WO2011124463A1 - Verfahren zur herstellung süsser proteine - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes und effizienteres Verfahren zur Herstellung und Gewinnung von Proteinen, die mit dem menschlichen T1R2/T1R3 Rezeptor reagieren und einen süßen Geschmack vermitteln.

Description

VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG süßER PROTEINE

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes und effizienteres Verfahren zur Herstellung und Gewinnung von Proteinen, die mit dem menschlichen T1R2/T1R3 Rezeptor reagieren und einen süßen Geschmack vermitteln.

Für die Wahrnehmung des süßen Geschmacks ist ein heterodimerer Rezeptor verantwortlich, der aus den beiden G-Protein-gekoppelten Rezeptoren T1R2 und T1R3 zusammengesetzt ist. Dieses Heterodimer vermittelt den süßen Geschmack aller für den Menschen süß schmeckender Stoffe, obwohl diese sehr unterschiedliche molekulare Strukturen aufweisen. Die Fähigkeit, eine Vielzahl unterschiedlicher Stoffe zu detektieren, wird durch den besonders langen extrazellulären N-Terminus der beiden Rezeptoruntereinheiten bewerkstelligt. Zur Bindung der einzelnen Stoffe sind verschiedene Teile des N-Terminus von Nöten.

Es gibt sehr verschiedene Proteine und Proteinverbindungen, die einen süßen Geschmack hervorrufen. Dabei fällt auf, dass oft nur kleine strukturelle Modifikationen zwischen süß und bitter entscheiden. Es wird derzeit angenommen, ohne an diese Hypothese gebunden zu sein, dass ein gemeinsames Strukturmerkmal, nämlich ein Protonendonator/-akzeptor-System (AHs/Bs- System) vorhanden sein muss, welches bestimmte sterische Voraussetzungen erfüllen muss, damit es mit dem komplementären System eines Rezeptors (AHr/Br-System) in Wechselwirkung treten kann. Neuere, erweiterte Modelle beziehen auch hydrophobe Wechselwirkungen ein (ns/es- System mit Rezeptorsystem nr/er) (Meyers & Brewer, 2008, J Food Sei, Vol. 73 (6) pp. R81-90).

Den derzeit bekannten Stand der Technik bilden sechs miteinander nicht-verwandte, süß schmeckende Proteine, nämlich Thaumatin, Monellin, Mabinlin, Pentadin, Brazzein und Cur- culin (Faus, 2000, Appl. Microbiol Biotechnol 53: 145-151). All diese Proteine wurden aus Pflanzen, die im tropischen Regenwald heimisch sind, isoliert. Sie sind strukturell grundsätzlich verschieden und zeigen keine Sequenzhomologien, gemein ist ihnen jedoch ihre Süßkraft, die zwischen 100 und 3000 mal größer ist als die von Saccharose.

Der Einsatz von Saccharose in großen Mengen ist eine Entwicklung der letzten 150 Jahre. Dies ist einerseits auf die Beliebtheit der süßen Geschmacksrichtung und andererseits auf die Verfüg- barkeit von billigem Zucker zurückzuführen. Aus ernährungsphysiologischer Sicht (Übergewicht, Karies, Trend zu kalorisch reduzierten Lebensmitteln) ist die Verwendung von großen Zuckermengen aber problematisch. Ferner ist Saccharose nicht zuletzt wegen ihrer Reinheit ein sehr einseitiger Kalorienlieferant ohne irgendwelche zusätzlichen inhaltlichen Werte. Grundsätzlich ist daher ein Ersatz durch andere Süßstoffe wünschenswert.

Unter dem Begriff Süßstoffe werden alle natürlichen oder synthetischen Verbindungen zusam- mengefasst, die einen süßen Geschmack, aber keinen oder im Verhältnis zu ihrer Süßkraft zu vernachlässigenden Nährwert besitzen ("non nutritive sweeteners"). Insbesondere umfasst der Begriff Süßstoffe die bekannten süßen Proteine, z.B. Thaumatin, Monellin, Mabinlin, Pentadin, Brazzein, Curculin und deren Derivate, sowie die bekannten synthetischen Süßstoffe, z.B. Aspar- tam, Cyclamat, Saccharin oder Acesulfam. All diese Verbindungen stoßen in der Zubereitung und Aufbereitung von Nahrungsmitteln auf großes Interesse, da es sinnvoll erscheint, die Verwendung von normalem Zucker (Saccharose) aus ernährungsphysiologischen Gründen einzu- schränken.

Der Ersatz von Zucker durch andere Süßstoffe bedingt, dass die entsprechenden Ersatzstoffe gesundheitlich unbedenklich sind und darüber hinaus auch noch diverse technologische und sensorische Kriterien erfüllen müssen. Hierzu gehören eine ausreichende Löslichkeit, Stabilität in einem breiten Temperatur- und pH-Bereich, reiner Süßgeschmack ohne Neben- und Nachge- schmack, ausreichende Süßkraft, technologische Herstell ungs- oder Gewinnungsverfahren sowie Wirtschaftlichkeit des Herstellungsprozesses.

Bei weitem nicht alle der oben aufgeführten Stoffe sind bereits für Ernährungszwecke oder die Nahrungsmittelproduktion zugelassen. Neben dieser formellen Problematik sind, bezogen auf die süßen Proteine, insbesondere die eingeschränkte Verfügbarkeit, der hohe Aufwand, solche Proteine aus natürlichen Ressourcen zu isolieren, sowie die technologischen Rückschläge bzw. die geringe Ausbeute in biotechnologischen Herstellungsverfahren der vorrangig limitierende Faktor auf dem Weg, solche süßen Proteine vermehrt zum Einsatz zu bringen (Faus, 2000, siehe oben). Am Beispiel Thaumatin sind diese Probleme am besten dokumentiert (Faus, 2000, siehe oben). Natürliches Thaumatin, extrahiert aus den Früchten der tropischen Pflanze Thaumatococ- cus daniellii, ist seit 1983 als Süßstoff für die Lebensmittelherstellung zugelassen. Mit der Zulassung stieg das Interesse, von der Verfügbarkeit der natürlichen Isolate los zu kommen und re- kombinant erzeugtes Thaumatin einsetzen zu können. In den vergangenen Jahren wurde daher immer wieder versucht, Thaumatin über verschiedene Expressionssysteme zu produzieren und zu isolieren. Wissenschaftlich betrachtet waren hierbei auch Erfolge zu erkennen, so gelang es, Thaumatin z.B. in E.coli (Edens et al, 1982,), in S. cervisi e (Lee et al, 1988,), in Kluyveromyces lactis (Edens & van der Wel, 1985,) in Bacillus subtilis (Illingworth et al, 1988,) und anderen Systemen heterolog zu exprimieren und zu isolieren.

