DE102008054494B4

DE102008054494B4 - Hefezellbasierter Bioassay zur Testung spezifischer Inhibitoren gegen humane tumorrelevante Matrix-Metalloproteasen (MMPs)

Info

Publication number: DE102008054494B4
Application number: DE200810054494
Authority: DE
Inventors: Prof. Dr. Schmitt Manfred; Björn Diehl
Original assignee: Universitaet des Saarlandes
Current assignee: Universitaet des Saarlandes
Priority date: 2008-12-10
Filing date: 2008-12-10
Publication date: 2012-08-30
Anticipated expiration: 2028-12-11
Also published as: DE102008054494A1

Abstract

Nukleinsäure, die ein Fusionsprotein kodiert, das eine Aminosäuresequenz gemäß einer der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3, sowie eine Matrix-Metalloprotease umfasst.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet von zellbasierten Testsystemen. Insbesondere betrifft sie eine Wirtszelle, die Matrix-Metalloproteasen exprimiert, die in ihrer Zellwand verankert sind. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung besagter Wirtszelle in einem zellbasierten Testsystem zur Untersuchung der Aktivität von Matrix-Metalloproteasen und zur Charakterisierung von Inhibitoren der Matrix-Metalloproteasen.
Mehrzellige Gewebe bestehen aus einem komplexen extrazellulären Bereich, der in seiner Gesamtheit als Extrazelluläre Matrix (EZM) bezeichnet wird. Hauptbestandteil der EZM ist Kollagen, ein 300 nm langes, 1050 Aminosäuren umfassendes Protein, das besonders reich an Glycin, Prolin und Hydroxyprolin ist. Ein einzelner Kollagenstrang bildet eine linksgängige Helix. Drei derartige Stränge lagern sich zu einer rechtsgängigen Tripelhelix, dem Tropokollagen, zusammen. Aus diesem Tropokollagen entstehen Kollagenfibrillen, die sich ihrerseits wieder zu Kollagenfasern zusammenlagern. Ferner enthält die EZM Proteoglykane. Diese sind stark glykosylierten Proteine, deren negativ geladene Seitenketten große Mengen an Wasser binden. Dadurch erhält die EZM ihr Volumen und ihre gelartige Beschaffenheit. Schließlich enthält die EZM noch Multiadhäsionsproteine die einerseits die verschiedenen Komponenten der EZM untereinander vernetzen, andererseits aber auch die Zellen mit der EZM vernetzen.
Die Bedeutung der extrazellulären Matrix geht über ihre Funktion als „Zellleim” und Wasserspeicher hinaus. Die EZM unterliegt einem dynamischen Gleichgewicht aus Auf- und Abbau. Die Struktur der EZM beeinflusst Prozesse wie Wundheilung oder die Neubildung von Blutgefäßen.
Eine entscheidende Rolle für die Struktur der EZM spielt die Aktivität von Matrix-Metallproteasen (MMPs). Das Wechselspiel dieser Enzyme und ihrer Inhibitoren der TIMPs (tissue inhibitors of matrixmetalloproteinases) sorgt für einen geregelten Umbau der EZM.
Matrix-Metalloproteinasen sind eine Gruppe von zinkabhängigen Endopeptidasen, die in ihrer Gesamtheit alle Bestandteile der extrazellulären Matrix abbauen können. In fast allen Abteilungen mehrzelliger Lebewesen ist eine Vielzahl von MMPs beschrieben, unter anderem in den Modellorganismen Drosophila melanogaster (Llano et al., 2000, J Biol Chem 275: 35987–359885), Caenorhabditis elegans (Wada et al., 1998, Gene, 211: 57–62), Hydra spec. (Leontovich et al., 2000, Development, 127: 907–920) und im Pflanzenreich bei Arabidopsis thaliana (Maidment et al., 1999, J Biol Chem, 274: 34706–34710). Nach derzeitigem Kenntnisstand besitzt der Mensch 24 verschiedene MMPs, von denen 7 membrangebunden sind. (Amalinei et al., 2007, Rom J Morphol Embryol, 48: 323–334; Somerville et al., 2003, Genome Biol, 4: 216). MMPs sind an einer Vielzahl von homöostatischen Funktionen wie Wachstum, Gewebereparatur oder Immunität, aber auch an pathologischen Prozessen wie Krebs, Arthritis oder Entzündungen beteiligt (Fu et al., 2008, Semin Cell Dev Biol, 19: 2–13; Gill and Parks, 2008, Int J Biochem Cell Biol, 40: 1334–1347; Matt and Werb, 2004, Curr Opin Cell Biol, 16: 558–564). Insbesondere die Matrix-Metalloproteasen 2 (Gelatinase A, Typ-IV-Kollagenase) und 9 (Gelatinase B) tragen vielfach zu einer schnellen Invasion, Metastasierung und Proliferation entarteter Zellen bei, indem sie die Angiogenese und damit die Bildung tumoreigener Blutgefäße fördern (Masson et al., 2005, FASEB J, 19: 234–236; Rauvala et al., 2006, Int J Gynecol Cancer, 16: 1297–1302; Turpeenniemi-Hujanen, 2005, Biochimie, 87: 287–297; Zheng et al., 2006, Anticancer Res, 26: 3579–3583). Auch andere Krankheitsbilder sind mit erhöhter Aktivität von MMPs, insbesondere von MMP-2 und MMP-9 assoziiert, so zum Beispiel Herz-Kreislauferkrankungen (Dorman et al., 207, Recent Patents Cardiovasc Drug Discov, 2: 186–194), neurologische Erkrankungen (Agrawal et al., 2008, Semin Cell Dev Biol, 19: 42–51) und Alzheimer (Nalivaeva et al., 208, Curr Alzheimer Res, 5: 212–214).
Q. Wang et al., 2007, Biotechnol Lett, 29: 1561–1566, beschreiben ein System zum Display von heterologen Proteinen auf der Zelloberfläche von P. pastoris, wobei α-Agglutinin aus S. cerevisiae als Membrananker verwendet wird.
Aufgrund der Bedeutung von Matrix-Metalloproteasen bei Krebserkrankungen gibt es eingroßes Interesse an der Entwicklung von MMP-Hemmstoffen. Da MMPs im gesunden Gewebe nur eine geringe Aktivität aufweisen, wurde gehofft, dass die Hemmung ihrer Aktivität zu einer nebenwirkungsarmen Krebstherapie führen könne. Die erste Generation von MMP-Inhibitoren hat diese Hoffnungen nicht erfüllt. Es traten gravierende Nebenwirkungen auf, die zum Teil einen Abbruch der Behandlung erzwangen. Ursächlich für diese Nebenwirkungen war vermutlich die geringe Selektivität der verwendeten Inhibitoren. Sie beeinflussten neben MMPs auch Adamalysine und andere zinkabhängige Enzyme (Fingleton, 2008, Semin Cell Dev Biol, 19: 61–68). Darüber hinaus ist die Bindungsstelle für Inhibitoren im aktiven Zentrum der MMPs hoch konserviert, so dass einzelne Inhibitoren mehrere unterschiedliche MMPs hemmen. Bisher wurden 60 MMP-Inhibitoren klinisch getestet. Nur einer davon hat bisher die Zulassung erhalten (Periostat von CollaGenex Pharmaceuticals) und einige weitere Präparate befinden sich in der klinischen Prüfung (Rebimastat von Bristol Myers Squibb, Neovastat von Aetema Laboratortes, Dermostat und COL-3 von CollaGeneX sowie S3304 von Shinogi). Darüber hinaus sind einige natürlich vorkommende Hemmstoffe für MMPs bekannt, z. B. Cucurmin aus Cucurma sp. oder Nobelitin aus Citrusfrüchten.
Die Verwendung von Hefen für die rekombinante Herstellung von Säugetierproteinen ist allgemein bekannt. Im Gegensatz zur rekombinanten Produktion dieser Proteine in Prokaryoten, z. B. Escherichia coli, bieten Hefen den Vorteil, dass die produzierten Proteine durch Glykosylierungen, Phosphorylierungen oder Disulfidbrückenbindungen posttranslational modifiziert werden. Diese Modifikationen sind für die Funktion der Proteine häufig vorteilhaft oder sogar essentiell. Für die rekombinante Proteinexpression werden unter anderem Saccharomyces cerevisae, Kluyveromyces lactis, Zygosaccharomyces bailii, Schizosaccharomyces pombe und Pichia pastoris verwendet.
Eine Verankerung des produzierten Proteins in der Zellwand der Hefe bietet den Vorteil, dass die Hefezelle z. B. als Ganzzell-Biokatalysator eingesetzt werden kann. Außerdem ist das zellwandgebundene Protein häufig stabiler als ein gelöstes Protein (Schreuder et al., 1996, Trends Biotechnol, 14: 115–120)
Ein großes Hindernis bei der Entwicklung neuartiger MMP-Inhibitoren ist der große Aufwand bei der Gewinnung aktiver Matrix-Metalloproteasen für die erforderlichen Untersuchungen. Derzeit werden MMPs aus humanen Tumor-Zelllinien oder Primärzellen isoliert. Eine rekombinante Herstellung von stabilen MMPs ist deswegen wünschenswert.
Aufgabe der Erfindung ist es also, Mittel und Verfahren bereitzustellen, die eine Herstellung stabiler MMPs ohne die zuvor genannten Nachteile erlauben. Die Aufgabe wird durch die Ausführungsformen gelöst, die in den Patentansprüchen und nachfolgend beschrieben werden.
Die Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, die ein Fusionsprotein kodiert, das eine Aminosäuresequenz gemäß einer der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3, sowie eine Matrix-Metalloprotease umfasst.
Die Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise DNA einschließlich cDNA oder RNA. Der Begriff „Nukleinsäure” umfasst einzelsträngige Nukleinsäuren ebenso wie doppelsträngige. Darüber hinaus bezieht sich der Begriff auch auf chemisch modifizierte Nukleinsäuren einschließlich natürlich vorkommender, beispielsweise durch Glykosylierung oder Methylierung veränderte Nukleinsäuren oder auch künstlich veränderte, beispielsweise durch Biotinylierung veränderte Nukleinsäuren.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren sollen ein „Fusionsprotein” kodieren. Dies ist ein Protein, das Bestandteile enthält, die aus wenigstens zwei unterschiedlichen (heterologen) Proteinen stammen. Dadurch erhält das erfindungsgemäße Fusionsprotein eine Kombination von Eigenschaften, wie sie in keinem der natürlich vorkommenden Proteine gefunden wird. Das erfindungsgemäße Fusionsprotein enthält wenigstens einen Bestandteil, der der Verankerung des Proteins in der Zellwand der Wirtszelle dient und einen zweiten Bestandteil, der eine Matrix-Metalloprotease-Aktivität besitzt.
