JPH03127741A

JPH03127741A - 悪性腫瘍治療剤

Info

Publication number: JPH03127741A
Application number: JP1264762A
Authority: JP
Inventors: Kawa Katou; 加藤　革; Satoshi Nakamura; 聡中村; Tsukio Sakugi; 柵木　津希夫; Kazuo Kitai; 北井　一男; Kenji Yone; 米　賢二; Jun Suzuki; 純鈴木; Yataro Ichikawa; 市川　弥太郎
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1989-10-11
Filing date: 1989-10-11
Publication date: 1991-05-30

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１０発明の目的［産業上の利用分野］本発明は、腫瘍壊死因子［Ｔ　（ＩｍＯｒ　　Ｎ　ｅｃ
ｒＯ３ｉ３Ｆ　ａｃｔｏｒ以下、ＴＮＦと略称］　　（
Ａ成分）、および、グルコース、乳酸等のアシド−シス
促進剤（Ｂ成分）とを有効活性成分として含有する抗腫
瘍性医薬組成物［（Ａ成分）内に示した蛋白質には、生
理学的にこれと同様の生理活性を呈する改変蛋白質をも
含む］に関する。

［発明の背景］ＴＮＦは文献［Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｗｅｌｌ　ら、ｐ
ｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ、　Ｓ、　Ａ、、７
２．３６６６〜３６７０（１９７５）　］に記載されて
いるように、例えばＣＤ−Ｉ　　５ｗ１ｓｓマウスにＢ
ＣＧを接種して約２週間後にエンドトキシンを静脈内に
注射することによって該マウス血清中に誘導されるＭｅ
ｔｈＡ肉腫出血性壊死能を有する因子に与えられた名称
である。

生体におけるＴＮＦ産生はマウスの以外にも、ラット、
家兎、ヒトにおいても認められている［原中勝征、ＴＮ
Ｆ−腫瘍壊死因子−１医事新報社４１〜１０８頁（１９
８４）　］　。

最近になって、ヒトＴＮＦのアミノ酸配列、遺伝子配列
が解明され［Ｄ　、　Ｐ　ｅｎｎｉｃａら、Ｎ　ａｔｕ
ｒｅ。

３１２、　７２４〜７２９（１９８５）　、Ｔ、　５ｈ
ｉｒａｉ　ら、Ｎａｔｕｒｅ、　３１３．　８０３〜８
０６（１９８５）　、Δ０Ｍ。

Ｗａｎｏら、５ｃｉｅｎｃｅ、　　２８８，１４９〜１
５４（１９８５）　］、遺伝子組換えヒトＴＮＦ［以下
、ｒＨｕ（Ｎ　Ｆと略称］の臨床研究（臨床第工相試験
・第■相試験〉が精力的に推進されている。当初、ＴＮ
Ｆは、正常細胞に対しては障害作用を示すことなく、腫
瘍細胞に刻してのみ選択的に細胞障害作用を示すことが
強く期待されてきたが、ｒＨｕ−ＴＮＦの使用が可能と
なった１９８６年以降、ＴＮＦの基礎および臨床研究は
著しく進展し、現在では、ＴＮＦは強力かつ多面的な作
用を有する重要なホルモンであることが解明されつつあ
る［石田名香雄ら、バイオボロニクウ・プロジエク１へ
・シンポジウム　マクロファージ１９８７〜ｌｕｍｏｒ
　　Ｎｅｃｒｏｓ＋ｓ　Ｆａｃｔｏｒ　。

セラビューティック・リサーチ、７巻２号２３１〜４１
４頁（１９８７）　］。例えば、脂肪細胞の脂肪酸代謝
抑制作用［３，３ｅｕｔｌｅｒ　　＆　　Ａ、　Ｃｅｒ
ａｍＮａｔｕｒｅ、　３２０．　５８４〜５８８（１９
８６）　、Ｊ、　Ｓ。

