasas que separan presenilina.

16. ¡ Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque la i secuencia separadora de proteasas es la proteína precursora ß-amiloide (ßAPP) humana o una parte de 1 a mi sma . ,

17. Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado porque la secuencia separadora de proteasas es una de las secuencias parciales de la proteína precursora ß-amiloide (ßAPP) humana representada1 en las figuras 5 ó 6.

18. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes para encontrar proteasas que separan sustratos asociados a membranas y sus genes a partir de genotecas.

19. ' Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes para encontrar la ?-secretasa o 'la pres eni 1 inasa o la proteasa NOTCH o caspasas que separan presenilina a partir de genotecas .

20. ,Proteína de fusión recombinante, que se puede asociar con una membrana celular y que contiene al . menos una porción de informador, una I secuencia separadora de proteasas y una poción de señal con la finalidad de un transporte dirigido a la membrana de un sistema de expresión.

21. Proteína de fusión recombinante según la rei indicación 20, caracterizada porque contiene una porción de anclaje a la membrana adicional.

22. Proteína de fusión recombinante según la reivindicación 20 ó 21, caracterizada por que ¡ contiene adicionalmente al menos un distanciador entre las porciones funcionales de la proteína de i fusión. !

23. Proteína de fusión recombinante según una de las ¡reivindicaciones 20 a 22, caracterizada porque la porción de informador es el activador de la transcripción en levaduras Ga 14.

24. , Proteína de fusión recombinante según una de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizada porque la porción de anclaje es el dominio TMl de presenilina ¡1.

25. ! Proteína de fusión recombinante según una de las ¡reivindicaciones 20 a 24, caracterizada porque la porción de señal es la secuencia señal de la invertasa. de levaduras.

26. Proteína de fusión recombinante según una de las reivindicaciones 20 a 25, caracterizada porque como secuencia separadora de proteasas contiene al' menos una de las secuencias de aminoácidos que son separadas específicamente por la ?-secretasa ¡o la proteasa NOTCH o la proteasa presenilina < o por las caspasas que separan preseni 1 ina . ¡

27. 'Proteína de fusión recombinante según una de las reivindicaciones 21 a 26, caracterizada I porque la proteína de fusión contiene, como porción de informador, el activador de ia transcripción en levaduras Gal4, el dominio TMl de presenilina 1 como porción de anclaje y una supuesta secuencia separadora de proteasas.

28. Proteína de fusión recombinante según la reivindicación 27, caracterizada porque una porción de señal adicional de la porción de señal es la invertasa de ¡ levaduras .

29. Proteína de fusión recombinante según una de las reivindicaciones 20 a 28, caracterizada porque la secuencia separadora de proteasas es la proteina precursora ß-amiloide (ßAPP) humana o una parte de la misma.

30. Proteína de fusión recombinante según una de las rei indicaciones 20 a 29, caracterizada porque la secuencia separadora de proteasas es una de las secuencias parciales de la proteína precursora ß-amiloide (ßAPP) humana representada en las figuras 5 ó 6.

31. Proteína de fusión recombinante según una de las ¡reivindicaciones 20 a 30, caracterizada porque contiene una secuencia señal según la figura I 3, una secuencia separadora de proteasas con di st anciador.es según la figura 5 y una porción de informador s.egún la figura 8.

32. Proteína de fusión recombinante según una de las reivindicaciones 20 a 30, caracterizada porque contiene una secuencia señal según la figura 3, una secuencia separadora de proteasas con distanciadores según la figura 6 y una porción de informador según la figura 8.

33. Empleo de una proteína de fusión según una de las reivindicaciones 20 a 32 en un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 19.