Der erste Bestandteil des Fusionsproteins ist eine Aminosäuresequenz, die eine Zellwandverankerung bei Hefen und ganz besonders bevorzugt bei Pichia pastoris erlaubt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnten geeignete Sequenzen aus Zellwandproteinin von S. cerevisae gewonnen werden. Die Sequenzen sind in den SEQ ID NO: 1 bis 3 gezeigt. Besonders effektiv kann hierbei die Aminosäuresequenz mit SEQ ID NO: 1 genutzt werden, wie ein Vergleichsversuch mit Esterasefusionsprotein gezeigt hat (Beispiel 3).
Ein zweiter Bestandteil des von der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodierten Fusionsproteins ist eine Matrix-Metallprotease.
Matrix-Metalloproteasen (im folgenden auch als MMPs abgekürzt) sind dem Fachmann bekannt. Es handelt sich um Endopeptidasen (E. C. 3.4.24), die in ihrem aktiven Zentrum ein Zn²⁺-Ion enthalten. Eine detaillierte Beschreibung der humanen Matrix-Metalloproteasen kann in Somerville et al., 2003, Genome Biol, 4: 216 gefunden werden. Vorzugsweise enthält das erfindungsgemäße Fusionsprotein die Matrix-Metalloprotease 1, MMP-2, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-18, MMP-19, MMP-20, MMP-21, MMP-23, MMP-24, MMP-25 MMP-26 oder MMP-28. Besonders bevorzugt sind MMP-2 und MMP-9.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Aminosäuresequenz, die eine Zellwandverankerung erlaubt (d. h. die Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO. 1, 2 oder 3), mit dem Carboxy-Terminus der Matrix-Metalloprotease fusioniert.
Besonders bevorzugt wird der Matrix-Metalloprotease-Bestwndteil der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert von einer Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) Nukleinsäuresequenz wie in SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 5 gezeigt;
b) Nukleinsäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 gezeigt kodiert;
c) Nukleinsäuresequenz, die zumindest 70% identisch ist zu einer Nukleinsäuresequenz nach a) und b) und die ein Protein mit MMP-Aktivität kodiert; und
d) Nukleinsäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz kodiert, die zumindest 70% identisch zu einer Aminosäuresequenz ist, die von einer Nukleinsäuresequenz nach a), b) oder c) kodiert wird und die ein Protein mit MMP-Aktivität kodiert.

Der Begriff ”Nukleinsäure” wie er in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung benutzt wird umfasst auch Varianten der oben beschriebenen spezifischen Nukleinsäuren. Besagte Varianten können Orthologe, Paraloge oder andere Homologe der Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung repräsentieren. Die Nukleinsäurevarianten umfassen vorzugsweise eine Nukleinsäuresequenz, die dadurch charakterisiert ist, dass sie von den oben genannten spezifischen Nukleinsäuresequenzen, die das erfindungsgemäße Fusionsprotein kodieren, durch wenigstens eine Nukleotidsubstitution, Addition und/oder Deletion abgeleitet werden können, wobei die Nukleinsäurevariante weiterhin eines der oben beschriebenen Fusionsproteine kodieren soll. Varianten umfassen auch solche Nukleinsäuren, die eine Nukleinsäuresequenz enthalten, welche mit den oben genannten spezifischen Nukleinsäuresequenzen hybridisieren kann, vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungsbedingungen. Diese stringenten Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und können in current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, NY (1989), 6.3.1. bis 6.3.6 gefunden werden. Ein bevorzugtes Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen sind Hybridisierungsbedingungen in 6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (= SSC) bei ungefähr 45°C, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 50–65°C. Der Fachmann weiß, dass diese Hybridisierungsbedingungen abhängig von der Art der Nukleinsäure und beispielsweise der Anwesenheit organischer Lösungsmittel hinsichtlich der Temperatur und Konzentration des Puffers variieren können. Beispielweise variiert die Temperatur unter „Standardhybridisierungsbedingungen” abhängig von der Art der Nukleinsäure zwischen 42°C und 58°C in wässriger Lösung mit einer Konzentration von 0,1 bis 5 × SSC (pH 7,2). Wenn der vorher genannte Puffer ein organisches Lösungsmittel enthält, zum Beispiel 50% Formamid, beträgt die Temperatur unter Standardbedingungen ungefähr 42°C. Die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybridisierungen sehen vorzugsweise 0,1 × SSC und eine Temperatur zwischen 20°C und 45°C vor, vorzugsweise zwischen 30°C und 45°C. Die Hybridisierungsbedingungen für DNA:RNA-Hybridisienmgen sehen vorzugsweise zum Beispiel 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen 30°C und 55°C vor, vorzugsweise zwischen 45°C und 55°C. Die oben genannten Hybridisierungstemperaturen sind für eine Nukleinsäure von ungefähr 100 Basenpaaren Länge und einem GC-Gehalt von 50% in der Abwesenheit von Formamid berechnet. Der Fachmann weiß, wie er die erforderlichen Hybridisierungsbedingungen berechnet, indem er auf Lehrbücher zurückgreift wie oben erwähnt oder auf die folgenden Lehrbücher: Sambrook et al., „Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor, Laboratory, 1989; Hames and Higgins (Ed.) 1985, „Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach”, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, Brown (Ed.) 1991, „Essential Molecular Biology: A Practical Approach”, IRL Press at Oxford University Press, Oxford. Alternativ können Nukleinsäurevarianten durch PCR-basierte Methoden, beispielsweise durch die Verwendung degenerierter Primer gegen konservierte Domänen der Proteine der vorliegenden Erfindung, erhalten werden. Konservierte Domänen der Polypeptide der vorliegenden Erfindung können durch den Vergleich der Nukleinsäuresequenzen der Nukleinsäuren oder der Aminosäuresequenzen der Proteine der vorliegenden Erfindung mit den Sequenzen anderer Matrix-Metalloproteasen ermittelt werden.
Weiterhin umfassen Varianten Nukleinsäuren, die Nukleinsäuresequenzen beinhalten, die wenigstens 70%, wenigstens 75%, wenigstens 80%, wenigstens 85%, wenigstens 90%, wenigstens 95%, wenigstens 98% oder wenigstens 99% identisch zu den oben beschriebenen oder in SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 5 gezeigten Nukleinsäuresequenzen sind. Darüber hinaus werden auch solche Nukleinsäuren umfasst, die Nukleinsäuresequenzen enthalten, welche für Aminosäuresequenzen kodieren, die wenigstens zu 70%, wenigstens zu 75%, wenigstens zu 80%, wenigstens zu 85%, wenigstens zu 90%, wenigstens zu 95%, wenigstens zu 98% oder wenigstens zu 99% identisch zu dem erfindungsgemäßen Fusionsprotein oder den in SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 gezeigten Aminosäuresequenzen. Die prozentuale Identität wird vorzugsweise über die gesamte Länge der Aminosäure oder Nukleinsäureregion berechnet. Eine Reihe von Programmen, die auf einer Vielzahl von Algorithmen beruhen, steht dem Fachmann für den Sequenzvergleich zur Verfügung. In diesem Zusammenhang ergeben die Algorithmen von Needleman und Wunsch oder Smith und Waterman besonders verlässliche Ergebnisse. Für das Alignment der Sequenzen stehen das Programm PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351–360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151–153) oder die Programme Gap und BestFit [Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443–453 (1970)) und Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482–489 (1981))], die zum Softwarepaket GCG gehören [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)] zur Verfügung. Die oben aufgeführten Prozentwerte für die Sequenzidentität werden vorzugsweise mit dem Programm GAP über die gesamte Sequenzregion mit folgenden Einstellungen berechnet: depth weight: 50, length weight: 3, average match: 10,000 und average mismatch: 0,000. Wenn nicht anders angegeben sollen diese Werte immer Standardeinstellungen für Sequenzvergleiche verwendet werden.
Weiterhin umfasst die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäure, die ein Fragment einer der oben beschriebenen Nukleinsäuresequenzen enthält. Dieses Fragment sollte ein Protein kodieren, das die oben beschriebene Aktivität hat. Dementsprechend enthält das Protein die Domänen des Fusionsproteins der vorliegenden Erfindung, die ihm die beschriebene biologische Aktivität verleihen, oder es besteht aus diesen Domänen. Ein Fragment im Sinne dieser Patentanmeldung enthält vorzugsweise wenigstens 50, wenigstens 100, wenigstens 250, oder wenigstens 500 aufeinander folgende Nukleotide einer der vorgenannten Nukleinsäuresequenzen oder es kodiert für eine Aminosäuresequenz, die wenigstens 20, wenigstens 30, wenigstens 50, wenigstens 80, wenigstens 100 oder wenigstens 150 aufeinander folgende Aminosäuren einer der vorgenannten Aminosäuresequenzen enthält.
Es versteht sich, dass die zuvor beschriebenen Varianten immer auch die funktionellen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Fusionsproteins aufweisen, d. h. an der Zellwand von Pichia pastoris oder einer anderen Hefe verankert werden können und Matrix-Metalloprotease-Aktivität aufweisen.
Die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung bestehen entweder aus den oben genannten Nukleinsäuresequenzen oder sie enthalten besagte Nukleinsäuresequenzen. Das heißt, sie können auch weitere Nukleinsäuresequenzen enthalten. Solche weiteren Nukleinsäuresequenzen können vorzugsweise weitere Bestandteile des Fusionsproteins kodieren, z. B. detektierbare Marker wie FLAG-tags, Myc-tags, HA-tags oder fluoreszierende Proteine wie GFP.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren ermöglichen die Expression von Matrix-Metalloproteasen als Fusionsproteine mit Zellwandanker in einer Wirtszelle, wobei die MMPs an die Zellwand der Wirtszelle gebunden werden. Diese Bindung führt überraschenderweise zu einer höheren Stabilität der MMPs im Vergleich zu löslichen Proteasen. So können rekombinante Matrix-Metalloproteasen in konstant hoher Qualität bei geringen Kosten hergestellt werden. Darüber hinaus ermöglicht die Bindung der MMPs an die Wirtszelle den Einsatz der Wirtszelle in einem Ganzzell-Bioassay, wie er weiter unten beschrieben ist. Da bei zellgebundenen MMPs nicht die Proteine selbst, sondern nur ihre Wirtszellen aufgereinigt werden müssen, vereinfacht sich die Vorbereitung des Enzymtests. Die Aufreinigung der Wirtszellen kann sehr einfach durch Abzentrifugieren, Entfernen des Überstandes und Aufnahme der Zellen in Probenpuffer erfolgen. Im Vergleich zur chromatografischen Aufreinigung rekombinant hergestellter löslicher Proteine ist dieses Verfahren deutlich einfacher. Die gereinigten Zellen können lyophilisiert werden und sind in diesem Zustand ohne nennenswerte Aktivitätsverluste lagerfähig. Auch ein Vertrieb der erfindungsgemäßen Wirtszellen ist so mit geringem Aufwand möglich.