Ｐ　ａｔｔｏｎら、ｐ　ｒｏｃＪＪ　ａｔｌ、Ａｃａｄ
、３　ｃｆ、、Ｕ、　３　。

Ａ、、８３．８３１３〜８３１７（１９８６）　、Ｍ、
　Ｋａｗａｋａｍ＋　ら、Ｊ、　Ｂｔｏｃｈｅｍ、、　
１０１．３３１〜３３８（１９８７）　］　、正常線維
細胞の増殖促進作用［Ｊ　、　Ｖ　１ｌｃｅｋら、ｊ。

Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１６３．　６３２〜６４３　（
１９８６）　］　、好中球の血管内皮細胞への付着促進
作用［Ｈ。

ｐ　ｏｈｌｍａｎら、Ｊ　、　　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、、
　　１３６．　４５４８〜４５５３３− （１９８６）　、Ｊ、　　Ｒ，Ｇａｍｂｌｅ　ら、ｐ　
ｒｏｃ、　ｌ’、ｌ　ａｔｌ。

Ａｃａｄ、　　　Ｓｃｉ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、、８２．８６
６７〜８６７１（１９８５）　］　、好中球によるスー
パーオキサイド分泌促進作用［８，Ｊ、　Ｋｌｅｂａｎ
ｏｆｆら、」Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、、　１３６．４２２０
〜４２２５　（１９８６）　、Ｍ　。

Ｔ　ｓｕｊｉｍｏｔｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、　　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、　、　１３７．１０９４〜１１００　（
１９８６）　］　、血管内皮細胞の凝固活性亢進作用［
Ｐ　、　Ｐ　、　Ｎ　ａｗｒｏｔ１１＆　　Ｄ、　Ｍ、
　５ｔｅｒｎ１Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１６３゜
７４０〜７４５　（１９８６）　、Ｍ、　Ｐ、　Ｂｅｖ
ｉｌａｃｑｕａら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、、Ｕ、　Ｓ、　Ａ、、８３．４５３３〜４５３７
　（１９８６）　］　、軟骨細胞での破骨活性亢進作用
［Ｄ、　　Ｒ，Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉら、Ｎ　ａｊｕｒｅ
、　３１９，５１６〜５１８　（１９８６）　、Ｊ　、
　５ａｋｌａｔｖａｌａ　、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２２
゜５４７〜５４９（１９８６）　、Ｂ、　　Ｍ、　　Ｔ
ｈｏｍｓｏｎら、口。

１１１１ｍｕｏｎｌ、、　１３８．　７７５〜７７９（
１９８７）　］　、Ｉ　Ｌｌの産生誘導作用［ｐ　、　
ｐ　、Ｎ　ａｗｒｏｔｈら、ａ。

Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１６３．１３６３〜１３７５　
（１９８６）　］　、プロスタグランジン類の産生誘導
作用［Ｍ。

Ｋ　ａｗａｋａｍｉ　ら、３　ｉｏｃｈｅｍ、　３１ｏ
ｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。

− Ｃｏｍｍｕｎ、、　　１４１．　４８２〜４８７（１９
８６）　　、Ｊ、　　Ｍ。

１）　ａｙｅｒら、Ｊ　、　　Ｅｘｐ、　　Ｍｅｄ、、
　　１６２．　２１６３〜２１６８（１９８６）　］　
、細菌感染時のエンドトキシン・ショックメチイエ−タ
ー作用［Ｋ、　Ｊ、　Ｔｒａｃｅｙら、５ｃｉｅｎｃｅ
、　　２３４．　４７０〜４７４（１９８６）　、Ｂ。

Ｂ　ｅＵｔｌｅｒら、５ｃｉｅｎｃｅ、　　２２９．　
８６９〜８７１（１９８５）　］　、発熱作用［Ｃ０Ａ
、１）ｉｎａｒｅｌｌｏら、Ｊ　　、　　　ＥＸ　ｐ、
　　Ｍｅｄ、、　　１６３．　１４３３〜１４５０　　
（１９８６）　　コ　、局所シュワルツマン反応惹起作
用［Ｂ、Ｊ。