Allerdings wiesen die isolierten rekombinanten Thaumatinproteine in vielen Fällen, insbesondere beim Einsatz von altbewährten Expressionssystemen wie z.B. E. coli und S. cervisiae, einen ande- ren und nicht erklärbaren funktionellen Unterschied auf. Sie waren nicht mehr süß. Darüber hinaus war auch die Ausbeute sehr gering.

Um so erfreulicher ist es, dass es den Erfindern der vorliegenden Anmeldung gelungen ist, die Nachteile des Standes der Technik zu überkommen und ein Produktionsverfahren bereitzustellen, welches dazu dient, rekombinante süße Proteine sowie deren Derivate, die einen süßen Ge- schmack haben, herzustellen.

Die Erfindung stellt hierzu ein Verfahren gemäß Anspruch 1 bereit. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen ausgeführt.

Das erfinderische Verfahren umfasst dabei zunächst die Identifikation und nachfolgend die Anpassung eines geeigneten Expressionssystems. Trotz der negativen Erfahrung mit Hefen, insbe- sondere mit S ccheromyces Stämmen (siehe oben) wird als Expressionssystem ein Hefesystem, nämlich Schizos ccheromycetes, herangezogen.

Wissenschaftlich wurden die Schizosaccheromycetes oder Spalthefen bereits 1893 beschrieben. Es zeigte sich aber erst 2002, als die Sequenz publiziert wurde (Wood et al., (2002), Nature 415, 871-880), wie deutlich sie sich von anderen Hefen und insbesondere den Saccheromyceten unter- scheiden.

Ein interessanter Unterschied, den die Erfinder identifizieren konnten, ist z.B. das unterschiedliche Verhalten bzw. die unterschiedliche Anpassung an Stress, z.B. Thermostress, welche auch im erfindungsgemäßen Verfahren ausgenutzt wird.

Im Rahmen der Erfindung werden rekombinante Schizosaccheromyceten Stämme und vorzugs- weise rekombinante Sc. pombe als Expressionssystem eingesetzt. Weiterhin werden gemäß weiterer Ausführungsformen auch von rekombinanten Sc. pombe abgeleitete Stämme, nämlich konventionell oder molekularbiologisch modifizierte Stämme, eingesetzt, wobei die Modifikationen z.B. eine Insertion, eine Deletion, ein Basen- oder Genaustausch und/oder andere Veränderungen der genetischen Information umfassen, welche sich jedoch nicht auf die Stress- und/oder Thermotoleranz der Schizosaccheromyceten Stämme auswirken.

Der im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzte rekombinante Schizosaccheromyceten Stamm trägt und exprimiert wenigstens eine Gensequenz, welche für wenigstens ein mit dem humanen TlR2-TlR3-Rezeptor interagierendes Polypeptid kodiert.

Der Begriff„ein mit dem humanen TlR2-TlR3-Rezeptor interagierendes Polypeptid" be- schreibt dabei funktionelle Wirkung der mit dem vorliegenden Verfahren zu exprimierenden Proteine. Im Rahmen der Erfindung wird die Bereitstellung von süßen Proteinen verfolgt und nur solche Polypeptide, die eine Interaktion mit dem für den süßen Geschmack verantwortlichen Rezeptor auslösen, sind von Interesse. Die Interaktion mit dem humanen T1R2-T1R3- Rezeptor kann dabei durch Geschmacksprobe ermittelt werden. Sofern eine Testperson eine rekombinante Substanz als süß beurteilt, liegt die entsprechende Interaktion vor. Ferner kann die Interaktion mit dem humanen TlR2-TlR3-Rezeptor aber auch in standardmäßigen molekularbiologischen Rezeptorbindungsassays (Current Protocols in Immunology, New York: Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons; 1992) ermittelt und auch quantifiziert werden. Beispielsweise können zu diesem Zwecke Verfahren basierend auf der„surface plasmon resonan- ce"-Technologie zur Bestimmung von Rezeptor-Ligang-Interaktionen verwendet werden.

Die Gensequenz, die für ein mit dem humanen TlR2-TlR3-Rezeptor interagierendes Polypeptid kodiert, wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ausgewählt aus der Gruppe umfassend die derzeit bekannten Sequenzen für die süßen Proteine Thaumatin, Monellin, Mabinlin, Penta- din, Brazzein, Curculin sowie Derivate oder Mischungen derselben, ferner umfassend die adaptierten Sequenzen SEQ ID No: 1 bis 4.

Gemäß einer Ausführungsform ist der rekombinante Schizos ccheromyceten Stamm zumindest mit wenigstens einer Kopie, vorzugsweise mit zahlreichen Kopien eines Expressionsvektors tran- sient transformiert, welcher die kodierende Sequenz für wenigstens ein mit dem humanen T1R2- TlR3-Rezeptor interagierendes Polypeptid sowie einen Promotor enthält. Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist der rekombinante Schizosaccheromyceten Stamm zumindest mit wenigstens einer Kopie, vorzugsweise mit zahlreichen Kopien eines Expressionsvektors stabil transformiert, welcher die kodierende Sequenz für wenigstens ein mit dem humanen TlR2-TlR3-Rezeptor interagierendes Polypeptid sowie einen Promotor enthält.

Gemäß einer Ausführungsform ist der rekombinante Schizosaccheromyceten Stamm zusätzlich mit wenigstens einer Kopie eines Expressionsvektors transient oder stabil transformiert, welcher die kodierende Sequenz für wenigstens ein eukaryontisches Chaperon enthält. Chaperone werden benötigt, um neuen Aminosäureketten zu ihrer physiologischen Sekundärstruktur zu verhelfen. Darüber hinaus weisen Chaperone bei unphysiologisch hohen Temperaturen eine erhöhte

Syntheserate auf und gehören damit zu den klassischen Hitzeschockproteinen, deren Aktivierung in dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren erwünscht und angestrebt ist.

Gemäß weiterer Ausführungsformen wird das Chaperon ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der Chaperon Hsp90-Familie, Chaperon Hsp70-Familie, Chaperon HsplOO/Clp-Familie, Chaperon Hsp60-Familie, Chaperon HsplO-Familie und CCT-Familie.

