CN1955192A - 具有促红细胞生长因子活性的蛋白质及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有促红细胞生长因子活性的蛋白质及其制备方法。该蛋白质是在保持pleckstrin同源性结构域的三级结构不变的情况下，将其氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加衍生而来，具有促红细胞生长因子的活性。本发明的技术方案是利用蛋白质功能嫁接方法将红细胞生成素EPO的功能嫁接到pleckstrin同源性结构域骨架上，进行突变体设计、表达及纯化，并通过实验测定突变体与EPO受体的结合能力和EPO活性。本发明的蛋白质可作为EPO替代品，用于治疗贫血，慢性肾功能衰竭(CRF)，HIV感染/ZDU治疗病人，类风湿性关节炎，癌性贫血以及其它任何采用EPO治疗的症状。

Description

具有促红细胞生长因子活性的蛋白质及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及具有促红细胞生长因子活性的蛋白质，具体涉及广泛存在于生物体内的pleckstrin同源性结构域及其具有促红细胞生长因子活性的突变体。

背景技术

蛋白质是生物体中完成各种生命功能的主要物质。蛋白质结构和功能规律的研究是生命科学的中心课题之一，它不仅包括对天然蛋白质结构和功能规律分析研究，还包括利用现有知识进行蛋白质设计。蛋白质设计的最终目标是从头设计具有任意指定结构和功能的蛋白质。无论是使已有的蛋白质具有新的功能还是在全新设计的蛋白质中引入功能，对于研究蛋白质结构与功能的关系都具有十分重要的理论意义和潜在的应用价值。蛋白质功能设计包括蛋白质功能的改造和新功能的开发。我们发展了适用于非同源非连续位点的蛋白质功能嫁接方法，并应用于促红细胞生成素(EPO)功能的嫁接。

EPO是促进红系祖细胞分化、增殖并形成红细胞的主要激素。重组人EPO临床上用于治疗贫血，慢性肾功能衰竭(CRF)，HIV感染/ZDU治疗病人，类风湿性关节炎，癌性贫血等症状。最新的研究表明，EPO在神经和大脑发育中具有非常重要的作用。由于避免了过去常采用的输血治疗方法，重组人EPO产生了巨大的社会和经济效益。目前，全世界重组EPO年销售额高达数十亿美元。但是在临床上使用重组EPO的唯一方法是通过静脉或皮下注射，且要多次重复使用才能达到治疗目的。此外，用于生产重组EPO的哺乳动物细胞的培养成本很高，同时表达量不高，因而使用EPO治疗是相当昂贵的。因此，如果能够找到一种易于表达的蛋白质骨架，将EPO的功能位点嫁接到上面，那么就有可能成为重组人EPO的替代品，满足市场需求。

PH结构域是一种存在于多种信号蛋白和细胞骨架相关蛋白中的大约由120个氨基酸组成的功能性区域，在许多物种、器官以及不同蛋白中都有分布。由于它们与pleckstrin(血小板蛋白激酶C(PKC)的一个主要底物)中的一段重复序列具有同源性，所以被称为Pleckstrin Homology(PH)结构域。不同蛋白质中的PH结构域在一级结构上同源性并不一定很高，但是通过对其空间结构的研究发现，其肽链主链折叠方式基本相同，三级结构非常保守。关于该结构域本身的功能，目前主要认为其作用是通过与细胞膜结合，从而将同一蛋白其他成分定位在细胞膜上，可能还具有与SH2和SH3结构域类似的介导信号分子间相互作用的功能。由于该结构域的三级结构高度保守，所以非常便于在不改变其三级结构的基础上进行功能改造。

蛋白质与蛋白质的相互作用界面比较大。它们之间的接触面积往往在1200-2000²之间，作用界面涉及20-60个氨基酸残基。这些氨基酸残基所起的作用是不同的。定点突变表明，对结合有重大影响的只有少数几个残基(通常是结合的双方各提供3-4个关键残基)，但仅仅考虑起重要作用的氨基酸显然是不够的。我们发展了一套将序列上非连续的蛋白质-蛋白质相互作用区嫁接到非同源骨架蛋白上的切实可行的策略(Biopolymers，54：515-523，2000)。这种方法是在已知配体蛋白和受体蛋白复合物晶体结构的前提下，基于强相互作用残基的C_α、C_β原子和重要原子的坐标，将骨架蛋白叠加到配体-受体复合物中的配体蛋白上，评估骨架蛋白与受体的互补性并留下互补性好的骨架蛋白。调节骨架蛋白与受体的相对位置，使界面具有合理的堆积密度，并作其它必要的突变。具体算法分为四个步骤：搜索有合适嫁接位点的骨架蛋白；分子叠合及几何互补性评估；叠合构象的取向微调；结合位点的突变、优化及评估。