Konventionelle Matrix-Metalloproteasen müssen vor ihrer Verwendung aktiviert werden. Hierzu werden häufig umweltschädliche Organo-Quecksilberverbindungen verwendet. Die erfindungsgemäßen zellwandgebundenen Matrix-Metalloproteasen hingegen können durch Lyophilisierung oder in TTC-Puffer (Tris Triton X-100 Calciumchlorid) aktiviert werden. Die erfindungsgemäßen zellwandgebundenen Matrix-Metalloproteasen können ebenso einfach angewandt werden wie lösliche Proteine. Spezielle Vorkenntnisse sind nicht erforderlich.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Vektor, der eine der oben beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäuren enthält.
Der Begriff ”Vektor” umfasst vorzugsweise Phagen, Plasmide, virale oder retrovirale Vektoren ebenso wie künstliche Chromosomen, d. h. bacterial acrtificial chromosomes oder yeast artificial chromosomes. Darüber hinaus bezieht sich der Begriff ebenfalls auf Konstrukte, die zu einer zufälligen oder gerichteten Integration in die genomische DNA fähig sind. Solche Konstrukte enthalten vorzugsweise DNA von ausreichender Länge für entweder eine homologe oder eine heterologe Rekombination wie weiter unten im Detail beschrieben. Der die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthaltende Vektor enthält vorzugsweise zusätzlich selektierbare Marker für die Vermehrung und/oder Selektion in einer Wirtszelle. Der Vektor kann in die Wirtszelle durch verschiedene dem Fachmann bekannte Techniken eingebracht werden. Beispielsweise kann ein Plasmid in einem Präzipitat wie Kalziumphosphat oder Rubidiumchlorid oder in einem Komplex mit geladenen Fettsäuren oder in Kohlenstoff-basierten Cluster wie Fullerenen in die Zelle eingebracht werden. Alternativ kann ein Plasmid durch Hitzeschock oder Elektroporation in die Zelle eingebracht werden. Wenn der Vektor ein Virus ist, kann es in vitro in einer geeigneten Zelllinie verpackt werden, bevor es zu den Wirtszellen zugegeben wird. Retrovirale Vektoren können fähig oder unfähig zur Replikation sein. Ist letzteres der Fall, findet die Vermehrung des Virus im Allgemeinen nur in Wirtszellen statt, die mit den zu transformierenden Zellen gemischt werden.
Es ist besonders bevorzugt, dass die erfindungsgemäße Nukleinsäure im erfindungsgemäßen Vektor funktional mit Expressionskontrollsequenzen verbunden ist, die eine Kontrolle der Expression in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen oder isolierten Fraktionen davon ermöglichen. Die Expression der besagten Nukleinsäure umfasst die Transkription der Nukleinsäure, vorzugsweise in translatierbare mRNA. Regulatorische Elemente für Expressionskontrollsequenzen, die die Expression in eukaryotischen Zellen sicherstellen, sind dem Fachmann gut bekannt. Sie umfassen vorzugsweise regulatorische Sequenzen, die die Initiation der Transkription sicherstellen und, vorzugsweise, Poly-Adenylierungssignale, die die Termination der Transkription sicherstellen und das Transkript stabilisieren. Zusätzliche regulatorische Elemente können Transkriptions- sowie Translations-Enhancer enthalten. Mögliche regulatorische Elemente, die die Expression in prokaryotischen Wirtszellen ermöglichen, umfassen beispielsweise die lac-, trp- oder tac-Promoter in Escherichia coli. Beispiele für regulatorische Elemente, die die Expression in eukaryotischen Wirtszellen ermöglichen, sind der AOX1- oder GAL1-Promotor in Hefe oder die CMV-, SV40-, RSV-Promotoren, CMV-Enhancer, SV40-Enhancer oder ein Globin-Intron in Säugetier- oder anderen tierischen Zellen. Darüber hinaus können induzierbare Expressionskontrollsequenzen in einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor verwendet werden. Solche induzierbaren Vektoren können tet- oder lac-Operatorsequenzen oder Sequenzen, die durch Hitzeschock oder andere Umweltfaktoren induzierbar sind, enthalten. Passende Expressionskontrollsequenzen sind dem Fachmann gut bekannt. Neben Elementen, die für die Initiation der Transkription verantwortlich sind, können solche regulatorischen Elemente auch Signale enthalten, die die Termination der Transkription bewirken. Beispiele dafür sind die SV40-Poly-Adenylierungssequenz oder die tk-Poly-Adenylierungssequenz am 3'-Ende der Nukleinsäure. In diesem Zusammenhang sind passende Expressionsvektoren dem Fachmann bekannt, zum Beispiel der Okayama-Berg-Expressionsvektor pcDV1 (pharmacia), pBluescript (Stratagene), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen) oder pSPORT1 (GIBCO BRL).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Vektor der Expressionsvektor pPIC9 für die Hefe Pichia pastoris.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Polypeptid, das von den oben beschriebenen Nukleinsäuren kodiert wird.
Die Bezeichnungen „Polypeptid” und „Protein” werden in der vorliegenden Patentanmeldung synonym verwendet. Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Polypeptid durch die rekombinante Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in einer geeigneten Wirtszelle hergestellt. Alternativ kann das erfindungsgemäße Polypeptid auch durch rein chemische Synthese in vitro erhalten werden. Das erfindungsgemäße Polypeptid ist ein Fusionsprotein mit Bestandteilen und Eigenschaften wie zuvor angeführt.
Ferner betrifft die Erfindung eine Wirtszelle, die eine der oben beschriebenen Nukleinsäuren enthält.
Die erfindungsgemäße Wirtszelle ist vorzugsweise eine eukaryontische Zelle. Besonders bevorzugt ist die Wirtszelle eine Hefezelle, ganz besonders bevorzugt der Art Pichia pastoris. Pichia pastoris gehört, ebenso wie Saccharomyces cerevisae, zur Klasse Saccharomycetes, Ordnung Saccharomycetales. Sie ist methylotroph, d. h. sie kann auf Methanol als einziger Kohlenstoffquelle wachsen. Auch erreicht sie mit 130 g Trockenzellmasse sehr hohe Zelldichten. Im Vergleich zu S. cerevisae zeigt sie eine reduzierte Glykosylierungsaktivität. Vergleiche der Expression von Matrix-Metalloproteasen in E. coli und in anderen Hefen haben gezeigt, dass Pichia pastoris besonders gut in der Lage ist, MMP-2 und MMP-9 in aktiver Form zu exprimieren (siehe Beispiel 1). Am stärksten bevorzugt sind die Stämme GS115 und KM71 an Pichia pastoris, wobei der Stamm KM71 ganz besonders bevorzugt ist.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Wirtszelle zur Identifizierung oder Charakterisierung von Inhibitoren von Matrix-Metalloproteasen.
Unter „Inhibitoren von Matrix-Metalloproteasen” werden in dieser Patentanmeldung Substanzen verstanden, die in der Lage sind, die Enzymaktivität von MMPs herabzusetzen. Solche Substanzen können aus allen chemischen Klassen stammen und umfassen insbesondere anorganische Verbindungen, niedermolekulare organische Verbindungen mit einem Molekulargewicht ≤ 3000 Da, organische Polymere, Nukleinsäuren, Peptide, oder Proteine. Unterschiedliche Substanzen aus diesen Klassen können z. B. auch in Form von Bibliotheken bereitgestellt werden, die unterschiedliche Vertreter der jeweiligen Klassen enthalten. Dem Fachmann sind verschiedene Mechanismen der Inhibition der Enzymaktivität bekannt. Vorzugsweise hemmen die Inhibitoren die Enzymaktivität der MMP kompetitiv oder allosterisch. Bei der kompetitiven Enzymhemmung bindet der Inhibitor im aktiven Zentrum des Enzyms, wird aber nicht enzymatisch umgesetzt. Deswegen konkurriert er mit dem Substrat um die Bindungsstelle. Ein allosterisch wirkender Inhibitor bindet außerhalb des aktiven Zentrums an das Enzym und induziert Konformationsveränderungen des Enzyms, die die Enzymaktivität senken. Beide Formen der Enzymhemmung sind vollständig reversibel, wenn der Inhibitor aus der Lösung entfernt wird. In der vorliegenden Patentmeldung werden darüber hinaus auch solche Substanzen als „Inhibitoren von Matrix-Metalloproteasen” bezeichnet, die das Enzym irreversibel inaktivieren. Eine solche irreversible Inaktivierung wird vorzugsweise durch die kovalente Bindung des Inhibitors an das Enzym vermittelt, besonders bevorzugt durch die Bindung im aktiven Zentrum.
Unter der „Identifizierung von Inhibitoren von MMPs” wird die Untersuchung von chemischen Substanzen auf ihre Fähigkeit zur Senkung der Enzymaktivität von MMPs verstanden. Vorzugsweise wird eine Vielzahl verschiedener chemischer Substanzen getestet, um herauszufinden, welche dieser Substanzen fähig ist, die Enzymaktivität von MMPs zu senken und somit als Inhibitor fungieren kann. Unter einer Senkung der MMP-Aktivität wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorzugsweise eine signifikante Erniedrigung der MMP-Aktivität des mit dem potentiellen Inhibitor behandelten Fusionsproteins gegenüber einem unbehandelten Fusionsproteins verstanden. Ob eine Erniedrigung der Aktivität signifikant ist, kann mit gängigen, dem Fachmann bekannten statistischen Tests bestätigt werden. Besonders bevorzugt ist in diesem Zusammenhang Studen's t-Test mit p < 0,05 als Signifikanzniveau. Die Verfügbarkeit von Kristallstrukturen von MMPs ermöglicht theoretische Vorhersagen darüber, welche Verbindungen als Inhibitoren einer bestimmten MMP oder mehrerer MMPs geeignet sein könnten. Diese Substanzen können dann gezielt synthetisiert und mit Hilfe der erfindungsgemäßen Wirtszelle auf ihre Eignung als Inhibitor überprüft werden. Somit ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Wirtszelle in Zusammenhang mit „rational drug design” ebenfalls bevorzugt.
