CN102296088A - 人抗凝血酶ⅲ基因在崂山奶山羊乳腺中表达的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种利用基因打靶技术，使人抗凝血酶III基因在崂山奶山羊乳腺中表达的方法。本法构建的基因打靶载体，通过同源重组将人源性抗凝血酶III基因定点整合入崂山奶山羊胎儿成纤维细胞株基因组上某一确定的位点，克服了随机整合的盲目性和危险性，并且基因打靶载体的表达量高于转基因的表达量(大约高2～10倍)；在人源性抗凝血III基因的后面加上牛生长激素基因的poly(A)信号，有助于基因打靶载体在第一代克隆崂山奶山羊的乳腺中表达人抗凝血酶III基因；本基因打靶载体中有两个相同方向的lox序列，便于将来工作中除去筛选基因，以最终使人抗凝血酶III基因在崂山奶山羊体内高效表达。

Description

人抗凝血酶Ⅲ基因在崂山奶山羊乳腺中表达的方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种利用基因打靶技术，使人抗凝血酶III基因在崂山奶山羊乳腺中表达的方法。

背景技术

随着转基因动物的问世，基因工程制药愈来愈受到人们的认可和关注，转基因技术不但可以加快畜种改良力度，提高畜产品产量和质量，而且可以生产珍贵药用蛋白，为人类造福。转基因动物最诱人的前景是作为生物反应器，利用它生产人类所需的生物活性产品或药物。而乳腺生物反应器是目前生产外源蛋白最有效的生物反应器，也是目前国际上惟一证明可以达到商业化生产水平的生物反应器(朱小甫，2007)。1987年，Gordon等将组织纤溶酶原激活剂(tPA)与小鼠乳清酸蛋白(WAP)基因的启动子构成重组基因，成功培育出能在乳汁中表达tPA的转基因小鼠，开启了利用动物乳腺生物反应器生产药用蛋白的时代(Gordon K，1987)。

外源基因在动物乳腺中高效表达的关键是整合到动物染色体组中的表达载体(调控序列和外源基因)要处于一个开放和活跃转录的状态。常用的乳腺生物反应器的表达载体分为普通质粒的表达载体、人工染色体的表达载体和基因打靶表达载体。其中，基于普通质粒的外源基因随机整合到宿主基因组中，往往产生位置效应，影响外源基因的高效表达；而人工染色体尚存在克隆片段不稳定、易发生缺失等难以避免的缺陷。基因打靶载体由基因打靶技术衍生而来，基因打靶技术(Gene targeting technology)是20世纪80年代后半期兴起的，按预期方式精细改造生物遗传信息的研究技术手段。是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因为目的的一项技术。它克服了随机整合的盲目性和危险性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法(孙振红，2010)。

PPL公司的McCrearh等在Nature上报道了COL1A1(原胶原)基因在胎儿成纤维细胞内进行基因打靶，在COL1A1基因内插入了IRES和无启动子的neo和α1-Antitrypsin(AAT)基因，生产出转基因克隆绵羊，羊乳中AAT蛋白含量高达650mg/L，这是第一例通过核移植生产的体细胞基因打靶克隆绵羊(McCreath，2000)。2006年Lai等(Lai，2006)制备出能够合成多不饱和脂肪酸的猪。2008年Baldassarre等(Baldassarre，2008)报道，重组人丁酰胆碱酯酶(rBChE)在哺乳期山羊乳中的表达量可达到1～5g/L，这充分些证实了利用基因打靶技术制备动物乳腺生物反应器广阔的产业化前景。

理论上，各种重组蛋白都可以通过乳腺生物反应器途径获得，其中包括一些相当复杂的蛋白分子，但可能由于转基因动物研究理论不足，转基因技术支撑体系不够完善，致使目前转基因动物成功率和成活率极低，这是限制转基因动物发展的主要因素。世界范围内，目前利用乳腺生物反应器可进行商业生产的药用蛋白仅有十余种，仍有大量的转基因药用蛋白处在研究阶段(刘静，2009)。

人抗凝血酶III是存在于血浆中的一类重要的抗凝血因子，是抗凝血酶活性的主要承担者，在临床上，可预防和治疗急、慢性血栓、血塞形成，对治疗抗凝血酶缺失症有显著疗效。目前市场上有从人体血浆中直接提取的人抗凝血酶III的蛋白注射针剂，也有用细胞和酵母作为表达载体，在体外合成的重组人抗凝血酶III蛋白，但成本高，表达量低，生产费用昂贵。2006年6月，美国GTC公司研制成功世界上第一个利用转基因乳腺生物反应器生产的基因工程蛋白药物——重组人抗凝血酶III(商品名为Atryn，治疗先天性抗凝血酶缺乏症)，其上市许可申请获得了欧洲医药评价署人用医药产品委员会肯定的批准意见，充分证明利用哺乳动物乳腺生物反应器生产重组人抗凝血酶III具有理想的市场价值(王庆忠，2005)，但是GTC公司采用原核注射法获得转基因动物乳腺生物反应器，投入高、效率低；2008年，青岛森淼实业有限公司成功构建了分泌人抗凝血酶III的转基因山羊(邹贤刚等，2008)，并申请了专利(CN1840187A)，但鲜见利用基因打靶技术来获得携带抗凝血酶III基因的奶山羊乳腺生物反应器。

乳腺生物反应器的研究始于模型动物小鼠，许多学者将研究集中在转基因鼠、兔、猪等动物上，但是从生物维持成本和产奶量的角度来看，用以食草为主的乳用型家畜进行转基因乳腺生物反应器研究比较理想，且具备产奶量高，药用蛋白活性高且易提纯、开发周期短、生产成本低等优点(吴应积，2009)。山羊的研究周期短、饲养管理费用低，是乳腺生物反应器的主要研究对象之一，我国已开展了一些山羊乳腺生物反应器方面的研究工作(Zhang et al，2004；Shen et al，2007)，并获得了含有人组织纤溶酶原激活剂基因的基因打靶山羊细胞株(Shen et al，2007)。崂山奶山羊(Capra hircus L.)是我国的高产奶羊之一，产奶量高、产奶期长，相当于1/3头奶牛的产奶量，本研究利用基因打靶技术，获得了表达人抗凝血酶III基因的崂山奶山羊，为进一步从羊奶中获得人抗凝血酶III蛋白向前迈进重要一步。

发明内容

本研究的发明目的，是针对上述现有技术存在的缺陷和不足，构建含有lox序列的基因打靶载体，提供一种利用基因打靶技术和核移植技术，使人抗凝血酶III基因在崂山奶山羊乳腺中表达的方法。

