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Die
vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet von zellbasierten Testsystemen.
Insbesondere betrifft sie eine Wirtszelle, die Matrix-Metalloproteasen
exprimiert, die in ihrer Zellwand verankert sind. Die vorliegende Erfindung
betrifft auch die Verwendung besagter Wirtszelle in einem zellbasierten
Testsystem zur Untersuchung der Aktivität von Matrix-Metalloproteasen
und zur Charakterisierung von Inhibitoren der Matrix-Metalloproteasen.
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Mehrzellige
Gewebe bestehen aus einem komplexen extrazellulären Bereich,
der in seiner Gesamtheit als Extrazelluläre Matrix (EZM)
bezeichnet wird. Hauptbestandteil der EZM ist Kollagen, ein 300
nm langes, 1050 Aminosäuren umfassendes Protein, das besonders
reich an Glycin, Prolin und Hydroxyprolin ist. Ein einzelner Kollagenstrang
bildet eine linksgängige Helix. Drei derartige Stränge
lagern sich zu einer rechtsgängigen Tripelhelix, dem Tropokollagen,
zusammen. Aus diesem Tropokollagen entstehen Kollagenfibrillen,
die sich ihrerseits wieder zu Kollagenfasern zusammenlagern. Ferner
enthält die EZM Proteoglykane. Diese sind stark glykosylierten
Proteine, deren negativ geladene Seitenketten große Mengen
an Wasser binden. Dadurch erhält die EZM ihr Volumen und
ihre gelartige Beschaffenheit. Schließlich enthält
die EZM noch Multiadhäsionsproteine die einerseits die
verschiedenen Komponenten der EZM untereinander vernetzen, andererseits aber
auch die Zellen mit der EZM vernetzen.
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Die
Bedeutung der extrazellulären Matrix geht über
ihre Funktion als „Zellleim” und Wasserspeicher hinaus.
Die EZM unterliegt einem dynamischen Gleichgewicht aus Auf- und
Abbau. Die Struktur der EZM beeinflusst Prozesse wie Wundheilung
oder die Neubildung von Blutgefäßen.
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Eine
entscheidende Rolle für die Struktur der EZM spielt die
Aktivität von Matrix-Metallproteasen (MMPs). Das Wechselspiel
dieser Enzyme und ihrer Inhibitoren der TIMPs (tissue inhibitors
of matrixmetalloproteinases) sorgt für einen geregelten
Umbau der EZM.
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Matrix-Metalloproteinasen
sind eine Gruppe von zinkabhängigen Endopeptidasen, die
in ihrer Gesamtheit alle Bestandteile der extrazellulären
Matrix abbauen können. In fast allen Abteilungen mehrzelliger Lebewesen
ist eine Vielzahl von MMPs beschrieben, unter anderem in den Modellorganismen
Drosophila melanogaster (Llano et al., 2000, J Biol Chem
275: 35987–359885), Caenorhabditis elegans (Wada
et al., 1998, Gene, 211: 57–62), Hydra spec. (Leontovich
et al., 2000, Development, 127: 907–920) und im
Pflanzenreich bei Arabidopsis thaliana (Maidment et al.,
1999, J Biol Chem, 274: 34706–34710). Nach derzeitigem
Kenntnisstand besitzt der Mensch 24 verschiedene MMPs, von denen
7 membrangebunden sind. (Amalinei et al., 2007, Rom J Morphol
Embryol, 48: 323–334; Somerville et al.,
2003, Genome Biol, 4: 216). MMPs sind an einer Vielzahl
von homöostatischen Funktionen wie Wachstum, Gewebereparatur
oder Immunität, aber auch an pathologischen Prozessen wie
Krebs, Arthritis oder Entzündungen beteiligt (Fu
et al., 2008, Semin Cell Dev Biol, 19: 2–13; Gill
and Parks, 2008, Int J Biochem Cell Biol, 40: 1334–1347; Mott
and Werb, 2004, Curr Opin Cell Biol, 16: 558–564).
Insbesondere die Matrix-Metalloproteasen 2 (Gelatinase A, Typ-IV-Kollagenase)
und 9 (Gelatinase B) tragen vielfach zu einer schnellen Invasion,
Metastasierung und Proliferation entarteter Zellen bei, indem sie
die Angiogenese und damit die Bildung tumoreigener Blutgefäße
fördern (Masson et al., 2005, FASEB J, 19: 234–236; Rauvala
et al., 2006, Int J Gynecol Cancer, 16: 1297–1302; Turpeenniemi-Hujanen,
2005, Biochimie, 87: 287–297; Zheng et
al., 2006, Anticancer Res, 26: 3579–3583). Auch
andere Krankheitsbilder sind mit erhöhter Aktivität
von MMPs, insbesondere von MMP-2 und MMP-9 assoziiert, so zum Beispiel
Herz-Kreislauferkrankungen (Dorman et al., 207, Recent Patents
Cardiovasc Drug Discov, 2: 186–194), neurologische Erkrankungen
(Agrawal et al., 2008, Semin Cell Dev Biol, 19: 42–51)
und Alzheimer (Nalivaeva et al., 208, Curr Alzheimer Res,
5: 212–214).
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Aufgrund
der Bedeutung von Matrix-Metalloproteasen bei Krebserkrankungen
gibt es ein großes Interesse an der Entwicklung von MMP-Hemmstoffen.
Da MMPs im gesunden Gewebe nur eine geringe Aktivität aufweisen,
wurde gehofft, dass die Hemmung ihrer Aktivität zu einer
nebenwirkungsarmen Krebstherapie führen könne.
Die erste Generation von MMP-Inhibitoren hat diese Hoffnungen nicht
erfüllt. Es traten gravierende Nebenwirkungen auf, die
zum Teil einen Abbruch der Behandlung erzwangen. Ursächlich
für diese Nebenwirkungen war vermutlich die geringe Selektivität
der verwendeten Inhibitoren. Sie beeinflussten neben MMPs auch Adamalysine
und andere zinkabhängige Enzyme (Fingleton, 2008,
Semin Cell Dev Biol, 19: 61–68). Darüber
hinaus ist die Bindungsstelle für Inhibitoren im aktiven
Zentrum der MMPs hoch konserviert, so dass einzelne Inhibitoren
mehrere unterschiedliche MMPs hemmen. Bisher wurden 60 MMP-Inhibitoren
klinisch getestet. Nur einer davon hat bisher die Zulassung erhalten
(Periostat von CollaGenex Pharmaceuticals) und einige weitere Präparate
befinden sich in der klinischen Prüfung (Rebimastat von
Bristol Myers Squibb, Neovastat von Aeterna Laborstories, Dermostat
und COL-3 von CollaGeneX sowie S3304 von Shinogi). Darüber
hinaus sind einige natürlich vorkommende Hemmstoffe für
MMPs bekannt, z. B. Cucurmin aus Cucurma sp. oder Nobelitin aus
Citrusfrüchten.
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Die
Verwendung von Hefen für die rekombinante Herstellung von
Säugetierproteinen ist allgemein bekannt. Im Gegensatz
zur rekombinanten Produktion dieser Proteine in Prokaryoten, z.
B. Escherichia coli, bieten Hefen den Vorteil, dass die produzierten
Proteine durch Glykosylierungen, Phosphorylierungen oder Disulfidbrückenbindungen
posttranslational modifiziert werden. Diese Modifikationen sind
für die Funktion der Proteine häufig vorteilhaft
oder sogar essentiell. Für die rekombinante Proteinexpression
werden unter anderem Saccharomyces cerevisae, Kluyveromyces lactis,
Zygosaccharomyces bailii, Schizosaccharomyces pombe und Pichia pastoris
verwendet.
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Eine
Verankerung des produzierten Proteins in der Zellwand der Hefe bietet
den Vorteil, dass die Hefezelle z. B. als Ganzzell-Biokatalysator
eingesetzt werden kann. Außerdem ist das zellwandgebundene
Protein häufig stabiler als ein gelöstes Protein
(Schreuder et al., 1996, Trends Biotechnol, 14: 115–120)
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Ein
großes Hindernis bei der Entwicklung neuartiger MMP-Inhibitoren
ist der große Aufwand bei der Gewinnung aktiver Matrix-Metalloproteasen
für die erforderlichen Untersuchungen. Derzeit werden MMPs
aus humanen Tumor-Zelllinien oder Primärzellen isoliert.
Eine rekombinante Herstellung von stabilen MMPs ist deswegen wünschenswert.
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Aufgabe
der Erfindung ist es also, Mittel und Verfahren bereitzustellen,
die eine Herstellung stabiler MMPs ohne die zuvor genannten Nachteile
erlauben. Die Aufgabe wird durch die Ausführungsformen
gelöst, die in den Patentansprüchen und nachfolgend
beschrieben werden.
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Die
Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, die ein Fusionsprotein
kodiert, das eine Aminosäuresequenz gemäß einer
der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3, sowie eine Matrix-Metalloprotease
umfasst.
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Die
Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise
DNA einschließlich cDNA oder RNA. Der Begriff „Nukleinsäure” umfasst
einzelsträngige Nukleinsäuren ebenso wie doppelsträngige.
Darüber hinaus bezieht sich der Begriff auch auf chemisch
modifizierte Nukleinsäuren einschließlich natürlich
vorkommender, beispielsweise durch Glykosylierung oder Methylierung
veränderte Nukleinsäuren oder auch künstlich
veränderte, beispielsweise durch Biotinylierung veränderte
Nukleinsäuren.
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Die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuren sollen
ein „Fusionsprotein” kodieren. Dies ist ein Protein,
das Bestandteile enthält, die aus wenigstens zwei unterschiedlichen
(heterologen) Proteinen stammen. Dadurch erhält das erfindungsgemäße
Fusionsprotein eine Kombination von Eigenschaften, wie sie in keinem
der natürlich vorkommenden Proteine gefunden wird. Das
erfindungsgemäße Fusionsprotein enthält
wenigstens einen Bestandteil, der der Verankerung des Proteins in
der Zellwand der Wirtszelle dient und einen zweiten Bestandteil,
der eine Matrix-Metalloprotease-Aktivität besitzt.
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Der
erste Bestandteil des Fusionsproteins ist eine Aminosäuresequenz,
die eine Zellwandverankerung bei Hefen und ganz besonders bevorzugt
bei Pichia pastoris erlaubt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnten
geeignete Sequenzen aus Zellwandproteinin von S. cerevisae gewonnen
werden. Die Sequenzen sind in den SEQ ID NO: 1 bis 3 gezeigt. Besonders
effektiv kann hierbei die Aminosäuresequenz mit SEQ ID NO:
1 genutzt werden, wie ein Vergleichsversuch mit Esterasefusionsprotein
gezeigt hat (Beispiel 3).