Zur Kultivierung des im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzten rekombinan- ten Schizosaccheromyceten Stamms sind Kulturbedingungen zu wählen, die z.B. einen Thermo- stress für den rekombinanten Stamm darstellen. Ohne durch die Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass die besonderen Temperaturbedingungen bei der Kultivierung der rekombinanten Schizosaccheromyceten Stämme entscheidend dazu beitragen, dass die rekombi- nant exprimierten Polypeptide tatsächlich einen süßen Geschmack bzw. süßen Phänotyp aufweisen.

Der Begriff„Kulturbedingungen, die Stress auslösen" beschreibt im Rahmen dieser Erfindung solche Kulturbedingungen, die z.B. durch kurzzeitige oder längerfristige Temperaturveränderungen während der Kultivierung der rekombinanten Stämme zur Aktivierung von Schizosaccheromyceten eigenen oder rekombinant eingeführten Hitzeschockproteinen z.B. Chaperonen führen.

Gemäß weiterer Ausführungsformen kann die Aktivierung von den Schizosaccheromyceten eigenen oder rekombinant eingeführten Hitzeschockproteinen z.B. Chaperonen auch durch andere Faktoren wie oxidativer Stress, zellschädigende Substanzen oder auch Aktivierung eines induzierbaren Promotors induziert werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Kulturbedingungen, die einen Ther- mostress auslösen, Temperaturkurven, bei denen die Kultivierungstemperatur im Laufe der 24- 72 stündigen Produktionsphase, die üblicherweise bei ca. 30°C abläuft, einmalig für einen Zeit- räum von 2-20 min oder in Intervallen von wenigstens 2 min auf eine Temperatur von etwa

34°C - 42°C erhöht wird. Gemäß weiterer Ausführungsformen findet die Temperaturerhöhung einmalig für 2 min, 5 min, 10 min, 15 min, oder bis zu 20 min statt. Alternativ und gemäß einer weiteren Ausführungsform findet die Temperaturerhöhung in Intervallen von 2 min, 3 min, 5 min oder 7 min über einen Zeitraum von 10 min bis zu 40 min statt.

Gemäß einer Ausführungsform findet die einmalige oder intervallartige Erhöhung der Kultivierungstemperatur innerhalb der ersten 2 - 4 Stunden der Produktionsphase statt. Gemäß einer weiteren Ausführungsform findet die einmalige oder intervallartige Erhöhung der Kultivierungstemperatur erstmalig nach 24 Stunden der Produktionsphase statt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Temperatur für 10 min auf 38°C oder 42°C erhöht.

Nach Abschluss der Produktionsphase des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die rekombinant exprimierten Polypeptide isoliert. Die hierzu herangezogenen Verfahren zur Proteinabtrennung und -aufreinigung sind hinlänglich bekannt. Es spielt dabei keine Rolle, ob das Protein intrazellulär vorliegt oder von dem Expressionssystem in den Überstand sekretiert wird.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform, die auch eine Beschleunigung und damit weitere Op- timierung des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens darstellt, wird das zu exprimierende Polypeptid als Fusionsprotein mit einer Sekretionssequenz in den Expressionsvektor Moniert. Eine im Rahmen der Erfindung bevorzugte Fusionssequenz ist die 60 bp lange Präsequenz der sauren Phosphatase (pho-1, (Maundrell et al, 1985). Gemäß weiterer Ausführungsformen kann die Sekretionssequenz ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus: Xylanase (XynA, (Schlacher et al, 1996), Berberine bridge Enzym (bbel , (Dittrich & Kutchan, 1991), P-Faktor (P3, (Imai & Yamamoto, 1994), Hepatitis C Virus Hüllprotein (HCV, (Choi et al, 2005), Car- boxypeptidase Y (Cpy, (Kjaerulff & Jensen, 2005) und Maltase (Okuyama et al, 2001).

Die vorliegende Erfindung stellt somit neben dem Verfahren zur Herstellung von süßen Protei- nen insbesondere auch rekombinante Sc. pombe Stämme bereit, die zum Einsatz in besagtem Verfahren optimal geeignet und die dadurch charakterisiert sind, dass sie die Gensequenz für süße Proteine bzw. Polypeptide, die mit dem humanen TlR2-TlR3-Rezeptor interagieren, sowie homo- und/oder heterogene Hitzeschockproteine und/oder Chaperone exprimieren können.

Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierten Polypeptide werden erfindungsgemäß alle einem Funktionstest unterzogen, ob sie auch wirklich mit dem humanen TlR2-TlR3-Rezeptor interagieren und somit einen süßen Geschmack aufweisen. Diese Funktionstests können mit Testpersonen oder in molekularbiologischen Standardassays durchgeführt werden.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren war es möglich, süß schmeckende Varianten aller derzeit bekannten süßen Proteine, nämlich Thaumatin, Monellin, Mabinlin, Pentadin, Brazzein, Cur- culin sowie deren Derivate zu erzeugen.

Diese süßen Proteine eigenen sich insbesondere zum Süßen von Produkten, die zum tierischen oder menschlichen Verzehr, nämlich Futtermittel, Lebensmittel, Getränke oder Arzneimittel, bestimmt sind.

Kurze Beschreibung der Figuren:

Figur 1: Schema des Integrationsvektors pCADl . Pnmtl = nmtl Promotor; Insert = zu exprimie- rendes Gen (in der gezeigten Zeichnung 1 ,5 kb lang); ura4 = Selektionsmarker; LeulLoc = Zielsequenzen für den Integrationslocus; AmpR = Ampicillin Resistenzgen; Ndel, BamHI, Notl: Restriktionsschnittstellen.

Figur 2: Die für die Spalthefe optimierte cDNA für Brazzein. ORF = open reading frame = kodierende Sequenz des Brazzeins; Org = Originalsequenz vor der Optimierung; Opt: = optimierte Sequenz; Ndel/BamHI = Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen.

Figur 3: Schema des Expressionsvektors pREP42GFP-C und Sequenz der darin enthaltenen Kassette, die die Expression von Proteinen carboxyterminal markiert mit GFP ermöglicht. ura4+ = Selektionsmarker; arsl = autonom replizierende Sequenz; Hindill, Pstl, Sacl, EcoRI, Ndel, Sali, KpnL, Bglll, Xhol, BamHI, Smal, Ncol: Restriktionsschnittstellen.