为实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案：

研究一种使人抗凝血酶III基因在崂山奶山羊乳腺中表达的方法，该方法包括以下步骤，功能基因的获得，基因打靶载体的构建和标记基因的连接，转化受体细胞经筛选获得阳性细胞株，阳性细胞株DNA制备，阳性细胞株经核移植，获得含有人抗凝血酶III基因的克隆崂山奶山羊，崂山奶山羊中抗凝血酶III基因的PCR和Southern blot鉴定。

其特征是：

(1)功能基因的获得

从人肝脏组织中获得人抗凝血酶III基因的mRNA，逆转录成cDNA；通过PCR方法建立两端的连接酶切位点；PCR产物连接在pUC19质粒上，再进行DNA序列分析；

(2)基因打靶载体的构建和目的基因的连接

以崂山奶山羊β-酪蛋白基因为表达框架，分别将人抗凝血酶III基因(具体DNA序列见序列表<400>4)，lox序列(具体DNA序列见序列表<400>5)，poly(A)信号(具体DNA序列见序列表<400>7)，新霉素抗性筛选基因(具体DNA序列见序列表<400>9)和lox序列(具体结构见序列表<400>10)依次构建到β-酪蛋白基因为表达框架中(具体DNA序列见序列表<400>1和<400>12)；

(3)转化受体细胞经筛选获得阳性细胞株

转化受体细胞后，经筛选获得基因打靶阳性细胞株；

(4)阳性细胞株DNA制备

培养的细胞转入含有蛋白酶K的DNA裂解液中，用Pst I酶消化，在0.8％的凝胶上进行电泳，然后将DNA转入纤维膜中，分别用P³²标记探针杂交；

(5)阳性细胞株核移植

经供核细胞的培养，核移植，和胚胎移植，获得含有人抗凝血酶III基因的克隆崂山奶山羊。

(6)判断所述转基因羊的方法

提取提取转基因奶山羊所生羊羔的总DNA，用PCR和Southern检测是否为阳性。

上述的方法，其特征是所述功能基因的获得的方法是，根据人抗凝血酶III的DNA序列，设计PCR引物，并在引物前加入一个唯一的Xho I酶切位点(具体DNA序列见<400>4)，进行PCR反应，PCR产物克隆到pUC19载体上，进行序列分析，再将DNA序列分析正确的ATIII的DNA片段，加上一个lox序列，Poly(A)序列，新霉素基因和lox序列，使两个lox序列的方向相同。

上述的方法，其特征是所述基因打靶载体的构建和标记基因连接的方法是，用绵羊的β-酪蛋白基因片断为探针，从崂山奶山羊基因组文库中分离出一段完整的β-酪蛋白基因，并用PCR方法去除β-酪蛋白基因的部分第二外显子与第七外显子及其之间的DNA序列，建立一个Not I位点，然后将抗凝血酶III和含有两个同一方向的lox序列的Poly(A)信号和新霉素基因(neo)，连接在崂山奶山羊β-酪蛋白基因的表达框架上。

上述的方法，其特征是所述转化受体细胞经筛选获得阳性细胞株的方法是，从40d胎龄的崂山奶山羊胎儿中分离出胎儿成纤维细胞，分离的细胞培养在DMEM-F12的培养基中，并在培养基中添加10％胎牛血清和抗菌素，用脂质体介导的方法，将基因打靶载体转入山羊胎儿成纤维细胞中，然后在含有G418 600μg/mL的培养基中筛选培养18d；细胞株再进行扩繁，一部分细胞株冷冻保存，一部分用于制备DNA。

上述的方法，其特征是所述阳性细胞株DNA制备的方法是，将培养的细胞转入含有蛋白酶K的DNA裂解液中，在55℃水浴锅中过夜，然后加入两倍量的纯酒精，混匀，离心；

用70％酒精洗DNA一次，自然干燥，然后加入适量的Tris-EDTA溶液，待DNA全部溶解后，放入-20℃冰箱中；

用Pst I酶消化过夜，在0.8％的凝胶上进行电泳，然后将DNA转入纤维膜中，分别用P³²标记探针杂交。

上述的方法，其特征是所述阳性细胞的细胞核移植的方法是，

供核细胞的培养：作为供核细胞的基因打靶细胞株从液氮中复苏后，在DMEM-F12培养基体外培养3d，然后在含有0.5％胎牛血清的培养基中饥饿2d，备用；

核移植：经同期发情和超排处理，获得体内成熟的卵母细胞和继母羊，用体内成熟的313个卵母细胞制备去核细胞，取饥饿3d的阳性细胞，将其移入去核卵母细胞的卵周隙中，用电刺激的方法将阳性细胞与去核卵母细胞融合，体外培养4h后，用离子霉素激活5min，再在含有6-二甲基苯胺嘌呤的培养基中培养5h，将克隆胚胎移入DMEM-F12培养基中培养1d。

胚胎移植：克隆胚胎在培养基中培养1d后，将胚胎移植到继母羊输卵管内，正常怀孕，产羔；Southern blot和PCR分析表明，如结果为阳性，则证克隆羊羔含有抗凝血酶III基因，获得的是含有人抗凝血酶III基因的克隆崂山奶山羊。

上述的人抗凝血酶III基因在崂山奶山羊乳腺中表达的方法，其特征在于所述抗凝血酶III基因是否在转基因奶山羊体内的鉴定判断的方法是，提取所述转基因奶山羊羊羔耳部组织的总DNA，用PCR和Southern检测是否为阳性；如结果为阳性，则证明克隆羊羔含有抗凝血酶III基因，获得的是含有人抗凝血酶III基因的克隆崂山奶山羊。

本发明的优点：

本方法选择崂山奶山羊β-酪蛋白基因为表达框架，构建基因打靶载体，通过同源重组将人源性抗凝血酶III基因定点整合入崂山奶山羊胎儿成纤维细胞株基因组上某一确定的位点，克服了随机整合的盲目性和危险性，并且基因打靶载体的表达量高于转基因的表达量(大约高2～10倍)；与森淼实业有限公司之前申请的专利(一种利用基因打靶技术制备哺乳动物乳腺生物反应器的方法，CN1730659A；利用乳腺生物反应器制备重组人的抗凝血酶III蛋白的方法，CN1944645A)相比，本专利公开了一种通过基因打靶技术使人抗凝血酶III基因在崂山奶山羊乳腺细胞内表达的方法，并且所采用的基因打靶载体携带有人完整的抗凝血酶III基因表达序列，在人源性抗凝血III基因的后面加上牛生长激素基因的poly(A)信号，有助于基因打靶载体在第一代克隆崂山奶山羊的乳腺中表达人抗凝血酶III基因；本专利基因打靶载体中有两个相同方向的lox序列，便于将来工作中除去筛选基因，以最终获得高效表达人抗凝血酶III基因的崂山奶山羊乳腺生物反应器。