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Ein
zweiter Bestandteil des von der erfindungsgemäßen
Nukleinsäure kodierten Fusionsproteins ist eine Matrix-Metallprotease.
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Matrix-Metalloproteasen
(im folgenden auch als MMPs abgekürzt) sind dem Fachmann
bekannt. Es handelt sich um Endopeptidasen (E. C. 3.4.24), die in
ihrem aktiven Zentrum ein Zn2+-Ion enthalten.
Eine detaillierte Beschreibung der humanen Matrix-Metalloproteasen
kann in Somerville et al., 2003, Genome Biol, 4: 216 gefunden
werden. Vorzugsweise enthält das erfindungsgemäße
Fusionsprotein die Matrix-Metalloprotease 1, MMP-2, MMP-7, MMP-8,
MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17,
MMP-18, MMP-19, MMP-20, MMP-21, MMP-23, MMP-24, MMP-25 MMP-26 oder
MMP-28. Besonders bevorzugt sind MMP-2 und MMP-9.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform ist die Aminosäuresequenz,
die eine Zellwandverankerung erlaubt (d. h. die Aminosäuresequenzen
gemäß SEQ ID NO. 1, 2 oder 3), mit dem Carboxy-Terminus
der Matrix-Metalloprotease fusioniert.
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Besonders
bevorzugt wird der Matrix-Metalloprotease-Bestandteil der erfindungsgemäßen
Nukleinsäure kodiert von einer Nukleinsäuresequenz
ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
- a)
Nukleinsäuresequenz wie in SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO:
5 gezeigt;
- b) Nukleinsäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz
wie in SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 gezeigt kodiert;
- c) Nukleinsäuresequenz, die zumindest 70% identisch
ist zu einer Nukleinsäuresequenz nach a) und b) und die
ein Protein mit MMP-Aktivität kodiert; und
- d) Nukleinsäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz
kodiert, die zumindest 70% identisch zu einer Aminosäuresequenz
ist, die von einer Nukleinsäuresequenz nach a), b) oder
c) kodiert wird und die ein Protein mit MMP-Aktivität kodiert.
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Der
Begriff ”Nukleinsäure” wie er in Zusammenhang
mit der vorliegenden Erfindung benutzt wird umfasst auch Varianten
der oben beschriebenen spezifischen Nukleinsäuren. Besagte
Varianten können Orthologe, Paraloge oder andere Homologe
der Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung repräsentieren.
Die Nukleinsäurevarianten umfassen vorzugsweise eine Nukleinsäuresequenz,
die dadurch charakterisiert ist, dass sie von den oben genannten
spezifischen Nukleinsäuresequenzen, die das erfindungsgemäße
Fusionsprotein kodieren, durch wenigstens eine Nukleotidsubstitution,
Addition und/oder Deletion abgeleitet werden können, wobei
die Nukleinsäurevariante weiterhin eines der oben beschriebenen
Fusionsproteine kodieren soll. Varianten umfassen auch solche Nukleinsäuren,
die eine Nukleinsäuresequenz enthalten, welche mit den
oben genannten spezifischen Nukleinsäuresequenzen hybridisieren
kann, vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungsbedingungen.
Diese stringenten Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und können
in current protocols in molecular biology, John Wiley and
Sons, NY (1989), 6.3.1. bis 6.3.6 gefunden werden. Ein
bevorzugtes Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen
sind Hybridisierungsbedingungen in 6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat
(= SSC) bei ungefähr 45°C, gefolgt von einem oder
mehreren Waschschritten in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 50–65°C.
Der Fachmann weiß, dass diese Hybridisierungsbedingungen
abhängig von der Art der Nukleinsäure und beispielsweise der
Anwesenheit organischer Lösungsmittel hinsichtlich der
Temperatur und Konzentration des Puffers variieren können.
Beispielweise variiert die Temperatur unter „Standardhybridisierungsbedingungen” abhängig
von der Art der Nukleinsäure zwischen 42°C und
58°C in wässriger Lösung mit einer Konzentration
von 0,1 bis 5 × SSC (pH 7,2). Wenn der vorher genannte
Puffer ein organisches Lösungsmittel enthält,
zum Beispiel 50% Formamid, beträgt die Temperatur unter
Standardbedingungen ungefähr 42°C. Die Hybridisierungsbedingungen
für DNA:DNA-Hybridisierungen sehen vorzugsweise 0,1 × SSC und
eine Temperatur zwischen 20°C und 45°C vor, vorzugsweise
zwischen 30°C und 45°C. Die Hybridisierungsbedingungen
für DNA:RNA-Hybridisierungen sehen vorzugsweise zum Beispiel
0,1 × SSC und Temperaturen zwischen 30°C und 55°C
vor, vorzugsweise zwischen 45°C und 55°C. Die
oben genannten Hybridisierungstemperaturen sind für eine
Nukleinsäure von ungefähr 100 Basenpaaren Länge
und einem GC-Gehalt von 50% in der Abwesenheit von Formamid berechnet.
Der Fachmann weiß, wie er die erforderlichen Hybridisierungsbedingungen
berechnet, indem er auf Lehrbücher zurückgreift
wie oben erwähnt oder auf die folgenden Lehrbücher: Sambrook
et al., „Molecular Cloning", Cold Spring Harbor,
Laboratory, 1989; Hames and Higgins (Ed.) 1985, „Nucleic
Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press at
Oxford University Press, Oxford, Brown (Ed.) 1991, „Essential
Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press at
Oxford University Press, Oxford. Alternativ können
Nukleinsäurevarianten durch PCR-basierte Methoden, beispielsweise
durch die Verwendung degenerierter Primer gegen konservierte Domänen
der Proteine der vorliegenden Erfindung, erhalten werden. Konservierte
Domänen der Polypeptide der vorliegenden Erfindung können
durch den Vergleich der Nukleinsäuresequenzen der Nukleinsäuren
oder der Aminosäuresequenzen der Proteine der vorliegenden
Erfindung mit den Sequenzen anderer Matrix-Metalloproteasen ermittelt
werden.
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Weiterhin
umfassen Varianten Nukleinsäuren, die Nukleinsäuresequenzen
beinhalten, die wenigstens 70%, wenigstens 75%, wenigstens 80%,
wenigstens 85%, wenigstens 90%, wenigstens 95%, wenigstens 98% oder
wenigstens 99% identisch zu den oben beschriebenen oder in SEQ ID
NO: 4 oder SEQ ID NO: 5 gezeigten Nukleinsäuresequenzen
sind. Darüber hinaus werden auch solche Nukleinsäuren
umfasst, die Nukleinsäuresequenzen enthalten, welche für
Aminosäuresequenzen kodieren, die wenigstens zu 70%, wenigstens
zu 75%, wenigstens zu 80%, wenigstens zu 85%, wenigstens zu 90%,
wenigstens zu 95%, wenigstens zu 98% oder wenigstens zu 99% identisch
zu dem erfindungsgemäßen Fusionsprotein oder den
in SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 gezeigten Aminosäuresequenzen.
Die prozentuale Identität wird vorzugsweise über
die gesamte Länge der Aminosäure oder Nukleinsäureregion
berechnet. Eine Reihe von Programmen, die auf einer Vielzahl von
Algorithmen beruhen, steht dem Fachmann für den Sequenzvergleich
zur Verfügung. In diesem Zusammenhang ergeben die Algorithmen
von Needleman und Wunsch oder Smith und Waterman besonders verlässliche
Ergebnisse. Für das Alignment der Sequenzen stehen das
Programm PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351–360,
1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151–153)
oder die Programme Gap und BestFit [Needleman and Wunsch
(J. Mol. Biol. 48; 443–453 (1970)) und Smith
and Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482–489 (1981))],
die zum Softwarepaket GCG gehören [Genetics Computer Group,
575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)] zur Verfügung.
Die oben aufgeführten Prozentwerte für die Sequenzidentität
werden vorzugsweise mit dem Programm GAP über die gesamte
Sequenzregion mit folgenden Einstellungen berechnet: depth weight:
50, length weight: 3, average match: 10,000 und average mismatch:
0,000. Wenn nicht anders angegeben sollen diese Werte immer Standardeinstellungen
für Sequenzvergleiche verwendet werden.
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Weiterhin
umfasst die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäure, die
ein Fragment einer der oben beschriebenen Nukleinsäuresequenzen
enthält. Dieses Fragment sollte ein Protein kodieren, das
die oben beschriebene Aktivität hat. Dementsprechend enthält
das Protein die Domänen des Fusionsproteins der vorliegenden
Erfindung, die ihm die beschriebene biologische Aktivität
verleihen, oder es besteht aus diesen Domänen. Ein Fragment
im Sinne dieser Patentanmeldung enthält vorzugsweise wenigstens
50, wenigstens 100, wenigstens 250, oder wenigstens 500 aufeinander
folgende Nukleotide einer der vorgenannten Nukleinsäuresequenzen
oder es kodiert für eine Aminosäuresequenz, die
wenigstens 20, wenigstens 30, wenigstens 50, wenigstens 80, wenigstens
100 oder wenigstens 150 aufeinander folgende Aminosäuren
einer der vorgenannten Aminosäuresequenzen enthält.
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Es
versteht sich, dass die zuvor beschriebenen Varianten immer auch
die funktionellen Eigenschaften des erfindungsgemäßen
Fusionsproteins aufweisen, d. h. an der Zellwand von Pichia pastoris
oder einer anderen Hefe verankert werden können und Matrix-Metalloprotease-Aktivität
aufweisen.
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Die
Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung bestehen entweder
aus den oben genannten Nukleinsäuresequenzen oder sie enthalten
besagte Nukleinsäuresequenzen. Das heißt, sie
können auch weitere Nukleinsäuresequenzen enthalten.
Solche weiteren Nukleinsäuresequenzen können vorzugsweise
weitere Bestandteile des Fusionsproteins kodieren, z. B. detektierbare
Marker wie FLAG-tags, Myc-tags, HA-tags oder fluoreszierende Proteine
wie GFP.
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Die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuren ermöglichen
die Expression von Matrix-Metalloproteasen als Fusionsproteine mit
Zellwandanker in einer Wirtszelle, wobei die MMPs an die Zellwand
der Wirtszelle gebunden werden. Diese Bindung führt überraschenderweise
zu einer höheren Stabilität der MMPs im Vergleich
zu löslichen Proteasen. So können rekombinante
Matrix-Metalloproteasen in konstant hoher Qualität bei
geringen Kosten hergestellt werden. Darüber hinaus ermöglicht
die Bindung der MMPs an die Wirtszelle den Einsatz der Wirtszelle
in einem Ganzzell-Bioassay, wie er weiter unten beschrieben ist.