利用上述方法可以将所需的蛋白功能位点嫁接到合适的蛋白质骨架上，从而获得更便于应用的新的功能蛋白质。

发明内容

本发明的目的是找到具有类似EPO活性的蛋白质突变体，用于治疗贫血、慢性肾功能衰竭等EPO适用症。

本发明的技术方案是利用蛋白质功能嫁接方法寻找能够嫁接EPO功能的合适蛋白质骨架，进行突变体设计、表达及纯化，利用表面等离子体共振技术测定蛋白质突变体与EPO受体的结合活性，并通过细胞实验测定突变体的EPO活性。

按照以上方案进行蛋白质嫁接设计，本发明找到pleckstrin同源性蛋白质结构域(PH结构域)作为嫁接EPO功能的蛋白质骨架。在保持pleckstrin同源性结构域的三级结构不变的情况下，将其氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加可得到具有促红细胞生长因子活性的PH结构域衍生蛋白质。

PH结构域是一种存在于多种信号转导蛋白及细胞骨架蛋白中的约由120个氨基酸残基组成的功能性区域，但PH结构域与EPO受体的作用未见报导。文献表明，PH结构域是一种三级结构上非常保守的蛋白(Cell 120：574-576，2005；Biochem Soc Trans.32：707-711，2004)。用关键词PLECKSTRIN HOMOLOGY DOMAIN，搜索PDB数据库(Protein Data Bank)，得到43个具有与1mai(大鼠磷脂酶C delta1蛋白PH结构域)相似结构的含PH结构域的蛋白。通过结构比对发现，所有这些PH结构域的三维结构非常保守。因此，适合于构建本发明的具有促红细胞生长因子活性的蛋白质的PH结构域广泛存在于生物体内。

目前，对磷脂酶C PH结构域的研究较为深入，特别是大鼠磷脂酶C delta1蛋白的PH结构域的晶体结构已经解析出来。通过计算我们发现，在与EPO受体结合的界面上，大鼠磷脂酶C delta1蛋白的PH结构域上的以下氨基酸残基很重要：18，23，24，41，43，45，46，47，49，50，51，52，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，70，71，72，73，77，80，93，94，101，102，103，104，105，106，119，123，126，127，129，130。这些残基参与了与EPO受体相关残基的直接作用，形成静电力、氢键、范德华力或者疏水堆积等，对两者的结合起到了非常重要的作用。例如根据计算结果突变后的PH结构域上的Asn47能够与EPO受体上的His114形成氢键，Arg49能与EPO受体上的Glu117形成静电作用，Phe63能与EPO受体上的Phe93形成疏水作用，Thr50可能与EPO受体上的Phe93形成疏水作用等等。因此对所有这些残基的突变都有可能改变(提高或者降低)两者的相互作用强度。本发明重点选取了在大鼠的磷脂酶C delta1蛋白的PH结构域的63，47，49，46等位置上进行氨基酸残基替换，得到了下述具有类似EPO活性的蛋白质突变体：E63F、D47N、K49R、E63F-D47N、E63F-K49R、D47N-K49R、E63F-D47N-K49R和E63F-D47N-K49R-E46A。

上述63，47，49，46位置还可以突变为其他的氨基酸及其衍生物。除了这四个位置以外，PH结构域上的其它位置也可以进行氨基酸及其衍生物的替代、缺失或添加，只要这些突变加强了PH结构域与EPO受体的相互作用，这样的突变体蛋白就有可能具有类似EPO的活性。