附图说明

图1：本发明崂山奶山羊β-酪蛋白基因结构和基因打靶技术路线示意图；

图2：实施例1中基因打靶细胞株及实施例2中克隆羊的PCR分析；

图3：实施例1中基因打靶细胞株及实施例2中克隆羊的Southern分析；

图4：实施例3中基因打靶克隆公羊和后代的PCR分析；

图5：实施例3中基因打靶克隆公羊和后代的Southern分析。

图1中，1，2，3，4，5，6，7，8，9是奶山羊β-酪蛋白基因的外显子；Kpn I，Pst I，Not I是基因克隆和Southern杂交中用主要酶切位点；PA是Poly A终止信号；ATIII是抗凝血酶III基因；Lox是一段34bp DNA序列；Neo是新霉素基因；

引物A或B是用于长片段PCR反应(产物5.7KB)的引物；

引物C或D是用于短片段PCR反应(产物0.85kb)的引物；

Southern杂交探针：用Pst I和Kpn I之间的DNA序列。

图2中，1是实施例2中基因打靶克隆羊PCR条带；2、4是实施例1中基因打靶的胎儿成纤维细胞株PCR条带；3是对照组羊DNA条带；W是空白对照；MW是分子量标记。DNA用Pst I酶切，Pst I和Kpn I之间的DNA为探针。

PCR条件：94℃ 2min；94℃ 25s；65℃ 15s；72℃ 8min，共31循环；最后在68℃下10min。

图3中，1是实施例2中基因打靶克隆羊的Southern条带，2是实施例1中基因打靶胎儿成纤维细胞株的Southern分析条带；3是对照组羊DNA的Southern分析条带。

图4中，其中，a，b，c，d，e，f，g，h，i，j，k，l，m，n，o，p，q，r，s是基因打靶克隆羊的后代的DNA样品，t是基因打靶克隆公羊本身的DNA样品；MW是DNA分子量；5.0kb片段是山羊的基因组片段，6.0kb是基因靶片段。

图5中，a，e，f，g，h，j，m，o，q，r，t是PCR检测阳性的奶山羊基因Southern分析；5.0kb片段是山羊的基因组片段，6.0kb是基因打靶片段。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步阐述。

实施例1：人抗凝血酶III基因转入崂山奶山羊体内的方法

1材料及试剂：

本试验所用化学试剂购自Sigma-Aldrich公司；

所用内切酶、载体、分子量标记等分子生物学方面的试剂购自Invitrogen公司；

培养基购自Gibco公司。

2具体步骤

(1)功能基因的获得

从人肝脏组织中获得抗凝血酶III(ATIII)基因的mRNA，逆转录成cDNA；然后通过PCR方法建立两端的连接酶切位点。PCR产物连接在pUC19质粒上，再进行DNA序列分析；克隆的ATIII基因的DNA序列与已公开的DNA序列相同。

具体方法：抗凝血酶III基因的制备是根据已公开的ATIII的DNA顺序(Gene Bank，D29832)，设计PCR引物(并在引物前加入一个唯一的Xho I酶酶切位点)进行PCR反应，PCR产物克隆到pUC19载体上，进行序列分析，再将DNA序列分析正确的ATIII的DNA片段，加上一个lox序列，Poly(A)序列，新霉素基因(neo)和lox序列，使两个lox序列的方向相同，最后连接到崂山奶山羊β-酪蛋白DNA载体的表达框架上。

(2)基因打靶载体的构建

用绵羊的β-酪蛋白基因片断为探针，从崂山奶山羊基因组文库中分离出一段完整的β-酪蛋白基因，并用PCR方法去除β-酪蛋白基因的第二外显子与第七外显子及其之间的部分DNA序列，建立一个Not I位点，然后将抗凝血酶III和含有两个同一方向的lox序列的Poly(A)信号和新霉素基因，连接在β-酪蛋白基因的表达框架上。

(3)转化受体细胞

从40d胎龄的崂山奶山羊胎儿中分离出胎儿成纤维细胞，分离的细胞培养在DMEM-F12(1∶1)培养基中，并在培养基中添加10％胎牛血清(FCS)和抗菌素，用脂质体介导的方法将基因打靶载体转入山羊胎儿成纤维细胞中，然后在含有G418(600μg/mL)的培养基中筛选培养18d；本实施例共获得6个阳性细胞，建立6个原始细胞系，从中筛选了4个细胞系用于细胞转染；对阳性细胞株进行扩繁，一部分细胞株冷冻保存，一部分用于制备DNA。

(4)受体细胞株DNA制备，Southern分析

将培养的细胞转入DNA裂解液(含有蛋白酶K)中，在55℃水浴锅中过夜，然后加入两倍的纯酒精，混匀，离心；用70％酒精洗DNA一次，自然干燥，然后加入适量的Tris-EDTA溶液，待DNA全部溶解后，放入-20℃冰箱中。用Pst I酶消化过夜，在0.8％的凝胶上进行电泳，然后将DNA转入纤维膜中，用P³²标记探针进行杂交。获得DNA的Southern图片(细胞株的基因打靶分析)，相关结果见表一，共分离6个崂山奶山羊的胎儿细胞，建立6个原始细胞系。从中筛选了4个细胞系用于细胞转染。

表一细胞的生长与转基因和基因打靶效率

(5)阳性细胞的细胞核移植

供核细胞的培养：供核细胞(基因打靶细胞株)从液氮中复苏后，在DMEM-F12培养基体外培养3d，然后在含有0.5％胎牛血清(FCS)的培养基中饥饿3d，备用。

核移植：经同期发情和超排处理，获得体内成熟的卵母细胞和继母羊，首批试验用体内成熟的313个卵母细胞制备去核细胞，取饥饿3d的阳性细胞，将其移入去核卵母细胞的卵周隙中，用电刺激的方法将阳性细胞与去核卵母细胞融合，体外培养4h后，用离子霉素(Ionomycin)激活5min，再在含有6-二甲基苯胺嘌呤(6-DMAP)的培养基中培养5h，融合率为56％，获得174枚克隆胚胎，将克隆胚胎移入DMEM-F12培养基中培养1d。第二批试验用体内成熟的161个卵母细胞制备去核细胞，取饥饿3d的阳性细胞，将其移入去核卵母细胞的卵周隙中，用电刺激的方法将阳性细胞与去核卵母细胞融合，体外培养4h后，用离子霉素(Ionomycin)激活5min，再在含有6-二甲基苯胺嘌呤(6-DMAP)的培养基中培养5h，融合率为60％，获得97枚克隆胚胎，将克隆胚胎移入DMEM-F12培养基中培养1d。

胚胎移植：克隆胚胎在培养基中培养1d后，首批试验将86枚胚胎移植到22只继母羊输卵管内，1头继母羊怀孕，产出1头克隆羊羔并成活；第二批试验将97枚胚胎移植到8头继母羊输卵管内，5头继母羊怀孕，产出3头克隆羊羔并全部成活。两批试验共成活四头克隆羊羔。

