DE202021004299U1

DE202021004299U1 - Fusionspolypeptide für die Zielpeptidherstellung

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Publication number: DE202021004299U1
Application number: DE202021004299.7U
Authority: DE
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2020-04-27
Filing date: 2021-04-27
Publication date: 2023-10-13
Anticipated expiration: 2031-04-28
Also published as: WO2021219585A3; US20230203109A1; EP3904525A1; WO2021219585A2; MX2022013416A; EP4143331A2; CN115605604A; CA3180878A1

Abstract

Fusionspolypeptid, umfassend oder bestehend aus in Richtung vom N-Terminus zum C-Terminus
(i) eine Reinigungsdomäne,
(ii) eine Autoprotease-Domäne,
(iii) eine Zielpeptiddomäne,
(iv) optional: eine Signalsequenz, und
(v) optional: eine Linker-Sequenz,
wobei die Autoprotease-Domäne (ii) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.: 117 oder eine Aminosäuresequenz mit einer Sequenzidentität von 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr zur SEQ ID No.: 117 umfasst oder daraus besteht, und
wobei die Reinigungsdomäne (i) an eine Kohlenhydratmatrix bindet und mindestens eine Aminosäure-Konsens-Motivsequenz gemäß SEQ ID No.: 1, SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.: 3, SEQ ID No.: 4, SEQ ID No.: 5, SEQ ID No.: 6, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 8 oder SEQ ID No.: 9 umfasst oder daraus besteht.

Description

Technischer Bereich
Die vorliegende Erfindung betrifft Fusionspolypeptide, Nukleinsäuremoleküle, die für solche Fusionspolypeptide kodieren und genetisch veränderte Zellen, umfassend solche Nukleinsäuremoleküle. Zusätzlich wird ein Verfahren zum Herstellen eines Zielpeptids und Zielpeptidmischungen beschrieben. Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung gehen aus den beigefügten Ansprüchen und der Beschreibung, einschließlich der Beispiele hervor.
Hintergrund der Erfindung
Der Bedarf an Peptiden und Proteinen mit hoher Reinheit für verschiedene Industrie- und Forschungsanwendungen hat in den letzten Jahren kontinuierlich zugenommen. Es ist daher besonders gewünscht, Peptide mit einer vorbestimmten Sequenz auf wirtschaftlich günstige Weise herzustellen. Bis heute stützt sich die industrielle Peptidproduktion auf zwei Möglichkeiten: die Herstellung durch chemische Synthese und die Herstellung mit biotechnologischen Methoden. Die chemische Synthese hat den Nachteil, dass es sich um ein kostspieliges und zeitaufwändiges Verfahren handelt und nicht alle gewünschten Peptide in industriellem Maßstab hergestellt werden können. Peptide mit einem hohen Gehalt an hydrophoben Aminosäuren sind beispielsweise nicht durch chemische Synthese herstellbar, und es ist besonders schwierig, Peptide mit einem N-terminalen Prolin herzustellen. Außerdem erfordert die chemische Synthese die Verwendung von aggressiven Reagenzien und kostspieligen Reinigungsschritten. Andererseits können diese Nachteile aber auch durch biotechnologische Synthese überwunden werden. Biotechnologische Systeme wie gentechnisch modifizierte E. coli sind geeignet, die gewünschten Zielpeptide oder -proteine kostengünstig und skalierbar herzustellen. Dennoch bleiben auch hier die Reinigungsprozesse ineffizient und kostspielig, da Zellen wie E. coli eine Vielzahl verschiedener Metaboliten produzieren, bei denen es sich ebenfalls um Proteine und Peptide handelt, die spezifisch vom erwünschten Produkt getrennt werden müssen.
WO 2006/113957 offenbart ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines heterologen Polypeptids, umfassend die Expression eines Fusionspolypeptids, wobei das Fusionspolypeptid eine Mutante der Autoprotease N^pro des Pestivirus und ein zweites C-terminales verbundenes Polypeptid umfasst, wobei das zweite Polypeptid autoproteolytisch abgespalten werden kann. Außerdem können am N-Terminus weitere Fusionsdomänen vorhanden sein, die für die Bindung an ein Affinitätschromatographiesystem erforderlich sind, z. B. Poly(aminosäuren) wie Polylysin oder Epitop-Tags, d. h. kurze Peptidsequenzen, für die ein spezifischer Antikörper verfügbar ist. Zusätzlich umfasst die Methode komplexe Reinigungsschritte wie Affinitätschromatographie und HPLC. Da für die Affinitätschromatographie giftige und teure Reagenzien verwendet werden, ist das beschriebene Verfahren nicht leicht skalierbar und kostenineffizient. Die resultierenden Peptide müssen deshalb weiter gereinigt werden, um die toxischen Verbindungen aus den Peptiden zu entfernen.
WO 2008/052387 offenbart stärkebindende Domänen und rekombinante Polypeptide, die stärkebindende Domänen enthalten, wobei die stärkebindenden Domänen in N-terminaler und/oder C-terminaler Richtung des Zielpolypeptids arrangiert sind. Die Fusionspolypeptide können durch Chromatographie auf einem Stärketräger gereinigt werden. Die offengelegte Methode bietet nur die Verwendung von bekannten Stärkebindungsstellen, während die für die Reinigung verwendete Bindungsdomäne nicht leicht abzutrennen ist.
Genauer gesagt offenbaren EP 2746390 und AU 2011253661 Fusionspolypeptide, die in einem Affinitätschromatographiesystem mit einer Autoprotease N^pro aus Pestivirus verwendet werden können. Beide Dokumente offenbaren keine Methoden, um den Nachteil der Verwendung eines N^pro in Bezug auf die die Kontrolle der Autoprotease-Aktivität in einem sehr spezifischen pH-Bereich und eine hohe Abhängigkeit von Reaktionsbedingungen wie z. B. der gesetzten Temperatur zu überwinden. Darüber hinaus können geringfügige Änderungen der Reaktionsumgebung zu einer Aktivierung oder Deaktivierung der autoproteolytischen Domäne führen.
WO 2019/138125 offenbart auch Fusionspolypeptide mit einer Autoproteasedomäne aus N^pro. Außerdem werden Fusionspolypeptide mit einer CBM-Affinitätsdomäne offengelegt. Die internationale Anmeldung offenbart keine spezifischen architektonischen Konzepte für die Gestaltung des CBM oder der autoproteolytischen Domäne, um die Nachteile der Instabilität und der hohen Abhängigkeit der Fusionspolypeptide von festen Reaktionsbedingungen auszugleichen. Die starke Abhängigkeit von festgelegten Reaktionsbedingungen kann zu Produktverlusten oder Verunreinigungen im Produkt führen. Reinigungsprozesse, bei denen N^pro als Autoprotease eingesetzt wird, sind in ihrer Leistung begrenzt. Wenn die Autoprotease N^pro als solche oder als Teil eines Fusionspolypeptids in einem Standard-E.co//-Expressionssystem exprimiert wird, wird sie in Einschlusskörpern abgelagert. Sobald die Autoprotease N^pro aus den Einschlusskörpern gewonnen und in ihre native Konformation zurückgefaltet wird, erfolgt die Autoproteolyse, da die für die Rückfaltung der Einschlusskörper erforderlichen Bedingungen und die Bedingungen für die Autoproteolyse von N^pro übereinstimmen. Dementsprechend sind die Bindungskinetik und die Affinität der CBM-Affinitätsdomäne für die Reinigung und die Ausbeute gleichzeitig der begrenzende Faktor des Reinigungsprozesses. Es muss eine Kompromissentscheidung getroffen werden zwischen hoher Ausbeute und geringer Reinheit (N^pro ist nicht vollständig aktiviert, aber das Polypeptid kann aus den Einschlusskörpern zurückgewonnen werden) oder hoher Reinheit und geringer Ausbeute des Produkts (N^pro ist vollständig aktiviert, aber nicht das gesamte Polypeptid kann aus den Einschlusskörpern zurückgewonnen werden). Das Hauptziel der vorliegenden Erfindung war es daher, verbesserte Fusionspolypeptide bereitzustellen, die in einem Verfahren zur Herstellung von Zielpeptiden verwendet werden können, die mit allgemein verfügbaren chemischen oder biotechnologischen Methoden nicht oder nur ineffizient hergestellt werden können. Vorzugsweise erlauben solche Polypeptide oder Methoden, einen oder mehrere, vorzugsweise alle der oben genannten Nachteile früherer, aus dem Stand der Technik bekannter Methoden zu vermeiden. Weitere der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Gegenstände können der Beschreibung entnommen werden, einschließlich der Beispiele, und den hierin erwähnten Vorteilen ergeben.
Zusammenfassung der Erfindung
Dieses Hauptziel wird durch die Bereitstellung von Fusionspolypeptiden umfassend oder bestehend aus in Richtung vom N-Terminus zum C-Terminus: eine Reinigungsdomäne, eine Autoprotease Domäne, eine Zielpeptiddomäne, gegebenenfalls eine Signalsequenz und gegebenenfalls eine Linkersequenz gelöst, wobei die Reinigungsdomäne (i) an eine Kohlenhydratmatrix bindet und mindestens einer der Aminosäure-Konsensus-Motivsequenzen gemäß SEQ ID No.: 1, SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.: 3, SEQ ID No.: 4, SEQ ID No.: 5, SEQ ID No.: 6, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 8 oder SEQ ID No.: 9 umfasst oder daraus besteht.
Außerdem werden Nukleinsäuren, die für solche Fusionspolypeptide kodieren, und genetisch veränderte Zellen, die solche Fusionspolypeptide enthalten, bereitgestellt.
Ebenfalls beschrieben ist ein Verfahren zur Herstellung eines Zielpeptids. Dieses Verfahren umfasst die Schritte des Bereitstellens einer genetisch veränderten Zelle gemäß der vorliegenden Erfindung, Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, die geeignet für die Expression eines erfindungsgemäßen Fusionspolypeptids sind, Gewinnen des Fusionspolypeptids und gegebenenfalls Entfalten des erhaltenen Fusionspolypeptids sowie gezieltes Rückfalten des genannten Fusionspolypeptids sind, Inkontaktbringen des erhaltenen Fusionspolypeptids mit einer Kohlenhydratmatrix, Spalten des Fusionspolypeptids durch Aktivieren der Autoprotease-Domäne des Fusionsproteins, wodurch ein Zielpeptid erhalten wird, und Sammeln eines Gemischs, das das Zielpeptid umfasst.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Gemisch, umfassend ein Zielpeptid, hergestellt, welches mit einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden kann.
Kurze Beschreibung der Sequenzen

SEQ ID Nos.: 1 bis 9 sind künstliche Aminosäuresequenzen für Konsensmotive der Reinigungsdomäne.
SEQ ID Nos.: 10 bis 13 sind künstliche Aminosäuresequenzen, die für die Reinigungsdomäne kodieren.
SEQ ID Nos.: 14 bis 116 sind Aminosäuresequenzen, die für Kohlenhydratbindende Module von verschiedenen Mikroorganismen kodieren.
SEQ ID Nos.: 117 ist eine künstliche Aminosäuresequenz, die für die Konsensusdomäne der Autoprotease-Domäne kodiert.
SEQ ID Nos.: 118 bis 120 sind künstliche Aminosäuresequenzen, die für die Autoproteasedomäne kodieren.
SEQ ID Nos.: 121 und 122 sind künstliche Aminosäuresequenzen, die für bevorzugte Linker Sequenzen kodieren.
SEQ ID Nos.: 123 bis 130 sind künstliche Aminosäuresequenzen, die für Signalsequenzen für das intrazelluläre Targeting des erfindungsgemäßen Fusionspolypeptids kodieren.
SEQ ID Nos.: 131, 133, 135, 137, 139, 141 und 143 sind künstliche Aminosäuresequenzen die für erfindungsgemäße Fusionspolypeptide kodieren.
SEQ ID Nos.: 132, 134, 136, 138, 140, 142 und 144 sind künstliche Nukleinsäuresequenzen die für erfindungsgemäße Fusionspolypeptide kodieren.