Ａ　ｖｅｒｂｏｏｋら、Ｊ　、　ＣＩｉｎ、ｌ　ｍｍｕ
ｎｏｌ、、　７　、　３３３〜３４２　（１９８７）　
］　、チトクロームＰ４５０依存性の薬物代謝活性の抑
制作用［Ｐ、　Ｇｈｅｚｚｉ　ら、Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、
　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、ユ
孤。

３１６〜３２１　　（１９８６）　］　、筋筋細胞電電
の脱分極作用［Ｋ　、　Ｊ　、　Ｔ　ｒａｃｅｙら、Ｊ
、　ＥＸＩ）、　１ｙｌｅｄ、。

１６４、１３６８〜１３７３　（１９８６）　］などの
多様な作用が知られてきた。さらに、敗血症で死亡した
患者の血清中からＴＮＦが検出され、４４０Ｕ／ｍｆ２
（ｒ）−１１１−Ｔ　Ｎ　Ｆ　１００１）（１／　ｍａ
ｌに相当）以上の血清レベルの患者は全て死亡したと指
摘する報告もある［Ａ、Ｗａｎｇら、Ｌ　ａｎｃｅｔ、
上（８５２９）　Ｆｅｂ、　１４゜３５５〜３５７　（
１９８７）　］。したがって、ＴＮＦを抗腫瘍剤として
用いる場合、抗腫瘍作用以外の多様な作用が副作用とし
て生体に惹起される恐れがある。

［従来の技術］ＴＮＦの制癌剤としての臨床応用においては、局所投与
では効果が見られるものの、全身投与の効果は期待され
たほどではなかった「田口鐵男、癌と化学療法、１３巻
１１月３４９１〜３４９７頁（１９８６）、田口鐵男、
バイオセラビー　１巻１号３１〜３７頁（１９８７）　
、Ｍ、　　Ｂ　１ｉｃｋら、Ｃａｎｃｃｉｒ　ＲＯ３，
、，４７゜２９８６〜２９８９　（１９８７）　］。

したがって、ＴＮＦと他のサイト力インや化学療法剤の
ような制癌剤との併用による相加・相乗効果により、抗
腫瘍作用を増強し、その波及効果である相対的な副作用
の軽減を実現する試みが為されてきた。

例えば、ＴＮＦの抗腫瘍作用を増強するために、マイト
マイシン−Ｃ［以下、ｆｖｌ　Ｍ　Ｃと略称］、アドリ
アマイシン、サイクロフォスフアミドなどの各種抗腫瘍
化学療法剤との併用投与の基礎研究が行われ、併用効果
が認められたく中田勝久ら、癌と化学療法、１３巻１１
号３１６８〜３１９３頁（１９８６）　］。

また、インターフェロン、特にインターフェロン−γ［
以下、ＩＦＮ−γと略称］によるＴＮＦの抗腫瘍効果増
強作用も認められた［Ｂ、Ｄ。

Ｗ　ｉ＋　＋　ｉａｍｓｏｎら、Ｐ　ｒｏｅ、Ｎ　ａｔ
ｌ、Ａ　ｃａｄ、Ｓ　ｃ＋、、Ｕ　。

３、　　Ａ、、８０．　５３９７〜（１９８３）　、Ｌ
、　　Ｆｒａｎｓｅｎら、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅ
ｒ　＆　　Ｃ１１ｎ、０ｎｃｏｌ、、２２．　４１９〜
（１９ｇ　　）　、Ｗ、　　Ｆ　１ｅｒｓら、Ｃｏ１ｄ
　　３ｐｒｉｎｇ１−Ｉａｒｂｏｒ　３ｙｍｐｏｓｉａ
　ｏｎ　　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　３　ｉｏｌｏｇ
ｙ。