表二细胞核移植统计表

(6)自所得到的羔羊中筛选出转基因阳性个体，供继续进行下步鉴定试验。

实施例2：转基因个体的鉴定

1.PCR检测

自所生羔羊的耳部采集组织块，-80℃冰箱保存，提取基因组DNA后进行PCR扩增，扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳进行分析，检测结果如图2所示。

2.Southern杂交检测

取新鲜奶山羊耳部组织块，剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5mL离心管中，加入蛋白酶K，混匀。转入37℃水浴中过夜，间歇振荡离心管数次。以12000rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100μL吸头挑出，晾干，用200μL TE重新溶解；加等量的苯酚酚-氯仿-异戊醇混合液(体积比：25∶24∶1)振荡混匀，离心12000rpm，5min；取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿-异戊醇(体积比：24∶1)，振荡混匀，离心12000rpm，5min；取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L乙酸氨，加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min，离心12000rpm，10min；轻轻倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉；用70％乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000rpm，5min；轻轻倒掉上清液，自然干燥，然后加入适量的Tris-EDTA溶液，待DNA全部溶解后，放入-20℃冰箱中。用Pst I酶消化过夜，在0.8％的凝胶上进行电泳，然后将DNA转入纤维膜中，用P³²标记探针进行杂交。获得DNA的Southern图片，结果如图3所示。

实施例3：基因打靶克隆崂山奶山羊的扩繁及后代个体鉴定

首批试验选择1头生长发育正常的含有抗凝血酶III基因的基因打靶雄性克隆崂山奶山羊，分别与6头雌性崂山奶山羊进行交配，获得19头奶山羊后代，全部成活，选择基因打靶克隆公羊及其19头奶山羊后代的DNA样品进PCR分析，但只有PCR阳性的羊的DNA用于Southern杂交分析，结果如图4所示。

参考文献

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岛森淼实业有限公司人抗凝血酶Ⅲ基因在崂山奶山羊乳腺中表达的方法

                                   序列表

<110>  青岛森淼实业有限公司

<120>  人抗凝血酶Ⅲ基因在崂山奶山羊乳腺中表达的方法

<130> 

<140> 

<141> 

<150>  CN201010274695.4

<151>  2010-09-07

<160>  13

<170>  Patent version 3.3

 

<210>  1

<211>  3866

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<221>  misc_feature

<222>  (1).. . (3866)

<223>  奶山羊β－酪蛋白的启动区和第1 外显子和内含子部分，基因打靶载体的5’同源臂

 