Unter der „Charakterisierung von Inhibitoren von MMPs” wird die weitere Untersuchung der identifizierten Inhibitoren verstanden. Hierzu zählen vorzugsweise die Untersuchungen zur Stärke der Hemmung verschiedener MMPs und Untersuchungen zum Mechanismus der Hemmung. Ebenfalls vorzugsweise zählt dazu der Vergleich der Wirkung von chemischen Verbindungen mit ähnlicher Struktur, um Struktur-Wirkungsbeziehungen zu ermitteln. Auf Basis der ermittelten Struktur-Wirkungsbeziehungen können dann weitere chemische Substanzen mit verbesserten Eigenschaften entwickelt werden.
Schließlich betrifft die die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung von Inbibitoren von Matrix-Metalloproteasen, vorzugsweise in vitro, bestehend aus den Schritten erfindungsgemäße oben beschriebene Polypeptid umfasst

a) In Kontakt Bringen des potentiellen Inhibitors mit einer Wirtszelle, die das oben beschriebene erfindungsgemäße Polypeptid umfasst.
b) Bestimmung der Aktivität der Matrix-Metalloprotease und Vergleich mit einer Referenz, wodurch der Inhibitor identifiziert wird.

Die im Verfahren eingesetzte Wirtszelle kann einer Zellsuspension vorliegen. Vorzugsweise enthält eine die erfindungsgemäße Wirtszelle enthaltende Zellsuspension zusätzlich weitere chemische Substanzen. Besonders bevorzugt sind Puffer, die den pH der Zellsuspension in dem Bereich stabilisieren, der für die Aktivität der zu testenden Matrix-Metalloprotease besonders günstig ist. Ebenfalls vorzugsweise enthält die Zellsuspension Kofaktoren, die für die Aktivität der MMP erforderlich sind. Darüber hinaus ist es bevorzugt, dass die Zellsuspension ein Substrat der zu testenden MMP enthält.
Es versteht sich, dass die erfindungsgemäßen Wirtszellen, die zuvor beschrieben wurden, auch in dem erfindungsgemäßen Verfahren als Wirtszellen eingesetzt werden können.
Verfahren zur Messung der Aktivität von Enzymen im Allgemeinen und Matrix-Metalloproteasen im Besonderen sind dem Fachmann bekannt. Vorzugsweise wird die Enzymaktivität über die Zunahme der Konzentration eines Reaktionsprodukts oder die Abnahme der Konzentration eines Edukts bestimmt. Besonders bevorzugt sind hierbei Edukte, deren Konzentration sich durch eine spezifische Lichtabsorption oder Fluoreszenz bestimmen lässt oder deren Spaltprodukte eine solche spezifische Lichtabsorption oder Fluoreszenz aufweisen. Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise in einem Photometer, Fluoreszenz-Photometer oder einem Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Leser durchgeführt.
Als Referenz bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die MMP-Aktivität dienen, die für eine Wirtszelle nur in a) beschrieben unter denselben experimentellen Bedingungen bestimmt wurde, wobei die Wirtszelle jedoch nicht mit dem potentiellen Inhibitor in Kontakt gebracht wurde. Alternativ kann die MMP-Aktivität auch vor der Behandlung der Wirtszelle als Referenz bestimmt werden. Solche einmal bestimmten Referenzwerte können auch auf geeigneten Medien gespeichert werden und als Referenz für zukünftige Vergleiche dienen.
Soll das Verfahren zum Hochdurchsatz-Screening eingesetzt werden, können die Schritte des Verfahrens auch automatisiert werden. Die Kultivierung und Behandlung, sowie die Messung der MMP-Aktivität kann durch Roboter-Systeme automatisiert werden. Der Vergleich der Messwerte mit Referenzen und damit die Identifizierung von Inhibitoren kann durch gängige, dem Fachmann bekannte computer-implementierte Algorithmen durchgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Matrix-Metalloprotease-Aktivität durch die Freisetzung eines Fluoreszenzfarbstoffs aus Gelatine bestimmt. Die Moleküle des Fluoreszenzfarbstoffs sind in der Gelatine so eng gepackt, dass eine Fluoreszenz wegen des gegenseitigen Quenching nicht möglich ist. Erst der Abbau der Gelatine durch die MMP setzt den Farbstoff frei und ermöglicht Fluoreszenz. Die Stärke des Anstiegs der Fluoreszenz über die Zeit ist ein Maß für die Aktivität der MMP. Die Anwesenheit von Inhibitoren von MMPs führt zu einem langsameren Anstieg der Fluoreszenz. Ein für diese Ausführungsform bevorzugter Farbstoff ist Fluorescein.
Die Abbildungen zeigen:
1: MMP-Expression in Escherichia coli bei 30°C und 37°C. Die Zellen wurden mittels Ultraschall aufgeschlossen, die Proteine über SDS-PAGE getrennt und mit Coomassie angefärbt (P = Pellet, R = Rohextrakt, rote Umrandung = MMP).
2: Western-Blot zum Nachweis einer MMP-Expression in Z. bailii ATCC36947. Im konzentrierten Kulturüberstand sind für MMP-9 zwei schwache Banden sichtbar. Die Kulturüberstände vom Stamm ATCC36947 enthielten keine MMPs.
3: Plasmid-Integration in das Genom von Pichia pastoris. Das im Bereich des HIS4-Gens linearisierte Plasmid wird durch ein einfaches Crossover in den his4-Lokus auf dem Pichia-Chromosom inseriert. Als Resultat ergeben sich zwei Kopien des HIS4/his4-Gens, wovon eine weiterhin in einer mutanten, die andere in der wildtypischen Form vorliegt.
4: MMP-Expression in Pichia pastoris (GS115). Die Western Blots mit ihren korrespondierenden Zymographien zeigen eine hohe MMP-Produktion in biologisch aktiver Form. Für KM71-Stamm wurden vergleichbare Ergebnisse erhalten (- = Negativ-Kontrolle, + = Positiv-Kontrolle, rote Umrandung = MMP).
5: Verwendete Zellwandanker-Sequenzen. Bei allen Ankern wurde die proteineigene ER-Signalsequenz am 5'-Ende entfernt, um eine intramolekulare Prozessierung durch eine Signalpeptidase zu verhindern. PIR1 wurde um 363 bp am 3'-Ende verkürzt.
6: Zelloberflächen-Expression von Esterase A in Pichia pastoris. Die Bildung von p Nitrophenol aus p Nitrophenylacetat wurde durch Absorptionsmessung bei λ = 405 nm verfolgt. Die Steigungen der Geraden dienten als Maß für die Bewertung des jeweiligen Zellwandproteins bezüglich seiner Eignung als Anker bei der heterologen Proteinexpression. (A) P. pastoris-Stamm GS115, (B) P. pastoris-Stamm KM71; die kleinere Graphik gibt die Werte in veränderter Ordinaten-Skalierung an. Die blaue gestrichelte Linie beschreibt den bei früheren Untersuchungen ermittelten Verlauf für S. cerevisiae SEY6210 mit Cwp2p-EstA-Expression.
7: Vergleich der Esterase A-Aktivitäten in Abhängigkeit der gewählten Stamm-Anker-Kombination. Die Effizienz der Zellwand-Verankerung konnte vom niedrigsten zum höchsten Wert um das Zehnfache gesteigert werden; im Vergleich zum etablierten S. cerevisiae-System war eine Erhöhung um das Sechsfache möglich (aufgeführt sind Volumenaktivitäten berechnet für Zellsuspensionen mit der OD600 = 10).
8: Indirekte Immunfluoreszenz zum Nachweis zellwandverankerter MMPs in P. pastoris. Hefezellen des Stamms KM71 mit entsprechendem Expressionsplasmid wurden 72 h unter induzierenden Bedingungen kultiviert. Die MMPs wurden mit Anti-MMP-AK (ABCAM, 1:25) und mit FITC-markierten Anti-Rabbit-IgG-AK (SIGMA, 1:15) gelabelt (Fluoreszenz-Mikrokop: KEVENCE BZ 8000; λ A = 480 nm; λ E > 510 nm).
9: Validierung des Inhibitor-Testsystems. (A) Als Modell-Hemmstoff diente der Metallchelator und allgemeine MMP-Inhibitor 1,10 Phenanthrolin; bei MP 137 und MP 146 handelt es sich um intermediäre Synthetisierungs-Stadien sich in Entwicklung befindlicher Inhibitoren (B) Konzentration-Wirkung-Diagramm von 1,10 Phenanthrolin für MMPACE II und MMPACE IX (DQ^TM Gelatine: 25 μg/ml; Fütterrate: 2 × 1% MeOH/d; Induktionsdauer: 96 h; OD600: 2,5; RFU = Relative Fluoreszenz-Einheiten).
10: Quantitative Bestimmung des MMP-Gehalts mittels ,human active MMPs' (CALBIOCHEM). Die gelatinolytischen Aktivitäten von MMP-Proben mit bekannter Konzentration wurden bestimmt und als Standard zur Quantifizierung der MMPACE-Proben heran gezogen. Die mathematische Funktion der resultierenden Regressionsgeraden diente der Berechnung der MMP-Masse in den Kulturen der Expressionsstämme (DQ^TM Gelatine: 50 μg/ml; Fütterrate: 2 × 1% MeOH/d; Induktionsdauer: 72 h; OD600: 2,5; RFU = Relative Fluoreszenz-Einheiten) Die folgenden Ausführungsbeispiele dienen nur dazu, die Erfindung zu illustrieren. Sie sollen den Gegenstand der Patentansprüche in keiner Weise beschränken.
Beispiele:
Die Konzentrationsangaben mM beziehen sich auf mMol/l.
1. Test verschiedener Wirtszellen
Escherichia coli
Zur Transformation der Expressionsplasmide pET24-MMP-HIS mittels Elektroporation wurden die Klonierungsarbeiten bereits mit dem E. coli-Expressionsstamm BL21 (DE3) durchgeführt. Der entsprechende Ligationsansatz wurde für 40 min gegen 10% Glycerin dialysiert und danach zu den elektrokompetenten Zellen gegeben. Die Elektroporation erfolgte bei 200 0, 2,48 kV/cm und 25 μF. Die Zellen wurden in in 1 ml SOC-Medium aufgenommen und für 60 min bei 37°C und 220 rpm in einem Reaktionsgefäß inkubiert. Die Selektion erfolgte auf LBKan-Agarplatten über Nacht bei 37°C. Anschließend wurden mehrere Klone angeimpft und einem Kontrollverdau unterzogen.
Zur Induktion der Expression wurden Erlenmeyerkolben mit LBKan-Medium 10%ig mit frischen Über-Nacht-Kulturen positiv identifizierter Klone beimpft; die Induktion erfolgte durch Zugabe von IPTG in einer Endkonzentration von 0,1 mM. Die Kulturen wurden bei unterschiedlichen Temperaturen (20°C, 25°C, 30°C, 37°C) unter Schütteln inkubiert, um mögliche temperaturbedingte Variationen in der Expression verfolgen zu können.