Ｖｏｌ、Ｌｌ、　　５８７〜５９５　（１９８６）　］
。

しかしながら、これらの試みの効果は充分なものではな
く、ＴＮＦ抗腫瘍作用増強のための併用剤は、それら自
体が抗腫瘍剤であるために、腫瘍のみならず生体に対し
ても毒性を相加・相乗的に発揮する。

ＴＮＦは、細胞表面に存在するＴＮＦレセプターに結合
し、細胞内に取り込まれることによって７− その作用が発揮されることが知られている［例えば、渡
辺直樹、新津洋司部、ビオメゾイカ、３巻、４Ｎ、　　
３５８〜３６３頁］。

ＴＮＦの抗腫瘍効果の作用機序はまだ完全には解明され
てはいないが、ＴＮＦは細胞代謝、特にリソシームとの
強い関連が示唆された。すなわち、リソシームの崩壊が
ＴＮＦの細胞障害作用の一翼を担っている可撓性が推測
された［例えば、Ｍ。

Ｒ，ＲｕｆｆとＧ、　Ｅ、　ＧｉｆｆｏｒｄｌＬｙｍｐ
ｈｏｋｉｎｅＶｏｌ、２．　ｅｄ、ｂｙ　Ｅ　、　Ｐ　
ｉｃｋ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ　。

Ｙ、　　２３５〜２７２（１９８１）　、Ｆ、　Ｃ，Ｋ
ｕｌｌ、Ｊｒ。

＆　　Ｐ、　Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ、　Ｃａｎｃｅｒ
　Ｒｅｓ、４１．４８８５〜４８９０　（１９８１）　
、原中勝征、メビオ、３巻２号２７〜３５頁（１９８６
）　、渡辺直樹ら、医学の歩み、１４２巻２号１０５〜
１０６　（１９８７）　、建水雅文、蛋白質核酸酵素、
３２巻５号３８６〜３９５頁（１９８７）　］。

ＩＩＩ胞内の種々の条件により、ライソゾームの膜が破
壊されると、内包の酸性氷解酵素および関連物質を細胞
質内に放出し、その構成物質（蛋白質。

脂質、多糖類等）は消化または異化作用を受け、８− その細胞は死に至る（細胞学体系３　小器官■、小川和
朗他編、朝倉書店、１９７３年、４２２〜４２４頁〉。

死細胞から遊離したライソゾーム由来酵素は、さらに他
の細胞にも破壊的作用を及ぼす。

方、腫瘍組織は周辺の正常器官と比較し、代謝が活発で
、ｐ口が酸性傾向（局所アシド−シス）にあることが知
られている。特に、グルコースは代、謝され、解糖系を
経て、乳酸を生成する。この乳酸は、局所アシド−シス
、の成因となる。

口０発明の構成［問題点を解決するための手段］そこで、本発明者らは、ＴＮＦと低毒性ＴＮＦ抗腫瘍作
用増強戒分成分組み合わせ、て成る悪性腫瘍治療剤の開
発が重要であるとの観点に立ち、局所アシド−シス促進
剤によって腫瘍細胞の酸性傾向を右進させることにより
、ＴＮＦの抗腫瘍作用を増強できると期待し、局所アシ
ド−シス促進剤について、ＴＮＦ抗腫瘍作用増強効果を
鋭意スクリーニングしたところ、局所アシド−シス促進
剤についてＴ　Ｎ　Ｆ抗腫瘍作用増強効果を認めるに至
　　− り、本発明を完成した。また特にすぐれたＴＮＦ抗腫瘍
作用増強効果を有するアシド−シス促進剤を特定したこ
とにより本発明を完成した。