Beschreibung der Abbildungen

veranschaulicht die Ergebnisse einer GFP-Messung in der Einschlusskörperfraktion.
zeigt die Bindung des erfindungsgemäßen Fusionspolypeptids an verschiedene Stärkeproben.
zeigt eine SDS-PAGE mit der Expression von Fusionspolypeptiden mit SEQ ID No.: 131 und GFP als Zielpolypeptid im Vergleich zu einem nach WO'125 konstruierten Fusionspolypeptid mit GFP als Zielpolypeptid. Gel a) zeigt uninduzierte (Bahn 1) und induzierte (Bahn 2) BL21-Zellen, die einen pET-Vektor mit einem Fusionspolypeptid gemäß SEQ ID No.: 131 mit GFP als Produkt tragen. In Gel a) bezeichnet ein Sternchen das Fusionspolypeptid mit dem Produkt GFP bei 70 kDa. Zwei Sternchen zeigen das Fusionspolypeptid ohne das Produkt mit 43 kDa. Drei Sternchen zeigen das Produkt GFP mit 27 kDa. Eine kleine Menge des Polypeptids wurde bereits aktiviert und autoproteolysiert. Gel b) zeigt uninduzierte (Bahn 2) und induzierte (Bahn 3) BL21-Zellen, die einen pET-Vektor mit einem GFP-tragenden Fusionspolypeptid von WO'125 tragen. Ein Sternchen bezeichnet das Fusionspolypeptid mit dem Produkt GFP bei 75 kDa. Zwei Sternchen zeigen das Fusionspolypeptid ohne das Produkt mit 48 kDa. Drei Sternchen zeigen das Produkt GFP bei 27kDa. Bei diesem Fusionspolypeptid wurde unter denselben Bedingungen, die für das Fusionspolypeptid gemäß SEQ ID No.: 131 verwendet wurden, kein intaktes Fusionspolypeptid in Einschlusskörpern gebildet. Die Bande bei 24 kDa ist das Enzym, das für die Chloramphenicol-Resistenz benötigt wird.
zeigt eine SDS-PAGE mit verschiedenen Fraktionen aus dem Aufreinigungsprozess zur Gewinnung von GFP als Zielpolypeptid. Das Fusionspolypeptid mit SEQ ID No.:131 und GFP als Zielpolypeptid wird mit Fusionspolypeptidkonstrukten gemäß WO'125 verglichen. Diese Gele zeigen, dass es im Vergleich zum Fusionspolypeptid mit SEQ ID No.: 131 schwierig ist, die Fusionspolypeptide von WO'125 während des Downstream-Processings inaktiv zu halten. Das Fusionspolypeptid muss während der Lyse inaktiv sein, da jede Aktivität der Autoprotease vor dem geplanten Aktivierungsschritt zu einem Verlust der Produktausbeute führt. Gel a) zeigt Proben des Reinigungsprozesses unter Verwendung des Fusionspolypeptids gemäß SEQ ID No.: 131. Gel b) zeigt ein Fusionspolypeptidkonstrukt aus WO'125 und Gel c) zeigt ein weiteres Fusionspolypeptidkonstrukt aus WO'125. Bahn 1 jedes Gels zeigt den ersten Überstand nach der Zelllyse, Bahn 2 zeigt den zweiten Überstand nach dem zweiten Waschschritt in Waschpuffer. Die Bahnen 3 und 4 zeigen die Waschschritte in bidestilliertem Wasser und Bahn 5 zeigt die Einschlusskörper-Pelletfraktion. Ein Sternchen bezeichnet das Fusionspolypeptid einschließlich des GFP-Produkts mit 70 kDa in a), 75 kDa in b) und 85 kDa in c). Zwei Sternchen zeigen das Fusionspolypeptid ohne das Produkt mit 43 kDa in a), 48 kDa in b) und 58 kDa in c). Drei Sternchen zeigen das Produkt GFP bei 27 kDa. Eine kleine Menge des Polypeptids wurde bereits bereits aktiviert und autoproteolysiert worden in allen Proben a) bis c). Allerdings ermöglicht nur das Fusionspolypeptid gemäß SEQ ID No.: 131 die erwünschte Verarbeitung der Einschlusskörper im Gegensatz zu den Fusionspolypeptiden von WO'125.
zeigt eine SDS-PAGE, die die Stabilität des Fusionspolypeptids gemäß SEQ ID No.: 131 mit GFP als Zielpolypeptid in Denaturierungs- und Aktivierungspuffer bei verschiedenen pH-Werten darstellt. Bahn 1 zeigt das Lysatpellet vor dem Waschen. Bahn 2 zeigt die gewaschenen Einschlusskörper, die in Denaturierungspuffer (III) mit 2 % Natriumdodecylsulfat (SDS) aufgelöst wurden. Die Probe in Bahn 2 wurde zwei Wochen nach dem Auflösen der Einschlusskörper in Denaturierungspuffer (III) entnommen und bei Raumtemperatur gelagert. Die Probe in Bahn 3 wurde zwei Wochen, nachdem das SDS entfernt und die Probe bei 4 °C gelagert worden war, aus derselben Fusionspolypeptidprobe entnommen. In Bahn 2 und 3 lag der pH-Wert deutlich über 9,0. Die Bahnen 4 und 5 zeigen Proben, die von der gleichen Probe wie die in Bahn 3 stammen. Der SDS-freie Denaturierungspuffer wurde mit Aktivierungspuffer (II) mit einem pH-Wert von 7,2 verdünnt, wobei der Aktivierungspuffer eine niedrige Konzentration von Arginin und Saccharose enthielt (Bahn 4) und eine hohe Konzentration von Arginin und Saccharose (Bahn 5) mit einem pH-Wert von 7,2. Die Proben wurden 60 Minuten lang bei Raumtemperatur in den Puffer getaucht. Bahn 6 zeigt die gleiche Probe wie Bahn 3. Sie wurde als Referenzprobe für das vorliegende Gel verwendet. In Bahn 7 wurde die gleiche Probe wie in Bahn 6 mit Aktivierungspuffer (I) mit pH 10 verdünnt.
zeigt die Reinigung unter Verwendung des Fusionspolypeptids gemäß SEQ ID No.: 131 und GFP als Zielpeptid mit einem Elugramm zum Nachweis der Polypeptidmenge und der entsprechenden SDS-PAGE. Die Probe wird in den Puffer mit pH 9,4 geladen und GFP wird aus dem Fusionspolypeptid und der Säule mit Aktivierungspuffer bei pH 7,2 freigesetzt.

Ausführliche Beschreibung
Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Fusionspolypeptid umfassend oder daraus bestehend vom N-Terminus zu C-Terminus

(i) eine Reinigungsdomäne,
(ii) eine Autoproteasedomäne,
(iii) eine Zielpeptiddomäne,
(iv) optional: eine Signalsequenz, und
(v) optional: eine Linker-Sequenz,

Daher bezieht sich die vorliegende Erfindung in erster Linie auf ein Fusionspolypeptid, umfassend oder bestehend aus in Richtung vom N-Terminus zum C-Terminus

(i) einer Reinigungsdomäne,
(ii) einer Autoprotease-Domäne,
(iii) eine Zielpeptiddomäne,
(iv) optional: eine Signalsequenz, und
(v) optional: eine Linker-Sequenz,

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Fusionspolypeptids bezieht sich auf ein Fusionspolypeptid, das in Richtung vom N-Terminus zum C-Terminus umfasst oder daraus besteht

(i) eine Reinigungsdomäne,
(ii) eine Autoprotease-Domäne,
(iii) eine Zielpeptiddomäne,
(iv) optional: eine Signalsequenz, und
(v) optional: eine Linker-Sequenz,