<400>  1

1     GGTACCTGAT GTCATCTTAA ATTGCTGGCT TTTTGATTTT CCATTGGACA 50

   AGCTTCTTTC TTTAGTATAT TGTTAAGGAT TTCCTTGATC AAGATTTTAC 100

   CTACTTTTCT GGTCCAATTG GTGAGAGACA GTCATAAGGA AATGCTGTGT 150

   TTATTGCACA ATATGTAAAG CATCTTCCTG AGAAAATAAA AGGGAAATGT 200

5  TGAATGGGAA GGATATGCTT TCTTTTGTAT TCCTTTTCTG AGAAATCAGA 250

   CTTTTTCACC TGTGGCCTTG GCCACCAAAA GCTAACAAAT AAAGGCATAT 300

   GAAGTAGCCA AGGCCTTTTC TAGTTATATC TATGACACTG AGTTCATTTC 350

   ATCATTTATT TTCCTGACTT CCTCCTGGGT CCATATGAGC AGTCTTAGAA 400

   TGAATATTAG CTGAATAATC CAAATACATA GTAGATGTTG ATTTGGGTTT 450

10 TCTAAGCAAT CCAAGACTTG TATGACAGTA AGATGTATTA CCATCCAACA 500

   CACATCTCAG CATGATATAA ATGCAAGGTA TATTGTGAAG AAAAATTTTT 550

   AATTATGTCA AAGTGCTTAC TTTAGAAGGT CATCTATCTG TCCCAAAGCT 600

   GTGAATATAT ATATTGAAGG TAATGAATAG ATGAAGCTAA CCTTGTAAAA 650

   ATGAGTAGTG TGAAATACAA CTACAATTAT GAACATCTGT CACTAAAGAG 700

15 GCAAAGAAAC TTGAAGATTG CTTTTGCAAA TGGGCTCCTA TTAATAAAAA 750

   GTACTTTTGA GGTCTGGCTC AGACTCTATT GTAGTACTTA GGGTAAGACC 800

   CTCCTCCTGT ATGGGCTTTC ATTTTCTTTC TTGCTTCCCT CATTTGCCCT 850

   TCCATGAATA CTAGCTGATA AACATTGACT ATAAAAGATA TGAGGCCAAA 900

   CTTGAGCTGT CCCATTTTAA TAAATCTGTA TAAATAATAT TTGTTCTACA 950

20 AAAGTATTAT CTAAATAAAT GTTACTTTCT GTCTTAAAAT CCCTCAACAA 1000

   ATCCCCACTA TCTAGAGAAT AAGATTGACA TTCCCTGGAA TCACAGCATG 1050

   CTTTGTCTGC CATTATCTGA CCCCTTTCTC TTTCTCTCTT CTCACCTCCA 1100

   TCTACTCCTT TTTCCTTGCA ATTCATGACC CAGATTCACT GTTTGATTTG 1150

   GCTTGCATGT GTGTGTGCTG AGTTGCGTCT GACTGTTATC AACCCCATGA 1200

25 ATGATAGTCC ACCAGGCTCT ACTGTCCATG AAATTTTCCA GTCAAGAATA 1250

   CTGGAGTGGA TTGCATTTCC TACTCCATTT GATTAATTTA GTGACTTTTA 1300

   AATTTCTTTT TCCATATTCG GGAGCCTATT CTTCCTTTTT AGTCTATACT 1350

   CTCTTCACTC TTCAGGTCTA AGGTATCATC GTGTGCTTGT TAGCTTGTTA 1400

   CTTTCTCCAT TATAGCTTAA GCACTAACAA CTGTTCAGGT TGGCATGAAA 1450

30 TTGTGTTCTT TGTGTGGCCT GTATATTTCT GTTGTGTATT AGAATTTACC 1500

   CCAAGATCTC AAAGACCCAC TGAATACTAA AGAGACCTCA TTGTGGTTAC 1550

   AATAATTTGG GGACTGGGCC AAAACTTCCG TGCATCCCAG CCAAGATCTG 1600

   TAGCTACTGG ACAATTTCAT TTCCTTTATC AGATTGTGAG TTATTCCTGT 1650

   TGAAATGCTC CCCAGAATTT CTGGGGACAG AAAAATAGGA AGAATTCATT 1700

35 TCCTAATCAT GCAGATTTCT AGGAATTCAA ATCCACTATT GGTTTTATTT 1750

   CAAACCACAA AATTAGCATG CCATTAAATA CTATATATAA ACAGCCACTA 1800

   AATCAGATCA TTATCCATTC AGCTTCTCCT TCACTTCTTC TCCTCTACTT 1850

   TGGAAAAAAG GTAAGAATCT CAGATATAAT TTCAGTGTAT CTGCTACTCA 1900

   TCTTTATTTT GGACTAGGTT AAAATGTAGA AAGAACATAA TTGCTTAAAA 1950

40 TAGATCTTAA AAATAAGGGT GTTTAAGATA AGGTTTACAC TATTTTCAGC 2000

   AGATATGTTA AAAAATAGAA GTGACTATAA AGACTTGATA AAAATTATAG 2050

   TGACTGCAAA TGTTTTAGGA ATATAATAAG ATATAATAAC AGTGGTTGCT 2100

   ATTTTCTTTA GCACAAGACT AGTCAACAGG CTGTATTAAA AGATCTTTTC 2150

   TTGAATTAAA TATTTTCAAT TTGATTAAAC CTACCTCAGC CATAAAGGCA 2200

45 AGCACATTTC ATTTATACTA TGGGGATTTG AATAATTATT ACTGAAGAAG 2250

   CTCTACCAAC AAAAAGTTTA TAGAGCTATC ATATTTAGTC AAGAGATAAA 2300

   GAGGGTTGTT AGGATATATA TGCTATTTGA AAGGTATTTA TAAAAGAAGA 2350

   GTATATTTAT CAAAATTTCT CAGAACATCC AAATTTCAAG TTTATCATTT 2400

   ATCTTACAAT ATTTCAAAAA TATTAAAATA GATACATGAA ATACAGAAGT 2450

50 AAATTAAAGA GAAAGTATTT TACTTGGTAA AAAAATTCTA GGTTGGACAG 2500

   AGAGTGCCAG GAAACAAAAA CAATGAAAAA TGTGACCTGA CTGGAATTAT 2550

   AGCTCAAAGT ATAGTAGTAA GTAATGAAAT GGCTTAAAAA TTGGTATATA 2600

   AAATGCTAGT TATAAAATAA ACAAAATGCA ATAATATCCT CCCTACATGT 2650

   AATGAATTCT AGGTATTATG CTCTTTTTTG AAGTCTTGAC AATAAAAATT 2700

55 TTTTTAGAAG TTTATAGGCA TCTTGAATAA AGTGAAACAA ATTAAGAATT 2750

   AGTATCCATG AGAAAAATAT AGAACAATTT TCCTAATTTA GTTTGAAAAT 2800

   CTGGGATTGA AGATGTGTGT CAAGAGATGT TGGTGGCAAG AACATTTTTT 2850

   TTTCAAGAAC TTATAAAAAT GCAACAAAAC AAACCATTTA ATACATTTTG 2900

   GTCAAAATCA ATAATGTATT TTATTTTATG CTCCAAGGAG CATAAAATTG 2950

60 GGGACTGGGC AAGAGAAACT GACACCCTGG TAAATTACCA AGAGATAAGT 3000

   ACACAGTTCT ATGTAGAGAA AATAAGCATA GTGTATGATC TCTAAAATTA 3050

   TGTGAGACAA AGGAGAGATG ACATTAGGCA TGTGGGGATG AAGACTGAGT 3100

   AGAGAAGAAA CAATCTAATC AGTCCAAGAA AACATCTCGA TCAGTGGAAC 3150

   AAATAGAAGA AATGCTAAAA TGAAACAGAA GTCTTACTGG AAATAAAAGA 3200

65 TATGCATAAG ACAAAAATTC ATGAAAATCA CTTAGTTTAG CAGAGAAAAG 3250

   ATAAAAATAA AGTATGACCT TCTTCATATA CATTGTTTGA TCATATGCAC 3300

   CTCAATAAAA CTGAGTCTCC AACAGAAATG AAACATTAAT ATTTTGTTCA 3350

   CTGCTCTAAT CCCAGAATCT AAGCGATATC TGGCAATAAA AATAATAAAT 3400

   ATATATTTTT TAATAAATGA ATCAACCACT TAATTTTTCT GTAAATATCT 3450

70 GTAACTTCTC TTCTGTCTTT CCAAAAACAC TCATAAGTAC TGTGAATGAG 3500

   ATGAAAAAGA GTGAAGTAGG ATATAGGCTG TTAGCAGAAA ACATCTGAAT 3550

   GGCTGGCAGT GAAACATTAA CTTGAAATGT AAGATTAATG AGTAATAGTA 3600

   AATTTTAACC TTGGCCATAT GATAAAATGT TCATTAATAT TTTTCTAGAA 3650

   TACAGGGCTT TTTGTTTTTG CCATGAGGTT TGCAGGATCT TGGTTCCCTG 3700

75 ACCAGGGATC AAACCTGCAC TCCCCTGGAA GCATGGAGTC TTGGACATCT 3750

   GTATTATACA CTATCTTTGG TTCCTTTTAA AGGGAAGTAA TTTTACTTAA 3800

   ATAAGAAAAT AGATTGACAA GTAATACGCT GTTTCCTCAT CTTCCCATTC 3850

   ACAGGAATCG AGAGCC                                      3866

 

<210>  2

<211>  9

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<221>  misc_feature

<222>  (1)..(9)

<223>  NotⅠ位点

 

<400>  2

1  GCGGCCGCC                                               9

 

<210>  3

<211>  6

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<221>  misc_feature

<222>  (1)..(6)

<223>  XhoⅠ位点

 

<400>  3

1  CTCGAG                                                  6

 

<210>  4

<211>  1398

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<221>  misc_feature

<222>  (1)..(1398)

<223>  人源抗凝血酶III基因

 