本发明的具有促红细胞生长因子活性的PH结构域衍生蛋白质可以通过以下步骤制备：

(1)用PCR的方法扩增得到pleckstrin同源性结构域的基因，并连入合适的表达载体，获得表达pleckstrin同源性结构域的质粒；

(2)利用蛋白质功能嫁接方法进行突变体设计；

(3)通过引物引入突变，PCR扩增上述表达质粒，得到含有pleckstrin同源性结构域的突变基因的表达质粒；

(4)将上述质粒转入原核或真核宿主中，在适宜的条件下表达目的蛋白；

(5)用适当的方法收集和处理菌体、组织或细胞，得到目的蛋白的粗提物；

(6)用亲和柱、体积排阻柱等方法获得纯化的目的蛋白。

本发明利用表面等离子体共振方法测定了PH结构域突变体与EPO受体的结合常数。表面等离子体共振方法是公认的用于测定蛋白质-蛋白质结合常数的通用方法，具有蛋白质用量少、灵敏、结合常数测定准确的特点。

同时，本发明利用293T细胞体系，测定了PH结构域突变体激活EPO受体信号通路的作用。实验采用的是PathDetect in vivo signal transduction pathwaytrans-reporting system(购自Stratagene公司)，荧光酶活性检测采用的是luciferaseassay system(购自Promega公司)。

本发明的pleckstrin同源结构域相关突变体有可能作为EPO替代品，用于治疗治疗贫血，慢性肾功能衰竭(CRF)，HIV感染/ZDU治疗病人，类风湿性关节炎，癌性贫血以及其它任何采用EPO治疗的症状。该类具有EPO活性的突变体以及其衍生形式蛋白的任何性质的商业化生产和应用在本发明的保护范围之内。

具体实施方式：

为了更清楚地说明本发明，列举以下实施例，但其对本发明的范围无任何限制。

进行实验时，所采用的操作方法和操作步骤以及反应条件等，都是依据本技术领域的普通技术人员熟知的方法设计、实施的。

实施例1：PH结构域突变位点的选择

我们将本实验室发展的蛋白功能嫁接计算策略(Biopolymers，54：515-523，2000)用于EPO表面功能区嫁接的计算。将EPO(Protein Data Bank代码leer)与其受体EPOR相互作用界面的关键残基：48位PHE，147位ASN，150位ARG作为嫁接的关键残基。我们使用基于矢量匹配的嫁接策略将蛋白质关键结合位点嫁接转移到另一个非同源的蛋白质上，成功地找到了用于嫁接EPO功能的候选蛋白骨架PH结构域(Protein Data Bank代码是1mai)。通过我们根据这一策略编写的一个计算机程序计算得到这个骨架的互补性打分是561，关键残基的均方要偏差为0.843埃。需要突变的三个关键残基对应如下：

63位GLU→PHE；47位ASP→ASN；49位LYS→ARG

同时，该程序建议将46位GLU突变为较小的残基，如GLY。

上面四个突变之后，互补分数变为571，堆积密度为0.729，埋藏面积约为1610平方埃，疏水互补打分为85。这些数据表明该蛋白经过上述突变后能够与EPO受体形成理想的结合界面。

实施例2：PH结构域突变体的构建、表达与纯化

一、基因扩增与表达载体构建

大鼠(Rat)磷脂酶C delta1(Phospholipase C Delta 1)的PH结构域(残基1-140；Protein Data Bank代码为1mai)的基因通过引物对1(引物序列如表1所示)以pGST4/PLCdelta1质粒(Hitoshi Yagisawa教授赠送并授权；Eur.J.Biochem.265：481-490，1999)为模板，采取聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)扩增。扩增产物经纯化后用NdeI和EcoRI双酶切，酶切产物通过T4 DNA连接酶连入经NdeI和EcoRI双酶切的pET-28a载体(购自Novagen公司)中，得到表达载体pETPHD。经DNA测序检验序列正确。