Figur 4: Nachweis der Expression und Sekretion von Brazzein-GFP, Monellin-GFP, Curculin- GFP und Thaumatin-GFP durch Bestimmung der Fluoreszentintensitäten der Kulturüberstände von den Hefestämmen PBT-51, PBT-52, PBT-53 und PBT-54. Als Vergleichsprobe diente der Überstand einer Kultur von MB 163 (Ausgangsstamm).

Die Erfindung wird nachfolgend anhand bevorzugter Ausführungsbeispiele erläutert, wobei darauf hingewiesen wird, dass durch diese Beispiel Abwandlungen bzw. Ergänzungen, wie sie sich für den Fachmann unmittelbar ergeben, mit erfasst sind. Darüber hinaus stellen diese bevorzugten Ausführungsbeispiele keine Beschränkungen der Erfindung dar, so dass Abwandlungen oder Ergänzungen auch im Umfang der vorliegenden Erfindung liegen.

Beispiel 1:

In einem Ausführungsbeispiel wurden für die erfindungsgemäße Herstellung und Gewinnung von süßen Proteinen die jeweiligen Gensequenzen nach Standardmethoden der Molekularbiologie mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert. Zur späteren Steuerung der Sekretion der erwünschten süßen Proteine, nämlich Brazzein (SEQ ID NO: 1), Thaumatin (SEQ ID NO: 4), Monellin (SEQ ID NO: 3) und Curculin (SEQ ID NO: 2), wurden die jeweiligen Nukleo- tidsequenzen der Polypeptide mit der Sekretionssequenz der sauren Phosphatase (phol) der

Spalthefe fusioniert. Die Nukleinsäuresequenz der Sekretionssequenz wurde dazu zusammen mit den jeweiligen Nukleinsäuresequenzen der Gene der süßen Proteine synthetisiert, wobei vor der Synthese eine Codonoptimierung für die Expression der Proteine in der Spalthefe erfolgte, um eine möglichst hohe Produktionsmenge zu erhalten. Die Proteinsequenzen der jeweiligen süßen Proteine wurden hierbei nicht verändert, d.h. die Aminosäureabfolge ist exakt identisch zu derjenigen, die von den aus den entsprechenden Pflanzen isolierten Proteinen bekannt ist.

Die daraus resultierenden Nukleinsäuresequenzen wurden über eine Zwischenklonierung in E.coli ^' den Expressionsvektor für die Expression in den Spalthefezellen Moniert.

Als Expressionsvektor wurde z.B. pREP42GFP-C verwendet. Der Vektor ermöglicht die mittel- starke Expression von Proteinen unter der Kontrolle des Spalthefe-eigenen nmt4l -Promotors, der in Abhängigkeit von der Zugabe von Thiamin zum Nährmedium der Spalthefen reguliert werden kann. Durch die Verwendung von pREP42GFP-C kann ein beliebiges Protein mit einem C-terminalen GFP (green fluorescent protein)-tag exprimiert werden. Der GFP-tag stellt einerseits ein immunologisches Epitop dar, das zur Detektion der untersuchten Proteine verwen- det werden kann, andererseits ermöglicht er den direkten optischen Nachweis der Proteinexpression durch die Fluoreszenz des GFP. Weiterhin enthält der Vektor eine Expressionskassette für ß-Lactamase (AmpR) sowie das ura4-Gen für die Orotidinmonophosphat-decarboxylase, welches den Gendefekt ura4.dll 8 in der Spalthefe komplementiert und daher zur positiven Selektion eingesetzt werden kann. Die anschließende Transformation der Spalthefezellen erfolgte mittels der Lithiumacetat- Methode in Kombination mit einem Hitzeschock bei 42°C für 5 Minuten. Für die Transformation wurden 1 bis 5 ]xg DNA eingesetzt. Durch die positive Selektion über die mit dem Expressionsvektor eingebrachte, einen Gendefekt komplementierenden Nukleinsäuresequenz wurden die späteren Produktionsstämme, also die Stämme, welche die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz eines der süßen Proteine ausweisen, isoliert.

Die jeweiligen Produktionsstämme wurden unter induzierenden Bedingungen in 10 mL EMM bei 30°C etwa 24 h kultiviert. Anschließend wurden die Stämme in einer Hauptkultur von 100 mL EMM weiter für 24 h bei 30°C inkubiert, um das rekombinante Protein zu produzieren. Das auf diese Weise von den Spalthefen produzierte Protein wurde aufgrund der Fusion mit der Sekretionssequenz von den Spalthefen in das umgebende Medium sekretiert. Dadurch kann das Kulturmedium nach Abzentrifugation der Spalthefen direkt als Ausgangsmaterial für die anschließende Aufreinigung und die Geschmacksanalyse verwendet werden.

Beispiel 1.1

Detaillierte Versuchsbeschreibung am Beispiel der Brazzein-Herstellung

Der in diesem Beispiel verwendete Expressionsvektor pCAD 1 ist in Figur 1 dargestellt. Es handelt sich um einen Integrationsvektor, der sich in das leul-Gen im Chromosom II der Spalthefe stabil integriert und dieses dabei deletiert. Der Vektor ermöglicht eine starke Genexpression unter der Kontrolle des Spalthefe-eigenen nmtl-Promotors, der in Abhängigkeit von der Zugabe von Thiamin zum Nährmedium der Spalthefen reguliert werden kann (nmt steht für no Message in ihiamine). Durch die Verwendung von pCADl kann ein beliebiges Protein mit zwei C- terminalen tags (einem Hexahistidin- fecund einem Vk-tag) exprimiert werden. Während das Anhängen eines Polyhistidin-fczgy häufig für die Proteinaufreinigung verwendet wird, stellt der Pk- tag ein immunologisches Epitop dar, das zur Detektion der untersuchten Proteine verwendet wird. Weiterhin enthält der Vektor Genfragmente des leul-Gens, das als Integrationszielsequenz dient, einen cDNA für ß-Lactamase (AmpR) sowie das ura4-Gen für die Orotidinmonophos- phat-decarboxylase, welches den Gendefekt ura4.dll 8 in der Spalthefe komplementiert und daher zur positiven Selektion eingesetzt werden kann. Eine NoÄ - Restriktion von pCADl führt zu einem Integrationskonstrukt mit flankierenden leu /Sequenzen und einem 2 kbp Fragment, welches die bakteriellen Sequenzen enthält und nicht in die Spalthefe gelangt. Die Größe des Integrationsfragments ist abhängig von der Länge des interessierenden Gens (Insert) in pCAD 1.