Nach 24 h wurden die Zellen einer 50 ml-Kultur durch Zentrifugation (5 min bei 13.000 rpm) geerntet, in 10 ml Einding-Puffer aufgenommen und durch Ultraschall aufgeschlossen. Die nachfolgende Zentrifugation bei 15.000 rpm für 15 min trennte die Zelltrümmer der Pellet-Fraktion vom Rohextrakt, der die löslichen Proteine enthielt. Zur Überprüfung der MMP-Produktion wurden die Komponenten beider Fraktionen (15 μl) in einem SDS-Gel getrennt und eine Coomassie-Färbung durchgeführt.
Die Proben zeigten bei allen Temperaturen identische Muster. In sind vergleichend die Expressionsergebnisse für MMP-2 und MMP-9 jeweils bei 30°C und 37°C dargestellt. Bei der Pellet-Fraktion von MMP-2 ist eine deutliche Protein-Expression im Bereich von ca. 72 kDa zu erkennen, was der Größe des Volllängen-MMP-2-Proteins entspricht. Das Fehlen einer entsprechenden Bande im Rohextrakt legt die Vermutung nahe, dass das Protein als unlösliche Inclusion Bodies vorliegt. Die MMP-9-Proben zeigten keinerlei Expression im Bereich der erwarteten Größe (92 kDa).
Ergänzende Versuche zur Expression bei unterschiedlichen IPTG-Konzentrationen und Temperaturen sowie mit N-terminal (um die Prodomäne) verkürzten MMPs führten zu identischen Ergebnissen. Erwartungsgemäß waren die Gelatinasen nicht mittels Zymographie nachweisbar und lagen somit im Falle von MMP-2 nicht als funktionale Enzyme vor (Ergebnisse nicht gezeigt).
Kluyveromyces lactis
Die Untersuchungen bei K. lactis beschränkten sich aus Praktikabilitätsgründen zunächst ausschließlich auf MMP-9. Für den Fall einer erfolgreichen Expression waren ergänzende Experimente für MMP-2 geplant.
Die Transformation in den K. lactis-Stamm GG799 erfolgte mittels des Protein Expression Kits von NEW ENGLAND BIOLABS. Da der Vektor pKLAC1 erfahrungsgemäß dazu neigte, die Kopienzahl in E. coli mit der Zahl der Überimpfungen zu verringern, wurde das Plasmid frisch in DH5a-Zellen transformiert und die Plasmid-DNA der Über-Nacht-Kultur mittels alkalischer Lyse isoliert. Von dem Isolat wurden 2 μl pKLAC1-MMP-9s mit SacII verdaut, um den Vektor im Bereich des LAC4-PBI-Promotors zu linearisieren. Der Restriktionsansatz wurde über ein Gelextraktions-Kit gereinigt und zur Transformation eingesetzt. 3,75 μl wurden zu 50 μl kompetenter Zellen gegeben und der Ansatz mit 155 μl Yeast Transformation Reagent versetzt. Nach 30 minütiger Inkubation bei 30°C erfolgte für 1 h ein Hitzeschock bei 37°C. Die Zellen wurden auf YPD geshiftet und für 30 min unter Schütteln inkubiert, bevor sie zur Selektion auf YCB-Agarplatten mit Acetamid ausgebracht wurden. Nach 4 d bei 30°C konnten die Klone in Flüssigkultur angeimpft werden.
Zur Expression wurden die Zellen in SC-Gal-Medium bei 30°C für 3 d inkubiert. Nach dem Ernten (15 min bei 8.000 rpm) wurde der Kulturüberstand sterilfiltriert und mittels Ultrafiltration (SARTORIUS Vivaspin 20, 30 kDa) etwa 50fach konzentriert. Nach der Trennung im SDS-Gel wurden die Proteine mittels Western Blot auf eine PVDF-Membran übertragen und immunologisch mittels Anti-MMP-9-Antikörpern (BIOMOL; 1:1.000), die gegen die katalytische Domäne gerichtet waren, colorimetrisch detektiert. Als Negativ-Kontrolle fungierte der Kulturüberstand von GG799 transformiert mit dem pKLAC1-Leervektor.
In keiner der getesteten Proben konnte eine Expression von MMP-9 nachgewiesen werden. Der Blot zeigte außer der Positiv-Kontrolle (Gelatinase 92 kDa, ROCHE) lediglich unspezifische Bindungen im hochmolekularen Bereich. HOFFMANN (Diplomarbeit, Zentrum für Human- und Molekularbiologie, Universität des Saarlandes, 2007) konnte bei weiterführenden Untersuchungen mittels PAS-Färbung eine Glykosylierung der Proteine in diesem Bereich nachweisen. Dies eröffnet die Möglichkeit, dass MMP-9 eventuell in einer stark glykosylierten Form gebildet wurde.
Saccharomyces cerevisiae
Der S. cerevisiae-Stamm SEY6120 wurde mittels der Lithium-Acetat-Methode transformiert.
Zur Expression der rekombinanten Proteine wurden Erlenmeyerkolben mit Ura-d/o-Medium 1%ig mit einer frischen Über-Nacht-Vorkultur beimpft und für 3 d bei 30°C und 220 rpm kultiviert. Das Ernten erfolgte durch Zentrifugation bei 8.000 rpm für 15 min. Die Kulturüberstände wurden durch Filtration von den restlichen Zellen befreit und über Vivaspin Ultrafiltrationseinheiten (SARTORIUS, 30 kDa) konzentriert. Nach Trennung der Proteine in der SDS-PAGE wurde ein Western Blot durchgeführt. Zur Absättigung der Membran wurde diese für 2 h in Blockingpuffer mit 3% Magermilchpulver bei Raumtemperatur geschwenkt. Die Bindung der Anti-MMP-Antikörper (ABCAM, 1:5.000) erfolgte bei 4°C über Nacht. Der anschließenden Inkubation in sekundärem HRP-gekoppeltem Anti-Rabbit-IgG-Antikörper (SIGMA; 1:10.000) für 1 h bei 20°C folgte die Entwicklung der Membran mittels des Chemilumineszenz-Substrats SuperSignal West Dura (PIERCE). Als Negativ-Kontrolle fungierte der Kulturüberstand von SEY6210 mit pFB2-Leervektor; die mitgeführten Positiv-Kontrollen bestanden aus den kommerziell erhältlichen MMP-Isolaten ,MMP-2 human' bzw.,MMP-9 human' (MILLIPORE).
Außer den Positiv-Kontrollen waren keinerlei MMP Signale detektierbar. Auch bei verlängerter Belichtungsdauer zeigte sich keine Veränderung. Die gleichen Untersuchungen wurden zusätzlich parallel für die Saccharomyces cerevisiae-Stämme S86c und BY4742 durchgeführt und führten überall zu dem gleichen Ergebnis. S. cerevisiae scheint somit nicht in der Lage zu sein, sekretorische Formen von MMP-2 oder MMP-9 zu produzieren. KESSLER (Diplomarbeit, Zentrum für Human- und Molekularbiologie, Universität des Saarlandes, 2006) war in der Lage, die Proteine bei der Expression von zellwandverankerten Gelatinase-Formen in Zellfraktionierungs-Untersuchungen nachzuweisen. Die Experimente deuten darauf hin, dass MMP-2 und MMP-9 von S. cerevisiae sehr wohl exprimiert, allerdings nicht sezerniert werden können. Darüber hinaus zeigten die Proben bei den korrespondierenden Zymographien eine nur schwache enzymatische Aktivität Saccharomyces cerevisiae erwies sich daher für MMP-2 und MMP-9 als Expressionswirt ungeeignet.
Schizosaccharomyces pombe
Die Expression sekretorischer MMPs in Schizosaccharomyces pombe wurde in einer ersten Stufe unter Verwendung des Kre1p-Signalpeptids durchgeführt. Da die Funktionalität dieser Sequenz in S. pombe zu diesem Zeitpunkt noch nicht beschrieben war, wurden die Experimente zusätzlich durch eine zweite Versuchsreihe mit K28-Signalsequenz ergänzt.
Die Zellen wurden transformiert und nach 4 Tagen Inkubation bei 30°C in EMM-Leu-d/o-Flüssigmedium mit 5 mg/l Thiamin überführt. Die Kulturen verblieben über Nacht im Schüttler bei 30°C. Am nächsten Tag erfolgte das Animpfen der Hauptkultur in einem Erlenmeyerkolben (4%ig). Nach 24 h Inkubation bei 30°C und 220 rpm wurde die Kultur für 5 min bei 8.000 rpm zentrifugiert und zweimal mit Thiamin-freiem EMM-Leu-d/o-Medium gewaschen, um letzte Reste des reprimierenden Thiamins zu entfernen. Die Induktion der Expression erfolgte 3 d in EMM-Leu-d/o-Medium bei 30°C auf einem Inkubationschüttler.
Zur Gewinnung der Kulturüberstände wurden die Ansätze in Zentrifugationsgefäße überführt und bei 8.000 rpm für 15 min pelletiert. Die Überstände wurden wie bereits für andere Wirte beschrieben sterilfiltriert und eingeengt. Die Proteine wurden nach der SDS-PAGE auf eine PVDF-Membran geblottet und mit Anti-MMP-Antikörpern entwickelt. Für die Versuchsreihe mit Kre1p-Signalsequenz wurden Anti-MMP-AK gegen die katalytische Domäne (BIOMOL), bei K28-Signalpeptid gegen die Hinge-Region (SIGMA) verwendet. Die Bindungszeiten richteten sich nach den Angaben des jeweiligen Herstellers.
Unabhängig von der verwendeten Signal-Sequenz zeigten die Western-Blots weder eine Expression von MMP-2 noch von MMP-9. Ausschließlich die verwendeten Positiv-Kontrollen zeigten eine deutliche Bande in der erwarteten Höhe. Schizosaccharomyces pombe muss somit ebenfalls als Expressionswirt für die Matrix-Metalloproteasen MMP-2 und MMP-9 ausgeschlossen werden.
Zygosaccharomyces bailii
Für die heterologe Expression in Zygosaccharomyces bailii wurden die Stämme ATCC60483 und ATCC36947 verwendet. Die Transformation mit pZ3-ZSS-MMPs erfolgte mittels Elektroporation.