Vorzugsweise erhöht die Platzierung einer Signalsequenz gemäß SEQ ID No.: 126, SEQ ID No.: 127, SEQ ID No.: 128 und SEQ ID No.: 129 in einer N-terminalen Position zu den Sequenzen wie oben beschrieben die Fähigkeit des Fusionspolypeptids, sich in Einschlusskörpern abzulagern und unter basischen Bedingungen zurückgefaltet werden zu können.
Die Reinigungsdomäne sorgt für die Bindung des Fusionspolypeptids an eine Kohlenhydratmatrix. Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass die Kohlenhydratbindungsmodule (CBM) natürlich vorkommender Amylasen als Grundlage für die Konstruktion einer Reihe von Bausteinen mit einer Konsens-Motivsequenz verwendet werden können, nämlich die Sequenzen SEQ ID No.:1 bis SEQ ID No.:9, die miteinander kombiniert werden können, um die Reinigungsdomäne an die gewünschten Reaktionsbedingungen anzupassen. Durch die Kombination der einzelnen Bausteine miteinander, kann die Bindungsstärke der die Bindungsstärke der Reinigungsdomäne an die Kohlenhydratmatrix erhöht werden, die Bindung die Bindung unter bestimmten Reaktionsbedingungen (z. B. hohe lonenstärke) stabilisiert werden und die Größe der Reinigungsdomäne kann variiert werden, um sie an die gewünschte Zielpeptiddomäne anzupassen.
Verschiedene CBMs erfüllen unterschiedliche Funktionen, da sie verschiedene Polysaccharidbindungen oder Motiven in Polysacchariden binden. Der funktionelle Zweck von CBMs ist die Bindung des Fusionsproteins an Polysaccharide, bei denen die Monomere über glykosidische Bindungen zwischen D- oder L-Glucose oder anderen Kohlenhydratmonomeren verbunden sind. Vorzugsweise umfasst die Reinigungsdomäne mindestens eine Konsensussequenz oder besteht aus einer solchen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den CBM-Klassen 26, 53, 41, 35, 48 oder 58.
Die Fähigkeit der Reinigungsdomäne, sich in Einschlusskörpern abzulagern und in basischer Umgebung aktiv zu sein, kann durch die Wahl der Signalsequenz und die Wahl der Domänen der Kohlenhydratbindungseinheit beeinflusst werden. Die Signalsequenzen gemäß SEQ ID No.: 126 bis 129 beeinflussen die Löslichkeit des N-Terminus während der Expression und der Rückfaltung.
Die Autoproteasedomäne hat die Funktion einer autoproteolytischen Spaltstelle, die das Zielpeptid von der Reinigungsdomäne und der Autoproteasedomäne trennt. Diese Domäne wird unter bestimmten Reaktionsbedingungen aktiviert. Die erfindungsgemäße Autoproteasedomäne hat den Vorteil, dass sie auf der Basis verschiedener natürlich vorkommender Autoproteasen konstruiert werden kann, allerdings mit einem engen Aktivierungsfenster, welches sich genau steuern lässt. Daher hat die erfindungsgemäße Autoproteasedomäne außerhalb ihrer Reaktionsbedingungen eine sehr geringe Aktivität zur Abspaltung des Zielpeptids von der Reinigungsdomäne, und durch die Verwendung einer solchen Autoprotease können Verluste aufgrund einer autoproteolytischen Nebenaktivität erheblich reduziert werden.
Vorzugsweise (und vorteilhafterweise, insbesondere in Verbindung mit den hierin beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen) wird die Autoproteasedomäne bei einem pH-Wert von 6,8 oder darüber aktiviert (d.h. sie wird nicht darunter aktiviert), besonders bevorzugt bei einem pH-Wert von 6,8 bis 7,2. Bei der Beurteilung, ob die Autoproteasedomäne bei einem bestimmten pH-Wert aktiviert ist oder nicht, kann der Fachmann vorzugsweise zunächst die Bindung an Stärke initiieren. Der Überstand der Bindungsprobe, der einen pH-Wert über 7,2 aufweist, wird entfernt oder eluiert und durch ein gleiches Volumen Aktivierungspuffer bei einem pH-Wert von 6,8 bis 7,2, vorzugsweise bei pH 7,2, ersetzt. Die Änderung des pH-Wertes setzt wiederum die Autoproteolyse in Gang. Dies lässt sich durch eine Proteinanalyse des Eluenten oder der überstehenden Fraktion mit der dem Fachmann bekannten Analytik feststellen. Die Temperatur spielt keine Rolle bei der Aktivierung der Autoprotease.
Die Autoprotease N^pro kann so modifiziert werden, dass nicht die Chaotropenkonzentration, sondern der pH-Wert ihrer Umgebung der auslösende Faktor ist. Folglich muss kein Kompromiss zwischen Reinheit und Produktausbeute in Kauf genommen werden muss.
Die Zielpeptiddomäne umfasst oder besteht aus einer Aminosäuresequenz eines herzustellenden Zielpeptids oder -polypeptids. Die Domäne kann aus einer beliebigen Aminosäuresequenz bestehen, die zwischen 2 und mehr als 1000 Aminosäuren umfasst. Vorzugsweise besteht das Zielpeptid aus einer Aminosäuresequenz von 2 bis 1000 Aminosäuren, vorzugsweise 2 bis 500 Aminosäuren, noch bevorzugter von 2 bis 100 Aminosäuren, besonders bevorzugt von 2 bis 50 Aminosäuren. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Zielpeptid eine Menge von hydrophoben Aminosäuren von ≥ 10 %, bezogen auf die Gesamtzahl der Aminosäuren, mehr vorzugsweise von ≥ 20 %, besonders bevorzugt von ≥ 30 % und noch bevorzugter von ≥ 40 %. In einer anderen Ausführungsform kann das Zielpeptid einen Anteil an hydrophilen Aminosäuren aufweisen von ≥ 5 10 %, vorzugsweise von ≥ 20 %, besonders bevorzugt von ≥ 30 % und noch bevorzugter von ≥ 40 %, wiederum bezogen auf die Gesamtzahl der Aminosäuren. In einer weiteren Ausführungsform kann das Zielpeptid einen Anteil an hydrophoben und hydrophilen Aminosäuren von ≥ 10 % haben, vorzugsweise von ≥ 20 %, besonders bevorzugt von ≥ 30 % und noch bevorzugter von ≥ 40 %, bezogen auf die Gesamtzahl der Aminosäuren.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Fusionspolypeptid gemäß der Erfindung, wobei die Reinigungsdomäne (i) eine Aminosäuresequenz umfasst oder daraus besteht Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sequenzen gemäß SEQ ID No.: 10 bis SEQ ID No.:116 und Sequenzen mit einer Sequenzidentität von 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr mit einer der genannten Sequenzen aufweisen.
Wenn sich die vorliegende Anmeldung auf den Prozentsatz der Identität von Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen zueinander bezieht, definieren diese Werte die Werte, die durch die Verwendung des Programms EMBOSS Water Pairwise Sequence Alignments (Nukleotid) (www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html) Nukleinsäuren oder des EMBOSS Water Pairwise Sequence Alignments (Protein) Programm(www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/) für Aminosäuresequenzen. Alignments erhalten worden. Diese Werkzeuge, die vom European Molecular Biology Laboratory (EMBL) European Bioinformatics Institute (EBI) für lokale Sequenzen Alignments bereitgestellt werden, verwenden einen modifizierten Smith-Waterman-Algorithmus (siehe www.ebi.ac.uk/Tools/psa/ und Smith, T.F. & Waterman, M.S. „Identifizierung gemeinsamer molekularer Teilsequenzen“ Zeitschrift of Molecular Biology, 1981 147 (1):195-197). Bei der Durchführung eines Alignments werden die Standardeinstellung, definiert vom EMBL-EBI verwendet. Diese Parameter sind (i) für Aminosäuren Sequenzen: Matrix = BLOSUM62, gap open penalty = 10 und gap extend penalty = 0,5 oder (ii) für Nukleinsäuresequenzen: Matrix = DNAfull, gap open penalty = 10 und gap extend penalty = 0,5. Dem Fachmann ist bekannt, dass zum Beispiel eine Sequenz, die für ein Polypeptid kodiert, „kodon-optimiert“ sein kann, wenn die entsprechende Sequenz in einem anderen Organismus im Vergleich zum ursprünglichen Organismus, aus dem ein Molekül stammt, verwendet werden soll.
Die Reinigungsdomäne umfasst oder besteht aus einer Kombination von mindestens einer funktionellen Sequenz von CBMs, wie oben beschrieben. Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, dass dieses Design der Reinigungsdomäne mehrere Vorteile bietet, die in der natürlich vorkommenden Form von kohlenhydratbindenden Enzymen nicht vorhanden sind. Es wurde gezeigt, dass eine Reinigungsdomäne mit den beanspruchten Sequenzen eine höhere Bindungsaktivität über einen breiten Temperaturbereich aufweist, während natürlich vorkommende kohlenhydratbindende Polypeptide, wie die menschliche Amylase, nur in einem engen Temperaturbereich aktiv sind. In Kombination dazu ist beim Betrieb von Bioprozessen ein weiterer wichtiger Faktor der pH-Wert. Es wurde auch gezeigt, dass die erfindungsgemäße Reinigungsdomäne eine hohe Bindungsaktivität auch in einem breiten pH 5-Bereich und, was noch überraschender ist, in einer Kombination aus rauen Temperaturen von 0 bis 80 °C und rauen pH-Werten von bis zu pH 3,5 im sauren Bereich und bis zu pH 12,0 im basischen Bereich, aufweist.
Im Allgemeinen sind Enzyme oder insbesondere die aktiven Stellen von Enzymen, wie das CBM der menschlichen Amylase, sehr empfindlich gegenüber Chaotrop- oder Detergenzkonzentrationen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wurde gezeigt, dass die erfindungsgemäße Reinigungsdomäne über einen breiten Chaotrop- und Detergenskonzentrationsbereich stabil ist.
Wie oben beschrieben, umfasst oder besteht die Autoproteasedomäne (ii) eines erfindungsgemäßen Fusionspolypeptids aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No.: 117 oder einer Aminosäuresequenz mit einer Sequenzidentität von 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr mit SEQ ID No.: 117.
Die autoproteolytische Aktivität der autoproteolytischen Domäne basiert auf der katalytischen Diade von Histidin und Cystein im aktiven Zentrum von Autoprotease-Enzymen. Diese Enzyme sind die Basis für eine autoproteolytische Domäne im Sinne der Erfindung. Die Basis für eine solche autoproteolytische Domäne kann die Autoprotease N^pro aus dem Pestivirus sein oder eine Autoprotease aus einem Potyvirus, Picornavirus oder einer anderen viralen Autoprotease. Durch gezielte Rekombination oder Neugestaltung dieser Sequenzen können die Bausteine der Autoproteasedomäne entwickelt werden, die allein oder in Kombination mehrere Vorteile gegenüber ihren natürlichen Vorbildern aufweisen. Zum einen kann die pH-Empfindlichkeit der Autoprotease genau eingestellt werden. Dies hat den Vorteil, dass die Aktivität der Autoprotease kontrolliert und auf einen vorbestimmten Zeitpunkt sowie ausgerichtet auf die gewünschten Reaktionsbedingungen abgestimmt werden kann: entweder mit einem sehr engen pH-Wert-Bereich, um die Autoprotease genau bei dem gewünschten pH-Wert zu aktivieren und die vorzeitige Freisetzung des Zielpeptid zu vermeiden, oder auch bei rauen pH-Werten, bei denen natürlich vorkommende Autoproteasen nicht mehr nicht mehr stabil sind.
In einer weiteren Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein erfindungsgemäßes Fusionspolypeptid, wobei die Autoproteasedomäne (ii) eine Aminosäuresequenz umfasst oder aus einer Aminosäuresequenz besteht, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Sequenzen gemäß SEQ ID No.: 118, SEQ ID No.: 119 oder SEQ ID No.: 120 und Sequenzen mit einer Sequenzidentität von 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr zu einer der genannten Sequenzen, besteht. Durch Kombination der Autoprotease-Bausteine erhält man mehrere bevorzugte Autoprotease-Domänensequenzen, die eine hohe pH- und Temperaturstabilität Stabilität und die Fähigkeit aufweisen, über den eingestellten pH-Wert präzise aktiviert zu werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Autoprotease bei einem pH-Wert zwischen 7,5 und 6 und/oder in einem Temperaturbereich zwischen 4°C und 40°C aktiv sein.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Fusionspolypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung, umfassend eine Signalsequenz (iv), wobei die Signalsequenz (iv) eine Einschlusskörperfördernde Sequenz oder eine Sekretionssequenz, vorzugsweise vom Sekretionstyp IV oder Typ II von gram-negativen Bakterien ist. Vorzugsweise werden Signalsequenzen mit wiederkehrenden Arginin Motiven im N-terminalen Signalpeptid, die von Threonin, Lysin und Leucin flankiert werden, im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet.
Eine Signalsequenz im Sinne der vorliegenden Erfindung, beschreibt eine funktionelle Sequenz, die Fusionspolypeptide zu bestimmten Zellkompartimenten leitet. Mehrere Signalsequenzen sind aus dem Stand der Technik bekannt. Vorzugsweise wird eine Signalsequenz aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID No.: 123, SEQ ID No.: 124, SEQ ID No.: 125, SEQ ID No.: 126, SEQ ID No.: 127, SEQ ID No.: 128, SEQ ID No.: 129 oder SEQ ID No.: 130 verwendet. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass diese Sequenzen nicht nur die Förderung von Einschlusskörpern steuern, sondern auch den Prozess der Rückfaltung in stark basischen Umgebungen steuern.
Die Signalsequenzen werden stets nach ihrem Einfluss auf die Aufbereitung des Zielpeptids ausgewählt. In einer Ausführungsform wird eine Einschlusskörper-Signalsequenz verwendet, die das Zielpolypeptid zu Einschlusskörpern leitet. Es ist bekannt, dass Polypeptide, die in Einschlusskörpern produziert werden, vor der weiteren Verarbeitung neu gefaltet werden müssen. So kann beispielsweise die Signalsequenz Cry4AaCter (SEQ ID No.: 126) verwendet werden, die die alkalische Verarbeitung von Einschlusskörpern verbessert. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein N-terminales Tat-Signal verwendet werden, das ein Sekretionssignal des bakteriellen Sekretionssystems ist. Mit Hilfe dieser Signalsequenz wird das Zielpolypeptid sekretiert.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Fusionspolypeptid gemäß der Erfindung, umfassend eine Linkersequenz (v), die über eine N-terminale Alpha-Helix und/oder eine C-terminale Sequenz mit einer zufälligen Spulenstruktur verfügt.
Eine Linker-Sequenz im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Sequenz zwischen den funktionellen Domänen und auch zwischen der Autoprotease und dem Zielpeptid. Die Länge des Linkers beträgt vorzugsweise 1 bis 50 oder mehr als 50 Aminosäuren. In einer weiteren Ausführungsform sind Reinigungsdomäne und Autoproteasedomäne direkt, d. h. ohne Linker, fusioniert. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann eine Linkersequenz, ausgewählt aus SEQ ID No.:121 oder SEQ ID No.: 122 verwendet werden.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das für ein erfindungsgemäßes Fusionspolypeptid kodiert.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID No.: 132, SEQ ID No.: 134, SEQ ID No.: 136, SEQ ID No.: 138, SEQ ID No.: 140, SEQ ID No.: 142 und SEQ ID No.: 144.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine rekombinante Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID No.: 131, SEQ ID No.: 133, SEQ ID No.: 135, SEQ ID No.: 137, SEQ ID No.: 139, SEQ ID No.: 141 und SEQ ID No.: 143.
Ein weiterer Aspekt betrifft eine genetisch veränderte Zelle, die ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung enthält, wobei die Zelle in der Lage ist, ein erfindungsgemäßes Fusionspolypeptid zu exprimieren.
Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft eine erfindungsgemäße genetisch veränderte Zelle, wobei Wirtsorgansimen aus der folgenden Liste in Frage kommen: Escherichia coli, Vibrio natrigens, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger, Grünalgen, Mikroalgen, HEK T293 und Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO).
Ebenfalls hierin beschrieben ist ein Verfahren zur Herstellung eines Zielpeptids mit den folgenden Schritten:

(a) Bereitstellen einer genetisch veränderten Zelle gemäß der Erfindung,
(b) Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, die für die Expression einer Fusionsverbindung geeignet sind Polypeptid gemäß der Erfindung,
(c) Erhalten des Fusionspolypeptids und gegebenenfalls Entfaltung des erhaltenen Fusionspolypeptid und gerichtete Rückfaltung des Fusionspolypeptids,
(d) Inkontaktbringen des in Schritt (c) erhaltenen Fusionspolypeptids mit einer Kohlenhydratmatrix,
(e) Spalten des Fusionspolypeptids durch Aktivierung der Autoproteasedomäne des Fusionsproteins, wodurch ein Zielpeptid erhalten wird,
(f) Sammeln eines Gemischs, das das Zielpeptid enthält.

Schritt (a) umfasst die Bereitstellung einer genetisch veränderten Zelle, die ein Fusionspolypeptid exprimiert. Eine solche Zelle ist erhältlich durch Einführen eines Nukleinsäuremoleküls, das eine für ein Fusionspolypeptid kodierende Sequenz enthält, vorzugsweise in Form eines Vektors, in die Zelle durch bekannte Methoden, wie zum Beispiel durch Transfektion oder Transformation. In Schritt (b) wird die Zelle unter Bedingungen kultiviert, die für die Expression eines Fusionspolypeptids gemäß der Erfindung geeignet sind, vorzugsweise in einer Hochdichtekultur. Kulturbedingungen und insbesondere Bedingungen zur Erzielung einer Hochdichtekultur und entsprechender Medien sind dem Fachmann gut bekannt. Fachmann bekannt. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Expression des Fusionspolypeptids Polypeptids mit anschließendem Transport zu Einschlusskörpern unter Verwendung einer geeigneten Signalsequenz. Schritt (c) umfasst die Gewinnung des Fusionspolypeptids aus der Kulturbrühe und gegebenenfalls die Entfaltung des erhaltenen Fusionspolypeptids und die gerichtete Rückfaltung des Fusionspolypeptids, wenn das Fusionspolypeptid in Einschlusskörpern vorhanden ist. Solubilisierungsbedingungen für die Verarbeitung von Einschlusskörpern und Bedingungen für die gezielte Rückfaltung sind im Stand der Technik gut bekannt. Vorzugsweise werden die Einschlusskörper unter Verwendung von 6 M Guanidiniumchlorid, 8 M Harnstoff oder 2 % Natriumdodecylsulfat gelöst und unter neutralen oder leicht basischen Bedingungen rückgefaltet.
In Schritt (d) wird das solubilisierte Fusionspolypeptid mit einer Matrix auf Kohlenhydratbasis in Kontakt gebracht, sodass das Fusionspolypeptid über seine Reinigungsdomäne an die Matrix bindet. Dieser Schritt wird unter Bedingungen durchgeführt, bei denen die Autoproteasedomäne (ii) inaktiv ist, vorzugsweise durch Steuerung des pH-Werts und nicht der Chaotrop- oder Denaturierungsmittelkonzentration, um einerseits eine vorzeitige Spaltung der Zielpeptiddomäne (iii) zu vermeiden und andererseits die Aktivität der Reinigungsdomäne (i) zu induzieren. Unter diesen Bedingungen beträgt die Menge des gespaltenen Fusionspolypeptids vorzugsweise <10 %, noch bevorzugter <5 %, besonders bevorzugt <3 % oder noch bevorzugter <1 %, bezogen auf die Gesamtmenge des Fusionspolypeptids. Der zugrundeliegende Mechanismus der Inaktivität der autoproteolytischen Domäne kann anhand von zwei Fällen beschrieben werden:

(1) Bedingungen, wobei die Autoproteasedomäne konstitutionell inaktiv ist und nur durch eine Änderung der Umgebungsbedingungen aktiviert wird, wie etwa durch eine Anpassung der der Temperatur, des pH-Werts und/oder der lonenstärke, vorzugsweise durch Anpassung des pH-Werts; oder
(2) Bedingungen, unter denen die Autoproteasedomäne konstitutionell aktiv ist, jedoch unzureichende Aktivität aufweist, um eine vorzeitige Spaltung der Zielpeptiddomäne Zielpeptiddomäne während der für die Durchführung des Verfahrensschritts (d) erforderlichen Zeitspanne zu erreichen, d.h. kinetisch inaktiv ist, vorzugsweise für bis zu 10 min, noch bevorzugter für bis zu 20 min und besonders bevorzugt bis zu 30 min.

In einer Ausführungsform wird Schritt (d) unter nativen Bedingungen durchgeführt, d. h. unter Bedingungen, unter denen die Autoprotease konstitutionell aktiv ist. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass selbst, wenn das Fusionspolypeptid in seinem nativen Zustand vorliegt, die Autoproteasedomäne während Schritt (d) ausreichend inaktiv bleibt. Dieser Effekt war insbesondere bei der Verwendung der Hybrid N^pro-Autoprotease gemäß SEQ ID NO.: 120 zu beobachten. Vorzugsweise wird eine unlösliche Kohlenhydrat Matrix verwendet, die die Abtrennung von Verunreinigungen erleichtert.
In Schritt (e) wird das Fusionspolypeptid durch die Autoproteasedomäne gespalten und das Zielpeptid (iii) wird freigesetzt. Die Spaltung des Fusionspolypeptids kann aus der Zugabe eines Autoproteolysepuffers , d. h. eines Puffers, der Bedingungen bietet, unter denen die Autoprotease aktiv ist, z. B. unter sauren oder alkalischen Bedingungen, resultieren.
In Schritt (f) wird durch Elution des gespaltenen Zielpeptids von der Säule ein Gemisch gewonnen. Vorzugsweise erfolgt die Elution unter Verwendung eines Puffers, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus HEPES, PBS und TrisHCl in Konzentrationen zwischen 1 und 100 mM und 30 mM KCI, bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,5. Außerdem kann der bevorzugte Puffer durch Arginin in einer Konzentration von 10 bis 100 mM oder durch Saccharose in einer Konzentration von 2 bis 20 mM ergänzt werden.
Eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bezieht sich auf ein Verfahren, bei dem die Kohlenhydratmatrix in Schritt (d) aus einer Substanz besteht oder eine Substanz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Stärke, Lignin-Kohlenhydrat-Polymeren, Copolymeren mit alpha-1,4- und alpha-1,6-glykosidische Bindungen von Glucose oder anderen Zuckern und deren Mischungen und liegt vorzugsweise in einer gepackten Säule, als gepacktes Substrat oder als Stärkekörner, die aus Amylose und Amylopektin bestehen, vor.
Stärke ist eine komplexe Mischung von Kohlenhydraten aus verschiedenen Zuckerpolymeren. Pflanzenzellen sammeln die von ihnen produzierten Zucker in einer Speicherorganelle, der Vakuole. Wenn die Zellen und Organellen mechanisch zerstört werden, werden die Stärkekörner freigesetzt. Je nach Pflanzenart gibt es Unterschiede zwischen den Rohstärken. Stärken können unterschiedliche Körnerspezies aufweisen, wobei Größen von weniger als 25 µm bis mehr als 100 µm im Durchmesser vorkommen können. Je höher der Anteil mit Durchmessern von über 75 µm ist, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit einer unspezifischen Adsorption und damit die Rückhaltung von VeruNoeinigungen in den Produkten nach der Stärkereinigung. Darüber hinaus gibt es Stärkekörner, wie z. B. im Falle von Weizen, die porös sind und Amylasen in internen Kanälen in wässriger Lösung aufnehmen können. Die Stärke besteht aus den Komponenten Amylose und Amylopektin. Im Gegensatz zu Amylopektin ist Amylose wasserlöslich. Das Quellverhalten der jeweiligen Stärke in Wasser hängt auch von den Anteilen der beiden Spezies ab. Ungereinigte Maisstärke in Wasser erhält eine zementartige Konsistenz, während die Stärke aus Speisekartoffeln wasserdurchlässig bleibt. Alle kohlenhydratbindenden Enzyme haben auch unter nicht nativen Bedingungen eine hohe Affinität zu ihrem Substrat. Vorzugsweise sind die Stärkekörner in Wasser unlöslich. Es ist außerdem vorteilhaft, wenn die löslichen Amyloseanteile und Proteine aus der Stärke entfernt worden sind.
Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bezieht sich auf ein Verfahren, wobei die Aktivierung der Autoproteasedomäne in Schritt (e) bei pH 6 bis pH 8 erfolgt, vorzugsweise bei pH 6,5 bis 7,5, besonders bevorzugt bei pH 7 bis pH 7,4.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das für ein erfindungsgemäßes Fusionspolypeptid kodiert, und eine Klonierungsstelle zum Einbau eines erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, gegebenenfalls mit der damit verbundenen Funktionalität der Expressionskontrollsequenz. Vorzugsweise wird eine Expressionskontrollstelle aus der Gruppe der IPTG-gesteuerten Promotoren, vorzugsweise T5 oder T7, und Rhamnose kontrollierten Promotoren ausgewählt. Vorzugsweise wird eine Expressionskontrollstelle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IPTG-kontrollierten Promotoren, vorzugsweise T5 oder T7, und Rhamnose kontrollierten Promotoren sowie einem Ensemble von zusätzlichen tRNAs besteht.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Gemisch, umfassend oder daraus bestehend ein Zielpeptid, vorzugsweise ein synthetisches Zielpeptid und einer Gesamtmenge von 0,001 bis 1 Gew.-% Natrium und/oder Kalium, bezogen auf das Gesamtgewicht der Summe von Natrium (falls vorhanden), Kalium (falls vorhanden) Natrium (falls vorhanden), Kalium (falls vorhanden) und Zielpeptid, wobei das Gemisch erhalten wird oder erhältlich ist durch ein Verfahren wie hierin beschrieben. Das in Schritt (f) erhaltene Gemisch des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält neben dem hergestellten Zielpeptid auch spezifische Mengen an Natrium und/oder Kalium.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein synthetisches Zielpeptid, wobei das Peptid ein N-terminales Prolin umfasst, erhalten oder erhältlich durch ein hierin beschriebenes Verfahren oder auf ein erfindungsgemäßes Gemisch, wobei das Zielpeptid ein Peptid umfassend ein N-terminales Prolin ist. Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass es möglich war synthetische Zielpeptide mit einem N-terminalen Prolin mit dem hierin beschriebenen Verfahren herzustellen. Im Allgemeinen ist es eine besondere Herausforderung, synthetische Peptide mit N-terminalem Prolin zu produzieren, da das Prolin die Produktionsprozesse von Peptiden der bekannten Methoden sterisch behindert.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von nicht einschränkenden Beispielen näher erläutert.
Beispiele
Beispiel 1: Herstellung des Zielpeptids Melittin
A. Klonierung eines Peptids umfassend die Nukleinsäuresequenz des Zielpolypeptids