Als Modellprotein für Beispiel 1.1 wurde Brazzein ausgewählt, da es über eine sehr starke Süßkraft verfügt und zudem sehr thermostabil ist. Mit einem Molekulargewicht von ca. 6 kDa ist es ein relativ kleines Protein. Um später eine möglichst hohe Produktionsmenge zu erhalten, erfolgte eine Codonoptimierung für die Expression in der Spalthefe, wie in Figur 2 gezeigt. Die Proteinsequenz des Brazzeins wurde hierbei nicht verändert, d.h. die Aminosäureabfolge ist exakt identisch zu derjenigen, die vom aus der Pflanze isolierten Protein bekannt ist.

Zur Steuerung der Sekretion wurde die Sekretionssequenz der sauren Phosphatase (phol) der Spalthefe ausgewählt und an die Brazzein-cDNA über eine PCR-Reaktion fusioniert. Folgende Primer (in 5'— »^■ 3' Richtung angegeben) wurden verwendet:

Vorwärtsprimer:

5'-ATTAAT ATG TTT TTA CAA AAT TTA TTT TTA GGT TTT TTA GCT GTT GTT TGT GCT AAT GCT CAT ATG CAA GAT AAG TGC AAG AAA GTC TAC G-3' Nde l (SEQ ID No: 5)

Rückwärtsprimer:

5 '-GGATCCGTACTCGCAATAATCGCAAATG-3 ' Barril l (SEQ ID No: 6)

Der Vorwärtsprimer enthält die /5 wi-Sekretionssequenz zwischen den Restriktionsschnittstellen der Enzyme Ase I und Nde I. Der Rückwärtsprimer enthält kein Stopcodon und ermöglicht dadurch die Fusion der tags im Expressionsvektor pCADl mit der Brazzein Sequenz.

Die Reaktionslösung für einen PCR-Ansatz wurde folgendermaßen zusammengesetzt:

Primer 0.5 jeweils Vorwärtspr. und Rückwärtspr. 100 μΜ; Ausgangs DNA x μί; dNTPs 2.0 μΐ, einer 5 mM Stammlösung; Polymerase 0.5 μί Pfu Polymerase (Promega, USA); Puffer 5 L; deionisiertes Wasser ad 50 μL·

Mit Hilfe der genannten Primer wurde durch PCR-Reaktion die /5 wi-Sekretionssequenz an die Brazzein-cDNA fusioniert. Die hierbei erhaltenen Produkte wurden vermittels DNA- Gelelektrophorese überprüft. Die Länge der Brazzein-cDNA beträgt 174 bp und die der phol- Sequenz beträgt 60 bp. Daraus ergibt sich (in guter Übereinstimmung mit der Größe des amplifi- zierten Fragments auf dem Agarose-Gel) eine Gesamtlänge von 234 bp. Dieses Experiment zeigt also die erfolgreiche Fusion der /5 wi-Exportsequenz an die Brazzein-cDNA.

Nach der PCR-Reaktion erfolgte die Isolierung und Fällung des gezeigten DNA-Fragments aus dem Gel und die Addition eines Adenosin-Nukleotids am 3'-Ende. Das Fragment konnte an- schließend im kommerziell erhältlichen Vektor pGEM-T (Promega, Madison, WI, USA) mittels Ligation zwischenkloniert werden. Nach erfolgter E. cö/z-Transformation wurden vier pGEM-T- /5 wi-Brazzein- Klone (Kl, K4, K5 und K6) herangezüchtet und zur Plasmid-Isolierung einge- setzt.

Die Überprüfung der erfolgreichen Klonierung erfolgte durch eine Restriktionsanalyse der erhaltenen pGEM-T-/5Äöi-Brazzein- Plasmide mit den Restriktionsenzymen Ase l und Bamti I.

Das Ausschneiden von Nukleinsäurefragmenten aus Plasmiden erfolgte unter Einsatz von Re- striktionsendonukleasen. Das Enzym Ase I wurde von der Firma NEB (Beverly, MA, USA),

B mW I, A^ I und Notl von der Firma Promega (Madison, WI, USA) bezogen. Die Reaktionslösung bestand aus folgenden Komponenten:

DNA x μί; Enzympuffer 3.0 μί; Enzym 0.5 ί; bovines Serumalbumin 1.0; μΐ, deionisiertes Wasser ad 30 μΐ, Das Totalvolumen der Reaktion betrug 30 μL· Das Volumen der eingesetzten DNA x richtete sich nach der Konzentration der vorhandenen Lösung. Für präparative Restriktionen wurden ca. 5 ]xg DNA, für analytische Restriktionen ca. 100 ng DNA eingesetzt.

Die positiven pGEM-T-/5 wZ-Brazzein-Klone wurden mit Ase I und BamW I präparativ verdaut, während der Vektor pCADl einer präparativen Restriktion mit A^ I und BamW I unterzogen wurde. Die durch die Enzyme Ase I und Nde I erzeugten Nukleotidüberhänge sind zueinander kompatibel, sodass nach Ligation der zwei Fragmente die /5 wi-Brazzein-cDNA mit dem Vektor pCAD 1 verbunden wird. Nach der Ligation erfolgte eine E. cö/z-Transformation.

Jeweils vier Klone wurden kultiviert und einer Plasmidisolierung unterzogen. Die Überprüfung der Klonierung im Expressionsvektor erfolgte durch eine analytische Restriktion mit Nde I und BamW I. Dabei sollte die Brazzein-cDNA von der Sekretionssequenz sowie vom Vektor getrennt werden.

Die pCADl-/5Äöi-Brazzein-Konstrukte wurden mittels Notl geschnitten, um das Integrationsfragment des Expressionsvektors pCAD 1 zu gewinnen. Nach anschließender Trennung in der Gelelektrophorese wurden die Fragmente isoliert und zur Transformation des Spalthefestammes MB 163 (Genotyp: h ura4.dll 8) verwendet. Die Klone aus dieser Transformation wurden nach etwa 4 Tagen sichtbar. 16 Klon-Kolonien wurden mittels PCR mit den oben genannten Primern getestet, um die Integration der /5 wi-Brazzein-cDNA in das Genom der Spalthefen zu zeigen. Es konnte gezeigt werden, dass phol -Brazzein erfolgreich in das Spalthefegenom integriert worden ist. Der neue Spalthefestamm erhielt die Bezeichnung PBT-50.