                               表1.引物设计

引物对		引物序列(5’-3’)	序列号(SEQ ID NO)
				1	正向引物	CACTCTA CATATGGACTCGGGTAGGGAC	1
反向引物	CAT GAATTCTTACTTCTGCCGCTGGTCCATGG	2
			2		正向引物	GGTCATGAGGTCCCCGTTCTCGCAGCTGTTCTCCA	3
反向引物	TGGAGAACAGCTGCGAGAACGGGGACCTCATGACC	4
				3	正向引物	CTACAAGCTACAGGAGAACTGCAAGACCATCTGGC	5
反向引物	GCCAGATGGTCTTGCAGTTCTCCTGTAGCTTGTAG	6
			4		正向引物	CAGGAGGACTGCAGGACCATCTGGCAG	7
反向引物	CTGCCAGATGGTCCTGCAGTCCTCCTG	8
				5	正向引物	CTACAAGCTACAGGAGAACTGCAGGACCATCTGG	9
反向引物	CCAGATGGTCCTGCAGTTCTCCTGTAGCTTGTAG	10

6	正向引物	TCTACAAGCTACAGGCGAACTGCAGGACCATC	11
				反向引物	GATGGTCCTGCAGTTCGCCTGTAGCTTGTAGA	12
	7	正向引物	GATA GGATCCATGGACTCGGGTAGGGACTTC				13
反向引物				GATGT TCTAGACTTCTGCCGCTGGTCCATGG	14
		8	正向引物			GATA GGATCCATGGGGGTGCACGAATGTC	15
反向引物	GATGT TCTAGATCTGTCCCCTGTCCTGCAG			16

注：＿＿标志为内切酶位点。CATATG为NdeI位点；GAATTC为EcoRI位点；GGATCC为BamHI位点；TCTAGA为XbaI位点。

二、PH结构域突变体的构建

1、E63F突变体的构建

以pETPHD为模板，用引物对2(序列见表1)和PfuUltraHigh-Fidelity Polymerase(购自Stratagene公司)采用PCR方法突变。突变后的产物用DpnI酶酶切切断含有甲基化位点的模板载体，得到完整的没有甲基化位点的突变体载体(参见《分子克隆手册》第三版，美国冷泉港实验室出版)。

2、E63F-D47N突变体的构建

方法同上述E63F突变体的构建方法，所用模板为E63F突变体，引物为引物对3(序列见表1)。

3、E63F-K49R突变体的构建

方法同上述E63F突变体的构建方法，所用模板为E63F突变体，引物为引物对4(序列见表1)。

4、E63F-D47N-K49R突变体的构建

方法同上述E63F突变体的构建方法，所用模板为E63F-K49R突变体，引物为引物对5(序列见表1)。

5、D47N突变体的构建

方法同上述E63F突变体的构建方法，所用模板为pETPHD，引物为引物对3(序列见表1)。

6、K49R突变体的构建

方法同上述E63F突变体的构建方法，所用模板为pETPHD，引物为引物对4(序列见表1)。

7、D47N-K49R突变体的构建

方法同上述E63F突变体的构建方法，所用模板为K49R突变体，引物为引物对5(序列见表1)。

8、E63F-D47N-K49R-E46A突变体的构建

(1)第一步PCR

模板为E63F-D47N-K49R突变体，反应A的引物为1号正向引物和6号反向引物，反应B的引物为1号反向引物和6号正向引物(引物序列见表1)，其他成分相同。A和B的产物经纯化后用于第二步PCR。

(2)第二步PCR

反应A和B的产物等摩尔浓度混合后，用1号正向引物和1号反向引物进行PCR。产物纯化后用于下一步实验。

(3)双酶切并连入载体

步骤(2)的产物经NdeI和EcoRI双酶切后，用T4 DNA连接酶连入经双酶切的pET-28a载体中，得到突变体。

上述1-8所有突变体均经过DNA测序确证。

三、蛋白表达与纯化

pETPHD载体被转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLys(购自Novagen公司)菌株中表达目的蛋白(NH-PHD)。挑取单克隆或者吸取100μL菌种接到50mL含30μg·mL^-1硫酸卡那霉素和34μg·mL^-1氯霉素的LB液体培养基中，于摇床上37℃，220转/分钟震荡培养过夜。然后以1∶100的比例将过夜培养基转接到1L含同样量抗生素的新鲜LB液体培养基中，于摇床上37℃，220转/分钟震荡培养至OD₆₀₀为0.6-1.0。然后加入IPTG至终浓度为0.5mM，于30℃，220转/分钟震荡培养4个小时后离心收集细胞(4℃，5000g，15min)。弃去上清，然后用40mL 0.8％的NaCl水溶液重新悬浮细胞，并再次离心沉淀细胞(4℃，4000g，20min)。弃去上清后得到的细胞可以进入下一步纯化实验或者置于-70℃冰箱放置待用。