Da bei zellgebundenen MMPs nicht die Proteine selbst, sondern nur
ihre Wirtszellen aufgereinigt werden müssen, vereinfacht
sich die Vorbereitung des Enzymtests. Die Aufreinigung der Wirtszellen
kann sehr einfach durch Abzentrifugieren, Entfernen des Überstandes
und Aufnahme der Zellen in Probenpuffer erfolgen. Im Vergleich zur
chromatografischen Aufreinigung rekombinant hergestellter löslicher
Proteine ist dieses Verfahren deutlich einfacher. Die gereinigten Zellen
können lyophilisiert werden und sind in diesem Zustand
ohne nennenswerte Aktivitätsverluste lagerfähig.
Auch ein Vertrieb der erfindungsgemäßen Wirtszellen
ist so mit geringem Aufwand möglich.
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Konventionelle
Matrix-Metalloproteasen müssen vor ihrer Verwendung aktiviert
werden. Hierzu werden häufig umweltschädliche
Organo-Quecksilberverbindungen verwendet. Die erfindungsgemäßen
zellwandgebundenen Matrix-Metalloproteasen hingegen können
durch Lyophilisierung oder in TTC-Puffer (Tris Triton X-100 Calciumchlorid)
aktiviert werden. Die erfindungsgemäßen zellwandgebundenen
Matrix-Metalloproteasen können ebenso einfach angewandt
werden wie lösliche Proteine. Spezielle Vorkenntnisse sind
nicht erforderlich.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch einen Vektor, der eine der oben
beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäuren
enthält.
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Der
Begriff ”Vektor” umfasst vorzugsweise Phagen,
Plasmide, virale oder retrovirale Vektoren ebenso wie künstliche
Chromosomen, d. h. bacterial acrtificial chromosomes oder yeast
artificial chromosomes. Darüber hinaus bezieht sich der
Begriff ebenfalls auf Konstrukte, die zu einer zufälligen
oder gerichteten Integration in die genomische DNA fähig
sind. Solche Konstrukte enthalten vorzugsweise DNA von ausreichender Länge
für entweder eine homologe oder eine heterologe Rekombination
wie weiter unten im Detail beschrieben. Der die erfindungsgemäße
Nukleinsäure enthaltende Vektor enthält vorzugsweise
zusätzlich selektierbare Marker für die Vermehrung
und/oder Selektion in einer Wirtszelle. Der Vektor kann in die Wirtszelle
durch verschiedene dem Fachmann bekannte Techniken eingebracht werden.
Beispielsweise kann ein Plasmid in einem Präzipitat wie
Kalziumphosphat oder Rubidiumchlorid oder in einem Komplex mit geladenen
Fettsäuren oder in Kohlenstoff-basierten Cluster wie Fullerenen
in die Zelle eingebracht werden. Alternativ kann ein Plasmid durch
Hitzeschock oder Elektroporation in die Zelle eingebracht werden.
Wenn der Vektor ein Virus ist, kann es in vitro in einer geeigneten
Zelllinie verpackt werden, bevor es zu den Wirtszellen zugegeben
wird. Retrovirale Vektoren können fähig oder unfähig
zur Replikation sein. Ist letzteres der Fall, findet die Vermehrung
des Virus im Allgemeinen nur in Wirtszellen statt, die mit den zu
transformierenden Zellen gemischt werden.
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Es
ist besonders bevorzugt, dass die erfindungsgemäße
Nukleinsäure im erfindungsgemäßen Vektor funktional
mit Expressionskontrollsequenzen verbunden ist, die eine Kontrolle
der Expression in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen oder
isolierten Fraktionen davon ermöglichen. Die Expression
der besagten Nukleinsäure umfasst die Transkription der
Nukleinsäure, vorzugsweise in translatierbare mRNA. Regulatorische
Elemente für Expressionskontrollsequenzen, die die Expression
in eukaryotischen Zellen sicherstellen, sind dem Fachmann gut bekannt.
Sie umfassen vorzugsweise regulatorische Sequenzen, die die Initiation
der Transkription sicherstellen und, vorzugsweise, Poly-Adenylierungssignale,
die die Termination der Transkription sicherstellen und das Transkript
stabilisieren. Zusätzliche regulatorische Elemente können
Transkriptions- sowie Translation-Enhancer enthalten. Mögliche
regulatorische Elemente, die die Expression in prokaryotischen Wirtszellen
ermöglichen, umfassen beispielsweise die lac-, trp- oder
tac-Promoter in Escherichia coli. Beispiele für regulatorische
Elemente, die die Expression in eukaryotischen Wirtszellen ermöglichen,
sind der AOX1- oder GAL1-Promotor in Hefe oder die CMV-, SV40-,
RSV-Promotoren, CMV-Enhancer, SV40-Enhancer oder ein Globin-Intron
in Säugetier- oder anderen tierischen Zellen. Darüber
hinaus können induzierbare Expressionskontrollsequenzen
in einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor verwendet
werden. Solche induzierbaren Vektoren können tet- oder
lac-Operatorsequenzen oder Sequenzen, die durch Hitzeschock oder andere
Umweltfaktoren induzierbar sind, enthalten. Passende Expressionskontrollsequenzen
sind dem Fachmann gut bekannt. Neben Elementen, die für
die Initiation der Transkription verantwortlich sind, können
solche regulatorischen Elemente auch Signale enthalten, die die
Termination der Transkription bewirken. Beispiele dafür
sind die SV40-Poly-Adenylierungssequenz oder die tk-Poly-Adenylierungssequenz
am 3'-Ende der Nukleinsäure. In diesem Zusammenhang sind
passende Expressionsvektoren dem Fachmann bekannt, zum Beispiel
der Okayama-Berg- Expressionsvektor pcDV1 (pharmacia), pBluescript
(Stratagene), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen) oder pSPORT1
(GIBCO BRL).
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In
einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße
Vektor der Expressionsvektor pPIC9 für die Hefe Pichia
pastoris.
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Ferner
betrifft die vorliegende Erfindung ein Polypeptid, das von den oben
beschriebenen Nukleinsäuren kodiert wird.
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Die
Bezeichnungen „Polypeptid” und „Protein” werden
in der vorliegenden Patentanmeldung synonym verwendet. Vorzugsweise
wird das erfindungsgemäße Polypeptid durch die
rekombinante Expression der erfindungsgemäßen
Nukleinsäure in einer geeigneten Wirtszelle hergestellt.
Alternativ kann das erfindungsgemäße Polypeptid
auch durch rein chemische Synthese in vitro erhalten werden. Das
erfindungsgemäße Polypeptid ist ein Fusionsprotein
mit Bestandteilen und Eigenschaften wie zuvor angeführt.
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Ferner
betrifft die Erfindung eine Wirtszelle, die eine der oben beschriebenen
Nukleinsäuren enthält.
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Die
erfindungsgemäße Wirtszelle ist vorzugsweise eine
eukaryontische Zelle. Besonders bevorzugt ist die Wirtszelle eine
Hefezelle, ganz besonders bevorzugt der Art Pichia pastoris. Pichia
pastoris gehört, ebenso wie Saccharomyces cerevisae, zur
Klasse Saccharomycetes, Ordnung Saccharomycetales. Sie ist methylotroph,
d. h. sie kann auf Methanol als einziger Kohlenstoffquelle wachsen.
Auch erreicht sie mit 130 g Trockenzellmasse sehr hohe Zelldichten.
Im Vergleich zu S. cerevisae zeigt sie eine reduzierte Glykosylierungsaktivität.
Vergleiche der Expression von Matrix-Metalloproteasen in E. coli
und in anderen Hefen haben gezeigt, dass Pichia pastoris besonders
gut in der Lage ist, MMP-2 und MMP-9 in aktiver Form zu exprimieren
(siehe Beispiel 1). Am stärksten bevorzugt sind die Stämme
GS115 und KM71 an Pichia pastoris, wobei der Stamm KM71 ganz besonders
bevorzugt ist.
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Ferner
betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen
Wirtszelle zur Identifizierung oder Charakterisierung von Inhibitoren
von Matrix-Metalloproteasen.
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Unter „Inhibitoren
von Matrix-Metalloproteasen” werden in dieser Patentanmeldung
Substanzen verstanden, die in der Lage sind, die Enzymaktivität
von MMPs herabzusetzen. Solche Substanzen können aus allen
chemischen Klassen stammen und umfassen insbesondere anorganische
Verbindungen, niedermolekulare organische Verbindungen mit einem
Molekulargewicht ≤ 3000 Da, organische Polymere, Nukleinsäuren, Peptide,
oder Proteine. Unterschiedliche Substanzen aus diesen Klassen können
z. B. auch in Form von Bibliotheken bereitgestellt werden, die unterschiedliche
Vertreter der jeweiligen Klassen enthalten. Dem Fachmann sind verschiedene
Mechanismen der Inhibition der Enzymaktivität bekannt.
Vorzugsweise hemmen die Inhibitoren die Enzymaktivität
der MMP kompetitiv oder allosterisch. Bei der kompetitiven Enzymhemmung
bindet der Inhibitor im aktiven Zentrum des Enzyms, wird aber nicht
enzymatisch umgesetzt. Deswegen konkurriert er mit dem Substrat
um die Bindungsstelle. Ein allosterisch wirkender Inhibitor bindet
außerhalb des aktiven Zentrums an das Enzym und induziert
Konformationsveränderungen des Enzyms, die die Enzymaktivität senken.
Beide Formen der Enzymhemmung sind vollständig reversibel,
wenn der Inhibitor aus der Lösung entfernt wird. In der
vorliegenden Patentmeldung werden darüber hinaus auch solche
Substanzen als „Inhibitoren von Matrix-Metalloproteasen” bezeichnet,
die das Enzym irreversibel inaktivieren. Eine solche irreversible
Inaktivierung wird vorzugsweise durch die kovalente Bindung des
Inhibitors an das Enzym vermittelt, besonders bevorzugt durch die
Bindung im aktiven Zentrum.
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Unter
der „Identifizierung von Inhibitoren von MMPs” wird
die Untersuchung von chemischen Substanzen auf ihre Fähigkeit
zur Senkung der Enzymaktivität von MMPs verstanden. Vorzugsweise
wird eine Vielzahl verschiedener chemischer Substanzen getestet,
um herauszufinden, welche dieser Substanzen fähig ist,
die Enzymaktivität von MMPs zu senken und somit als Inhibitor
fungieren kann. Unter einer Senkung der MMP-Aktivität wird
im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorzugsweise eine signifikante
Erniedrigung der MMP-Aktivität des mit dem potentiellen
Inhibitor behandelten Fusionsproteins gegenüber einem unbehandelten
Fusionsproteins verstanden. Ob eine Erniedrigung der Aktivität
signifikant ist, kann mit gängigen, dem Fachmann bekannten
statistischen Tests bestätigt werden. Besonders bevorzugt
ist in diesem Zusammenhang Studen's t-Test mit p < 0,05 als Signifikanzniveau.