Zum Nachweis des Exports von Brazzein wurden der Stamm PBT-50 in EMM mit 0.1% Leucin für 24 h bei 30°C und 120 rpm kultiviert. Die Proteine aus dem Kulturüberstand wurden per SDS-PAGE und Western Blot Analyse auf die Anwesenheit von Brazzein hin getestet. Die immunologische Detektion erfolgte hierbei über einen primären Antikörper, der den an das Braz- zein fusionierte Pk-tag erkennt. Brazzein konnte hiermit eindeutig im Kulturüberstand der Spalthefen nachgewiesen werden. Die durchschnittliche Expressionsrate im Schüttelkolbenmaßstab lag bei ca. 2 mg je L Kulturvolumen.

Die geschmacklichen Eigenschaften des hergestellten Brazzeins wurden in Verdünnungsreihen auf die Interaktion mit dem humanen TlR2-TlR3-Rezeptor in molekularbiologischen Rezep- torbindungsassays untersucht und im Vergleich mit Kontrollsubstanzen quantitativ als süß eingestuft (Current Protocols in Immunology, New York: Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons; 1992).

Beispiel 1.2 bis 1.4

Detaillierte Versuchsbeschreibung am Beispiel der Thaumatin-, Monellin- und Curculin- Herstellung

Zur Steuerung der Sekretion von Thaumatin, Monellin und Curculin wurde (wie bereits im Beispiel 1.1) die Sekretionssequenz der sauren Phosphatase (phol) der Spalthefe verwendet. Die Se- kretionssequenz wurde zusammen mit den jeweiligen Genen synthetisiert. Es erfolgte eine Codo- noptimierung für die Expression der Proteine in der Spalthefe, um später eine möglichst hohe Produktionsmenge zu erhalten. Die Proteinsequenzen von Thaumatin, Monellin, und Curculin wurden hierbei nicht verändert, d.h. die Aminosäureabfolge ist exakt identisch zu derjenigen, die von den aus den entsprechenden Pflanzen isolierten Proteinen bekannt ist.

Während der Durchführung dieses Projekts konnte gezeigt werden, dass sich die Fusion eines Proteins an GFP äußerst positiv auf dessen Sekretionsverhalten auswirkt und sich somit wesentlich größere Ausbeuten an sekretiertem Protein erreichen lassen. Daher wurden alle vier süßen Proteine durch die Verwendung des pREP42GFP-C- Vektors mit einem C-terminalen GFP-tag versehen. Diese Markierung beeinflusst nicht nur vorteilhaft die Sekretionseigenschaften des jeweiligen Proteins, sondern ermöglicht darüber hinaus den direkten Nachweis der Proteinexpression via Fluoreszenzmessung. Eine Proteindetektion über die Fluoreszenzeigenschaften des jeweiligen Proteins gestattet im Vergleich zur Proteindetektion mittels Western Blot-Analyse und anschließendem immunologischen Nachweis z.B. im Verlauf einer Fermentation der Produktionsorganismen eine wesentlich schnellere und gleichzeitig weniger aufwendige Überwachung der Proteinproduktion und -Sekretion.

Der Expressionsvektor pREP42GFP-C ist in Figur 3 dargestellt. Der Vektor ermöglicht die mittelstarke Expression von Proteinen unter der Kontrolle des Spalthefe-eigenen nmt41-Promotors, der in Abhängigkeit von der Zugabe von Thiamin zum Nährmedium der Spalthefen reguliert werden kann {nmt steht für no Message in iiiamine). Durch die Verwendung von pREP42GFP- C kann ein beliebiges Protein mit einem C-terminalen GFP (green fluorescent protein)- tag expri- miert werden. Der GFP- tag stellt einerseits ein immunologisches Epitop dar, das zur Detektion der untersuchten Proteine verwendet werden kann, andererseits ermöglicht er den direkten optischen Nachweis der Proteinexpression durch die Fluoreszenz des GFP. Weiterhin enthält der Vektor eine Expressionskassette für ß-Lactamase (AmpR) sowie das ura4-Gen für die Orotidin- monophosphat-decarboxylase, welches den Gen defekt ura4.dll 8 in der Spalthefe komplementiert und daher zur positiven Selektion eingesetzt werden kann.

Um die Expression der süßen Proteine fusioniert an einen GFP-fez^zu ermöglichen, mussten die jeweiligen Gene zunächst in einer PCR-Reaktion ohne Stoppcodon amplifiziert werden, bevor sie in den Expressionsvektor pREP42GFP-C einkloniert wurden. Folgende Primer (in 5'— > 3' Richtung angegeben) wurden von der Firma MWG Biotech AG (Ebersberg) synthetisiert und für dieses Experiment verwendet:

Vorwärtsprimer (für alle süßen Proteine identisch, da immer gleiche Sekretionssequenz vorhanden ist):

5 '-ATATATATTAATATGTTCTTACAGAA-3 ' Äse I (SEQ ID No: 7)

Rückwärtsprimer:

Für Thaumatin :

5'- ATATATGGATCCAGCAGTTGGACAAAAGGT-3 ' BamH I (SEQ ID No: 8)

Für Monellin:

5'- ATATATGGATCCAGGAGGTGGTACAGGACCATT-3' BamH I (SEQ ID No: 9) Für Curculin:

5 '-ATATATGGATCCATTGTTAATGACCATCTTAAT-3 ' BamH I (SEQ ID NO: 10)

Die Rückwärtsprimer enthalten kein Stoppcodon und ermöglichen dadurch die Fusion des tags im Expressionsvektor pREP42GFP-C mit der jeweiligen Proteinsequenz.

Mit Hilfe der genannten Primer wurden durch PCR-Reaktion die cDNAs von Thaumatin, Monellin und Curculin ohne Stoppcodon amplifiziert. Die hierbei erhaltenen Produkte wurden mittels DNA-Gelelektrophorese analysiert. Die Länge der Thaumatin-cDNA mit Sekretionssequenz beträgt 696 bp, der Monellin-cDNA 363 bp und die der Curculin-cDNA beträgt 546 bp. Diese Länge befindet sich in guter Übereinstimmung mit der Größe der amplifizierten Fragmente auf dem Agarose-Gel. Dieses Experiment zeigt also die erfolgreiche Amplifikation der Gene von Thaumatin, Monellin und Curculin ohne Stoppcodon. Nach der PCR-Reaktion erfolgte die Isolierung und Fällung der gezeigten DNA-Fragmente aus dem Gel und die Addition eines Adenosin-Nukleotids am 3'-Ende. Das Fragment konnte anschließend im kommerziell erhältlichen Vektor pGEM-T (Promega, Madison, WI, USA) mittels Ligation zwischenkloniert werden. Nach erfolgter E. cö/z-Transformation wurden Klon-Kolonien mittels PCR mit den oben genannten Primern getestet, um die erfolgreiche Ligation der jeweiligen cDNA in den pGEM-T- Vektor zu zeigen. Dieser Schritt wurde ebenfalls wie mit der Braz- zein-cDNA durchgeführt, um auch für dieses süße Protein ein entsprechendes Expressionskon- strukt zu erhalten.