Das Fusionspolypeptid gemäß einer der Sequenzen SEQ ID No.: 132, SEQ ID No.: 138, SEQ ID No.: 140 oder SEQ ID No.: 142 wird in den Expressionsvektor pET28a zusammen mit einer Sequenz für das Zielpeptid Mellitin und einer Einschlusskörper-fördernden Sequenz kloniert. Die genetische Information des Fusionspolypeptids ist so aufgebaut, dass jeder Baustein (z. B. die Reinigungsdomäne oder die Autoproteasedomäne) leicht ausgetauscht werden kann. Die Restriktionsschnittstellen und die entsprechenden Enzyme sind in Tabelle 1 aufgeführt. Ein Standardklonierungsprotokoll unter Verwendung der Restriktionsstellen Ncol oder Ndel und EcoRI des pET28a-Vektor wird zum Einfügen des Fusionspolypeptidgens verwendet. Die erhaltene Plasmidlösung wird für die weitere Verarbeitung aufbewahrt. Tabelle 1: Restriktionsschnittstellen für die Bausteine des Fusionspolypeptids

Restriktionsschnittstelle	Position innerhalb des Fusionspolypeptid Gens	Sequenz	Verwendetes Restriktionsenzym
1	Vektor / Signalsequenz	catatg	Ndel, Ncol
2	Signalsequenz / Reinigungstag	catatg	Ndel
3	Reinigungstag / Linker (N-terminal)	aaggag	CstMI
4	Linker (C-terminal) / Autoprotease	ggcgcc	Eco78I, Egel
5	Autoprotease / Zielpeptid	ggtnacc	AspAI, Acrll, Bse64I, BstPl, Eco91I, EcoO65I, BstEII, PspEI
6	Zielpeptid / vector	gaattc	EcoRI

B. Peptidherstellunq von Melittin

Schritt 1): 5 µl der in Beispiel 1 erhaltenen Plasmidlösung umfassend eine DNA-Konzentration von 100 ng/µl werden in ein 2-ml-Reaktionsgefäß übertragen, das 50 µl aufgetautes E. coli BL21 pLys enthält. Die Mischung aus Plasmid und Zellen wird 30 Minuten lang auf Eis inkubiert. Nach der Inkubation wird das Gemisch aus Plasmid und Zellen einem einminütigen Hitzeschock bei 42°C im Wasserbad ausgesetzt. Nach dem Hitzeschock werden die Zellen 2 Minuten auf Eis gelagert und dann mit 950 µL warmem SOC-Medium behandelt. Die Zellen einschließlich des SOC-Mediums werden dann unter ständigem leichten Schütteln bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Anschließend werden die Zellen zwei Minuten lang bei 5000 rpm, Raumtemperatur zentrifugiert und 950 µL des Überstandes werden entfernt. Die Zellen werden in der restlichen Flüssigkeit resuspendiert und auf eine feste LB-Agar-Platte auf einer Petrischale mit 25 ml LB-Agar und 34 µg/ml Chloramphenicol und 38 µg/ml Kanamycin ausplattiert. Die Agarplatte wird dann über Nacht bei 37 °C inkubiert.
Schritt 2): Nach 24 Stunden wird eine Kolonie gepickt und in 10 ml LB-Medium mit 34 µg/ml Chloramphenicol und 38 µg/ml Kanamycin und acht Stunden lang bei 37°C und leichtem Schütteln inkubiert. 8 ml der Kultur werden in 500 ml LB Medium mit 34 µg/ml Chloramphenicol und 38 µg/ml Kanamycin in eine Schüttelflasche übergeben und unter leichtem Schütteln über Nacht inkubiert. 2 ml der Kultur werden für die Plasmidpräparation und die Verifizierung von Plasmid und Insert zurückbehalten.
Schritt 3): Die über Nacht inkubierte Kultur wird im Verhältnis 1:5 (v/v) in einer geeigneten Minimallösung in einem Medium in einer 2-L-Schüttelflasche suspendiert. Die Kultur wird bis zu einer OD₆₀₀ von 5 gezüchtet und dann mit IPTG in einer Endkonzentration von 1 mM induziert. Die Expressionskultur wird sechs Stunden lang mit Glucose oder Glycerin (beide 20 g/l), durchgeführt und mit Thiamin, Zitronensäure und einer geeigneten Spurenelementlösung supplementiert. Die Lösungen werden mit einer Rate von 0,1 ml/min für 3,5 Stunden und eine weitere Stunde mit 0,2 ml/min zugegeben. Die Kultur wird durch 20-minütige Zentrifugation bei 4 °C und 3000 U/min geerntet und die Zellen werden entweder sofort für die weitere Verarbeitung verwendet oder schockgefroren in getrockneten und dann bei - 80°C gelagert.
Schritt 4): Die Zellen werden in einem Lysepuffer resuspendiert. Dieser Puffer kann zwischen 0 mM und 75 mM Natriumacetat, 0 mM bis 20 mM HEPES, 2 mM Magnesiumchlorid und 1 % Triton X-100 enthalten. Die Zellen werden in einem tarierten Reaktionsgefäß gewogen, nachdem sie durch Zentrifugation geerntet wurden. Die Ultraschalllyse erfordert einen vierfachen Überschuss an Lysepuffer zur Zellmasse. Die Lyse erfolgt durch Beschallung und ein 12"-Becherhornspitze. Das Protokoll wird auf Eis bei 80 W mit 15 Sekunden Pulsung und 20 Sekunden Dauer durchgeführt. Zwischen den Pulsen von 15 Sekunden gibt es eine Pause für 8 Minuten. Die löslichen Teile der Lysatmischung werden aus der Einschlusskörper tragenden festen Phase durch Zentrifugation bei 4°C und 5000 U/min für 25 Minuten getrennt. Der Überstand und das Pellet werden mit Hilfe von Polyacrylamid-Gelen auf ihre Einschlusskörper untersucht. Wenn der größte Teil des Fusionspolypeptids im Polyacrylamid-Gel identifiziert worden ist und in der Pelletfraktion gefunden wird, wird das Gel ebenfalls auf Verunreinigungen des Pellets überprüft. Wenn diese Verunreinigungen signifikant sind, muss das Pellet gewaschen werden. Es wird erneut in demselben Lysepuffer resuspendiert und 10 Minuten lang auf Eis gelegt. Die Suspension wird durch Vortexen alle zwei Minuten lang homogenisiert. Nach der Inkubation wird der Vorgang noch einmal wiederholt. Nach dem dritten Zentrifugationsschritt wird das Pellet in Wasser resuspendiert und zehn Minuten lang auf Eis mit regelmäßigem Vortexen wie oben beschrieben inkubiert. Die Suspension wird 25 Minuten lang bei 4°C und 5000 U/min zentrifugiert. Das Pellet wird nun gewogen und zum zweiten Mal und bereitete sich auf die nächsten Schritte vor.
Schritt 5): Die gewaschenen Einschlusskörper aus Schritt 4 werden aufgefaltet. Das Verhältnis der Einschlusskörper zum verwendeten Puffer (w/v) ist nicht kleiner als 1:10. Die chaotropen Puffer enthalten mindestens entweder 6M Guanidiniumchlorid oder 8M Harnstoff. Der Puffer, der auf einem Detergens basiert, enthält bis zu 5 % (w/v) Natriumlaurylsulfat (SDS) und optional bis zu 20 mM HEPES. Der pH-Wert wird mit Natriumacetat, Natriumhydroxid und/oder Kaliumhydroxid eingestellt. Nach der Resuspendierung, bei der die Mischung alle 10 Minuten für 30 Sekunden durch Vortexen homogenisiert wird, wird die Mischung 40 bis 60 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Schritt 6): Eine Säule wird mit Stärke als Säulenmaterial gepackt. Bei der Stärkemischung handelt es sich um das Substrat des Fusionsproteins. Die Stärke kann unverändert oder siebgefiltert sein, so dass die Stärkekörner eine Korngröße zwischen 25 und 50 µm haben. Die Stärke wird mehrere Male mit Wasser und/oder Puffer zur Proteinstabilisierung gewaschen, um Protein und lösliche Amylose aus der Stärke zu entfernen. Die Stärke ist vorzugsweise aus Weizen oder Kartoffelstärke. Letztere kann problemlos als Säulenmaterial verwendet werden. Die gewaschenen und gesiebten Stärkekörner der Weizen- und Kartoffelstärke werden in Flüssigkeit aufgeschwemmt in einer Säule verpackt. Das noch von Entfaltungspuffer umgebene Fusionspolypeptid wird nun mit einem Aktivierungspuffer verdünnt. Die Verdünnung wird so durchgeführt, dass nur die Bindungseinheit sich zurückfaltet und die Bindung an das Säulenmaterial ermöglicht. Im Falle von Guanidiniumchlorid sollte die Endkonzentration des Chaotrops zwischen 4,5 M und 5 M liegen. Bei Harnstoff sollte die Verdünnungskonzentration zwischen 5 M und 6 M sein. SDS muss nicht notwendigerweise aus dem Gemisch von ungefaltetem Protein und Denaturierungspuffer entfernt werden. Das Abtrennen des SDS aus der Denaturierungslösung erfolgt entweder durch Titration von 30 mM einer Kaliumchloridlösung zu dem Gemisch, durch eine Kühlung des Gemischs bei 0 bis 4°C oder einer Kombination beider SDS Beseitigungsmaßnahmen gleichzeitig. Man kann die SDS-Konzentration auf 0,5 % SDS in der Mischung verringern, ohne die Autoprotease zu aktivieren. Dann wird die Mischung in Kontakt mit dem Säulenmaterial gebracht und überschüssiges SDS kann mit Kaliumchlorid oder Kühlung oder mit beiden Methoden entfernt werden, ohne eine Verstopfung des Säulenmaterials zu riskieren.
Schritt 7): Der verdünnte Puffer wird freigesetzt und eluiert. Die Waschelution wird verworfen. Die Säule wird mit einem Säulenvolumen Wasser gewaschen. Das Fusionspolypeptid bleibt an das Material in der Säule gebunden und kann auf diesem belassen werden, während die autoproteolytische Domäne aktiviert wird. Sobald die Reste des Denaturierungspuffers entfernt wurden, können die gebundenen Fusionspolypeptide aktiviert werden. Das Säulenmaterial wird mit etwas mehr als einem Volumen Aktivierungspuffer beschickt. Die Säule wird dann bei Temperaturen zwischen 2°C und 37°C inkubiert. Die Autoprotease ist nun bei beiden Methoden in der Stärkematrix aktiv. Die Inkubation kann zwischen 80 Minuten bei 2°C bis 8°C und vier Stunden bei 9°C bis 22°C und 12 Stunden von 23°C bis 37°C ihre Aktivität entfalten. Während dieser Zeit wird das Zielpeptid aus dem an das Stärkematerial gebundenen Fusionspolypeptid freigesetzt.
Schritt 8): Das im vorherigen Schritt freigesetzte Zielpeptid wird gesammelt. 50 % des Säulenvolumens werden in Form von Aktivierungspuffer oder Wasser hinzugefügt, um die gesamte Menge des Zielpeptids von der Säule zu eluieren. Das Eluat oder der Überstand, der das Zielpeptid enthält, wird in Ethanol 1:3 (v/v) ausgefällt. Die Mischung aus Produkt und Ethanol wird zehn Minuten lang bei 5000 U/min und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Präzipitat über Nacht gefriergetrocknet. Die gefriergetrocknete Probe wird dann in einem geeigneten Lösungsmittel (z. B. 60 % bis 80 % Methanol, DMF, deionisiertem Wasser) und in einem Ultraschallbad bei 40 W eine Stunde lang bei Raumtemperatur einem Ultraschall ausgesetzt. Anschließend wird die Probe 10 Minuten lang bei 5000 U/min und 25 °C zentrifugiert. Der Überstand enthält das reine Zielpeptid. Tabelle 3 zeigt verschiedene Ausbeuten an Melittin in Verbindung mit verschiedenen Fusionspolypeptiden im Vergleich mit den erreichten Zellmassen.

