CN101244258A - Tat-n25多肽在治疗银屑病等细胞生长异常皮肤病中的用途 - Google Patents

Tat-n25多肽在治疗银屑病等细胞生长异常皮肤病中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了TAT－N25多肽在治疗银屑病等与细胞生长异常相关皮肤病中的用途。该多肽药物组合物能够抑制上皮细胞增生，调节表皮增生及分化，使皮肤角化过程正常化；此外，还能抑制淋巴细胞分裂，减少炎症因子合成分泌，调节人体免疫功能。

Description

TAT-N25多肽在治疗银屑病等细胞生长异常皮肤病中的用途
技术领域
本发明涉及一种融合多肽在治疗银屑病等细胞生长异常皮肤病中的用途，属于医药生物工程领域。
背景技术
银屑病俗称“牛皮癣”，是皮肤科常见、多发的顽固性皮肤病之一。根据银屑病的临床和病理特征，一般可分为寻常型、关节炎型、脓疱型、掌跖脓疱病、红皮病型、及连续性肢端皮炎六种类型。因该病顽固难治，因此被列为当今世界皮肤科领域的重要研究课题。
银屑病病因不明，其主要病理特点是表皮细胞异常增殖及角化不全，具体病理特征主要表现为：1.表皮角质形成细胞过度增殖和分化不全；2.真皮浅层微血管扩张；3.炎症反应。
临床上以往多以白血宁、乙亚胺、乙双吗啉、环磷酰胺等细胞毒类抗癌药，地塞米松、强的松、倍他米松等激素类药物，免疫抑制剂以及表皮细胞分化促进剂维甲酸等药物治疗。因以上药物及其配制的各种制剂，只能作用于银屑病的单一病理变化并对机体肝、肾和免疫功能有严重损坏作用；部分患者用后虽有一定的短期效果，但停药后病情反跳加重恶化的毒副作用，已使不少患者深受其害。
治愈或全面改善银屑病病情的有效方法是很需要的。这种方法应该理想地控制表皮细胞异常增殖及角化不全并抑制在病患部位的炎症反应。本发明中叙述的融合多肽就满足了这一需要并具备上述优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种融合多肽，该融合多肽包括：抑制细胞生长、促进细胞分化的多肽和穿透细胞膜的多肽或分子，穿透细胞膜的多肽或分子将抑制细胞生长的多肽带入细胞中。经过实验证明了这一融合多肽具有抑制表皮细胞生长、促进表皮细胞分化的能力，此外，该融合多肽也能有效地抑制银屑病人的病理变化，并取得显著疗效。
融合多肽已在专利申请200710051286.6公开，融合多肽包括：抑制细胞生长、促进细胞分化的多肽和穿透细胞膜的多肽或分子，抑制细胞生长的多肽与穿透细胞膜的多肽或分子通过化学共价健连接，或抑制细胞生长的多肽与穿透细胞膜的多肽在细胞中表达成融合多肽。
融合多肽的抑制细胞生长的多肽与纯化融合多肽的标签蛋白连接。
抑制细胞生长促进细胞分化的多肽是由磷脂酰肌醇-3-激酶的调节亚基p55PIK中氨基端25个氨基酸残基组成的N-25多肽，其序列为：甲硫氨酸-天门冬氨酸-精氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-丙氨酸-天门冬氨酸-色氨酸-精氨酸-谷氨酸-缬氨酸-甲硫氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸(MDRDDADWREVMMPYSTELIFYIEM)，或是从该多肽氨基端连续或间断地缺失或取代1-12中任意数值个氨基酸残基得到的多肽之一，或是将所述多肽的序列经过一个或几个氨基酸残基的添加得到的具有抑制细胞生长活性的多肽之一。
穿透细胞膜的多肽是衍生于HIV病毒TAT蛋白的多肽，其序列为：酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-精氨酸-谷酰胺-精氨酸-精氨酸-精氨酸(YGRKKRRQRRR)。
TAT多肽在TAT-N25融合多肽中的作用为帮助N25多肽进入细胞，发挥N25的药效作用。除了TAT外，目前已知有其他多肽，比如来自×蛋白的TDT多肽，序列为×××××，也具有类似的帮助多肽穿透细胞膜的功能。其他分子如多聚赖氨酸，某些脂质体也能帮助N25或其他多肽穿透细胞膜。我们预计上述分子和N24通过共价或非共价结合组成新的化合物也应具有TAT-N25类似的药效。
用于纯化融合多肽的标签蛋白是寡聚组氨酸标签，其中组氨酸数目为5-10中的任意数值个。
抑制细胞生长的N25多肽与穿透细胞膜的TAT多肽或分子通过化学共价健连接成融合多肽(TAT-N25多肽)在治疗银屑病及其他皮肤细胞增生和分化异常导致的疾病中的用途。
治疗细胞生长异常相关皮肤病及银屑病的TAT-N25多肽药物，将TAT-N25多肽以及药学上可接受的药剂配制而成的多肽软膏。