Die Expression erfolgte in einem Erlenmeyerkolben mit synthetischem Z. bailii-Medium, das 4%ig mit einer frischen Über-Nacht-Kultur beimpft wurde. Nach 3 d bei 30°C und 220 rpm wurden die Kulturüberstände sterilfiltriert und konzentriert. Die Trennung der Proteine erfolgte mittels SDS-PAGE und anschließendem Western Blot, der mit Anti-MMP-AK (ABCAM, whole molecule, 1:3.000) mittels Chemilumineszenz entwickelt wurde.
Die Blots aller Z. bailii-ATCC36947-Proben erschienen sowohl für MMP-2 als auch für MMP-9 vollständig leer. Lediglich bei ATCC60483 konnten in der konzentrierten MMP-9-Probe zwei schwache Banden zwischen 60 kDa und 70 kDa ausgemacht werden, bei denen es sich möglicherweise um MMP-9-Abbauprodukte gehandelt haben könnte.
Pichia pastoris
Die Expression in Pichia pastoris fand parallel in den Stämmen GS115 und KM71 aus dem Pichia Expression Kit (INVITROGEN) statt. Beide Stämme unterscheiden sich vor allem bezüglich ihrer Phänotypen bei der Methanolverwertung. GS115 verfügt über zwei funktionale Alkoholoxigenasen AOX1 und AOX2, die einen Mut+-Phänotyp (,methanol utilizing plus') bewirken. Bei KM71 ist, bedingt durch eine aox1::ARG4-Disruption, nur noch das schwächere AOX2-Gen aktiv, weshalb sich durch eine verlangsamte Methanol-Verwertung ein MutS Phänotyp (,methanol utilizing slow') ergibt.
Die Transformation mit dem integrativen Vektor pPIC9-MMPs erfolgte mittels Elektroporation. Der Vektor ermöglicht die Integration an unterschiedlichen Orten im Hefe-Genom über drei verschiedene Mechanismen. Eine Vektorlinearisierung mit BglII führt zu einer Integrationskassette mit flankierenden Fragmenten des AOX1-Promotors (am 5'-Ende) bzw. des AOX1-Gens (am 3'-Ende). Durch das doppelte Crossover-Ereignis bei der Genom-Integration kommt es bei GS115 zu einer Änderung im Phänotyp der Methanolverwertung (Mut+ zu MutS), da das gesamte AOX1-Gen durch die Expressionkassette ersetzt wird. Wird der Vektor mit SacI im Bereich des AOX1-Promotors geschnitten, kommt es bei der Insertion nur zu einem einfachen Crossover, wodurch der Phänotyp erhalten bleibt. Die experimentellen Versuche der vorliegenden Arbeit wurden ausschließlich über Integrationen des dritten Typs durchgeführt: Linearisierung mit StuI oder SalI schneidet das im Vektor enthaltene HIS4-Gen, welches mit einem einfachen Crossover-Ereignis durch homologe Rekombination im his4-Lokus des Chromosoms integriert werden kann. Dies fährt zu zwei Kopien des Histidinol-Dehydrogenase-Gens, wovon eine weiterhin in einer mutanten, die andere durch Komplementierung des mutierten chromosomalen his4-Genabschnitts in der Wild-Typ-Form vorliegt. Die Hefe wird dadurch phänotypisch prototroph für Histidin und kann auf entsprechenden Minimalmedien selektiert werden. Da die Integration keine Veränderung im Bereich des AOX1-Gens bedingt, entspricht die Ausprägung des Methanolverwertungs-Phänotyps dem des ursprünglich verwendeten Stammes (Mut+ für GS115 und MutS für KM71).
Zur Transformation der Expressionsplasmide pPIC9-MMPs wurden diese für 5 h mit StuI restringiert und der Ansatz anschließend mittels des innuPREP Gel Extraction Kits (ANALYTIK JENA) gereinigt. Für die Elektroporation wurden jeweils 5 μl des Reisolats eingesetzt.
Zr Expression wurden große Kolonien von der Agarplatte aufgenommen und in 5 ml His-d/o-Flüssigmedium überführt. Nach 24 h Inkubation bei 30°C und 220 rpm wurden 50 ml BMG (100 mM Na-Phosphatpuffer; pH 7,0) 4%ig mit der Vorkultur beimpft und 24 h bei 28°C und 165 rpm kultiviert. Das anschließende Überführen in induzierendes Medium erfolgte durch Zentrifugation der Kultur für 4 min bei 8.000 rpm (bei 4°C) und anschließendes Resuspendieren der Zellen in BMM (100 mM Na-Phosphatpuffer; pH 7,0). Die Kulturen wurden für 3 d bei 28°C und 165 rpm geschüttelt und dabei täglich mit 0,5% Methanol gefüttert. Die Kulturüberstände wurden sterilfiltriert und mittels Vivaspin-Ultrafiltrationseinheiten (SARTORIUS) konzentriert. Nach der SDS-PAGE wurde ein Western Blot durchgeführt und mit Anti-MMP-Antikörpern (BIOMOL, katalytische Domäne, 1:1.000) colorimetrisch detektiert. Wie in gezeigt, ergaben sich deutliche Banden auf der erwarteten Höhe der Gelatinasen, die bereits im nicht eingeengten Kulturüberstand nachweisbar waren.
Zur Überprüfung der biologischen Aktivität der MMPs wurden korrespondierende Zymographien angefertigt. Bei der Coomassie-Färbung erschien die intakte (nicht hydrolysierte) Gelatine im Gel farbig, wodurch die Bereiche mit gelatinolytischer Aktivität als farblose Areale sichtbar wurden. Die Ergebnisse demonstrieren die Fähigkeit von Pichia pastoris, MMP-2 und MMP-9 in enzymatisch aktiver Form zu sezernieren, was sie zu einem vielversprechenden Kandidaten zur heterologen Expression von Gelatinasen macht. Generell erschien GS115 als der Stamm mit der besseren Sekretionsleistung (vgl. HOFFMANN, loc. cit, 2007).
Zusammenfassend ergaben sich folgende Rückschlüsse bei der Identifikation des optimalen Expressionswirts für die Matrix-Metalloproteasen MMP-2 und MMP-9: Die Hefegattungen Kluyveromyces, Saccharomyces und Schizosaccharomyces waren nicht in der Lage, die humanen Gelatinasen heterolog in sezernierter Form zu exprimieren. Ein Stamm von Zygosaccharomyces zeigte ein Signal für MMP-9, jedoch in einer zu niedrigen Proteingröße. Sie schieden damit als Expressionswirte bei den weiteren Untersuchungen aus. Escherichia coli war in der Lage, MMP-2 zu exprimieren, jedoch nur in einer enzymatisch inaktiven Form. MMP-9 wurde auch von E. coli nicht gebildet.
Pichia pastoris war als einziger der getesteten Organismen fähig, MMP-2 und MMP-9 in einer den Anforderungen entsprechenden Qualität als biologisch aktive Enzyme zu sezernieren. Alle folgenden Untersuchungen stützten sich daher ausschließlich auf das Pichia pastoris-Expressionssystem.
2. Herstellung des Expressionsplasmids mit Zellwandanker
Vergleichende Untersuchungen zur Zellwandverankerung in P. pastoris beinhalteten die S. cerevisiae-Zellwandproteine Cwp2p, Pir1p und Sed1p. Cwp2p und Sed1p verfügen über ein intramolekulares GPI-Ankersignal, das nach dem Transport in das ER durch eine Transamidase entfernt und durch einen GPI-Anker ersetzt wird, der primär eine Immobilisierung in der Plasmamembran des Organismus bewirkt (AMTHAUER et al., 1993, Proc Natl Acad Sci USA, 90: 3973–3977). Nachfolgend werden die Proteine über noch ungeklärte Wege kovalent in der Zellwand verankert. Pir1p verfügt anstelle eines GPI-Signals über interne Sequenz-Wiederholungen (Pir = ,Protein with internal repeats'), die nach der Sekretion die Bindung an μ-1,3-Glukane der Zellwand vermitteln (SUMITA et al., 2005, Eukaryot Cell, 4: 1872–1881). Cwp2p spielt als Haupt-Mannoprotein bei S. cerevisiae eine zentrale Rolle bei der Vermittlung der Zellstabilität (VAN DER VAART et al., 1995, J Bacteriol, 177: 3104–3110). Bisher ist noch keine funktionale Anwendung in P. pastoris beschrieben worden. Das Gen hat eine Größe von 279 bp und wurde daher 5'-terminal nur um die ersten 63 bp verkürzt, die für die proteineigene ER-Signalsequenz kodieren (vgl. ). Pir1p findet sich in der Zellwand vor allem in den Chitin-Ringen der Sprossnarben (SUMITA et al., loc. cit.). Neben seiner intrazellulären Funktion bei der mitochondrialen Translokation von Apn1p, einem DNA-Reparaturprotein, spielt es eine Rolle bei der Vermittlung einer Toleranz gegenüber Hitzeschock (TOH E et al., 1993, Yeast 9: 481–494; VONGSAMPHANH et al., 2001, Mol Cell Biol 21: 1647–1655). WANG et al. entwickelten damit 2008 ein neuartiges Zelloberflächen-Expressionssystem, mit dem sie in der Lage waren, eGFP auf der Oberfläche von P. pastoris zu verankern. Sie konnten zeigen, dass eine C-terminale Verkürzung des Proteins eine homogenere Verteilung auf der Zelloberfläche bewirkt. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde in der vorliegenden Arbeit das Gen PIR1 3' terminal um 363 bp auf 663 bp verkürzt (Ursprungslänge: 1.026 bp). Am 5'-Ende wurde zusätzlich die für die Signalsequenz kodierende Region entfernt, wodurch sich eine finale Länge von 606 bp ergab. Sed1p ist ein Hauptzellwand-Protein in der stationären Wachstums-Phase von Hefezellen und dabei maßgeblich für die Resistenz gegen lytische Enzyme, wie Zymolyase o. ä., verantwortlich (SHIMOI et al., 1998, J Bacteriol 180: 3381–3387). Eine Verwendung als Zellwandanker in P. pastoris ist bisher nicht beschrieben worden. Zur praktischen Anwendung bei der Esterase-Verankerung wurde das 1.017 bp große Gen am 5' Ende um die natürliche ER-Signalsequenz auf 960 bp verkürzt und zur Klonierung eingesetzt.