Die Verfügbarkeit von Kristallstrukturen von MMPs ermöglicht
theoretische Vorhersagen darüber, welche Verbindungen als
Inhibitoren einer bestimmten MMP oder mehrerer MMPs geeignet sein
könnten. Diese Substanzen können dann gezielt
synthetisiert und mit Hilfe der erfindungsgemäßen
Wirtszelle auf ihre Eignung als Inhibitor überprüft
werden. Somit ist die Verwendung der erfindungsgemäßen
Wirtszelle in Zusammenhang mit „rational drug design” ebenfalls
bevorzugt.
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Unter
der „Charakterisierung von Inhibitoren von MMPs” wird
die weitere Untersuchung der identifizierten Inhibitoren verstanden.
Hierzu zählen vorzugsweise die Untersuchungen zur Stärke
der Hemmung verschiedener MMPs und Untersuchungen zum Mechanismus
der Hemmung. Ebenfalls vorzugsweise zählt dazu der Vergleich
der Wirkung von chemischen Verbindungen mit ähnlicher Struktur,
um Struktur-Wirkungsbeziehungen zu ermitteln. Auf Basis der ermittelten
Struktur-Wirkungsbeziehungen können dann weitere chemische Substanzen
mit verbesserten Eigenschaften entwickelt werden.
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Schließlich
betrifft die die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung
und Charakterisierung von Inhibitoren von Matrix-Metalloproteasen,
vorzugsweise in vitro, bestehend aus den Schritten erfindungsgemäße
oben beschriebene Polypeptid umfasst
- a) In
Kontakt Bringen des potentiellen Inhibitors mit einer Wirtszelle,
die das oben beschriebene erfindungsgemäße Polypeptid
umfasst.
- b) Bestimmung der Aktivität der Matrix-Metalloprotease
und Vergleich mit einer Referenz, wodurch der Inhibitor identifiziert
wird.
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Die
im Verfahren eingesetzte Wirtszelle kann einer Zellsuspension vorliegen.
Vorzugsweise enthält eine die erfindungsgemäße
Wirtszelle enthaltende Zellsuspension zusätzlich weitere
chemische Substanzen. Besonders bevorzugt sind Puffer, die den pH
der Zellsuspension in dem Bereich stabilisieren, der für
die Aktivität der zu testenden Matrix-Metalloprotease besonders
günstig ist. Ebenfalls vorzugsweise enthält die
Zellsuspension Kofaktoren, die für die Aktivität
der MMP erforderlich sind. Darüber hinaus ist es bevorzugt,
dass die Zellsuspension ein Substrat der zu testenden MMP enthält.
-
Es
versteht sich, dass die erfindungsgemäßen Wirtszellen,
die zuvor beschrieben wurden, auch in dem erfindungsgemäßen
Verfahren als Wirtszellen eingesetzt werden können.
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Verfahren
zur Messung der Aktivität von Enzymen im Allgemeinen und
Matrix-Metalloproteasen im Besonderen sind dem Fachmann bekannt.
Vorzugsweise wird die Enzymaktivität über die
Zunahme der Konzentration eines Reaktionsprodukts oder die Abnahme
der Konzentration eines Edukts bestimmt. Besonders bevorzugt sind
hierbei Edukte, deren Konzentration sich durch eine spezifische
Lichtabsorption oder Fluoreszenz bestimmen lässt oder deren
Spaltprodukte eine solche spezifische Lichtabsorption oder Fluoreszenz
aufweisen. Das erfindungsgemäße Verfahren wird
vorzugsweise in einem Photometer, Fluoreszenz-Photometer oder einem
Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Leser durchgeführt.
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Als
Referenz bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann
die MMP-Aktivität dienen, die für eine Wirtszelle
nur in a) beschrieben unter denselben experimentellen Bedingungen
bestimmt wurde, wobei die Wirtszelle jedoch nicht mit dem potentiellen
Inhibitor in Kontakt gebracht wurde. Alternativ kann die MMP-Aktivität
auch vor der Behandlung der Wirtszelle als Referenz bestimmt werden.
Solche einmal bestimmten Referenzwerte können auch auf
geeigneten Medien gespeichert werden und als Referenz für
zukünftige Vergleiche dienen.
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Soll
das Verfahren zum Hochdurchsatz-Screening eingesetzt werden, können
die Schritte des Verfahrens auch automatisiert werden. Die Kultivierung
und Behandlung, sowie die Messung der MMP-Aktivität kann durch
Roboter-Systeme automatisiert werden. Der Vergleich der Messwerte
mit Referenzen und damit die Identifizierung von Inhibitoren kann
durch gängige, dem Fachmann bekannte computer-implementierte
Algorithmen durchgeführt werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens wird die Matrix-Metalloprotease-Aktivität durch
die Freisetzung eines Fluoreszenzfarbstoffs aus Gelatine bestimmt.
Die Moleküle des Fluoreszenzfarbstoffs sind in der Gelatine
so eng gepackt, dass eine Fluoreszenz wegen des gegenseitigen Quenching
nicht möglich ist. Erst der Abbau der Gelatine durch die
MMP setzt den Farbstoff frei und ermöglicht Fluoreszenz.
Die Stärke des Anstiegs der Fluoreszenz über die
Zeit ist ein Maß für die Aktivität der
MMP. Die Anwesenheit von Inhibitoren von MMPs führt zu
einem langsameren Anstieg der Fluoreszenz. Ein für diese Ausführungsform
bevorzugter Farbstoff ist Fluorescein.
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Die
Abbildungen zeigen:
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1:
MMP-Expression in Escherichia coli bei 30°C und 37°C.
Die Zellen wurden mittels Ultraschall aufgeschlossen, die Proteine über
SDS-PAGE getrennt und mit Coomassie angefärbt (P = Pellet,
R = Rohextrakt, rote Umrandung = MMP).
-
2:
Western-Blot zum Nachweis einer MMP-Expression in Z. bailii ATCC36947.
Im konzentrierten Kulturüberstand sind für MMP-9
zwei schwache Banden sichtbar. Die Kulturüberstände
vom Stamm ATCC36947 enthielten keine MMPs.
-
3:
Plasmid-Integration in das Genom von Pichia pastoris. Das im Bereich
des HIS4-Gens linearisierte Plasmid wird durch ein einfaches Crossover
in den his4-Lokus auf dem Pichia-Chromosom inseriert. Als Resultat
ergeben sich zwei Kopien des HIS4/his4-Gens, wovon eine weiterhin
in einer mutanten, die andere in der wildtypischen Form vorliegt.
-
4:
MMP-Expression in Pichia pastoris (GS115). Die Western Blots mit
ihren korrespondierenden Zymographien zeigen eine hohe MMP-Produktion
in biologisch aktiver Form. Für KM71-Stamm wurden vergleichbare
Ergebnisse erhalten (– = Negativ-Kontrolle, + = Positiv-Kontrolle,
rote Umrandung = MMP).
-
5:
Verwendete Zellwandanker-Sequenzen. Bei allen Ankern wurde die proteineigene
ER-Signalsequenz am 5'-Ende entfernt, um eine intramolekulare Prozessierung
durch eine Signalpeptidase zu verhindern. PIR1 wurde um 363 bp am
3'-Ende verkürzt.
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6:
Zelloberflächen-Expression von Esterase A in Pichia pastoris.
Die Bildung von p Nitrophenol aus p Nitrophenylacetat wurde durch
Absorptionsmessung bei λ = 405 nm verfolgt. Die Steigungen
der Geraden dienten als Maß für die Bewertung
des jeweiligen Zellwandproteins bezüglich seiner Eignung
als Anker bei der heterologen Proteinexpression. (A) P. pastoris-Stamm
GS115, (B) P. pastoris-Stamm KM71; die kleinere Graphik gibt die
Werte in veränderter Ordinaten-Skalierung an. Die blaue
gestrichelte Linie beschreibt den bei früheren Untersuchungen
ermittelten Verlauf für S. cerevisiae SEY6210 mit Cwp2p-EstA-Expression.
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7:
Vergleich der Esterase A-Aktivitäten in Abhängigkeit
der gewählten Stamm-Anker-Kombination. Die Effizienz der
Zellwand-Verankerung konnte vom niedrigsten zum höchsten
Wert um das Zehnfache gesteigert werden; im Vergleich zum etablierten
S. cerevisiae-System war eine Erhöhung um das Sechsfache möglich
(aufgeführt sind Volumenaktivitäten berechnet
für Zellsuspensionen mit der OD600 = 10).
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8:
Indirekte Immunfluoreszenz zum Nachweis zellwandverankerter MMPs
in P. pastoris. Hefezellen des Stamms KM71 mit entsprechendem Expressionsplasmid
wurden 72 h unter induzierenden Bedingungen kultiviert. Die MMPs
wurden mit Anti-MMP-AK (ABCAM, 1:25) und mit FITC-markierten Anti-Rabbit-IgG-AK
(SIGMA, 1:15) gelabelt (Fluoreszenz-Mikrokop: KEYENCE BZ 8000; λ A
= 480 nm; λ E > 510
nm).
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9:
Validierung des Inhibitor-Testsystems. (A) Als Modell-Hemmstoff
diente der Metallchelator und allgemeine MMP-Inhibitor 1,10 Phenanthrolin;
bei MP 137 und MP 146 handelt es sich um intermediäre Synthetisierungs-Stadien
sich in Entwicklung befindlicher Inhibitoren (B) Konzentration-Wirkung-Diagramm
von 1,10 Phenanthrolin für MMPACE II und MMPACE IX (DQTM Gelatine: 25 μg/ml; Fütterrate:
2 × 1% MeOH/d; Induktionsdauer: 96 h; OD600: 2,5; RFU =
Relative Fluoreszenz-Einheiten).
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10:
Quantitative Bestimmung des MMP-Gehalts mittels, human active MMPs'
(CALBIOCHEM). Die gelatinolytischen Aktivitäten von MMP-Proben
mit bekannter Konzentration wurden bestimmt und als Standard zur
Quantifizierung der MMPACE-Proben heran gezogen. Die mathematische
Funktion der resultierenden Regressionsgeraden diente der Berechnung
der MMP-Masse in den Kulturen der Expressionsstämme (DQTM Gelatine: 50 μg/ml; Fütterrate:
2 × 1% MeOH/d; Induktionsdauer: 72 h; OD600: 2,5; RFU =
Relative Fluoreszenz-Einheiten)
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Die
folgenden Ausführungsbeispiele dienen nur dazu, die Erfindung
zu illustrieren. Sie sollen den Gegenstand der Patentansprüche
in keiner Weise beschränken.