Inhaltsstoffe	Konzentration [mM]
Arginin	10 bis 100
HEPES	20
Tris HCl	0 bis 100
Saccharose	2 bis 20

SEQ ID No.:	Zellmasse LB Medium [g / Liter Kultur]	Korrespondierendes Einschlusskörpergewicht [g / Liter Kultur]	Zellmasse Hochdichte [g / Liter Kultur]	Zielpeptid Ausbeute [mg / Liter Kultur]
131	8 bis 12	3 bis 4	30 bis 40	10 bis 12
137	14 bis 16	3 bis 4	80 bis 93	21 bis 28
139	25 bis 35	8 bis 12	75 bis 90	25 bis 32
141	28 bis 36	14 bis 22	115 bis 135	56 bis 70

Beispiel 2: Herstellung des Zielpeptids GFP
A. Klonierung eines Plasmids, das die Ziel-Polypeptid-Nukleinsäuresequenz enthält

Das Fusionspolypeptid gemäß einer der Sequenzen SEQ ID No.: 132, SEQ ID No.: 138, SEQ ID No.: 140 oder SEQ ID No.: 142 wird zusammen mit einer Sequenz für das Zielpeptid grün fluoreszierendes Polypeptid (GFP) und einer Einschlusskörperfördernden Sequenz in den Expressionsvektor pET28a kloniert. Das Fusionspolypeptidgen besteht aus drei Haupt- und zwei optionalen Bausteinen, die in einer bestimmten Reihenfolge vom N-Terminus zum C-Terminus angeordnet sind. Alle Bausteine sind durch Restriktionsstellen auf genetischer Ebene voneinander getrennt. Die Restriktionsstellen und die entsprechenden Enzyme sind in Tabelle 4 aufgeführt. Ein Standardklonierungsprotokoll unter Verwendung der Restriktionsstellen Ncol oder Ndel und EcoRI eines beliebigen Vektors der pET-Familie zum Einfügen des Fusionspolypeptidgens verwendet wird. Die erhaltene Plasmid Lösung wird für die weitere Verarbeitung aufbewahrt. Tabellle 4: Restriktionsschnittstellen für die Bausteine des Fusionspolypetids

Restriktionsschnittstelle	Position innerhalb des Fusionspolypeptid Gens	Sequenz	Verwendetes Restriktionsenzym
1	Vektor / Signalsequenz	catatg	Ndel, Ncol
2	Signalsequenz / Reinigungstag	catatg	Ndel
3	Reinigungstag / Linker (N-terminal)	aaggag	CstMI
4	Linker (C-terminal) / Autoprotease	ggcgcc	Eco78I, Egel
5	Autoprotease / Zielpeptid	ggtnacc	AspAI, Acrll, Bse64!, BstPI, Eco91I, EcoO65I, BstEII, PspEI
6	Zielpeptid / vector	gaattc	EcoRI

B. Polypeptid-Produktion von GFP
Das folgende Produktionsprotokoll wurde für Fusionspolypeptide mit den SEQ ID Nos: 131 und 137 durchgeführt, die eine Aminosäuresequenz für GFP als Zielpolypeptid haben. Im Vergleich zu den erfindungsgemäßen Fusionspolypeptiden wurden die Fusionspolypeptide gemäß WO2019138125 (WO'125) konstruiert. Diese Fusionspolypeptide haben die folgende Domänenarchitektur:

• ssTorrA (Einschlusskörper fördernde Sequenz, SEQ ID No.: 2 von WO'125) -3x-CBM Aspergillus niger (Bindungsdomäne, SEQ ID No.: 10 von WO'125) - Npro (autoproteolytische Domäne, SEQ ID No.: 12 von WO'125)
• ssTorrA (Einschlusskörper fördernde Sequenz, SEQ ID No.: 2 von WO'125)-Amylase-homo- sapiens (Bindungsdomäne, SEQ ID No.: 5 von WO'125) - Npro (autoproteolytische Domäne, SEQ ID No. 12 von WO'125)

Schritt 1) Transformation:

5 µl der in Beispiel 2 A erhaltenen Plasmidlösung mit einer DNA-Konzentration von 100 ng/µl werden in ein 2-ml-Reaktionsgefäß überführt, das 50 µl aufgetaute E.coli BL21 pLys oder einem anderen BL21-Derivat enthalten. Die Mischung aus Plasmid und Zellen wird 30 Minuten lang auf Eis bebrütet. Nach der Inkubation wird das Gemisch aus Plasmid und Zellen in einem Wasserbad einem einminütigen Hitzeschock bei 42 °C ausgesetzt. Nach dem Hitzeschock werden die Zellen 2 Minuten lang auf Eis gelockert und dann mit 950 µl warmem SOC-Medium behandelt. Die Zellen einschließlich SOC-Medium werden dann eine Stunde lang bei 37 °C unter ständiger leichter Bewegung bebrütet. Anschließend werden die Zellen bei 5000 U/min zwei Minuten lang bei Raumtemperatur geschleudert und 950 µl des Überstands werden entfernt. Die Zellen werden in der verbleibenden Flüssigkeit resuspendiert und auf eine feste LB-Agar-Platte auf einer Petrischale mit 25 ml LB-Agar und 30 µg/ml Chloramphenicol und 30 µg/ml Kanamycin. Die Agarplatte wird dann über Nacht bei 37 °C bebrütet.

Schritt 2) Kolonieentnahme und Vorbereitung der Impfkultur:

Nach 24 Stunden wird eine Kolonie entnommen und in 10 ml LB-Medium mit 30 µg/ml Chloramphenicol und 30 µg/ml Kanamycin übertragen und acht Stunden lang bei 37 °C und leichter Bewegung bebrütet. 8 ml der Kultur werden in einer Schüttelflasche in 500 ml LB-Medium mit 30 µg/ml Chloramphenicol und 30 µg/ml Kanamycin überführt oder sofort als Inokulationskultur verwendet und unter leichtem Schütteln über einen geeigneten Zeitraum bebrütet, der von drei Stunden Expression bis über Nacht Expression. 2 ml der Kultur werden für die Plasmidpräparation und die Überprüfung des Plasmids und des Inserts zurückbehalten. des Plasmids und des Inserts.

Schritt 3) Expression des Fusionspolypeptids:

Die Expressionskultur wird in einer 2-Liter-Schüttelflasche gezüchtet und mit einer geeigneten Menge eines chemischen Induktors, einschließlich Laktose, Rhamnose und Isopropyl-β-thiogalactopyranosid (IPTG), induziert. Die Kultur wird bei einer Temperatur von 37°C gezüchtet, bei Schütteln zwischen 150 und 250 U/min bis zur exponentiellen Wachstumsphase geschüttelt und induziert. Die Expressionskultur wird sechs Stunden lang laufen gelassen und diskret mit Glucose oder Glycerin (beide 20 g/l), Thiamin, Zitronensäure und einer geeigneten Spurenelementlösung ergänzt. Die Lösungen werden mit einer Geschwindigkeit von 0,1 ml/min für 3,5 Stunden und eine weitere Stunde mit 0,2 ml/min zugegeben. Die Kultur wird durch 20-minütiges Zentrifugieren bei 4 °C und 3000 U/min geerntet, und die Zellen werden entweder sofort für die weitere Verarbeitung verwendet oder in Trockeneis schockgefroren und dann bei - 80°C gelagert.

Schritt 4) Zelllyse und Einschlusskörperpräparation:

Die Zellen werden in einem Lysepuffer resuspendiert. Dieser Puffer kann zwischen 0 mM und 75 mM Natriumacetat, 0 mM bis 20 mM 2-[4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethansulfonsäure (HEPES), 2 mM Magnesiumchlorid und 1 % Triton X-100 enthalten. Der pH-Wert des Lyse- und Waschpuffers wird auf einen Wert über 9,0 eingestellt. Die Zellen werden in einem tarierten Reaktionsgefäß gewogen, nachdem sie durch Zentrifugation geerntet wurden. Die Lyse kann durch Beschallung, Dispergierung oder französische Presse erfolgen. Die löslichen Teile des Lysatgemischs werden durch Zentrifugation bei 4°C und 8000 U/min für 10 Minuten von der Einschlusskörper tragenden festen Phase getrennt. Der letzte Waschschritt erfolgt in Wasser, um Spuren von Triton X-100 zu beseitigen und DNA und zytoplasmatische Polypeptidreste zu entfernen. Der Überstand und das Pellet werden mittels Polyacrylamidgelen auf Einschlusskörper und aktive Fusionspolypeptide untersucht, um Kontaminationen festzustellen. Wenn diese Kontaminationen signifikant sind, muss das Pellet gewaschen werden. Das Pellet wird erneut in demselben Lysepuffer resuspendiert und 10 Minuten lang bei 4°C bis 15 0°C gehalten. Die Suspension wird durch Vortexen homogenisiert (z. B. alle 5 Minuten für 30 Sekunden). Die Inkubation und Zentrifugation des Pellets wird einmal wiederholt. Schließlich wird das Pellet in Wasser resuspendiert und zehn Minuten auf Eis inkubiert, wobei es auch geschüttelt wird (z. B. wie oben beschrieben). Die Suspension wird 25 Minuten lang bei 4 °C und 6000 bis 7000 U/min zentrifugiert. Die Kontaminationen einschließlich DNA und unerwünschter Polypeptide sind weniger dicht als die Einschlusskörperfraktion und können als Teil des Überstandes verworfen werden. Das Pellet wird nun ein zweites Mal gewogen gewogen und für den folgenden Schritt vorbereitet.