Zur Amplifikation der Ankersequenzen wurde die genomische DNA aus 5 ml einer frischen Über-Nacht-Kultur von S. cerevisiae BY4742 bzw. S86c isoliert und 2 μl der DNA-Lösung als Template bei der PCR eingesetzt. Die DNA-Abschnitte erhielten dabei eine BlnI-Schnittstelle am 5'- und eine NotI-Schnittstelle am 3'-Ende. Anschließend wurden sie in den Vektor pSTBlue-1 kloniert und sequenziert. Zur Klonierung in das Expressionsplasmid wurden der Vektor pPIC9 und die Plasmid-DNA mutationsfreier Anker-Klone mit BlnI/NotI restringiert und danach ligiert. Die PCR zur Produktion des Esterase-Gens fand unter Verwendung des Template-Plasmids pFB2 EstA statt. Der 5'-Primer war dabei so gestaltet, dass er eine XhoI- und eine EcoRI-Schnittstelle getrennt von einer Signal-Cleavage-Region enthielt; 3'-terminal wurde eine BlnI-Restriktionsstelle angefügt. Nach Klonierung in pSTBlue-1 und anschließender Sequenzierung wurde das Gen als XhoI/BlnI-Fragment in die einzelnen Anker-Plasmide ligiert. Durch die Struktur des 5'-Terminus führte dies zu einer Entfernung der ursprünglich in der MCS des Vektors enthaltenen SnaBI-Schnittstelle, wodurch die resultierenden Proteine nach finaler Prozessierung eine N-terminale Verlängerung um ausschließlich zwei Aminosäuren (Glu-Phe) vorwiesen. Die Esterase-Expressionsplasmide wurden entsprechend der verwendeten Ankersequenzen als pPIC9-CWP2-EstA, pPIC9-PIR1-EstA und pPIC9-SED1-EstA bezeichnet. Sie wurden so gestaltet, dass die Zellwandverankerung beliebiger Genprodukte (wie z. B. MMPs) durch einen einfachen Austausch des Esterase-Gens über die Schnittstellen EcoRI/BlnI möglich war.
3. Test der verschiedenen Zellwandanker
Die Esterase A-Expressionsplasmide wurden mit StuI oder SacII linearisiert, gereinigt und standardmäßig durch Elektroporation in P. pastoris transformiert. Zur Expression wurden die Zellen für 24 h in einem Erlenmeyerkolben mit 25 ml BMG und anschließend für 72 h in 25 ml BMM-Medium kultiviert (28°C, 165 rpm); die Fütterrate betrug dabei 2 × 0,5% Methanol pro Tag.
Zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität wurde die OD600 der Zellen in einer Küvette auf 0,32 eingestellt und die Suspension mit 4,5 mM p-Nitrophenylacetat versetzt. Dieses Substrat wurde durch die auf der Zelloberfläche verankerten Esterasen zu p Nitrophenol umgesetzt. Die Zunahme der Absorption bei λ = 405 nm konnte spektralphotometrisch bei neutralem pH und 32°C über einen Zeitraum von 2 min gegen eine zellfreie Referenz bestimmt werden. Als Negativ-Kontrolle diente der jeweilige Pichia-Stamm transformiert mit dem Leervektor pPIC9.
Zur Auswertung der Daten wurden die Absorptionen von mindestens drei Messreihen gemittelt und graphisch gegen die Zeit aufgetragen. Die Steigung λ A/min der resultierenden Geraden beschreibt die Substratumsetzung pro Zeiteinheit und wurde als Maß für die Effektivität der Esterase-Verankerung herangezogen. Ein Vergleich der Steigungen der unterschiedlichen Zellwand-Proteine ließ Rückschlüsse auf deren Eignung als P. pastoris-Zelloberflächen-Anker zu.
zeigt die Ergebnisse der Aktivitätsmessungen getrennt für die beiden Stämme GS115 und KM71. Jede Graphik enthält zusätzlich eine Messreihe früherer Untersuchungen der Esterase A-Aktivität in einem etablierten S. cerevisiae-Zellwandanker-System, was eine anschauliche Einordnung der aktuellen Messergebnisse ermöglichen soll. Im S. cerevisiae-Stamm BY4742 wurde die Esterase A mittels eines Cwp2p-Anken auf der Oberfläche immobilisiert und die Messungen unter gleichen Parametern durchgeführt. Es ist zu beachten, dass die S. cerevisiae-Zellen im Gegensatz zu den Pichia-Proben unter optimierten Bedingungen in einem Bioreaktor kultiviert wurden.
Bestimmung der Esterase-Aktivität
Volumenaktivität
Auf der Basis der Ergebnisse des enzymatischen Aktivitätstests war es möglich, die Volumenaktivitäten der Testkulturen zu bestimmen. Eine ,Unit (U)' wurde definiert als die Menge an Esterase A, die unter den beschriebenen Parametern benötigt wird, um 1 μMol p Nitrophenol pro min freizusetzen. Zur Ermittlung des molaren Extinktionskoeffizienten e wurde eine p Nitrophenol-Verdünnungsreihe mit Endkonzentrationen von 0,002 mM bis 0,225 mM erstellt und deren Absorptionswerte graphisch gegen die jeweilige Konzentration aufgetragen. Eine Regression der erhaltenen Geraden ergab den molaren Extinktionskoeffizienten e = 3,7283.
Die Berechnung der Volumenaktivität erfolgte nach der Formel:
Trotz einer ubiquitär vorhandenen enzymatischen Aktivität, traten abhängig von der gewählten Stamm-Anker-Konstellation signifikante Unterschiede im Vergleich der Einzel-Aktivitäten auf. In sind die Volumenaktivitäten der getesteten Konstrukte dargestellt; zur besseren Vergleichbarkeit wurden alle Volumenaktivitäten für Zellsuspensionen der OD600 = 10 bestimmt. Der Cwp2p-Anker zeigte in beiden Stämmen eine vergleichbare Aktivität (GS115: 251 mU/ml; KM71: 302 mU/ml) und stellte sich in Relation zu den übrigen als der ineffektivste heraus. Die Verankerung mit Pir1p lag bei KM71 mit 407 mU/ml etwa im Bereich des Cwp2p-Ankers. Bei GS115 konnte mit Pir1p hingegen eine fast doppelt so hohe Aktivität (805 mU/ml) verzeichnet werden, eine Verdreifachung der Effektivität des Cwp2p-Ankers in diesem Stamm. Die effektivsten Immobilisierungen wurden in beiden Stämmen mit dem Zellwandprotein Sed1p erreicht. Mit 1.599 mU/ml lag die Aktivität im Stamm GS115 zweimal so hoch wie bei Pir1p und sechsmal so hoch wie bei Cwp2p. Eine außerordentlich hohe Esterase-Aktivität konnte bei KM71-Zellen mit Sed1p-Anker erreicht werden. Die bereits in subjektiv erkennbare Immobilisierungs-Effizienz erreichte eine Volumenaktivität von 3.169 mU/ml und lag somit zweimal höher als der gleiche Anker im GS115-Stamm; im Vergleich zum Cwp2p-Anker konnte die Effektivität um das Zehnfache gesteigert werden. Selbst die unter optimalen Bedingungen kultivierte S. cerevisiae-Probe erreichte nur ein Sechstel dieser Aktivitätswerte.
Spezifische Aktivität
Der Vergleich der bisherigen Messergebnisse basierte auf der Annahme, dass beide Pichia-Stämme bei gleicher OD600 über eine vergleichbare Zellzahl und somit Gesamtproteinmenge verfügen. Um auszuschließen, dass die gemessenen Aktivitätsunterschiede auf abweichende Gesamtmengen an Zellprotein zurückgeht und um eine spätere Vergleichbarkeit der Zellankersysteme in z. B. anderen Hefe-Gattungen zu ermöglichen, wurden die Aktivitäten in Relation zur Proteinmenge dargestellt. Zur Ermittlung der Gesamt-Proteinmenge wurden BMG-Kulturen von GS115 und KM71 mit einer OD600 von ca. 50–60 verwendet. Die Zellen wurden mittels Glasperlen aufgeschlossen und der Ansatz danach mit H2O dest. wieder auf das ursprüngliche Volumen aufgefüllt.
Der Proteingehalt einer 1:1-Verdünnung dieser Lösung wurde mittels BCA Protein Assay Kit (PIERCE) bestimmt. Als Referenzwerte dienten parallel gemessene BSA-Standards (25 1.000 μg/ml), aus denen später eine Regressionsgerade erstellt und die Proteinkonzentrationen der Proben errechnet wurden.
Umgerechnet auf die in der Küvette vorhandene optische Dichte von 0,32 ergaben sich für GS115: 2,18 μg/ml Protein, für KM71: 2,17 μg/ml. Die beinahe identischen Werte lassen demnach einen Vergleich der beiden Stämme auch auf Ebene der Volumenaktivität zu.
4. Zellwandverankerung der MMPs
Nachdem Sed1p für Esterase A als geeigneter Zellwandanker in P. pastoris identifiziert worden war, wurde dessen Anwendbarkeit bei der Immobilisierung der Matrix-Metalloproteasen untersucht. Hierzu wurden geeignete Expressionsplasmide hergestellt und die Zelloberflächen-Expression der rekombinanten Proteine fluoreszenzmikroskopisch nachgewiesen.
Herstellung der Expressionsplasmide pMMPACE II und IX
Die Vektoren zur Expression zellwandverankerter MMPs wurden analog zu denen der Esterase-Expression gestaltet. Hierzu wurde durch Restriktion mit EcoR/BlnI das Esterase A-Gen aus pPIC9-SED1-EstA entfernt und durch das jeweilige MMP-Gen aus dem Vektor TOPO-MMP (EcoRI/XbaI) ersetzt. Die Ligation der Fragmente wurde über die kompatiblen überhängenden Enden von XbaI und BlnI ermöglicht, was zur Zerstörung beider Erkennungssequenzen führte. Die resultierenden Proteine besaßen nach vollständiger Prozessierung einen um vier Aminosäuren (Tyr Val Glu Phe) verlängerten N Terminus an ihrer Prodomäne und waren an ihrem C Terminus über zwei weitere Aminosäuren (Ser-Arg) mit Sed1p fusioniert. Die MMP-Expressionsplasmide erhielten die Bezeichnungen pMMPACE II (MMP 2) und pMMPACE IX (MMP 9).
Die Plasmide wurden mit StuI linearisiert und beide Pichia-Stämme mittels Elektroporation transformiert.
Indirekte Immunfluoreszenz
Zum fluoreszenzmikroskopischen Nachweis einer erfolgreichen MMP-Verankerung auf der Zelloberfläche von P. pastoris wurden die auf His-d/o-Platten selektierten KM71-Klone in His-d/o-Flüssigmedium angeimpft, über Nacht bei 30°C geschüttelt und von dieser Lösung eine BMG-Kultur im Erlenmeyerkolben 4%ig beimpft. Nach 24 h bei 28°C (165 rpm) erfolgte das Shiften auf BMM-Medium (100 mM Na-Phosphatpuffer, pH 7,0). Die Hauptkultur wurde 72 h bei 28°C und 165 rpm inkubiert und zweimal täglich mit 1% Methanol gefüttert.