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Beispiele:
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1. Test verschiedener Wirtszellen
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Escherichia coli
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Zur
Transformation der Expressionsplasmide pET24-MMP-HIS mittels Elektroporation
wurden die Klonierungsarbeiten bereits mit dem E. coli-Expressionsstamm
BL21 (DE3) durchgeführt. Der entsprechende Ligationsansatz
wurde für 40 min gegen 10% Glycerin dialysiert und danach
zu den elektrokompetenten Zellen gegeben. Die Elektroporation erfolgte
bei 200 O, 2,48 kV/cm und 25 μF. Die Zellen wurden in in
1 ml SOC-Medium aufgenommen und für 60 min bei 37°C
und 220 rpm in einem Reaktionsgefäß inkubiert.
Die Selektion erfolgte auf LBKan-Agarplatten über Nacht
bei 37°C. Anschließend wurden mehrere Klone angeimpft
und einem Kontrollverdau unterzogen.
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Zur
Induktion der Expression wurden Erlenmeyerkolben mit LBKan-Medium
10%ig mit frischen Über-Nacht-Kulturen positiv identifizierter
Klone beimpft; die Induktion erfolgte durch Zugabe von IPTG in einer Endkonzentration
von 0,1 mM. Die Kulturen wurden bei unterschiedlichen Temperaturen
(20°C, 25°C, 30°C, 37°C) unter
Schütteln inkubiert, um mögliche temperaturbedingte
Variationen in der Expression verfolgen zu können.
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Nach
24 h wurden die Zellen einer 50 ml-Kultur durch Zentrifugation (5
min bei 13.000 rpm) geerntet, in 10 ml Binding-Puffer aufgenommen
und durch Ultraschall aufgeschlossen. Die nachfolgende Zentrifugation bei
15.000 rpm für 15 min trennte die Zelltrümmer
der Pellet-Fraktion vom Rohextrakt, der die löslichen Proteine
enthielt. Zur Überprüfung der MMP-Produktion wurden
die Komponenten beider Fraktionen (15 μl) in einem SDS-Gel
getrennt und eine Coomassie-Färbung durchgeführt.
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Die
Proben zeigten bei allen Temperaturen identische Muster. In 1 sind
vergleichend die Expressionsergebnisse für MMP-2 und MMP-9
jeweils bei 30°C und 37°C dargestellt. Bei der
Pellet-Fraktion von MMP-2 ist eine deutliche Protein-Expression
im Bereich von ca. 72 kDa zu erkennen, was der Größe
des Volllängen-MMP-2-Proteins entspricht. Das Fehlen einer
entsprechenden Bande im Rohextrakt legt die Vermutung nahe, dass
das Protein als unlösliche Inclusion Bodies vorliegt. Die
MMP-9-Proben zeigten keinerlei Expression im Bereich der erwarteten
Größe (92 kDa).
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Ergänzende
Versuche zur Expression bei unterschiedlichen IPTG-Konzentrationen
und Temperaturen sowie mit N-terminal (um die Prodomäne)
verkürzten MMPs führten zu identischen Ergebnissen.
Erwartungsgemäß waren die Gelatinasen nicht mittels
Zymographie nachweisbar und lagen somit im Falle von MMP-2 nicht
als funktionale Enzyme vor (Ergebnisse nicht gezeigt).
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Kluyveromyces lactis
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Die
Untersuchungen bei K. lactis beschränkten sich aus Praktikabilitätsgründen
zunächst ausschließlich auf MMP-9. Für
den Fall einer erfolgreichen Expression waren ergänzende
Experimente für MMP-2 geplant.
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Die
Transformation in den K. lactis-Stamm GG799 erfolgte mittels des
Protein Expression Kits von NEW ENGLAND BIOLABS. Da der Vektor pKLAC1
erfahrungsgemäß dazu neigte, die Kopienzahl in
E. coli mit der Zahl der Überimpfungen zu verringern, wurde
das Plasmid frisch in DH5a-Zellen transformiert und die Plasmid-DNA
der Über-Nacht-Kultur mittels alkalischer Lyse isoliert.
Von dem Isolat wurden 2 μl pKLAC1-MMP-9s mit SacII verdaut,
um den Vektor im Bereich des LAC4-PBI-Promotors zu linearisieren.
Der Restriktionsansatz wurde über ein Gelextraktions-Kit
gereinigt und zur Transformation eingesetzt. 3,75 μl wurden
zu 50 μl kompetenter Zellen gegeben und der Ansatz mit
155 μl Yeast Transformation Reagent versetzt. Nach 30 minütiger
Inkubation bei 30°C erfolgte für 1 h ein Hitzeschock
bei 37°C. Die Zellen wurden auf YPD geshiftet und für
30 min unter Schütteln inkubiert, bevor sie zur Selektion
auf YCB-Agarplatten mit Acetamid ausgebracht wurden. Nach 4 d bei
30°C konnten die Klone in Flüssigkultur angeimpft
werden.
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Zur
Expression wurden die Zellen in SC-Gal-Medium bei 30°C
für 3 d inkubiert. Nach dem Ernten (15 min bei 8.000 rpm)
wurde der Kulturüberstand sterilfiltriert und mittels Ultrafiltration
(SARTORIUS Vivaspin 20, 30 kDa) etwa 50fach konzentriert. Nach der
Trennung im SDS-Gel wurden die Proteine mittels Western Blot auf
eine PVDF-Membran übertragen und immunologisch mittels
Anti-MMP-9-Antikörpern (BIOMOL; 1:1.000), die gegen die
katalytische Domäne gerichtet waren, colorimetrisch detektiert.
Als Negativ-Kontrolle fungierte der Kulturüberstand von
GG799 transformiert mit dem pKLAC1-Leervektor.
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In
keiner der getesteten Proben konnte eine Expression von MMP-9 nachgewiesen
werden. Der Blot zeigte außer der Positiv-Kontrolle (Gelatinase
92 kDa, ROCHE) lediglich unspezifische Bindungen im hochmolekularen
Bereich. HOFFMANN (Diplomarbeit, Zentrum für Human- und
Molekularbiologie, Universität des Saarlandes, 2007) konnte
bei weiterführenden Untersuchungen mittels PAS-Färbung
eine Glykosylierung der Proteine in diesem Bereich nachweisen. Dies
eröffnet die Möglichkeit, dass MMP-9 eventuell
in einer stark glykosylierten Form gebildet wurde.
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Saccharomyces cerevisiae
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Der
S. cerevisiae-Stamm SEY6120 wurde mittels der Lithium-Acetat-Methode
transformiert.
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Zur
Expression der rekombinanten Proteine wurden Erlenmeyerkolben mit
Ura-d/o-Medium 1%ig mit einer frischen Über-Nacht-Vorkultur
beimpft und für 3 d bei 30°C und 220 rpm kultiviert.
Das Ernten erfolgte durch Zentrifugation bei 8.000 rpm für
15 min. Die Kulturüberstände wurden durch Filtration
von den restlichen Zellen befreit und über Vivaspin Ultrafiltrationseinheiten
(SARTORIUS, 30 kDa) konzentriert. Nach Trennung der Proteine in
der SDS-PAGE wurde ein Western Blot durchgeführt. Zur Absättigung
der Membran wurde diese für 2 h in Blockingpuffer mit 3%
Magermilchpulver bei Raumtemperatur geschwenkt. Die Bindung der
Anti-MMP-Antikörper (ABCAM, 1:5.000) erfolgte bei 4°C über
Nacht. Der anschließenden Inkubation in sekundärem
HRP- gekoppeltem Anti-Rabbit-IgG-Antikörper (SIGMA; 1:10.000)
für 1 h bei 20°C folgte die Entwicklung der Membran
mittels des Chemilumineszenz-Substrats SuperSignal West Dura (PIERCE).
Als Negativ-Kontrolle fungierte der Kulturüberstand von
SEY6210 mit pFB2-Leervektor; die mitgeführten Positiv-Kontrollen
bestanden aus den kommerziell erhältlichen MMP-Isolaten
,MMP-2 human' bzw. ,MMP-9 human' (MILLIPORE).
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Außer
den Positiv-Kontrollen waren keinerlei MMP Signale detektierbar.
Auch bei verlängerter Belichtungsdauer zeigte sich keine
Veränderung. Die gleichen Untersuchungen wurden zusätzlich
parallel für die Saccharomyces cerevisiae-Stämme
S86c und BY4742 durchgeführt und führten überall
zu dem gleichen Ergebnis. S. cerevisiae scheint somit nicht in der
Lage zu sein, sekretorische Formen von MMP-2 oder MMP-9 zu produzieren.
KESSLER (Diplomarbeit, Zentrum für Human- und Molekularbiologie,
Universität des Saarlandes, 2006) war in der Lage, die
Proteine bei der Expression von zellwandverankerten Gelatinase-Formen
in Zellfraktionierungs-Untersuchungen nachzuweisen. Die Experimente
deuten darauf hin, dass MMP-2 und MMP-9 von S. cerevisiae sehr wohl
exprimiert, allerdings nicht sezerniert werden können.
Darüber hinaus zeigten die Proben bei den korrespondierenden
Zymographien eine nur schwache enzymatische Aktivität.
Saccharomyces cerevisiae erwies sich daher für MMP-2 und
MMP-9 als Expressionswirt ungeeignet.
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Schizosaccharomyces pombe
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Die
Expression sekretorischer MMPs in Schizosaccharomyces pombe wurde
in einer ersten Stufe unter Verwendung des Kre1p-Signalpeptids durchgeführt.
Da die Funktionalität dieser Sequenz in S. pombe zu diesem
Zeitpunkt noch nicht beschrieben war, wurden die Experimente zusätzlich
durch eine zweite Versuchsreihe mit K28-Signalsequenz ergänzt.
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Die
Zellen wurden transformiert und nach 4 Tagen Inkubation bei 30°C
in EMM-Leu-d/o-Flüssigmedium mit 5 mg/l Thiamin überführt.
Die Kulturen verblieben über Nacht im Schüttler
bei 30°C. Am nächsten Tag erfolgte das Animpfen
der Hauptkultur in einem Erlenmeyerkolben (4%ig). Nach 24 h Inkubation
bei 30°C und 220 rpm wurde die Kultur für 5 min
bei 8.000 rpm zentrifugiert und zweimal mit Thiamin-freiem EMM-Leu-d/o-Medium
gewaschen, um letzte Reste des reprimierenden Thiamins zu entfernen.
Die Induktion der Expression erfolgte 3 d in EMM-Leu-d/o-Medium
bei 30°C auf einem Inkubationschüttler.