すなわち本発明は、少なくとも、腫瘍壊死因子（Ａ成分
〉およびアシド−シス促進剤（Ｂ成分）とを有効活性成
分として含有する抗腫瘍性医薬組成物である。

また本発明は腫瘍壊死因子（へ成分）とアシド−シス促
進剤（Ｂ成分）とを混合して抗腫瘍性医薬組成物を製造
する方法をも包含する。

アシド−シス促進剤（Ｂ成分）としてグルコース及び／
又は乳酸が好適である。

本発明においてはへ成分及びＢ成分以外に溶媒。

添加剤等を含有してもよいことはいうまでもない。

本発明において、腫瘍壊死因子は、天然型、リコンビナ
ントＴＮＦを包含し、ＴＮＦと生理学的に同様な生理活
性を呈する改変蛋白質をも含む。

ＴＮＦは１５７コのアミノ酸よりなるポリペプチドであ
り、本発明においては、この改変体をも包含する。改変
の具体例として、ＴＮＦのＮ末のア１０ミノ酸を１〜１２コ程度欠失させたもの、Ｎ末から８〜
１０番目のＰ　ｒｏ８−３　ｅｒ９−八３ｐｌＯをＡｒ
ｃ＋Ｌ　ＶＳ−Ａ　ｒｇに置換したもの、Ｃ末のＡ　１
ａ／ｊｌＬｅｕ″を他のアミノ酸たとえばＴｒｐあるい
はＰｈｅ等に置換したものも包含する。あるいはこれら
の組み合せを包含する。

本発明の特異な点は、抗腫瘍剤であるＴＮＦ（Ａ成分）
と、元来それ単独では抗腫瘍効果を期待できないアシド
−シス促進剤を抗腫瘍効果増強成分（Ｂ成分）として組
み合わせることにより、著名な抗腫瘍効果の増強を実現
できることにある。

本悪性腫瘍治療剤を投与することにより、腫瘍サイズま
たは腫瘍細胞数を減少させ、担癌動物あるいは癌患者の
生存期間を延長する。本悪性腫瘍治療剤の治療効果は、
ＴＮＦの単独投与の時よりも大きく、ＴＮＦ抗腫瘍作用
増強成分（Ｂ成分）だけを投与した場合には治療効果は
ほとんどない。

本発明のＴＮＦ成分（Ａ成分）として、ｒＨｕＴＮＦ（
リコンビナントヒト−ＴＮＦ）を投与する場合には、公
知のように、単回投与における最　１　− 大安全耐容量は、５×１０″Ｕ／′ｒＩＬ（単位ボは担
腫瘍渇血動物の体表面積を示す二級下同様、ヒトの場合
的１．５尻／ｂｏｄｙ）であり、好ましくは１．５〜５
×１０５Ｕ／Ｔｄ、の範囲が用いられる［田口鐵男、セ
ラビューティック・リザーチ、７巻２号３２８〜３３５
頁（１９８７）　、漆崎−朗、セラビューティック・リ
ザーチ、７巻２号３３６〜３４２頁（１９８７）　］。

本発明のＴＮＦ抗腫瘍作用増強成分（Ｂ成分）グルコー
ス、乳酸の投与量については、生体が生理学的に許容し
得る範囲内の投与量を投与することができる。

本悪性腫瘍治療剤の投与量は、腫瘍発生部位。

組織像、周期、前治療履歴の内容によって変わるが、１
回当りの投与量は低量から開始し、例えば主として（Ａ
成分〉に起因する血圧低下、血小板減少、ＧＯＴ／ＧＰ
Ｔの一過性上昇、主として（Ｂ成分）に起因する、全身
性アシド−シス等、の有害な副作用を惹起することなく
、所望の腫瘍サイズまたは腫瘍細胞数の減少が達成され
るまで徐々に投与量を増加させるのが好ましい。投与ス
　２− ケジュールは毎日１〜３回程度から２〜１０回毎に１回
程度まで変わりうる。この投与量および投与スケジュー
ルは症状、患者の栄養状態、出血傾向。