Die Uberprüfung der erfolgreichen Klonierung erfolgte durch eine Kolonie-PCR der pGEMT- p ol-SP-YAon- Kolonien mit den oben genannten Primern sowie durch Restriktionsanalyse. Dazu wurde von jedem der süßen Proteine je ein in der Kolonie-PCR positiv getesteter Klon herangezüchtet, zur Plasmid-Isolierung eingesetzt und die erhaltenen pGEM-T-Plasmide mit den Restriktionsenzymen Ase I und Bamli I verdaut.

Die pGEM-T- Klone wurden mit Ase I und Bamli I präparativ verdaut, während der Vektor pREP42GFP-C einer präparativen Restriktion mit Nde I und Bamli I unterzogen wurde. Die durch die Enzyme Ase I und Nde I erzeugten Nukleotidüberhänge sind zueinander kompatibel, sodass nach Ligation der zwei Fragmente die jeweilige /5 wZ-SP-cDNA mit dem Vektor pREP42GFP-C verbunden wird. Nach der Ligation erfolgte eine E. cö/z-Transformation.

Die Uberprüfung der Klonierung im Expressionsvektor erfolgte durch eine Kolonie-PCR von je 20 Klonen. Im Anschluss wurde je ein positiv getesteter Klon herangezüchtet, zur Plasmid- Isolierung eingesetzt und die erhaltenen pREP42GFP-C- >Äo/-SP Expressionsplasmide zusätzlich durch eine analytische Restriktion mit Nde I und Bamli I überprüft. Dabei sollte die jeweilige SP-cDNA von der Sekretionssequenz sowie vom Vektor getrennt werden. Die erhaltenen Ergebnisse stimmen gut mit der theoretischen Größe von 174 bp für das Brazzein, 296 bp für das Mo- neilin, 479 bp für das Curculin und 629 bp für das Thaumatin überein. Somit ist gezeigt, dass die /5 wZ-Brazzein-, die /5 wi-Monellin-, die phol-C cx^m- sowie die /5 wi-Thaumatin-cDNA erfolgreich in den Spalthefe-Expressionsvektor pREP42GFP-C einkloniert wurden.

Die pREP42-/5Äöi-SP-Konstrukte wurden zur Transformation des Spalthefestammes MB 163

(Genotyp: h ura4.dll8) verwendet. Die Klone aus dieser Transformation wurden nach etwa 4 Tagen sichtbar. 16 Klon-Kolonien wurden mittels PCR mit den oben genannten Primern getestet, um die Aufnahme der Expressionskonstrukte in die Spalthefen zu zeigen.

Es konnte die erfolgreiche Transformation der Spalthefezellen

pho l-Cmculm und /5 wi-Thaumatin nachgewiesen werden. Die neuen Spalthefestämme erhielten die Bezeichnungen PBT-51 (MB !63/pREP42GFP-C-phol Brazzein), PBT-52 (MBl63/pREP42GFP-C- phol-Monellin), PBT-53 (MBl63/pREP42GFPC-phol-Curculin) und PBT-54 (MB 163/pREP42GFP-C-pho 1 -Thaumatin) .

Zum Nachweis der Produktion und des Exports der süßen Proteine wurden die jeweiligen Stämme PBT-51, PBT-52, PBT-53 und PBT-54 in EMM für 24 h bei 30°C und 120 rpm kulti- viert. Die zellfreien Überstände dieser Kulturen wurden auf die Anwesenheit von Brazzein, Mo- nellin, Curculin bzw. Thaumatin hin getestet, indem deren Fluoreszenzintensitäten im Vergleich zu einer analog behandelten Negativkontrolle (Kulturüberstand des Ausgangs-Hefestamms MB 163) gemessen wurde. Dazu wurden die Produktionskulturen abzentrifugiert (3000 g, 5 min, 4°C) und jeweils 200 μΐ der zellfreien Kulturüberstände in die Vertiefungen einer 96-well- Mikro titerplatte gegeben. Die Messung der Fluoreszenzintensitäten erfolgte mit einem GENius Fluoreszenz- Plattenreader (Tecan Instruments; Salzburg, Österreich) bei einer Anregungswellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 535 nm.

In Figur 4 sind die einzelnen Fluoreszenzintensitäten dargestellt. Die Fluoreszenzintensitäten der Überstände von den Produktionsstämmen liegen durchweg signifikant höher als die des Kontroll- Stamms, deren Wert eine gewisse Eigenfluoreszenz des Hefemediums sowie der Mikro titerplatten widerspiegelt. Somit konnten die Proteine eindeutig im Kulturüberstand der Spalthefen nachgewiesen werden. Dieses Experiment zeigt, dass alle vier süßen Proteine (Brazzein, Monellin, Curculin und Thaumatin) erfolgreich von den Hefezellen exprimiert sowie effizient ins Kulturmedium sekretiert werden.

Die geschmacklichen Eigenschaften des hergestellten Thaumatins, Monellins und Curculins wurden in Verdünnungsreihen auf die Interaktion mit dem humanen TlR2-TlR3-Rezeptor in molekularbiologischen Rezeptorbindungsassays untersucht und im Vergleich mit Kontrollsubstanzen quantitativ als süß eingestuft (Current Protocols in Immunology, New York: Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons; 1992).