Schritt 5) Denaturierung der Einschlusskörper:

Die gewaschenen Einschlusskörper aus Schritt 4 werden durch Entfaltung denaturiert. Das Verhältnis der Einschlusskörper zum Denaturierungspuffer (w/v) ist nicht kleiner als 1:10, wenn Harnstoff (II) und Guanidiniumchlorid (III) enthaltende chaotrope Puffer verwendet werden. Die chaotropen Puffer enthalten mindestens entweder 6 M Guanidiniumchlorid oder 8 M Harnstoff. Der Puffer auf Detergensbasis enthält bis zu 2 % (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS) und optional bis zu 20 mM HEPES. Der pH-Wert wird mit Natriumacetat, Acetat, Natriumhydroxid und/oder Kaliumhydroxid eingestellt. Der Denaturierungspuffer (III) wird auf pH 9,0 oder höher eingestellt. Das Verhältnis von Einschlusskörpern zu SDS-Puffer beträgt 1:8 (g/ml). Nach dem Resuspendieren wird das Gemisch bei Raumtemperatur 40 bis 60 Minuten lang inkubiert, wobei alle 10 Minuten 30 Sekunden lang vortexiert wird. Das Fusionspolypeptid wird durch SDS, das im Denaturierungspuffer (III) enthalten ist, denaturiert. Das Fusionspolypeptid kann in dem Denaturierungspuffer (III) gelöst bei Raumtemperatur mindestens zwei Wochen gelagert werden ( ). Das SDS im Puffer wird aus dem Puffer, der das Fusionspolypeptid enthält, entfernt, indem die Lösung mindestens eine Stunde lang auf 4 °C abgekühlt wird. Das SDS wird ausgefällt, wobei ein kleiner Prozentsatz des Polypeptids, das an SDS gebunden ist, entfernt wird. Die SDS-Kristalle werden durch Zentrifugation bei 4 °C, 2000 bis 5000 Umdrehungen pro Minute und 4 bis 8 Minuten entfernt. Der Überstand wird aufgefangen und bei 4°C gelagert. Fallen weitere SDS-Kristalle aus, wird die Suspension noch einmal wie oben beschrieben zentrifugiert. Der pH-Wert des SDS-freien Puffers wird überprüft. Der beobachtete pH-Bereich lag zwischen 9,0 und 11,0 für den SDS-freien Puffer mit Fusionspolypeptid. Gemäß zerfiel das Fusionspolypeptid nicht, wenn es in dem SDS-freien Puffer bei 4°C für mindestens zwei Wochen gelagert wurde. Die Denaturierungspuffer (I) und (II) können ebenfalls verwendet werden. Allerdings weist der Denaturierungspuffer (III) weist jedoch mehrere Vorteile auf, d. h. einfache Entfernung des Detergens SDS, geringe Kosten von SDS (SDS kann nach der Fällung wiederverwendet werden) und die sofortige, detergenzfreie Verwendung oder Lagerung. Im Gegensatz zu den Denaturierungspuffern (I) und (II) ist kein Produktverlust beobachtet.

Puffername des Denaturierungspuffer	Puffer Zusammensetzung
Denaturierungspuffer (I)	HEPES (20 mM), Urea (8M)
Denaturierungspuffer (II)	HEPES (20 mM), Guanidiniumhydrochlorid (6M)
Denaturierungspuffer (III)	HEPES (20 mM), SDS (2 % = 2g SDS / 100 ml); pH 9,5

Schritt 6) Vorbereitung und Verpackung des Bindemittels:

Kartoffel- und Maisstärke, beide mit einem Korndurchmesser von weniger als 32 µm, werden zum Packen einer Säule verwendet. Die Stärken werden mit einem Polypeptidsammelpuffer gewaschen, der die löslichen, mit der Stärke verbundenen Polypeptide entfernt. Das Verhältnis von Stärke zu Puffer beträgt 1:2 w/v. Der Puffer besteht aus 50 mM 2-Amino-2-(hydroxymethyl)propan-1,3-diol (Tris) und 50 mM Natriumchlorid (NaCl), pH 7,2. Die Stärken werden eine Stunde lang bei 37°C ständig geschüttelt, um eine Sedimentation zu verhindern. Nach der Inkubation wird 12 Minuten lang bei 20 °C und 6000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und die Stärken werden acht Stunden lang bei 45 °C getrocknet. Die getrockneten, vorbereiteten Stärken werden bei Raumtemperatur gelagert. Die Säulen werden mit einer Mischung aus der aufbereiteten Maisstärke und Kartoffelstärke gepackt. Geeignete Mischungen von Maisstärke zu Kartoffelstärke sind 1:1, 2:3 und 1:4. Die getrockneten Stärken werden im gewünschten Verhältnis durch Schütteln gemischt. Eine Stärkeaufschlämmung für die Säulenpackung wird durch Suspendieren der Stärkemischung in einem Aktivierungspuffer hergestellt. Der Aktivierungspuffer, der für die Säulenpackung verwendet wird, wird auch zum Laden der Fusionspolypeptidprobe verwendet. Der Aktivierungspuffer, der zur Herstellung der Stärkeaufschlämmung verwendet wird, wird als Aktivierungspuffer (I) bezeichnet (Tabelle 7). Der Aktivierungspuffer (I) ermöglicht es der Bindungsdomäne des Fusionspolypeptids, das Stärkematerial zu binden, ohne dass die Autoprotease des Fusionspolypeptids aktiviert wird. Die oben beschriebene Stärkeaufschlämmung kann auf verschiedene Weise mit dem Fusionspolypeptid in Kontakt gebracht werden. Es kann eine Schwerkraftflusssäule gepackt werden, eine FPLC-Säule kann gepackt werden oder der Kontakt zwischen dem Fusionspolypeptid und der Stärkeaufschlämmung Stärkeaufschlämmung erfolgt in einem Zentrifugationsbecher, und der Aktivierungspuffer (I) wird durch Zentrifugation entfernt.

Inhaltsstoff	Konzentration [mM]
Natriumchlorid	50
Tris	50

Inhaltsstoff	Konzentration [mM]
HEPES	20
Arginin	100
Sucrose	20

Inhaltsstoff	Konzentration [mM]
HEPES	20
Arginin	10
Sucrose	2

Schritt 7) Aufreinigung:

Das Fusionspolypeptid wird in detergentfreiem Denaturierungspuffer (III) gelöst (Tabelle 5). Das Säulenmaterial, das auf eine der in Schritt 6 beschriebenen Arten verwendet wird, wird äquilibriert. Das Fusionspolypeptid mit der detergensfreien Lösung wird mit Aktivierungspuffer (I) in einem Verhältnis von 1 ml Fusionspolypeptidlösung zu 4 bis 6 ml Aktivierungspuffer (I). Diese Mischung wird auf das Stärkematerial aufgebracht. Das gebundene Fusionspolypeptid wird in Gegenwart des Aktivierungspuffers (II) (Tabelle 8), der zur Elution verwendet wird, aktiviert. Dies ist nicht möglich, wenn das in WO2019138125 beschriebene Verfahren und Fusionspolypeptid verwendet wird. Beim Ansatz von WO2019138125 müssen die chaotropen Substanzen vollständig entfernt werden, um den kohlenhydratbindenden Teil zu aktivieren. In der Zwischenzeit ist die Autoprotease bereits aktiv, was zu einem erheblichen Produktverlust führt. In der vorliegenden Erfindung wurde ein Weg gefunden, um eine aktive Reinigungsdomäne (i) zu erhalten, die eine einfache Entfernung aller Verunreinigungen ermöglicht, bevor die Autoprotease aktiviert wird. Eine weitere Beobachtung bezieht sich auf die Temperaturabhängigkeit von nativem Npro und der EDDI-Mutante. Bei beiden wurde festgestellt, dass sie zwischen 2°C und 8°C am aktivsten sind. Dies ist bei der neuen rein pH-sensitiven Autoprotease der SEQ ID No.: 131 nicht der Fall. Der pH-Bereich der Autoprotease des Fusionspolypeptids gemäß SEQ ID No.: 131 ist sehr eng (pH 6,8 bis 7,2). Bei einer bei 23°C durchgeführten Reinigung wird das Produkt GFP 15 Minuten nach dem ersten Kontakt mit pH 7,2 freigesetzt. Das vollständige GFP das als Teil des Fusionspolypeptids auf die Säule geladen wurde, wird innerhalb von dreißig Minuten freigesetzt. Bei dem bisher bekannten Npro kann die Inkubationszeit von 80 Minuten bei 2°C bis 8°C bis zu vier Stunden bei 9°C bis 22°C und 12 Stunden von 23°C bis 37°C.

Schritt 8) GFP-Sammlung

Das Zielpeptid, das im vorherigen Schritt freigesetzt wurde, wird gesammelt. 50 % des Säulenvolumens des Aktivierungspuffers (II) oder Wasser werden hinzugefügt, um die gesamte Menge des Zielpeptids von der Säule zu waschen. Das Eluat oder der Überstand, der das Zielpeptid enthält, wird in Ethanol 1:1 (v/v) ausgefällt. Das Gemisch aus Produkt und Ethanol wird bei 5000 U/min und 4 °C zehn Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen, und das Präzipitat wird über Nacht gefriergetrocknet. Die gefriergetrocknete Probe wird dann in einem geeigneten Lösungsmittel aufgelöst und eine Stunde lang bei 40 W im Ultraschallbad bei Raumtemperatur beschallt. Anschließend wird die Probe 10 Minuten lang bei 5000 U/min und 25 °C zentrifugiert. Der Überstand enthält das reine Zielpeptid.
Für GFP sind 500 mg pro Liter Kultur eine typische Ausbeute. Tabelle 9 zeigt die Ausbeuten der erfindungsgemäßen Fusionspolypeptide (SEQ ID Nos.: 131 und 137) im Vergleich zu den Fusionspolypeptidkonstrukten nach WO'125. Ein SDS-Gel, das die Ergebnisse der nachgeschalteten Verarbeitung eines Fusionspolypeptids gemäß SEQ ID No.: 131 mit GFP als Zielprotein im Vergleich zu dem Fusionspolypeptidkonstrukt Polypeptidkonstrukt ssTorrA-3x-CBM Aspergillus niger-Npro aus WO'125 ist in dargestellt.