血糖値、血清トリグリセリド値１年齢等を勘案して、生
体が生理学的に許容し得る範囲内、好ましくは次の範囲
内から決定される。

ＴＮ　Ｆ　：　１　ＸｌＯ４−５ｘ１０５Ｕ／ｍ／ｈｒ
。

本悪性腫瘍治療剤の好ましい投与経路は、溶液または懸
濁液の静脈性ｆＪＪ（点滴注射を含む）あるいは腫瘍内
投与である。

本発明の悪性腫瘍治療剤の剤型としては、例えば注射剤
などがあげられ、かかる注射剤としては、点滴注射剤、
静脈注射剤、動脈注射剤、皮下注射剤、皮肉注剖剤、筋
肉注射剤、腹腔内往側剤、腹腔内潅流剤、腫瘍内注射剤
、腫瘍内潅流剤などの剤型を包含し、注射剤以外の剤型
としては、肛門・直腸・結腸内座剤、膣・子宮内座剤、
舌下剤。

口腔内粘膜貼付剤、外用軟膏剤、皮膚貼付剤、鼻腔的粘
膜噴霧剤、咽喉・食道内粘膜噴霧剤、経口用錠剤、経口
用カプセル剤、経口用腸溶錠などの剤型を包含する。か
かる注射剤は自体公知の方法、すなわち、および元来そ
れ単独では抗腫瘍効果を期待できない抗腫瘍効果増強成
分群を構成する（Ｂ成分）と組み合わせたＴＮＦ（Ａ成
分〉を、通常注射剤に用いられる無菌の水性液に溶解あ
るは懸濁することによって調製される。

また、本発明の悪性腫瘍治療剤は、ＴＮＦ（Ａ成分）、
およびＴＮＦ抗腫瘍作用増強成分群を構成する（Ｂ成分
）は、粉末あるいは凍結乾燥体を同一もしくは別のバイ
アルあるいはアンプルに充填し、川崎、別に調製した注
射用水性液に懸濁または溶解して使用できる。注射剤の
水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖液、リンゲル液
やその他の補助薬を含む等張渡などがあげられる。

ハ３発明の効果本発明によれば、ＴＮＦの単独投与の時よりも、腫瘍の
ＴＮＦ感受性を増感し、腫瘍サイズまたは腫瘍細胞数を
減少させ、担癌動物あるいは癌患者の生存期間を延長す
ることを期待できる。

本発明にお（プる組成物、治療方法および抗腫瘍作用増
強方法は、腫瘍の治療または腫瘍の転移の予防に極めて
有用である。

二、実施例以下に本発明の実施の態様を諸実施例によって詳細に説
明するが、これらは本発明を限定するものではない。

〈実施例１〉ｒＨｕ−ＴＮＦの調製本発明に用いたｒＨｕ−ＴＮＦおよびその製造方法につ
いては、先に出願された特許（特開昭６２−２４８４９
８号：昭和６１年４月２１日出願：発明の名称゛新規生
理活性ポリペプチド″）に記載されている方法によって
得られたものを使用した。すなわち、ｒＨｕ−Ｔ　Ｎ　
Ｆ遺伝子発現ベクターを導入した大腸菌の培養を行ない
、ｒＨｕ−ＴＮＦ蛋白質の産生を促進した。集菌後大腸
菌を低温で超音波破砕し、得られた懸濁液より５ｈｉｒ
ａｉらの方法［Ｔ。

３ｈｉｒａｉ　ら、Ｎａｔｕｒｅ、　３１３．　８０３
〜８０６（１９８５）　］に従い、Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　　
Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ力ラムクロマトクう１５− ラフイーにより粗精製した。本粗精製製品中のｒト１　
ｕ−Ｔ　Ｎ　Ｆ含有率は、約３０％であった。