Beispiel 2

In einem weiteren Ausführungsbeispiel, welches bis auf die Kultur der Produktionsstämme zur Produktion der entsprechenden süßen Proteine dem vorstehenden Ausführungsbeispiel entspricht, wurden die jeweiligen Produktionsstämme unter induzierenden Bedingungen in 10 mL EMM bei 30°C etwa 24 h kultiviert. Anschließend wurden die Stämme in einer Hauptkultur von 100 mL EMM weiter für 24 h bei 30°C inkubiert, um das rekombinante Protein zu produzieren. Während dieser Inkubationsphase der Hauptkultur wurde innerhalb der ersten 2 bis 4 Stunden der als Produktionsphase bezeichneten Inkubationsphase der Hauptkultur die Inkubationstemperatur für 10 Minuten auf 38°C bzw. 42°C erhöht. Die Ausbeute der aufgereinigten süßen Proteine verbesserte sich hierdurch um 35% bzw. 40%.

Beispiel 3

In einem weiteren Ausführungsbeispiel, welches im Wesentlichen dem ersten Ausführungsbei- spiel entspricht, wurden die jeweiligen Produktionsstämme zusätzlich mit einem Vektor transformiert, welcher die Nukleinsäuresequenzen für den eukaryontischen Chaperonkomplex Hsp60/Hspl0 sowie einen induzierbaren Promotor enthält. Diese Produktionsstämme wurden unter induzierenden Bedingungen in 10 mL EMM bei 30°C etwa 24 h kultiviert. Anschließend wurden die Stämme in einer Hauptkultur von 100 mL EMM weiter für 24 h bei 30°C inku- biert, um das rekombinante Protein zu produzieren. Während dieser Inkubationsphase der

Hauptkultur wurde innerhalb der ersten 2 bis 4 Stunden der als Produktionsphase bezeichneten Inkubationsphase der Hauptkultur die Inkubationstemperatur für 10 Minuten auf 38°C bzw. 42°C erhöht.

Die Ausbeute der aufgereinigten süßen Proteine verbesserte sich hierdurch um 52% bzw. 78%.

Literaturverzeichnis

Choi S-H, et al, (2005) World J Gastroenterol 11(25): 3887-3892 Dittrich H, Kutchan TM (1991) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 88(22): 9969-9973

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Maundrell K, et al, (1985) Gene 39(2-3): 223-230 Okuyama M, et al, (2001) Eur J Biochem 268(8): 2270-2280.

Schlacher A, et al, (1996) Journal of Biotechnology 49(1-3): 211-218

Claims

Ansprüche

1. Verfahren zur Produktion von süßen Proteinen enthalten die folgenden Schritte:

a. Verwendung eines rekombinanten Schizosaccheromyceten Stammes, welcher eine Gensequenz, die für ein mit dem humanen TlR2-TlR3-Rezeptor interagierendes Polypeptid kodiert, exprimiert;

b. Kultivierung des rekombinanten Schizosaccheromyceten Stammes unter Kulturbedingungen, die Stress auslösen;

c. Aufreinigung der rekombinant exprimierten Proteine; und

d. Funktionstest auf ihre Interaktion mit dem humanen TlR2-TlR3-Rezeptor.

2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinante Schizosaccheromyceten Stamm Sc.pombe ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass die Gensequenz, die für ein mit dem humanen TlR2-TlR3-Rezeptor interagierendes Polypeptid kodiert, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenzen für die süßen Proteine Thaumatin, Monellin, Mabinlin, Pentadin, Brazzein, Curculin sowie deren Derivate oder Mischungen derselben, ferner umfassend die adaptierten Sequenzen SEQ ID No: 1 bis 4.

4. Verfahren nach Anspruch 3 dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinante Schizosaccheromyceten Stamm zumindest mit wenigstens einer Kopie eines Expressionsvektors transient oder stabil transformiert ist, welcher die kodierende Sequenz für ein mit dem humanen TlR2-TlR3-Rezeptor interagierendes Polypeptid sowie einen Promotor enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4 dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinante Schizosaccheromyceten Stamm zusätzlich mit wenigstens einer Kopie eines Expressionsvektors transient oder stabil transformiert ist, welcher die kodierende Sequenz für ein mit dem humanen TlR2-TlR3-Rezeptor interagierendes Polypeptid als Fusionsprotein mit einer Sekretionssequenz enthält.

Verfahren nach Anspruch 5 dadurch gekennzeichnet, dass die Sekretionsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der Präsequenz der sauren Phosphatase, der Xyla- nase, des Berberine bridge-Emzyms, des P-Faktors, des Hepatitis C Virus Hüllproteins, der Carboxypeptidase Y oder der Maltase.

Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6 dadurch gekennzeichnet, dass der rekombi- nante Schizos ccheromyceten Stamm zusätzlich mit wenigstens einer Kopie eines Expressionsvektors transient oder stabil transformiert ist, welcher die kodierende Sequenz für wenigstens ein eukaryontisches Hitzeschockprotein und/ oder Chaperon enthält, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der Chaperon Hsp90-Familie, Chaperon Hsp70- Familie, Chaperon HsplOO/Clp-Familie, Chaperon Hsp60-Familie, Chaperon HsplO- Familie und CCT-Familie.

Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierungsbedingungen der rekombinanten Stämme so gewählt werden, dass für die re- kombinanten Stämme ein Thermostress erzeugt wird.

Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass bei der Kultivierung der rekombinanten Stämme die im Laufe der 24-72 stündigen Produktionsphase, die üblicherweise bei 30°C abläuft, einmalig oder in Intervallen für wenigstens 2 min auf eine Temperatur von etwa 34°C - 42°C erhöht wird.

Rekombinanter Stamm der Sc. pombe dadurch gekennzeichnet, dass er mit wenigstens einer Kopie eines Expressionsvektors transient oder stabil transformiert ist, welcher a) wenigstens eine Gensequenz, die für ein mit dem humanen T1R2-T1R3- Rezeptor interagierendes Polypeptid kodiert, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenzen für die süßen Proteine Thaumatin, Monellin, Mabinlin, Pentadin, Brazzein, Curculin sowie deren Derivate oder Mischungen derselben, ferner umfassend die adaptierten Sequenzen SEQ ID No: 1 bis 4 enthält; und

b) wenigstens eine homo- und/ oder heterogene kodierende Sequenz für ein Hitzeschockprotein und/oder eukaryontisches Chaperon enthält.

1 1. Verwendung des rekombinanten Sc. pombe Stammes gemäß Anspruch 10 zur Herstellung von mit dem humanen TlR2-TlR3-Rezeptor interagierenden, süßen Polypeptiden.

12. Verwendung eines süßen Polypeptides, hergestellt nach einem der vorstehenden Ansprüche 1 bis 8 zum Süßen von Produkten, die zum tierischen oder menschlichen Verzehr bestimmt sind.