纯化时，先将上述得到的细胞用裂解液(50mM Na2HPO4/NaH2PO4，300mM NaCl，10mMImidazole，pH 7.0)悬浮，裂解液用量为5-10mL/g细胞。加入1mM PMSF(Phenylmethylsulphonylfluoride)后，用超声波(3s，5s，300W，90次)重复2-3次裂解细胞至溶液透明无混浊。离心(4℃，40000g，30min)后保留上清。上清用0.22μm滤膜过滤后上Ni-NTA柱纯化。

细胞裂解液上柱前，先用上述裂解液平衡Ni-NTA柱子。过滤后的细胞裂解液通过FPLC装置，以3mL·min^-1的速度上样。上样完毕后，继续用上述裂解液以3mL·min^-1速度冲洗柱子，直到基线平稳。然后用冲洗液(50mM Na2HPO4/NaH2PO4，300mM NaCl，20mMImidazole，pH 7.0)同样冲洗柱子至基线平稳。最后用洗脱液(50mM Na2HPO4/NaH2PO4，300mM NaCl，250mM Imidazole，pH 7.0)以3mL·min^-1流速洗脱并收集蛋白峰。

将上述得到的蛋白浓缩后，上样到用缓冲液(PBS，pH 7.0)平衡好的HiPrep 16/60Sephacryl S-200凝胶过滤柱(Amersham Biosciences)中，收集目的蛋白峰，加入2mM DTT(dithiothreitol)后保存。

上述各步均保留少量样品，用于12％(w/v)acrylamide gel(Laemmli，1970)检测。最终纯化蛋白(wild type NH-PHD，wtNH-PHD)的纯度为95％以上(SDS-PAGE)。

表达的到的蛋白在N端比原基因中的PH domain(PHD)蛋白多出一段His-tag序列(MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH)，主要用途是方便纯化，可以通过凝血酶(Thrombin)切除。经过凝血酶切除N端His-tag后，用HiTrap Benzamidine FF亲和柱(购自AmershamBiosciences公司)除去凝血酶，然后用HiPrep 16/60Sephacryl S-200凝胶过滤柱除去His-tag，得到纯化的PHD蛋白。

其他突变体蛋白的表达纯化采取同样的方法。

实施例3：体外受体结合能力检测

wtNH-PHD以及其突变体蛋白与EPOR(EPO受体)的结合能力利用表面等离子体共振技术(SPR)进行测试。实验仪器为Biacore 3000(购自瑞典Uppsala公司)，重组人EPO可溶性受体(rhEPO sR)购于R&D Systems。实验采用的缓冲液为HBS-EP(10mM Hepes，150mM NaCl，3.7mM EDTA，pH 7.4，0.005％P20)，芯片为CM5芯片。

将rhEPO sR溶于pH 3.1的100mM醋酸钠溶液中，得到pH 4的溶液用于固定化。在固定化过程中，流速保持为5μL·min^-1。将CM5芯片的第2通道用35μLN-ethyl-N’-(3-diethylaminopropyl)-carbodiimide/N-hydroxysuccinimide(EDC/NHS，1∶1)活化，然后注射45μL rhEPO sR，最后用35μL 1M的ethanolamine-HCl，pH 8.5封闭通道。固定的rhEPO sR为1200RU。用10μL 10mM Glycine-HCl，pH 2.2以20μL·min^-1的流速将通道2洗3遍后，基线稳定。通道1为参照道，处理方式同上，但不注射rhEPO sR。

用HBS-EP将系统冲洗三次后，体系稳定，基线漂移小于1RU·min^-1。所有动力学测试均采用50μL·min^-1的流速，温度为25℃。每一个分析循环由以下几步组成：(1)1分钟稳定时间；(2)上样150μL；(3)300秒解离时间；(4)采用快速注射方式注射20μL再生缓冲液洗脱结合蛋白；(5)清洗IFC。每个样品均包括至少一个空白对照(零浓度)和5个浓度测试，浓度排列顺序随机，并选取一个浓度重复测试。rhEPO结合的再生缓冲液为10mM Glycine-HCl，pH 2.2，wtNH-PHD及其突变体结合的再生缓冲液为5mM NaOH溶液。得到的动力学数据采用BIAevaluation 4.0处理。