さらに、先に出願された特許（特願昭６２１６２２３３
号：昭和６２年７月　１日出願：発明の名称゛モノクロ
ナル抗体およびハイブリドーマ細胞″）に記載されてい
るｒ）ｌｕ−ＴＮＦに対するモノクロナル抗体を、公知
の方法により３　ｅｐｈａｒｏｓｅ４　Ｂに固定した抗
ｒＨｕ−ＴＮＦモノクロナル抗体固定化アフィニティー
カラムを作成し、粗精製ｒｌ−１ｕ−ＴＮ「の純度を上
げるべくさらに精製を行なった。

本精製品中のｒＨｕ−ＴＮＦ含有率は、約９５％以上で
あった。

ＴＮＦの抗腫瘍作用増強効果の検定ＴＮＦの細胞障害作用活性のバイオアッセイ測定方法と
しては、ｉｎ　　ｖｉｖｏで腫瘍壊死効果を測定する方
法と、ｉｎ　ＶｉｔｒＯで腫瘍細胞障害効果を測定する
方法がある。

ｉｎ　ＶｉｔｒＯ法による腫瘍細胞障害効果測定は、例
えば、Ｍ、Ｒ，Ｒｕｆｆら［Ｌ　ｙｍｐｈｏｋｉｎｅ　
ＲｅｐｏｒｔｓＶｏｌ、２．　ｅｄ、ｂｙ　Ｅ　、　Ｐ
　ｉｃｋ　、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

１６− Ｎ、　Ｙ、　　（１９８０）　］あるいは、Ｆ、　Ｃ，
Ｋｕｌｌ。

Ｊｒ、とＰ、　Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ［Ｊ、　　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、、　１２６゜１２７９〜１２８３　（１９
８１）　］の方法があげられる。

本発明者らが用いているｉｎ　ｖｉｔｒｏ法は、これら
を改良したものであり、ＴＮＦがＬ−９２９細胞（アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ＣＣＬＩ
　、　ＮＣＴＣｃｌｏｎｅ　９２９）の生育を阻害する
効果を評価するものである。すなわち、Ｌ　−９２９細
胞を５ｖ／ｖ％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、以下ＦＢＳ
と略称〉添加イーグルのミニマム・エツセンシャル培地
〈青水製薬、以下ＥＭＥＭと略称、その組成は、たとえ
ば、「組織培養」中井準之助他編集、朝食書店（１９６
７年）に記載されている〉に分散させ、９６穴組織培養
用マイクロマルチウェルプレート（ファルコン社）にエ
ツペンドルフピペット４７８０　（■ヤトロン）を用い
て無菌的に４×１０３個細胞／　１００／ウエルとなる
ように分注する。

マイクロマルチウェルプレートを、５％の炭酸ガスを含
む空気中、３７℃で２４時間予備培養する。予備培養後
、ダルベツコの燐酸緩衝液（青水製薬、以下ＰＢＳ　（
−）と略称）あるいはＴＮＦ抗腫瘍作用増強剤を含むＰ
ＢＳ　（−）で、投与後濃度が１０〜１０４Ｕ／ｌ１ｌ
ｅとなるように、１１段階に連続２倍希釈したＴＮＦを
、エツペンドルフビベット４７８０を用いて無菌的に、
１００μ旦／ウエルで投与する。

投与後、マイクロマルチウェルプレートを、５％の炭酸
ガスを含む空気中、３７℃で、さらに４８時間本培養す
る。本培養後、培養上清を廃棄し、各ウェルをＰＢＳ（
−）　　３００μＪｌｌ／ウエルで一回洗浄後、用崎に
調製した０、１％クリスタルバイオレット、１％メタノ
ール水溶液を１００μｆ／ウェル加え、２０分間、細胞
を固定・染色する。余分なりリスタルバイオレットを洗
い流し乾燥した後、細胞を染色しているクリスタルバイ
オレットを１００μＵ／ウエルの０．５％ドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液で抽出し、その５９５ｎｍ
における吸光度と４０５ｎｍにおける吸光度の差の三波
長吸光度をＥＬＩＳＡアナライザー・モデルＥ　Ｔ　Ｙ
　−９６（東洋測置■）で測定する。この吸光度は、生
き残った細胞数に比例する。ＴＮＦを加えない対照の吸
光度を１００％、細胞が存在しないブランクの吸光度を
０％とした細胞生育率を、吸光率から計算し、横軸：Ｔ
ＮＦ投与量／縦軸：細胞生育率曲線を作成する。ＴＮＦ
を加えない対照の細胞生育率の５０％の値に相当するＴ
ＮＦの濃度をこの曲線の回帰式から計算し、５０％効果
投与量（以下ＥＤＳＯ略称）とした。以下、本発明にお
けるＴＮＦのｉｎ　ｖｉｔｒ。