<400>  4

1  ATGATTTATT CCAATGTGAT AGGAACTGTA ACCTCTGGAA AAAGGAAGGT 50 

   TTATCTTTTG TCCTTGCTGC TCATTGGCTT CTGGGACTGC GTGACCTGTC 100

   ACGGGAGCCC TGTGGACATC TGCACAGCCA AGCCGCGGGA CATTCCCATG 150

   AATCCCATGT GCATTTACCG CTCCCCGGAG AAGAAGGCAA CTGAGGATGA 200

5  GGGCTCAGAA CAGAAGATCC CGGAGGCCAC CAACCGGCGT GTCTGGGAAC 250

   TGTCCAAGGC CAATTCCCGC TTTGCTACCA CTTTCTATCA GCACCTGGCA 300

   GATTCCAAGA ATGACAATGA TAACATTTTC CTGTCACCCC TGAGTATCTC 350

   CACGGCTTTT GCTATGACCA AGCTTGGTGC CTGTAATGAC ACCCTCCAGC 400

   AACTGATGGA GGTATTTAAG TTTGACACCA TATCTGAGAA AACATCTGAT 450

10 CAGATCCACT TCTTCTTTGC CAAACTGAAC TGCCGACTCT ATCGAAAAGC 500

   CAACAAATCC TCCAAGTTAG TATCAGCCAA TCGCCTTTTT GGAGACAAAT 550

   CCCTTACCTT CAATGAGACC TACCAGGACA TCAGTGAGTT GGTATATGGA 600

   GCCAAGCTCC AGCCCCTGGA CTTCAAGGAA AATGCAGAGC AATCCAGAGC 650

   GGCCATCAAC AAATGGGTGT CCAATAAGAC CGAAGGCCGA ATCACCGATG 700

15 TCATTCCCTC GGAAGCCATC AATGAGCTCA CTGTTCTGGT GCTGGTTAAC 750

   ACCATTTACT TCAAGGGCCT GTGGAAGTCA AAGTTCAGCC CTGAGAACAC 800

   AAGGAAGGAA CTGTTCTACA AGGCTGATGG AGAGTCGTGT TCAGCATCTA 850

   TGATGTACCA GGAAGGCAAG TTCCGTTATC GGCGCGTGGC TGAAGGCACC 900

   CAGGTGCTTG AGTTGCCCTT CAAAGGTGAT GACATCACCA TGGTCCTCAT 950

20 CTTGCCCAAG CCTGAGAAGA GCCTGGCCAA GGTAGAGAAG GAACTCACCC 1000

   CAGAGGTGCT GCAAGAGTGG CTGGATGAAT TGGAGGAGAT GATGCTGGTG 1050

   GTCCACATGC CCCGCTTCCG CATTGAGGAC GGCTTCAGTT TGAAGGAGCA 1100

   GCTGCAAGAC ATGGGCCTTG TCGATCTGTT CAGCCCTGAA AAGTCCAAAC 1150

   TCCCAGGTAT TGTTGCAGAA GGCCGAGATG ACCTCTATGT CTCAGATGCA 1200

25 TTCCATAAGG CATTTCTTGA GGTAAATGAA GAAGGCAGTG AAGCAGCTGC 1250

   AAGTACCGCT GTTGTGATTG CTGGCCGTTC GCTAAACCCC AACAGGGTGA 1300

   CTTTCAAGGC CAACAGGCCT TTCCTGGTTT TTATAAGAGA AGTTCCTCTG 1350

   AACACTATTA TCTTCATGGG CAGAGTAGCC AACCCTTGTG TTAAGTAA   1398

<210>  5

<211>  34

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<221>  misc_feature

<222>  (1)..(34)

<223>  loxp序列

 

<400>  5

1  ATAACTTCGT ATAGCATACA TTATACGAAG TTAT                  34

 

<210>  6

<211>  6

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<221>  misc_feature

<222>  (1)..(6)

<223>  TaqⅠ位点

 

<400>  6

1  CTCGAC                                                   6

 

<210>  7

<211>  420

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<221>  misc_feature

<222>  (1)..(420)

<223>  牛生长激素基因的Poly(A)信号序列

 

<400>  7

1  ATTAATACGA CTCACTATAG GGAATTCCAG GGGGGTGGTG GATATCCTGG 50

   TACCGCGGCC GCTCGAGCAT GCATCTAGAG GGCCCTATTC TATAGTGTCA 100

   CCTAAATGCT AGAGCTCGCT GATCAGCCTC GACTGTGCCT TCTAGTTGCC 150

   AGCCATCTGT TGTTTGCCCC TCCCCCGTGC CTTCCTTGAC CCTGGAAGGT 200

5  GCCACTCCCA CTGTCCTTTC CTAATAAAAT GAGGAAATTG CATAAGCTTG 250

   GCACTGGCCG TCGTTTTACA ACGTCGTGAC TGGGAAAACC CTGGCGTTAC 300

   CCAACTTAAT CGCCTTGCAG CACATCCCCC TTTCGCCAGC TGGCGTAATA 350

   GCGAAGAGGC CCGCACCGAT CGCCCTTCCC AACAGTTGCG CAGCCTGAAT 400

   GGCGAATGGA AATTGTAAGC                                  420

 

<210>  8

<211>  6

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<221>  misc_feature

<222>  (1)..(6)

<223>  XhoⅠ位点

 

<400>  8

1  CTCGAG                                                 6

 

<210>  9

<211>  1104

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<221>  misc_feature

<222>  (1)..(1104)

<223>  Neo基因序列

 

<400>  9

1  ATCCGAACAA ACGACCCAAC ACCCGTGCGT TTTATTCTGT CTTTTTATTG 50

   CCGATCCCCT CAGAAGAACT CGTCAAGAAG GCGATAGAAG GCGATGCGCT 100

   GCGAATCGGG AGCGGCGATA CCGTAAAGCA CGAGGAAGCG GTCAGCCCAT 150

   TCGCCGCCAA GCTCTTCAGC AATATCACGG GTAGCCAACG CTATGTCCTG 200

5  ATAGCGGTCC GCCACACCCA GCCGGCCACA GTCGATGAAT CCAGAAAAGC 250

   GGCCATTTTC CACCATGATA TTCGGCAAGC AGGCATCGCC ATGGGTCACG 300

   ACGAGATCCT CGCCGTCGGG CATGCGCGCC TTGAGCCTGG CGAACAGTTC 350

   GGCTGGCGCG AGCCCCTGAT GCTCTTCGTC CAGATCATCC TGATCGACAA 400

   GACCGGCTTC CATCCGAGTA CGTGCTCGCT CGATGCGATG TTTCGCTTGG 450

10 TGGTCGAATG GGCAGGTAGC CGGATCAAGC GTATGCAGCC GCCGCATTGC 500

   ATCAGCCATG ATGGATACTT TCTCGGCAGG AGCAAGGTGA GATGACAGGA 550

   GATCCTGCCC CGGCACTTCG CCCAATAGCA GCCAGTCCCT TCCCGCTTCA 600

   GTGACAACGT CGAGCACAGC TGCGCAAGGA ACGCCCGTCG TGGCCAGCCA 650

   CGATAGCCGC GCTGCCTCGT CCTGCAGTTC ATTCAGGGCA CCGGACAGGT 700

15 CGGTCTTGAC AAAAAGAACC GGGCGCCCCT GCGCTGACAG CCGGAACACG 750

   GCGGCATCAG AGCAGCCGAT TGTCTGTTGT GCCCAGTCAT AGCCGAATAG 800

   CCTCTCCACC CAAGCGGCCG GAGAACCTGC GTGCAATCCA TCTTGTTCAA 850

   TGGCCGATCC CATATTGGCT GCAGGGTCGC TCGGTGTTCG AGGCCACACG 900

   CGTCACCTTA ATATGCGAAG TGGACCTGGG ACCGCGCCGC CCCGACTGCA 950

20 TCTGCGTGTT CGAATTCGCC AATGAAACCA CACTGCTCGA CATTGGGTGG 1000

   AAACATTCCA GGCCTGGGTG GAGAGGCTTT TTGCTTCCTC TTGCAAAACC 1050

   ACACTGCTCG AGGAATTCAT AACTTCGTAT AATGTATGCT ATACGAAGTT 1100

   ATGC                                                   1104

 