经SPR测定的蛋白质突变体与EPO受体的结合常数如表2所示。

表2.设计蛋白质与EPO受体结合的离解常数

蛋白质	KD/M
		人重组EPO	3.2E-10
PH-E63F-D47N-K49R-E46A突变体	1.2E-8
		PH-E63F-D47N-K49R突变体	8.9E-9
PH-E63F突变体	2.0E-8
		PH-E63F-D47N突变体	1.6E-8
PH-E63F-K49R突变体	1.5E-8
		PH-D47N-K49R突变体	1.0E-7

这些动力学数据表明，在体外条件下，野生型的PH结构域不与EPO受体结合，而其上述突变体能够与EPO受体有效结合。

实施例4：体内EPOR结合活性检测

利用293T细胞体系，测定PH结构域突变体激活EPO受体信号通路的作用。实验采用的是PathDetect in vivo signal transduction pathway trans-reporting system(购自Stratagene公司)，荧光酶活性检测采用的是luciferase assay system(购自Promega公司)。

1、质粒构建

首先在质粒pcDNA3.1(购自Invitrogen公司)的HindIII和KpnI位点间通过PCR引入信号肽序列MSALLILALVGAAVA(SEQ ID NO.18)，其碱基序列为5’ATGGACTCGGGTAGGGACTTCCCGACCCTGCAC 3’(SEQ ID NO.17)。得到的质粒标记为pcDNA3.1-SP myc/His A。

以pETPHD为模板，以7号引物对为引物(序列见表1)，通过PCR扩增出含有BamHI和XbaI位点的PH结构域及其突变体的序列(酶切位点通过引物设计引入)。用BamHI和XbaI双酶切后，用T4 DNA连接酶连入用BamHI和XbaI双酶切过的pcDNA3.1-SP myc/HisA载体中，得到pcDNA3.1-SP/PHD载体。其它突变体载体采用相应的模板，用同样的方法构建。

以pBS-hEPO质粒(Emmanuel Payen赠送；Blood 97：3776-3782，2001)为模板，以8号引物对为引物(序列见表1)，PCR扩增出含有BamHI和XbaI酶切位点的人EPO基因序列。用与上面同样的方法得到pcDNA3.1-SP/hEPO载体。

2、质粒转染

2.1质粒单独转染

按200μL每孔的量吸取无血清DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)培养基到新的无菌转染管中，然后加入以下四种质粒：STAT5(25ng/孔)，鼠EPOR(murineEPOR，250ng/孔)，LHRE(100ng/孔)，pTK-RL(购自Promega公司1.25ng/孔)。充分混匀后，按600ng/孔的量加入用于检测的质粒，其中阴性对照为pcDNA3.1-SP myc/His A，阳性对照为pcDNA3.1-SP/hEPO。混匀后，按3μL/孔的量加入Tfx-20转染试剂(购自Promega公司)，轻轻混匀后静止15分钟。

吸干培养有293T细胞的24孔板中的培养基后，每孔加入上面的混合物200μL。然后将24孔板置于37度，5％二氧化碳的培养箱中培养1小时。再每孔加入含1％双抗(青霉素+链霉素)和10％胎牛血清的DMEM培养基300μL。置于培养箱中继续培养。

培养24小时后，将孔中的培养基吸干，每孔加入不含血清的DMEM培养基500μL后，继续培养12小时后用于检测。

2.2质粒共同转染

操作与单独转染相同，但是待测质粒加入量为300ng/孔，同时添加300ngpcDNA3.1-SP/hEPO。阴性对照为600ng pcDNA3.1_sp myc/His A，阳性对照为300ngpcDNA3.1-SP myc/His A和300ng pcDNA3.1-SP/hEPO。