抗腫瘍作用増強効果は、ずべてこのＥＤ５０の比較で評
価する。

〈実施例２〉グルコースによるｒｌ−１ｕ−Ｔ　Ｎ　Ｆの抗腫瘍作用
増強４違グルコース（和光紬薬〉のＬ９２９細胞に対する細胞障
害作用を、上記のｒＨｕ−Ｔ　Ｎ　Ｆ　　ｉｎ　ｖｉｔ
ｒ。

アッセイ方法に準じて検定した結果、ＥＤｓｏは３１．
３ｍｇ／ｒｒｄｌ、細胞障害作用を示さない最高投与量
は１５．６ｍｇ／蔵であった。

グルコース投与濃度を１５ｍｇ／（ｄ一定で、ｒｌ−１
ｕＴＮＦ投与濃度を１０〜１ｏ４ｕ／ｙ　（１１段階に
連続　９− ２倍希釈）と変化させたときのＬ９２９細胞に対する細
胞障害作用の変化を、ｒｌ−１ｕ−Ｔ　Ｎ　Ｆ単独投与
の場合と比較して第１図に示した。

対照（ｒＨｕ−Ｔ　Ｎ　Ｆ単独投与）のＥＤｓｏは６０
０Ｕ／Ｉｎｆ！、であるのに対し、ｒＨｕ−ＴＮＦ／グ
ルコース併用投与の場合のＥＤ５０は１２０す／ｄであ
ったことか、グルコースは「９２９細胞のｒｌ−１ｕ−
Ｔ　Ｎ　Ｆに対する感受性を増感していることが明らか
である。

〈実施例３〉乳酸によるｒＨｕ−ＴＮＦの抗腫瘍作用増強４違乳Ｍ（
和光紬薬）のＬ９２９細胞に対する細胞障害作用を、〈
実施例１〉と同様に検定した結果、ＥＤ５０は３１３μ
ｇ／ｄ、細胞障害作用を示さない最高投与量は７８．１
μｇ／−であった。

乳酸投与濃度を７５μｇ／ｄ一定で、乳酸によるｒＨｕ
−ＴＮＦのＬ９２９細胞に対する抗腫瘍作用増強効果を
〈実施例１〉と同様に検定した結果を第２図に示した。

０対照（「口ｕ−Ｔ　Ｎ　Ｆ単独投与）（７）ＥＤｓｏは
１２０Ｕ／ｄであるのに対し、ｒＨｕ−ＴＮＦ／乳酸の
ＥＤｓｏは８０Ｕ／ｄであったことから、乳酸はし９２
９細胞のｒ口ｕ−ＴＮＦに対する感受性を増感している
ことが明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第２図は、横軸にＴＮＦＩ度を、縦軸にＬ９２
９細胞生育率を表わし、○印のプロットは対照（ＴＮＦ
単独投与）、・印のプロン１〜は併用投与を示す。ＴＮ
Ｆ投与量とＬ９２９細胞生育率との相関を示すグラフで
ある。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）少なくとも、腫瘍壊死因子（Ａ成分）およびアシ
ド−シス促進剤（Ｂ成分）とを有効活性成分として含有
する抗腫瘍性医薬組成物。
（２）アシド−シス促進剤がグルコース及び／又は乳酸
である請求項１記載の組成物。