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Zur
Gewinnung der Kulturüberstände wurden die Ansätze
in Zentrifugationsgefäße überführt
und bei 8.000 rpm für 15 min pelletiert. Die Überstände
wurden wie bereits für andere Wirte beschrieben sterilfiltriert und
eingeengt. Die Proteine wurden nach der SDS-PAGE auf eine PVDF-Membran
geblottet und mit Anti-MMP-Antikörpern entwickelt. Für
die Versuchsreihe mit Kre1p-Signalsequenz wurden Anti-MMP-AK gegen die
katalytische Domäne (BIOMOL), bei K28-Signalpeptid gegen
die Hinge-Region (SIGMA) verwendet. Die Bindungszeiten richteten
sich nach den Angaben des jeweiligen Herstellers.
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Unabhängig
von der verwendeten Signal-Sequenz zeigten die Western-Blots weder
eine Expression von MMP-2 noch von MMP-9. Ausschließlich
die verwendeten Positiv-Kontrollen zeigten eine deutliche Bande in
der erwarteten Höhe. Schizosaccharomyces pombe muss somit
ebenfalls als Expressionswirt für die Matrix-Metalloproteasen
MMP-2 und MMP-9 ausgeschlossen werden.
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Zygosaccharomyces bailii
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Für
die heterologe Expression in Zygosaccharomyces bailii wurden die
Stämme ATCC60483 und ATCC36947 verwendet. Die Transformation
mit pZ3-ZSS-MMPs erfolgte mittels Elektroporation.
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Die
Expression erfolgte in einem Erlenmeyerkolben mit synthetischem
Z. bailii-Medium, das 4%ig mit einer frischen Über-Nacht-Kultur
beimpft wurde. Nach 3 d bei 30°C und 220 rpm wurden die
Kulturüberstände sterilfiltriert und konzentriert.
Die Trennung der Proteine erfolgte mittels SDS-PAGE und anschließendem
Western Blot, der mit Anti-MMP-AK (ABCAM, whole molecule, 1:3.000)
mittels Chemilumineszenz entwickelt wurde.
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Die
Blots aller Z. bailii-ATCC36947-Proben erschienen sowohl für
MMP-2 als auch für MMP-9 vollständig leer. Lediglich
bei ATCC60483 konnten in der konzentrierten MMP-9-Probe zwei schwache
Banden zwischen 60 kDa und 70 kDa ausgemacht werden, bei denen es
sich möglicherweise um MMP-9-Abbauprodukte gehandelt haben
könnte.
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Pichia pastoris
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Die
Expression in Pichia pastoris fand parallel in den Stämmen
GS115 und KM71 aus dem Pichia Expression Kit (INVITROGEN) statt.
Beide Stämme unterscheiden sich vor allem bezüglich
ihrer Phänotypen bei der Methanolverwertung. GS115 verfügt über
zwei funktionale Alkoholoxigenasen AOX1 und AOX2, die einen Mut+-Phänotyp
(,methanol utilizing plus') bewirken. Bei KM71 ist, bedingt durch
eine aox1::ARG4-Disruption, nur noch das schwächere AOX2-Gen
aktiv, weshalb sich durch eine verlangsamte Methanol-Verwertung
ein MutS Phänotyp (,methanol utilizing slow') ergibt.
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Die
Transformation mit dem integrativen Vektor pPIC9-MMPs erfolgte mittels
Elektroporation. Der Vektor ermöglicht die Integration
an unterschiedlichen Orten im Hefe-Genom über drei verschiedene
Mechanismen. Eine Vektorlinearisierung mit BglII führt
zu einer Integrationskassette mit flankierenden Fragmenten des AOX1-Promotors
(am 5'-Ende) bzw. des AOX1-Gens (am 3'-Ende). Durch das doppelte
Crossover-Ereignis bei der Genom-Integration kommt es bei GS115
zu einer Änderung im Phänotyp der Methanolverwertung (Mut+
zu MutS), da das gesamte AOX1-Gen durch die Expressionkassette ersetzt
wird. Wird der Vektor mit SacI im Bereich des AOX1-Promotors geschnitten,
kommt es bei der Insertion nur zu einem einfachen Crossover, wodurch
der Phänotyp erhalten bleibt. Die experimentellen Versuche
der vorliegenden Arbeit wurden ausschließlich über
Integrationen des dritten Typs durchgeführt: Linearisierung
mit StuI oder SalI schneidet das im Vektor enthaltene HIS4-Gen,
welches mit einem einfachen Crossover-Ereignis durch homologe Rekombination
im his4-Lokus des Chromosoms integriert werden kann. Dies führt
zu zwei Kopien des Histidinol-Dehydrogenase-Gens, wovon eine weiterhin
in einer mutanten, die andere durch Komplementierung des mutierten
chromosomalen his4-Genabschnitts in der Wild-Typ-Form vorliegt.
Die Hefe wird dadurch phänotypisch prototroph für
Histidin und kann auf entsprechenden Minimalmedien selektiert werden.
Da die Integration keine Veränderung im Bereich des AOX1-Gens
bedingt, entspricht die Ausprägung des Methanolverwertungs-Phänotyps
dem des ursprünglich verwendeten Stammes (Mut+ für
GS115 und MutS für KM71).
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Zur
Transformation der Expressionsplasmide pPIC9-MMPs wurden diese für
5 h mit StuI restringiert und der Ansatz anschließend mittels
des innuPREP Gel Extraction Kits (ANALYTIK JENA) gereinigt. Für
die Elektroporation wurden jeweils 5 μl des Reisolats eingesetzt.
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Zur
Expression wurden große Kolonien von der Agarplatte aufgenommen
und in 5 ml His-d/o-Flüssigmedium überführt.
Nach 24 h Inkubation bei 30°C und 220 rpm wurden 50 ml
BMG (100 mM Na-Phosphatpuffer; pH 7,0) 4%ig mit der Vorkultur beimpft
und 24 h bei 28°C und 165 rpm kultiviert. Das anschließende Überführen
in induzierendes Medium erfolgte durch Zentrifugation der Kultur
für 4 min bei 8.000 rpm (bei 4°C) und anschließendes
Resuspendieren der Zellen in BMM (100 mM Na-Phosphatpuffer; pH 7,0).
Die Kulturen wurden für 3 d bei 28°C und 165 rpm
geschüttelt und dabei täglich mit 0,5% Methanol
gefüttert. Die Kulturüberstände wurden
sterilfiltriert und mittels Vivaspin-Ultrafiltrationseinheiten (SARTORIUS)
konzentriert. Nach der SDS-PAGE wurde ein Western Blot durchgeführt
und mit Anti-MMP-Antikörpern (BIOMOL, katalytische Domäne,
1:1.000) colorimetrisch detektiert. Wie in 4 gezeigt,
ergaben sich deutliche Banden auf der erwarteten Höhe der
Gelatinasen, die bereits im nicht eingeengten Kulturüberstand
nachweisbar waren.
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Zur Überprüfung
der biologischen Aktivität der MMPs wurden korrespondierende
Zymographien angefertigt. Bei der Coomassie-Färbung erschien
die intakte (nicht hydrolysierte) Gelatine im Gel farbig, wodurch die
Bereiche mit gelatinolytischer Aktivität als farblose Areale
sichtbar wurden. Die Ergebnisse demonstrieren die Fähigkeit
von Pichia pastoris, MMP-2 und MMP-9 in enzymatisch aktiver Form
zu sezernieren, was sie zu einem vielversprechenden Kandidaten zur
heterologen Expression von Gelatinasen macht. Generell erschien GS115
als der Stamm mit der besseren Sekretionsleistung (vgl. HOFFMANN,
loc. cit., 2007).
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Zusammenfassend
ergaben sich folgende Rückschlüsse bei der Identifikation
des optimalen Expressionswirts für die Matrix-Metalloproteasen
MMP-2 und MMP-9: Die Hefegattungen Kluyveromyces, Saccharomyces
und Schizosaccharomyces waren nicht in der Lage, die humanen Gelatinasen
heterolog in sezernierter Form zu exprimieren. Ein Stamm von Zygosaccharomyces
zeigte ein Signal für MMP-9, jedoch in einer zu niedrigen
Proteingröße. Sie schieden damit als Expressionswirte
bei den weiteren Untersuchungen aus. Escherichia coli war in der
Lage, MMP-2 zu exprimieren, jedoch nur in einer enzymatisch inaktiven
Form. MMP-9 wurde auch von E. coli nicht gebildet.
-
Pichia
pastoris war als einziger der getesteten Organismen fähig,
MMP-2 und MMP-9 in einer den Anforderungen entsprechenden Qualität
als biologisch aktive Enzyme zu sezernieren. Alle folgenden Untersuchungen
stützten sich daher ausschließlich auf das Pichia
pastoris-Expressionssystem.
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2. Herstellung des Expressionsplasmids
mit Zellwandanker
-
Vergleichende
Untersuchungen zur Zellwandverankerung in P. pastoris beinhalteten
die S. cerevisiae-Zellwandproteine Cwp2p, Pir1p und Sed1p. Cwp2p
und Sed1p verfügen über ein intramolekulares GPI-Ankersignal,
das nach dem Transport in das ER durch eine Transamidase entfernt
und durch einen GPI-Anker ersetzt wird, der primär eine
Immobilisierung in der Plasmamembran des Organismus bewirkt (AMTHAUER
et al., 1993, Proc Natl Acad Sci USA, 90: 3973–3977).
Nachfolgend werden die Proteine über noch ungeklärte
Wege kovalent in der Zellwand verankert. Pir1p verfügt
anstelle eines GPI-Signals über interne Sequenz-Wiederholungen
(Pir = ,protein with internal repeats'), die nach der Sekretion
die Bindung an β-1,3-Glukane der Zellwand vermitteln (SUMITA
et al., 2005, Eukaryot Cell, 4: 1872–1881). Cwp2p
spielt als Haupt-Mannoprotein bei S. cerevisiae eine zentrale Rolle
bei der Vermittlung der Zellstabilität (VAN DER VAART
et al., 1995, J Bacteriol, 177: 3104–3110). Bisher
ist noch keine funktionale Anwendung in P. pastoris beschrieben
worden. Das Gen hat eine Größe von 279 bp und
wurde daher 5'-terminal nur um die ersten 63 bp verkürzt,
die für die proteineigene ER-Signalsequenz kodieren (vgl. 5).