<210>  10

<211>  34

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<221>  misc_feature

<222>  (1)..(3866)

<223>  Lox序列

 

<400>  10

1  ATAACTTCGT ATAGCATACA TTATACGAAG TTAT                  34

 

<210>  11

<211>  3866

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<221>  misc_feature

<222>  (1)..(9)

<223>  NotⅠ位点

 

<400>  11

1  GCGGCCGCC                                              9

 

<210>  12

<211>  2233

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<221>  misc_feature

<222>  (1)..(2233)

<223>  奶山羊β－酪蛋白的部分第7 外显子至第9外显子基因序列，基因打靶载体的3’同源臂

 

<400>  12

1     ATCCCTTCAC TGGGCCCATC CCTAACAGCC TCCCACAAAA CATCCTGCCT 50

   CTTACTCAAA CCCCTGTGGT GGTGCCGCCT TTCCTTCAGC CTGAAATAAT 100 

   GGGAGTCCCC AAAGTGAAGG AGACTATGGT TCCTAAGCAC AAAGAAATGC 150

   CCTTCCCTAA ATATCCAGTT GAGCCCTTTA CTGAAAGCCA GAGCCTGACT 200

5  CTCACTGATG TTGAAAAGCT GCACCTTCCT CTGCCTCTGG TCCAGTCTTG 250

   GATGCACCAG CCTCCCCAGC CTCTTTCTCC AACCGTCATG TTTCCTCCTC 300

   AGTCCGTGCT GTCCCTTTCT CAGCCCAAAG TTCTGCCTGT TCCCCAGAAA 350

   GTAGTGCCCC AGAGAGATAT GCCCATCCAG GCCTTTCTGC TGTACCAGGA 400

   GCCTGTACTT GGTCCTGTCC GGGGACCCTT CCCTATTCTT GTAAGTCTAA 450

10 ATTTACTAAC TGTGCTGTTT AACTTCTGAT GTTTGTATGA TATTTGAGTA 500

   ATTAAGAGCC CTACAAAAAA TCAATAATGA ATGGTTCCAA AATAAGCATA 550

   GCTGAGATTA ATGATTCTCA GCATTGGTTA TAAATAGAAT AAGCTGGAAA 600

   ACCTTCACCT CCCCTCCACC ACCAGATCTC AATGTCTAGG CTTACCCATG 650

   GAGATTCTGA TTAACTGTTC TTTCTATGTA GAAGAAACTT ATTGGGAAGA 700

15 AATAATATAA TGGACTATGA TTTAATTGGT CTGTTGAGAA TTTAGATGAA 750

   GGGGATTAAG TTACAATAAA GCCAGAATTG AACTTGATAA TCTCACTTGG 800

   CTAAGAATAA CAAACCTAAG AAGGTTTGCT ATTTTCTACA ATTTTGAAGT 850

   TTTCCTTATG CACAATTATT TCACCACATG ACTCATTTCA CCTCTTGTTT 900

   TTGATATATG AGCATATGAG GGCAAAATAC TGAAGATGCT TATTTCAATA 950

20 CTCAGGGAAA ATTTTCTTGC CAAAAGGCAA GAATTGTATA ATTCATTCAC 1000

   TTATTTTATT TTTTTAATTT TTAAGGTCTA AGAGGATTTC AAAGTGAATG 1050

   CCCCCTCCTC ACTTTTGGTA AGCTTTAGGA GATTGGAGGC AGACTGATCA 1100

   TTTTTATAGT TAATATCTTT TACATTTCAT CTTCCTGGAT AAGCCCCAAT 1150

   AGTAGCAATT TCTATCAGTA TACCAGCGTA AAGATTAGTT TTAAATATAT 1200

25 TTTCAGTGAT TGACTGTTAT TTACTGACCT GAAATTATGT ATCTGTTATA 1250

   TTTCAAATAA TGCAAAACTG TATATATATG GTGTTGACAG ATTTGATTGG 1300

   TTTTCTTTCA ATTGCCTATA TCCTTATTAT TGATTGTAAT CATTTATAGA 1350

   AAAAACAAAA TAATTTCTTA TACTTTTATG TAAACCTGTT AGAGCTTATT 1400

   TTAAAGATCA ACTGCATTCA CATTTCTAAT CTAGTCATTA TGAGCTTCAA 1450

30 TTGTTTTATC TCACTTAAAA TTTATATATT GTCTTTTAAT TCATGAGTCA 1500

   AAATACAATC TCACAGTCCA GATATGGGAC TTAAAAGGGG AATAGCATAT 1550

   AGTTTTGATA TTCTTAAAGA AATACATCTT TTTGTGATCA TGATTCAGCA 1600

   GACATTTTAA TAAAACAATT CCAAGTGAGC CGACACTTGG TCCTAGAGGA 1650

   ATTTTTATAA TCTTAAGGTA AGGCACAGCA TGGTGTTTTT GTAATAAGAT 1700

35 TTCTTTTATG AAAAAGTCAC ACCAAAATTG GAAATGGGGT GAGATGAAGA 1750

   GTTATAACAT ATAACTAAAT GGACATTTGT TCTCTATTCC ACAGAATTGA 1800

   CTGCGACTGG AAATATGGCA ACTTTTCAAT CCTTGCATCA TGCTACTAAG 1850

   ATAATTTTTA AATGAGTATA CATGGAACAA AAAATGAAAC TTTATTCCTT 1900

   TATTTATTTT ATGCTTTTTC ATCTTAATTT GAATTTGAGT CATAAACCAT 1950

40 ATACTTTCAA AATGTTAATT CAACATTAGC ATAAAAGTTC AATTTTAACT 2000

   TGGAAATATC ATGAACATAT CAAATTATGT ATAAAAATAA TTTCTGGAAT 2050

   TGTGATTATT ATTTCTTTAA GAATCTATTT CCTAACCAGT CATTTCAATA 2100

   AATTAACCCT TAGGCATATT TAAGTTTTCT TGTCTTTATT ATATTTTTAA 2150

   AAATGAAATT GGTCTCTTTA TTGTTAACTT AAATTTATCT TTGATGTTAA 2200

   AAATAGCTGT GGAAAATTAA AATTGGATAG AAT                   2233

 