SEQ ID No.:	Zellmasse LB Medium [g / Liter Kultur]	Korrespondierendes Einschlusskörpergewicht [g / Liter Kultur]	Zellmasse Hochdichte [g / Liter Kultur]	Zielpeptid Ausbeute [mg / Liter Kultur]
131	8	2,1	32	810
137	6	0,86	19	200
ssTorrA-3x-CBM Aspergillus niger-N^pro (WO'125)	5	0,53	12	120
ssTorrAamylase-homosapiens-N^pro (WO'125)	7	0,48	11	90

Beispiel 3: Bindungskinetik von erfindungsgemäßen Fusionspolypeptiden

Die folgende Tabelle 10 zeigt einen Vergleich von fünf verschiedenen Fusionspolypeptiden in Bezug auf die Reinigung unter Verwendung verschiedener Bindemittel. Die Einschlusskörper werden mit 2 % SDS denaturiert oder sekretiertes Fusionspolypeptid wird verwendet. Ein Volumen von 30 mM KCl wird für die Fällung verwendet. Das gleiche Fusionspolypeptid wird unter den gleichen Bedingungen untersucht und entweder mit Maisstärke beziehungsweise Weizenstärke unter Sedimentationsbedingungen oder in einer Säule aus Weizen- oder Kartoffelstärke in Kontakt gebracht. Die Tabelle zeigt die Zielpeptidausbeute (Melittin) in mg/l Kultur für jedes Konstrukt. Tabelle 10: Vergleich von fünf Fusionspolypeptiden

SEQ ID No.:	Maisstärke mit Zentrifugation [mg/l Kultur]	Weizenstärke mit Zentrifugation	Weizenstärke in Säule	Kartoffelstärke in Säule
131	26 to 33	46 to 52	48 to 53	49 to 51
137	44 to 58	61 to 63	50 to 54	46 to 53
139	51 to 56	55 to 59	62 to 65	54 to 58
141	56 to 59	61 to 63	68 to 71	67 to 74
143	21 to 29	28 to 31	33 to 35	31 to 38

Beispiel 4: Bewertung verschiedener Produktionsschritte mit GFP
Die Effizienz der Einschlusskörperproduktion wird anhand von GFP bewertet. Da die Absorptions- und die Fluoreszenzeigenschaften von GFP unter verschiedenen Bedingungen bekannt sind, können GFP-Absorption und Fluoreszenz zur Untersuchung der Produktionsschritte verwendet werden. Super folder GFP wird als Zielprotein eingesetzt. Eine Vorkultur von Bakterien, die das Expressionsplasmid mit dem GFP am Fusionspolypeptid als Insert trägt, wird über Nacht gezüchtet. Diese Vorkultur wird verwendet, um wiederum die Expressionskultur anzuimpfen. Vor der Induktion wird die Kultur geteilt und nur eine der Kulturen wird mit IPTG induziert. Die nicht induzierte Kultur wird als Blindwert für die Induktion verwendet. Von beiden Kulturen wird jeweils 1 ml entnommen, um die OD600 zu jedem Zeitpunkt zu messen. Für beide Kulturen wird eine Verdünnungsreihe in TNG-Puffer erstellt, der aus 100mM Tris HCl besteht, 50 mM Natriumchlorid und 10 % Glycerin (w/v). Die nicht induzierten Zellen der Verdünnungsreihe werden als Leerwert für die induzierten Zellen der gleichen Verdünnung verwendet. Die gleichen Proben werden verwendet, um die Absorption bei 600 nm und die Fluoreszenz im Bereich von GFP zu messen. Jede Probe wird mit der gleichen Menge an Rhodamin als internem Standard behandelt. Die Zellaliquots, bei denen die Fluoreszenz gemessen wurde, werden in tarierten Gefäßen zentrifugiert und der Überstand wird entfernt. Das Gewicht der Zellmasse wird verwendet, um die Zellmasse zu Absorption und Fluoreszenz in Beziehung zu setzen. Die verbleibenden Aliquots der 1-ml-Proben werden auf die gleiche Weise verdünnt wie die Proben für die optischen Messungen. Die Proben dieser neuen Verdünnungsreihe wurden einer Zelllyse unterzogen. Der Überstand und das Pellet werden durch Zentrifugation getrennt. Die Überstände werden wie zuvor mit Rhodamin behandelt. Nach der Messung werden die Proben in Ethanol ausgefällt und die Masse wird bestimmt. Auf diese Weise können das GFP im Pellet und im Überstand miteinander verglichen werden. Super folder GFP kann auch in Einschlusskörpern bestimmt werden. Die Fluoreszenzmessung erfolgt bei 491 nm als Anregungswellenlänge und 512nm als Emissionswellenlänge.
In ist die GFP-Fluoreszenz von zwei verschiedenen Proben dargestellt. Auf der linken Seite ist die Fluoreszenz in der Lysatprobe gezeigt, in der keine oder nur wenig Fluoreszenz zu erwarten ist. Unter der Abbildung auf der rechten Seite ist eine deutliche Fluoreszenz für die GFP-Produktion zu erkennen. Diese Abbildung zeigt, dass GFP produziert wurde.
Beispiel 5: Prüfung der Bindung des Fusionsproteins
Getestet wird die Bindung des Fusionspolypeptids an die Stärkematrix. Daher wird ein Aliquot des Pelletmaterials der Säule oder des Zentrifugenbechers (100 mg) in ein 2 ml Reaktionsgefäß gegeben und mit 500 µl einer Lösung aus 1 % SDS und 10 mM Mercaptoethanol in Wasser beschickt. Die Mischung wird zehn Minuten lang bei 800 U/min und 37 °C geschüttelt. Die Probe wird dann fünf Minuten lang bei 10000 U/min und Raumtemperatur zentrifugiert. 15 µl des Überstandes werden für die Vorbereitung der SDS-Polyacrylamidgel-Proben verwendet und diese werden im Gel unterucht. Da die Masse des Fusionspolypeptids bekannt ist, ist es ist es möglich, die richtige Masse im Gel zu identifizieren.
zeigt ein 12 %iges Polyacrylamidgel, das die kinetische Beobachtung der Bindung des Fusionsproteins an eine Weizensäule zeigt. Neun Weizenstärkeproben werden mit aktiviertem Fusionsprotein werden zentrifugiert und der Überstand wird untersucht. Die Stärke der Proben wird nach einer bestimmten Zeit extrahiert, und die resultierenden Proben werden auf ein 12 %iges Polyacrylamid-Gel geladen. zeigt, dass das Fusionspolypeptid an die Stärke bindet.
Es folgt ein Sequenzprotokoll als elektronisches Dokument. Dieses kann sowohl in DEPATISnet als auch im DPMAregister aufgerufen werden.

Claims

Fusionspolypeptid, umfassend oder bestehend aus in Richtung vom N-Terminus zum C-Terminus (i) eine Reinigungsdomäne, (ii) eine Autoprotease-Domäne, (iii) eine Zielpeptiddomäne, (iv) optional: eine Signalsequenz, und (v) optional: eine Linker-Sequenz, wobei die Autoprotease-Domäne (ii) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.: 117 oder eine Aminosäuresequenz mit einer Sequenzidentität von 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr zur SEQ ID No.: 117 umfasst oder daraus besteht, und wobei die Reinigungsdomäne (i) an eine Kohlenhydratmatrix bindet und mindestens eine Aminosäure-Konsens-Motivsequenz gemäß SEQ ID No.: 1, SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.: 3, SEQ ID No.: 4, SEQ ID No.: 5, SEQ ID No.: 6, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 8 oder SEQ ID No.: 9 umfasst oder daraus besteht.
Fusionspolypeptid gemäß Anspruch 1, wobei die Reinigungsdomäne (i) mindestens eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sequenzen gemäß SEQ ID No.: 10 bis SEQ ID No.: 116, vorzugsweise aus den Sequenzen SEQ ID No.: 10 bis SEQ ID No.: 13 und Sequenzen mit einer Sequenzidentität von 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr zu einer der genannten Sequenzen, umfasst oder aus einer solchen besteht.
Fusionspolypeptid gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Autoproteasedomäne (ii) eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sequenzen gemäß SEQ ID No.: 118, SEQ ID No.: 119 oder SEQ ID No.: 120 und Sequenzen mit einer Sequenzidentität von 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr zu einer der genannten Sequenzen umfasst oder daraus besteht.
Fusionspolypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend eine Signalsequenz (iv), wobei die Signalsequenz (iv) eine Einschlusskörperfördernde Sequenz oder eine Sekretionssequenz ist, vorzugsweise vom Sekretionstyp IV oder Typ II von gram-negative Bakterien.
Fusionspolypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend eine Linkersequenz (v), wobei die Linkersequenz eine N-terminale Alpha-Helix umfasst und/oder eine C-terminale Sequenz einer „random coil“-Struktur.
Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das für ein Fusionspolypeptid nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche kodiert.
Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das für ein Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und für eine Klonierungsstelle zum Einbau eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls gemäß Anspruch 6, gegebenenfalls operativ verbunden mit einer Expressionskontrolle, kodiert.
Gemisch, enthaltend oder daraus bestehend ein Zielpeptid, vorzugsweise ein synthetisches Zielpeptid, und eine Gesamtmenge von 0,001 bis 1 Gew.-% Natrium und/oder Kalium, bezogen auf das Gesamtgewicht der Summe aus Natrium (falls vorhanden), Kalium (falls vorhanden) und Zielpeptid, wobei das Gemisch durch ein Verfahren das die folgenden Schritte umfasst, erhalten wird oder erhältlich ist: (a) Bereitstellen einer gentechnisch veränderten Zelle beinhaltend ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 6, wobei die Zelle in der Lage ist, ein Fusionspolypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 zu exprimieren, vorzugsweise, wobei die Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Escherichia coli, Vibrio natrigens, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger, Grünalgen, Mikroalgen, HEK T293 und chinesische Hamster Ovarienzellen (CHO); (b) Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, die für die Expression eines Fusionspolypeptids, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, geeignet sind, (c) Erhalten des Fusionspolypeptids und gegebenenfalls Entfalten des erhaltenen Fusionspolypeptids und gerichtetes Rückfalten des Fusionspolypeptids, (d) Inkontaktbringen des in Schritt (c) erhaltenen Fusionspolypeptids mit einer Kohlenhydratmatrix, (e) Spalten des Fusionspolypeptids durch Aktivieren der Autoproteasedomäne des Fusionspolypeptids, dadurch Erhalten eines Zielpeptids, (f) Sammeln eines Gemischs, das das Zielpeptid umfasst, vorzugsweise wobei die Kohlenhydratmatrix in Schritt (d) aus einem Stoff besteht oder umfasst, der aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus Stärke, Lignin, Kohlenhydratpolymeren, Copolymeren mit alpha-1,4- und alpha-1,6-glykosidischen Bindungen aus Glucose oder anderen Zuckern und Mischungen daraus und ist vorzugsweise in einer gepackten Säule, als gepacktes Substrat oder als Stärkekörner, bestehend aus Amylose und Amylopektin vorhanden, und/oder vorzugsweise, wobei die Aktivierung der Autoproteasedomäne in Schritt (e) bei pH 6 bis pH 8, vorzugsweise bei pH 6,5 bis 7,5, und besonders bevorzugt bei pH 7 bis pH 7,4 durchgeführt wird.
Synthetisches Zielpeptid, wobei das Peptid ein N-terminales Prolin umfasst, erhalten oder erhältlich durch ein Verfahren wie in Anspruch 8 definiert oder eine Mischung nach Anspruch 8, wobei das Zielpeptid ein Peptid aufweisend ein N-terminales Prolin, ist.