Pir1p findet sich in der Zellwand vor allem in den Chitin-Ringen
der Sprossnarben (SUMITA et al., loc. cit.). Neben
seiner intrazellulären Funktion bei der mitochondrialen
Translokation von Apn1p, einem DNA-Reparaturprotein, spielt es eine
Rolle bei der Vermittlung einer Toleranz gegenüber Hitzeschock
(TOH E et al., 1993, Yeast 9: 481–494; VONGSAMPHANH
et al., 2001, Mol Cell Biol 21: 1647–1655). WANG
et al. entwickelten damit 2008 ein neuartiges Zelloberflächen-Expressionssystem,
mit dem sie in der Lage waren, eGFP auf der Oberfläche
von P. pastoris zu verankern. Sie konnten zeigen, dass eine C-terminale
Verkürzung des Proteins eine homogenere Verteilung auf
der Zelloberfläche bewirkt. Basierend auf diesen Erkenntnissen
wurde in der vorliegenden Arbeit das Gen PIR1 3' terminal um 363
bp auf 663 bp verkürzt (Ursprungslänge: 1.026
bp). Am 5'-Ende wurde zusätzlich die für die Signalsequenz
kodierende Region entfernt, wodurch sich eine finale Länge
von 606 bp ergab. Sed1p ist ein Hauptzellwand-Protein in der stationären
Wachstums-Phase von Hefezellen und dabei maßgeblich für die
Resistenz gegen lytische Enzyme, wie Zymolyase o. ä., verantwortlich
(SHIMOI et al., 1998, J Bacteriol 180: 3381–3387).
Eine Verwendung als Zellwandanker in P. pastoris ist bisher nicht
beschrieben worden. Zur praktischen Anwendung bei der Esterase-Verankerung
wurde das 1.017 bp große Gen am 5' Ende um die natürliche
ER-Signalsequenz auf 960 bp verkürzt und zur Klonierung
eingesetzt.
-
Zur
Amplifikation der Ankersequenzen wurde die genomische DNA aus 5
ml einer frischen Über-Nacht-Kultur von S. cerevisiae BY4742
bzw. S86c isoliert und 2 μl der DNA-Lösung als
Template bei der PCR eingesetzt. Die DNA-Abschnitte erhielten dabei
eine BlnI-Schnittstelle am 5'- und eine NotI-Schnittstelle am 3'-Ende.
Anschließend wurden sie in den Vektor pSTBlue-1 kloniert
und sequenziert. Zur Klonierung in das Expressionsplasmid wurden
der Vektor pPIC9 und die Plasmid-DNA mutationsfreier Anker-Klone
mit BlnI/NotI restringiert und danach ligiert. Die PCR zur Produktion
des Esterase-Gens fand unter Verwendung des Template-Plasmids pFB2
EstA statt. Der 5'-Primer war dabei so gestaltet, dass er eine XhoI-
und eine EcoRI-Schnittstelle getrennt von einer Signal-Cleavage-Region
enthielt; 3'-terminal wurde eine BlnI-Restriktionsstelle angefügt.
Nach Klonierung in pSTBlue-1 und anschließender Sequenzierung
wurde das Gen als XhoI/BlnI-Fragment in die einzelnen Anker-Plasmide
legiert. Durch die Struktur des 5'-Terminus führte dies
zu einer Entfernung der ursprünglich in der MCS des Vektors
enthaltenen SnaBI-Schnittstelle, wodurch die resultierenden Proteine
nach finaler Prozessierung eine N-terminale Verlängerung
um ausschließlich zwei Aminosäuren (Glu-Phe) vorwiesen.
Die Esterase-Expressionsplasmide wurden entsprechend der verwendeten
Ankersequenzen als pPIC9-CWP2-EstA, pPIC9-PIR1-EstA und pPIC9-SED1-EstA
bezeichnet. Sie wurden so gestaltet, dass die Zellwandverankerung
beliebiger Genprodukte (wie z. B. MMPs) durch einen einfachen Austausch des
Esterase-Gens über die Schnittstellen EcoRI/BlnI möglich
war.
-
3. Test der verschiedenen
Zellwandanker
-
Die
Esterase A-Expressionsplasmide wurden mit StuI oder SacII linearisiert,
gereinigt und standardmäßig durch Elektroporation
in P. pastoris transformiert. Zur Expression wurden die Zellen für
24 h in einem Erlenmeyerkolben mit 25 ml BMG und anschließend
für 72 h in 25 ml BMM-Medium kultiviert (28°C,
165 rpm); die Fütterrate betrug dabei 2 × 0,5%
Methanol pro Tag.
-
Zur
Bestimmung der enzymatischen Aktivität wurde die OD600
der Zellen in einer Küvette auf 0,32 eingestellt und die
Suspension mit 4,5 mM p-Nitrophenylacetat versetzt. Dieses Substrat
wurde durch die auf der Zelloberfläche verankerten Esterasen
zu p Nitrophenol umgesetzt. Die Zunahme der Absorption bei λ = 405
nm konnte spektralphotometrisch bei neutralem pH und 32°C über
einen Zeitraum von 2 min gegen eine zellfreie Referenz bestimmt
werden. Als Negativ-Kontrolle diente der jeweilige Pichia-Stamm
transformiert mit dem Leervektor pPIC9.
-
Zur
Auswertung der Daten wurden die Absorptionen von mindestens drei
Messreihen gemittelt und graphisch gegen die Zeit aufgetragen. Die
Steigung λ A/min der resultierenden Geraden beschreibt
die Substratumsetzung pro Zeiteinheit und wurde als Maß für
die Effektivität der Esterase-Verankerung herangezogen.
Ein Vergleich der Steigungen der unterschiedlichen Zellwand-Proteine
ließ Rückschlüsse auf deren Eignung als
P. pastoris-Zelloberflächen-Anker zu.
-
6 zeigt
die Ergebnisse der Aktivitätsmessungen getrennt für
die beiden Stämme GS115 und KM71. Jede Graphik enthält
zusätzlich eine Messreihe früherer Untersuchungen
der Esterase A-Aktivität in einem etablierten S. cerevisiae-Zellwandanker-System,
was eine anschauliche Einordnung der aktuellen Messergebnisse ermöglichen
soll. Im S. cerevisiae-Stamm BY4742 wurde die Esterase A mittels
eines Cwp2p-Ankers auf der Oberfläche immobilisiert und
die Messungen unter gleichen Parameter durchgeführt. Es
ist zu beachten, dass die S. cerevisiae-Zellen im Gegensatz zu den
Pichia-Proben unter optimierten Bedingungen in einem Bioreaktor
kultiviert wurden.
-
Bestimmung der Esterase-Aktivität
-
Volumenaktivität
-
Auf
der Basis der Ergebnisse des enzymatischen Aktivitätstests
war es möglich, die Volumenaktivitäten der Testkulturen
zu bestimmen. Eine ,Unit (U)' wurde definiert als die Menge an Esterase
A, die unter den beschriebenen Parameter benötigt wird,
um 1 μMol p Nitrophenol pro min freizusetzen. Zur Ermittlung
des molaren Extinktionskoeffizienten e wurde eine p Nitrophenol-Verdünnungsreihe
mit Endkonzentrationen von 0,002 mM bis 0,225 mM erstellt und deren
Absorptionswerte graphisch gegen die jeweilige Konzentration aufgetragen.
Eine Regression der erhaltenen Geraden ergab den molaren Extinktionskoeffizienten
e = 3,7283.
-
Die
Berechnung der Volumenaktivität erfolgte nach der Formel:
-
Trotz
einer ubiquitär vorhandenen enzymatischen Aktivität,
traten abhängig von der gewählten Stamm-Anker-Konstellation
signifikante Unterschiede im Vergleich der Einzel-Aktivitäten
auf. In 7 sind die Volumenaktivitäten
der getesteten Konstrukte dargestellt; zur besseren Vergleichbarkeit
wurden alle Volumenaktivitäten für Zellsuspensionen
der OD600 = 10 bestimmt. Der Cwp2p-Anker zeigte in beiden Stämmen eine
vergleichbare Aktivität (GS115: 251 mU/ml; KM71: 302 mU/ml)
und stellte sich in Relation zu den übrigen als der ineffektivste
heraus. Die Verankerung mit Pir1p lag bei KM71 mit 407 mU/ml etwa
im Bereich des Cwp2p-Ankers. Bei GS115 konnte mit Pir1p hingegen
eine fast doppelt so hohe Aktivität (805 mU/ml) verzeichnet
werden, eine Verdreifachung der Effektivität des Cwp2p-Ankers
in diesem Stamm. Die effektivsten Immobilisierungen wurden in beiden
Stämmen mit dem Zellwandprotein Sed1p erreicht. Mit 1.599
mU/ml lag die Aktivität im Stamm GS115 zweimal so hoch
wie bei Pir1p und sechsmal so hoch wie bei Cwp2p. Eine außerordentlich
hohe Esterase-Aktivität konnte bei KM71-Zellen mit Sed1p-Anker
erreicht werden. Die bereits in 6(B) subjektiv erkennbare
Immobilisierungs-Effizienz erreichte eine Volumenaktivität
von 3.169 mU/ml und lag somit zweimal höher als der gleiche
Anker im GS115-Stamm; im Vergleich zum Cwp2p-Anker konnte die Effektivität
um das Zehnfache gesteigert werden. Selbst die unter optimalen Bedingungen
kultivierte S. cerevisiae-Probe erreichte nur ein Sechstel dieser
Aktivitätswerte.
-
Spezifische Aktivität
-
Der
Vergleich der bisherigen Messergebnisse basierte auf der Annahme,
dass beide Pichia-Stämme bei gleicher OD600 über
eine vergleichbare Zellzahl und somit Gesamtproteinmenge verfügen.
Um auszuschließen, dass die gemessenen Aktivitätsunterschiede
auf abweichende Gesamtmengen an Zellprotein zurückgeht
und um eine spätere Vergleichbarkeit der Zellankersysteme
in z. B. anderen Hefe-Gattungen zu ermöglichen, wurden
die Aktivitäten in Relation zur Proteinmenge dargestellt.
Zur Ermittlung der Gesamt-Proteinmenge wurden BMG-Kulturen von GS115
und KM71 mit einer OD600 von ca. 50–60 verwendet. Die Zellen wurden
mittels Glasperlen aufgeschlossen und der Ansatz danach mit H2O
dest. wieder auf das ursprüngliche Volumen aufgefüllt.
-
Der
Proteingehalt einer 1:1-Verdünnung dieser Lösung
wurde mittels BCA Protein Assay Kit (PIERCE) bestimmt. Als Referenzwerte
dienten parallel gemessene BSA-Standards (25 1.000 μg/ml),
aus denen später eine Regressionsgerade erstellt und die
Proteinkonzentrationen der Proben errechnet wurden.
-
Umgerechnet
auf die in der Küvette vorhandene optische Dichte von 0,32
ergaben sich für GS115: 2,18 μg/ml Protein, für
KM71: 2,17 μg/ml. Die beinahe identischen Werte lassen
demnach einen Vergleich der beiden Stämme auch auf Ebene
der Volumenaktivität zu.
-
4. Zellwandverankerung der
MMPs
-
Nachdem
Sed1p für Esterase A als geeigneter Zellwandanker in P.
pastoris identifiziert worden war, wurde dessen Anwendbarkeit bei
der Immobilisierung der Matrix-Metalloproteasen untersucht. Hierzu
wurden geeignete Expressionsplasmide hergestellt und die Zelloberflächen-Expression
der rekombinanten Proteine fluoreszenzmikroskopisch nachgewiesen.