Zur Bindung des primären Anti-MMP-Antikörpers (ABCAM) wurde dieser in einer Verdünnung von ca. 1:25 appliziert. Nach einer Stunde Inkubation bei 20°C auf einem Drehrad wurde nach mehreren Waschschritten FITC-markierter Anti-Rabbit-IgG-AK (SIGMA) in der Verdünnung 1:15 als sekundärer Antikörper zugegeben und der Ansatz weitere 45 min bei 20°C im Dunkeln gedreht. Nach weiteren Waschschritten wurde die Fluoreszenz der Hefe-Zellen fluoreszenzmikroskopisch (λ A = 480 nm, λ E > 510 nm) dokumentiert und die Bilder einem digitalen Schwarzabgleich und einer Unschärfereduktion unterzogen. Als Negativ-Kontrolle dienten die jeweils mit pPIC9-Leervektor transformierten Hefe-Stämme, die sowohl mit Anti-MMP 2- als auch Anti-MMP 9-Antikörpern behandelt und auf die gleiche Weise dokumentiert wurden. Die Negativ-Kontrollen zeigten weder nach Anti-MMP 2- noch nach Anti-MMP 9-AK-Behandlung eine Fluoreszenz. Bei den MMPACE Zellen war die Markierung der MMPs in der Zellwand als deutlich fluoreszierender Ring erkennbar. Dabei erschien die Fluoreszenz von KM71 mit pMMPACE Π subjektiv um einiges stärker als die von KM71 mit pMMPACE IX und trat auch bei mehr Zellen auf. Wiederholungen der Fluoreszenz-Mikroskopie zu späteren Zeitpunkten führten zu identischen Resultaten. Die Ergebnisse veranschaulichen die erfolgreiche Verankerung der humanen Gelatinasen auf der Zelloberfläche von P. pastoris.
Zusammenfassend konnten im Rahmen der Experimente zur Zellwandverankerung in P. pastoris drei Zellwandanker bezüglich ihrer Immobilisierungs-Effektivität untersucht werden. Die Zelloberflächen-Expression einer bakteriellen Esterase ermöglichte eine Quantifizierung und somit einen Vergleich der unterschiedlichen Ankersequenzen. Dabei konnte mit Sed1p ein für P. pastoris neuartiger Zellwandanker identifiziert werden, dessen Effizienz die bisher bekannten Ankersysteme um ein Vielfaches übertrifft. Durch die Fusion dieses Zellwandproteins mit dem C-Terminus der humanen Gelatinasen A und B konnten diese auf der Zelloberfläche von P. pastoris verankert und mittels indirekter Immunfluoreszenz-Mikroskopie dargestellt werden.
Um festzustellen, ob die Enzyme in einer biologisch aktiven Form vorhanden waren und für die Etablierung des angestrebten Testsystems verwendet werden konnten, bedurfte es nachfolgend eines geeigneten MMP-Aktivitäts-Assays.
5. Validierung des Gelatinase-Assays
Da die praktische Anwendung des Bioassays die qualitative Testung und den quantitativen Vergleich von Hemmstoffen gegen Matrix-Metalloproteasen zum Ziel hatte, wurde abschließend die Funktionalität des Testsystems anhand eines kommerziell erhältlichen MMP-Inhibitors verifiziert. Als allgemeiner MMP-Hemmstoff diente der Metallchelator 1,10 Phenanthrolin. Der Inhibitor wurde in einer Konzentrationsreihe von 1 mM bis 0,063 mM mit MMPACE-Zellen versetzt und die Rest-Aktivitäten gemessen. Die Steigungen der linearen Phasen der Messkurven wurden anschließend graphisch gegen die 1,10 Phenanthrolin-Konzentration aufgetragen (vgl. ). Die Graphik bestätigte für beide MMPs einen kausalen Zusammenhang zwischen der Steigerung der Hemmstoff-Konzentration und der Verminderung der gelatinolytischen Aktivität im Messansatz. MMP 2 zeigte bei einer Konzentration von ca. 0,06 mM Phenanthrolin eine Restaktivität von 50%; bei Konzentrationen > 0,25 mM wurden die Gelatinasen fast vollständig gehemmt. Durch die an sich niedrigere Grundaktivität von MMP 9 erfolgte dessen vollständige Hemmung bereits ab Inhibitor-Konzentrationen > 0,1 mM. Die Funktionalität des Testsystems konnte somit erfolgreich validiert werden und erlaubt die praktische Anwendung in der Inhibitor-Forschung.
Im Rahmen einer fächerübergreifenden Kooperation mit dem Lehrstuhl für Organische Chemie der Universität des Saarlandes (Prof. Dr. U. KAZMEIER) wurden erste Experimente zur praktischen Verwendung des Testsystems durchgeführt. Die Entwicklung neuartiger Hemmstoffe befand sich zum aktuellen Zeitpunkt noch in einem Zwischenstadium, weshalb nur zwei Intermediate auf ihre Wirksamkeit getestet werden konnten. Die Darstellung der Carboxylat- bzw. Hydroxamat-Inhibitoren MP 137 und MP 146 basierte auf der Strukturoptimierung eines funktionalen Gelatinase-Inhibitors. Der MMPACE-Assay konnte einen qualitativen Nachweis der Wirksamkeit der Inhibitoren erbringen. Durch den unpolaren Charakter und die somit sehr schwache Löslichkeit der Verbindungen war jedoch keine Quantifizierung der Inhibitor-Wirkung möglich (Daten nicht gezeigt).
6. Quantifizierung der MMP-Aktivität der Wirtszellen
Die Immobilisierung der MMPs auf der Zelloberfläche erschwerte eine direkte Bestimmung des Proteingehalts und der relativen MMP-Aktivität. Daher erfolgte die Quantifizierung indirekt über einen Vergleich mit den Messdaten bekannter MMP-Konzentration.
Als Standards für die Bestimmung der vorhandenen MMP-Konzentration dienten in Säugerzellen rekombinant hergestellte Gelatinasen, die zuvor mit APMA aktiviert und gereinigt worden waren (,human active MMP 2 bzw. 9', CALBIOCHEM). Zur Erstellung von Eichgeraden wurden die gelatinolytischen Aktivitäten in Verdünnungsstufen von 400 ng/ml bis 12,5 ng/ml bestimmt (leere Rauten) und die Steigungen der linearen Kurvenabschnitte graphisch gegen die Konzentration aufgetragen (siehe ). Um den möglichen Einfluss der Zellen auf das Messergebnis zu berücksichtigen, wurden die Verdünnungsstufen in 1 × Reaction Buffer mit einer KM71-Negativ-Kontrolle (OD600 = 2,5; pPIC9-Leervektor) erstellt. Aus den mathematischen Funktionen der Regressionsgeraden ließ sich anschließend die jeweilige MMP-Konzentration in den mitgeführten MMPACE-Proben (gerillte Rauten) berechnen. Obwohl die Aktivitäten der kommerziell erworbenen ,active MMP 2'-Proben bei gleichen Konzentrationen etwa um den Faktor 6,7 höher lagen als bei ,active MMP 9', wurden bei der Quantifizierung der MMPACE-Stämme nahezu identische Ergebnisse erhalten. Bei der im Messansatz eingestellten OD600 von 2,5 konnte für MMP 2 eine Konzentration von 147 ng/ml, bei MMP 9 von 142 ng/ml errechnet werden. Umgerechnet auf die Zellzahl des ursprünglichen Kulturmediums (OD600 ~ 80) liegt die Masse der aktiven MMPs für beide Stämme bei über 4,5 mg/l Kulturmedium. Die getesteten Proben waren 72 h induziert und vorher nicht aktiviert worden.
Basierend auf diesen Daten, wurde am Beispiel von MMP 2 die Anzahl der auf der Zelloberfläche verankerten Enzyme errechnet. Ausgehend von einem Molekulargewicht von 66.000 g/ml ergab sich für 1 ml einer Suspension der OD600 = 1 (mit einer Masse von 147 ng/2,5 = 58,8 ng = 5,88 × 10-8 g) eine Molekülzahl von 8,9 × 10–13 Mol = 5,4 × 1011. Bei einer angenommenen Zahl von 107 Zellen pro ml bei OD600 = 1 ergibt sich somit ein Wert von 5,4 × 104 MMP-Molekülen pro Zelle.

Claims

Nukleinsäure, die ein Fusionsprotein kodiert, das eine Aminosäuresequenz gemäß einer der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3, sowie eine Matrix-Metalloprotease umfasst.
Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, wobei die Matrix-Metalloprotease von einer Nukleinsäuresequenz kodiert wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) Nukleinsäuresequenz wie in SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 5 gezeigt; b) Nukleinsäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO:7 gezeigt kodiert; c) Nukleinsäuresequenz, die zumindest 70% identisch ist zu einer Nukleinsäuresequenz nach a) und b) und MMP-Aktivität aufweist; und d) Nukleinsäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz kodiert, die zumindest 70% identisch zu einer Aminosäuresequenz ist, die von einer Nukleinsäuresequenz nach a), b) oder c) kodiert wird und MMP-Aktivität aufweist.
Vektor, der eine Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2 enthält.
Vektor nach Anspruch 3, wobei der Vektor der Pichia-pastoris-Expressionsvektor pPIC9 ist.
Polypeptid, das von einer Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2 kodiert wird.
Wirtszelle, die eine Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2 enthält.
Wirtszelle nach Anspruch 6, wobei sie eine Zelle der Hefe Pichia pastoris ist.
Verwendung der Wirtszelle nach einem der Ansprüche 6 oder 7 zur Identifizierung oder Charakterisierung von Inhibitoren von Matrix-Metalloproteasen.
Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung von Inhibitoren von Matrix-Metalloproteasen bestehend aus den Schritten a) In Kontakt Bringen des Inhibitors mit einer Wirtszelle, die das Polypeptid nach Anspruch 5 umfasst; und b) Bestimmung der Aktivität der Matrix-Metalloprotease und Vergleich mit einer Referenz, wodurch der Inhibitor identifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei als Referenz die Aktivität der Matrix-Metalloprotease dient, die für eine Wirtszelle bestimmt wurde, die nicht mit dem potentiellen Inhibitor in Kontakt gebracht wurde.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei eine Aktivität der MMP, die in Schritt b) bestimmt wurde und geringer ist als die Referenz, indikativ für einen Inhibitor ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei die Wirtszelle die Wirtszelle nach Anspruch 6 oder 7 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei die Matrix-Metalloprotease-Aktivität über die beim Abbau von Fluorescein-markierter Gelatine induzierte Fluoreszenz bestimmt wird.