<210>  13

<211>  6

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<221>  misc_feature

<222>  (1)..(6)

<223>  SmaⅠ位点

 

<400>  13

1  CCCGGG                                                   6

 

 

抗凝血酶素III 基因的氨基酸序列

MYSNVIGTVTSGKRKVYLLSLLLIGFWDCVTCHGSPVDICTAKPRDIPMNPMCIYRSPEKKATEDEGSEQKIPEATNNRRVWELSKANSRFATTFYQHLADSKNDNDNIFLSPLSISTAFAMTKLGACNDTLQQLMEVFKFDTISEKTSDQIHFFFAKLNCRLYRKANKSSKLVSANRLFGDKSLTFNETYQDISELVYGAKLQPLDFKENAEQSRAAINKWVSNKTEGRITDVIPSEAINELTVLVLVNTIYFKGLWKSKFSPENTRKELFYKADGESCSASMMYQEGKFRYRRVAEGTQVLELPFKGDDITMVLILPKPEKSLAKVEKELTPEVLQEWLDELEEMMLVVHMPRFRIEDGFSLKEQLQDMGLVDLFSPEKSKLPGIVAEGRDDLYVSDAFHKAFLEVNEEGSEAAASTAVVIAGRSLNPNRVTFKANMPFLVFIREVPLNTIIFMGRVANPCVK

 

 

             

Claims (7)

1.人抗凝血酶III基因在崂山奶山羊乳腺中表达的方法，该方法包括以下步骤：

功能基因的获得；基因打靶载体的构建和标记基因的接入；转化受体细胞经筛选获得阳性细胞株；阳性细胞株DNA制备；阳性细胞株经核移植，获得含有人抗凝血酶III基因的克隆崂山奶山羊和转基因奶山羊的鉴定；

其特征是：

(1)功能基因的获得

从人肝脏组织中获得人抗凝血酶III基因的mRNA，逆转录成cDNA；通过PCR方法建立两端的连接酶切位点；PCR产物连接在pUC19质粒上，再进行DNA序列分析；

(2)基因打靶载体的构建和标记基因的接入

以崂山奶山羊β-酪蛋白基因为基因打靶载体，分别将人抗凝血酶III基因，lox序列，poly(A)信号，新霉素抗性筛选基因(neo)和lox序列依次构建到β-酪蛋白基因为表达框架中；

(3)转化受体细胞经筛选获得阳性细胞株

转化受体细胞后，经筛选获得基因打靶阳性细胞株；

(4)阳性细胞株DNA制备

培养的细胞转入含有蛋白酶K的DNA裂解液中，用Pst I酶消化，在0.8％的凝胶上进行电泳，然后将DNA转入纤维膜中，分别用P³²标记探针杂交；

(5)阳性细胞株核移植

经供核细胞的培养，核移植和胚胎移植，获得含有人抗凝血酶III基因的转基因崂山奶山羊；

(6)转基因奶山羊的鉴定

提取奶山羊组织DNA，通过PCR或Southern分析，进行转基因奶山羊的鉴定。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征是所述功能基因的获得方法是，根据人抗凝血酶III的DNA顺序，设计PCR引物，并在引物前加入一个唯一的Xho I酶酶切位点，进行PCR反应，PCR产物克隆到pUC19载体上，进行序列分析，再将DNA序列分析正确的ATIII的DNA片段，加上一个lox序列，Poly(A)序列，新霉素基因和lox序列，使两个lox序列的方向相同。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征是所述基因打靶载体的构建和标记基因接入的方法是，用绵羊的β-酪蛋白基因片断为探针，从崂山奶山羊基因组文库中分离出一段完整的β-酪蛋白基因，并用PCR方法去除β-酪蛋白基因的第二外显子与第七外显子及其之间的部分DNA序列，建立一个Not I位点，然后将抗凝血酶III和含有两个同一方向的lox序列的Poly(A)信号和新霉素基因，连接在崂山奶山羊β-酪蛋白基因的表达框架上。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征是所述转化受体细胞经筛选获得阳性细胞株的方法是，从40d胎龄的崂山奶山羊胎儿中分离出胎儿成纤维细胞，分离的细胞培养在DMEM-F12的培养基中，并在培养基中添加10％胎牛血清和抗菌素，用脂质体介导的方法，将基因打靶载体转入山羊胎儿成纤维细胞中，然后在含有G418 600μg/mL的培养基中筛选培养18d；细胞株再进行扩繁，一部分细胞株冷冻保存，一部分用于制备DNA。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征是所述阳性细胞株DNA制备的方法是，将培养的细胞转入含有蛋白酶K的DNA裂解液中，在55℃水浴锅中过夜，然后加入两倍量的纯酒精，混匀，离心；

用70％酒精洗DNA一次，自然干燥，然后加入适量的Tris-EDTA溶液，待DNA全部溶解后，放入-20℃冰箱中；

用Pst I酶消化过夜，在0.8％的凝胶上进行电泳，然后将DNA转入纤维膜中，分别用P³²标记探针杂交。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征是所述阳性细胞的细胞核移植的方法是，

供核细胞的培养：作为供核细胞的基因打靶细胞株从液氮中复苏后，在DMEM-F12培养基体外培养3d，然后在含有0.5％胎牛血清的培养基中饥饿3d，备用；

核移植：经同期发情和超排处理，获得体内成熟的卵母细胞和继母羊，用体内成熟的313个卵母细胞制备去核细胞，取饥饿3d的阳性细胞，将其移入去核卵母细胞的卵周隙中，用电刺激的方法将阳性细胞与去核卵母细胞融合，体外培养4h后，用离子霉素激活5min，再在含有6-二甲基苯胺嘌呤的培养基中培养5h，将克隆胚胎移入DMEM-F12培养基中培养1d。

胚胎移植：克隆胚胎在培养基中培养1d后，将胚胎移植到继母羊输卵管内，正常怀孕，产羔；Southern blot和PCR分析表明，克隆羊羔含有抗凝血酶III基因，获得的是含有人抗凝血酶III基因的克隆崂山奶山羊。

7.按照权利要求1所述的人抗凝血酶III基因在崂山奶山羊乳腺中表达的方法，其特征在于所述抗凝血酶III基因是否在转基因奶山羊体内的鉴定判断的方法是，提取所述转基因奶山羊羊羔耳部组织的总DNA，用PCR和Southern检测是否为阳性；如结果为阳性，则证明克隆羊羔含有抗凝血酶III基因，获得的是含有人抗凝血酶III基因的克隆崂山奶山羊。

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