-
Herstellung der Expressionsplasmide pMMPACE
II und IX
-
Die
Vektoren zur Expression zellwandverankerter MMPs wurden analog zu
denen der Esterase-Expression gestaltet. Hierzu wurde durch Restriktion
mit EcoRI/BlnI das Esterase A-Gen aus pPIC9-SED1-EstA entfernt und
durch das jeweilige MMP-Gen aus dem Vektor TOPO-MMP (EcoRI/XbaI)
ersetzt. Die Ligation der Fragmente wurde über die kompatiblen überhängenden
Enden von XbaI und BlnI ermöglicht, was zur Zerstörung
beider Erkennungssequenzen führte. Die resultierenden Proteine
besaßen nach vollständiger Prozessierung einen
um vier Aminosäuren (Tyr Val Glu Phe) verlängerten
N Terminus an ihrer Prodomäne und waren an ihrem C Terminus über
zwei weitere Aminosäuren (Ser-Arg) mit Sed1p fusioniert.
Die MMP-Expressionsplasmide erhielten die Bezeichnungen pMMPACE
II (MMP 2) und pMMPACE IX (MMP 9). Die Plasmide wurden mit StuI
linearisiert und beide Pichia-Stämme mittels Elektroporation
transformiert.
-
Indirekte Immunfluoreszenz
-
Zum
fluoreszenzmikroskopischen Nachweis einer erfolgreichen MMP-Verankerung
auf der Zelloberfläche von P. pastoris wurden die auf His-d/o-Platten
selektierten KM71-Klone in His-d/o-Flüssigmedium angeimpft, über
Nacht bei 30°C geschüttelt und von dieser Lösung
eine BMG-Kultur im Erlenmeyerkolben 4%ig beimpft. Nach 24 h bei
28°C (165 rpm) erfolgte das Shiften auf BMM-Medium (100
mM Na-Phosphatpuffer, pH 7,0). Die Hauptkultur wurde 72 h bei 28°C
und 165 rpm inkubiert und zweimal täglich mit 1% Methanol
gefüttert.
-
Zur
Bindung des primären Anti-MMP-Antikörpers (ABCAM)
wurde dieser in einer Verdünnung von ca. 1:25 appliziert.
Nach einer Stunde Inkubation bei 20°C auf einem Drehrad
wurde nach mehreren Waschschritten FITC-markierter Anti-Rabbit-IgG-AK
(SIGMA) in der Verdünnung 1:15 als sekundärer
Antikörper zugegeben und der Ansatz weitere 45 min bei
20°C im Dunkeln gedreht. Nach weiteren Waschschritten wurde
die Fluoreszenz der Hefe-Zellen fluoreszenzmikroskopisch (λ A
= 480 nm, λ E > 510
nm) dokumentiert und die Bilder einem digitalen Schwarzabgleich
und einer Unschärfereduktion unterzogen. Als Negativ-Kontrolle
dienten die jeweils mit pPIC9-Leervektor transformierten Hefe-Stämme,
die sowohl mit Anti-MMP 2- als auch Anti-MMP 9-Antikörpern
behandelt und auf die gleiche Weise dokumentiert wurden. Die Negativ-Kontrollen
zeigten weder nach Anti-MMP 2- noch nach Anti-MMP 9-AK-Behandlung
eine Fluoreszenz. Bei den MMPACE Zellen war die Markierung der MMPs
in der Zellwand als deutlich fluoreszierender Ring erkennbar. Dabei
erschien die Fluoreszenz von KM71 mit pMMPACE II subjektiv um einiges
stärker als die von KM71 mit pMMPACE IX und trat auch bei
mehr Zellen auf. Wiederholungen der Fluoreszenz-Mikroskopie zu späteren
Zeitpunkten führten zu identischen Resultaten. Die Ergebnisse
veranschaulichen die erfolgreiche Verankerung der humanen Gelatinasen
auf der Zelloberfläche von P. pastoris.
-
Zusammenfassend
konnten im Rahmen der Experimente zur Zellwandverankerung in P.
pastoris drei Zellwandanker bezüglich ihrer Immobilisierungs-Effektivität
untersucht werden. Die Zelloberflächen-Expression einer
bakteriellen Esterase ermöglichte eine Quantifizierung
und somit einen Vergleich der unterschiedlichen Ankersequenzen.
Dabei konnte mit Sed1p ein für P. pastoris neuartiger Zellwandanker
identifiziert werden, dessen Effizienz die bisher bekannten Ankersysteme
um ein Vielfaches übertrifft. Durch die Fusion dieses Zellwandproteins
mit dem C-Terminus der humanen Gelatinasen A und B konnten diese
auf der Zelloberfläche von P. pastoris verankert und mittels
indirekter Immunfluoreszenz-Mikroskopie dargestellt werden.
-
Um
festzustellen, ob die Enzyme in einer biologisch aktiven Form vorhanden
waren und für die Etablierung des angestrebten Testsystems
verwendet werden konnten, bedurfte es nachfolgend eines geeigneten MMP-Aktivitäts-Assays.
-
5. Validierung des Gelatinase-Assays
-
Da
die praktische Anwendung des Bioassays die qualitative Testung und
den quantitativen Vergleich von Hemmstoffen gegen Matrix-Metalloproteasen
zum Ziel hatte, wurde abschließend die Funktionalität
des Testsystems anhand eines kommerziell erhältlichen MMP-Inhibitors
verifiziert. Als allgemeiner MMP-Hemmstoff diente der Metallchelator
1,10 Phenanthrolin. Der Inhibitor wurde in einer Konzentrationsreihe
von 1 mM bis 0,063 mM mit MMPACE-Zellen versetzt und die Rest-Aktivitäten
gemessen. Die Steigungen der linearen Phasen der Messkurven wurden
anschließend graphisch gegen die 1,10 Phenanthrolin-Konzentration
aufgetragen (vgl. 9B). Die Graphik bestätigte
für beide MMPs einen kausalen Zusammenhang zwischen der Steigerung
der Hemmstoff-Konzentration und der Verminderung der gelatinolytischen
Aktivität im Messansatz. MMP 2 zeigte bei einer Konzentration
von ca. 0,06 mM Phenanthrolin eine Restaktivität von 50%;
bei Konzentrationen > 0,25
mM wurden die Gelatinasen fast vollständig gehemmt. Durch
die an sich niedrigere Grundaktivität von MMP 9 erfolgte
dessen vollständige Hemmung bereits ab Inhibitor-Konzentrationen > 0,1 mM. Die Funktionalität
des Testsystems konnte somit erfolgreich validiert werden und erlaubt
die praktische Anwendung in der Inhibitor-Forschung.
-
Im
Rahmen einer fächerübergreifenden Kooperation
mit dem Lehrstuhl für Organische Chemie der Universität
des Saarlandes (Prof. Dr. U. KAZMEIER) wurden erste Experimente
zur praktischen Verwendung des Testsystems durchgeführt.
Die Entwicklung neuartiger Hemmstoffe befand sich zum aktuellen
Zeitpunkt noch in einem Zwischenstadium, weshalb nur zwei Intermediate
auf ihre Wirksamkeit getestet werden konnten. Die Darstellung der
Carboxylat- bzw. Hydroxamat-Inhibitoren MP 137 und MP 146 basierte
auf der Strukturoptimierung eines funktionalen Gelatinase-Inhibitors.
Der MMPACE-Assay konnte einen qualitativen Nachweis der Wirksamkeit
der Inhibitoren erbringen. Durch den unpolaren Charakter und die
somit sehr schwache Löslichkeit der Verbindungen war jedoch
keine Quantifizierung der Inhibitor-Wirkung möglich (Daten
nicht gezeigt).
-
6. Quantifizierung der MMP-Aktivität
der Wirtszellen
-
Die
Immobilisierung der MMPs auf der Zelloberfläche erschwerte
eine direkte Bestimmung des Proteingehalts und der relativen MMP-Aktivität.
Daher erfolgte die Quantifizierung indirekt über einen
Vergleich mit den Messdaten bekannter MMP-Konzentration.
-
Als
Standards für die Bestimmung der vorhandenen MMP-Konzentration
dienten in Säugerzellen rekombinant hergestellte Gelatinasen,
die zuvor mit APMA aktiviert und gereinigt worden waren (,human
active MMP 2 bzw. 9', CALBIOCHEM). Zur Erstellung von Eichgeraden
wurden die gelatinolytischen Aktivitäten in Verdünnungsstufen
von 400 ng/ml bis 12,5 ng/ml bestimmt (leere Rauten) und die Steigungen
der linearen Kurvenabschnitte graphisch gegen die Konzentration
aufgetragen (siehe 10). Um den möglichen
Einfluss der Zellen auf das Messergebnis zu berücksichtigen,
wurden die Verdünnungsstufen in 1 × Reaction Buffer
mit einer KM71-Negativ-Kontrolle (OD600 = 2,5; pPIC9-Leervektor)
erstellt. Aus den mathematischen Funktionen der Regressionsgeraden
ließ sich anschließend die jeweilige MMP-Konzentration
in den mitgeführten MMPACE-Proben (gefüllte Rauten)
berechnen. Obwohl die Aktivitäten der kommerziell erworbenen
,active MMP 2'-Proben bei gleichen Konzentrationen etwa um den Faktor
6,7 höher lagen als bei ,active MMP 9', wurden bei der
Quantifizierung der MMPACE-Stämme nahezu identische Ergebnisse
erhalten. Bei der im Messansatz eingestellten OD600 von 2,5 konnte
für MMP 2 eine Konzentration von 147 ng/ml, bei MMP 9 von
142 ng/ml errechnet werden. Umgerechnet auf die Zellzahl des ursprünglichen
Kulturmediums (OD600 ~ 80) liegt die Masse der aktiven MMPs für
beide Stämme bei über 4,5 mg/l Kulturmedium. Die
getesteten Proben waren 72 h induziert und vorher nicht aktiviert
worden.
-
Basierend
auf diesen Daten, wurde am Beispiel von MMP 2 die Anzahl der auf
der Zelloberfläche verankerten Enzyme errechnet. Ausgehend
von einem Molekulargewicht von 66.000 g/ml ergab sich für
1 ml einer Suspension der OD600 = 1 (mit einer Masse von 147 ng/2,5
= 58,8 ng = 5,88 × 10–8 g) eine Molekülzahl
von 8,9 × 10–13 Mol = 5,4 × 1011. Bei
einer angenommenen Zahl von 107 Zellen pro ml bei OD600 = 1 ergibt
sich somit ein Wert von 5,4 × 104 MMP-Molekülen
pro Zelle.
-
Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
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werden.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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