3、活性测试

取出24孔板，吸干培养基，然后用1mL/孔的PBS(pH 7.4)洗一次。吸干PBS后，每孔加入100μL裂解液。轻轻振荡30分钟后测活。

测活采用的仪器是TopCount NXT Microplate Scintillation & Luminescence Counter(购自Packard公司)。测活时，于96孔板中加入30μL/孔底物I和20μL/孔裂解液后检测荧光酶活性；然后加入30μL/孔底物II后检测背景值。

4、测活结果

测活结果表明，在与EPO相当的表达量时，PH结构域突变体蛋白的EPO活性没有明显表现出来。但在与EPO共同转染的实验中，这些突变体表现出了对EPO的不同程度的抑制性或竞争性作用，表明这些突变体在与EPO表达量相当的情况下即可与EPO竞争结合EPO受体，同时预示着通过提高突变体的相对表达量，该实验方法就可能检测得到这些突变体的类似EPO的活性效应。

                          序列表

                      SEQUENCE LISTING

<110>北京大学

<120>具有促红细胞生长因子活性的蛋白质及其用途

<130>JSP050194

<160>18

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

cactctacat atggactcgg gtagggac                                     28

<210>2

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

 catgaattct tacttctgcc gctggtccat gg                               32

<210>3

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

 ggtcatgagg tccccgttct cgcagctgtt ctcca                            35

<210>4

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

 tggagaacag ctgcgagaac ggggacctca tgacc                            35

<210>5

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

ctacaagcta caggagaact gcaagaccat ctggc                             35

<210>6

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

 gccagatggt cttgcagttc tcctgtagct tgtag                            35

<210>7

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

caggaggact gcaggaccat ctggcag                                      27

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

ctgccagatg gtcctgcagt cctcctg                                      27

<210>9

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

ctacaagcta caggagaact gcaggaccat ctgg                              34

<210>10

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

ccagatggtc ctgcagttct cctgtagctt gtag                              34

<210>11

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

tctacaagct acaggcgaac tgcaggacca tc                                32

<210>12

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

gatggtcctg cagttcgcct gtagcttgta ga                                32

<210>13

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

gataggatcc atggactcgg gtagggactt c                                 31

<210>14

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

gatgttctag acttctgccg ctggtccatg g                                 31

<210>15

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

gataggatcc atgggggtgc acgaatgtc                                    29

<210>16

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

gatgttctag atctgtcccc tgtcctgcag                                   30

<210>17

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

atggactcgg gtagggactt cccgaccctg cac                               33

<210>18

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<400>18

Met Ser Ala Leu Leu Ile Leu Ala Leu Val Gly Ala Ala Val Ala

1                 5                      10                    15

Claims (7)

1.一种蛋白质，其特征在于：所述蛋白质是在保持pleckstrin同源性结构域的三级结构不变的情况下，将其氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而得到的具有促红细胞生长因子活性的pleckstrin同源性结构域衍生蛋白。

2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述pleckstrin同源性结构域为磷脂酶C的pleckstrin同源性结构域。

3.如权利要求2所述的蛋白质，其特征在于：所述pleckstrin同源性结构域为磷脂酶C deltal的pleckstrin同源性结构域。

4.如权利要求3所述的蛋白质，其特征在于：所述磷脂酶C来源于大鼠。

5.如权利要求4所述的蛋白质，其特征在于，该蛋白质选自：大鼠磷脂酶C deltal的pleckstrin同源性结构域的E63F、D47N、K49R、E63F-D47N、E63F-K49R、D47N-K49R、E63F-D47N-K49R、E63F-D47N-K49R-E46A突变体。

6.权利要求1～5中任一权利要求所述蛋白质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)用PCR的方法扩增得到pleckstrin同源性结构域的基因，并连入合适的表达载体，获得表达pleckstrin同源性结构域的质粒；

(2)利用蛋白质功能嫁接方法进行突变体设计；

(3)通过引物引入突变，PCR扩增上述表达质粒，得到含有pleckstrin同源性结构域的突变基因的表达质粒；

(4)将上述质粒转入原核或真核宿主中，在适宜的条件下表达目的蛋白；

(5)用适当的方法收集和处理菌体、组织或细胞，得到目的蛋白的粗提物；

(6)用亲和柱、体积排阻柱等方法获得纯化的目的蛋白。

7.权利要求1～5中任一权利要求所述的蛋白质作为促红细胞生成素替代品的用途。