TAT-N25多肽软膏，其特征在于：按重量百分比计：十八醇：3％；单硬脂酸甘油酯：6％；甘油：10％；液状石蜡：10％；白凡士林：3％；三乙醇胺：0.1％；十二烷基硫酸钠：0.2％；羟苯乙酯：0.1％；TAT-N25多肽：0.2％；水：60％；尿素：7.4％。
融合多肽药物应包括含有或应用该融合多肽以药学上可接受的药剂进行组合的内外用药物。
N25多肽也能和其他能帮助N25进入细胞膜的多肽或其他分子通过共价或非共价链接制成新的具有治疗细胞生长异常相关皮肤病及银屑病的药物。
融合多肽药物在治疗相关皮肤病：皮肤炎症、多基因遗传背景下细胞失常的免疫性疾病、表皮过度增殖与分化异常与细胞生长异常相关疾病比如银屑病中的用途以及通过不同方式应用该药物治疗这些疾病的途径。
TAT-N25多肽软膏治疗银屑病的机理为：
1.抑制上皮细胞增生；
2.促进上皮细胞分化；
3.抑制新生血管生成；
4.抑制淋巴细胞分裂，减少炎症因子合成分泌。
该多肽软膏的使用方法极其简便：将软膏均匀涂抹在患者皮肤上，每日3次，疗程为10天-1个月。
与现有技术相比，本发明具有治愈率高、安全副作用小等治疗优点，为银屑病患者提供了一种理想的药物。
具体实施方式
下面借助具体实验及其数据结果对本发明进行论证说明，但应该说明的是，这些实施例子并不对本发明加以限制。
TAT-N25多肽在下列实验中证明其治疗银屑病的有效性，包括但不限于下列实验：
实例1  TAT-N25多肽抑制角质细胞生长和DNA合成
用人角质细胞系HACAT细胞检测TAT-N25融合多肽对细胞生长的影响。HACAT细胞在含10％胎牛血清的细胞培养液(DMEM)，37℃，5％CO2/95％空气培养条件下培养于10厘米细胞培养皿，将细胞培养至对数生长期后，加入多肽至最终浓度为15微克/毫升，同时培养空白组和尿素组用以对照，培养24小时收取细胞，利用流式细胞仪分析这些细胞的细胞周期分布。TAT-N25多肽原液溶于6M尿素，6M尿素指的是每升水中含有6摩尔尿素，以下都简称为6M尿素。实验结果表明：在这一剂量下表达TAT-N25融合多肽对细胞凋亡没有明显影响，增加G0/G1期细胞数，其作用见下表1。
表1：TAT-N25对细胞周期的影响
  G0/G1   S   G2/M
  空白对照   65.8％   22.2％   12.0％
  6M尿素   61.1％   24.5％   14.3％
  TAT-N25   84.2％   7.6％   8.2％
DNA合成是细胞增殖的标志。下一个实验中，我们检测TAT-N25对细胞DNA合成的影响。因为BrdU为胸腺嘧啶类似物，在DNA合成的S期可掺入到DNA中，掺入到DNA的BrdU经过免疫染色后，利用流式细胞仪通过检测荧光强度的变化来分析DNA的合成情况，空白组和尿素组用以对照。结果显示：加入TAT-N25多肽后，肿瘤细胞中有DNA合成的S期的细胞数目变化不大，但平均BrdU的掺入量较空白组有明显减小，见表2，这说明融合多肽抑制了DNA的合成，减少了肿瘤细胞的增殖。
表2：TAT-N25抑制细胞DNA合成
  S期细胞数目   DNA的BrdU的平均掺入强度
  空白对照   24.9％   28.5
  6M尿素   27.1％   31.0
  TAT-N25   5.9％   24.0
实例2  TAT-N25多肽抑制小鼠阴道上皮细胞层增生
雌性小鼠预先注射雌激素如乙烯雌酚7天，使其处于雌激素生理周期。阴道给予0.2(wt)％的TAT-N25多肽软膏7天，末次给药后腹腔注射秋水仙碱以终止细胞分裂。取小鼠阴道组织，固定，染色，观察阴道上皮细胞的有丝分裂指数。0.2(wt)％TAT-N25多肽软膏为：按重量百分比计：十八醇：3％；单硬脂酸甘油酯：6％；甘油：10％；液状石蜡：10％；白凡士林：3％；三乙醇胺：0.1％；十二烷基硫酸钠：0.2％；羟苯乙酯：0.1％；TAT-N25多肽：0.2％；水：60％；尿素：7.4％。
试验结果如表3，表明TAT-N25多肽有效抑制阴道上皮细胞的有丝分裂。
表3：TAT-N25抑制阴道上皮细胞有丝分裂
  实验次数   分裂指数
  空白对照   3   16.14±2.16
  TAT-N25   4   7.60±2.03
实例3  TAT-N25多肽促进小鼠尾鳞片表皮细胞生成的影响试验取小鼠，将0.2(wt)％的TAT-N25多肽软膏直接在尾部外涂给药7天，每日3次，取尾根部皮肤，固定，染色，测量鼠尾表皮厚度和颗粒形成情况。试验结果如表4，表明TAT-N25多肽软膏有促进鼠尾颗粒层形成的作用。
表4：TAT-N25多肽促进鼠尾细胞颗粒层形成
  实验次数   鼠尾细胞颗粒层厚度
  空白对照   3   100％
  TAT-N25   4   225％
实例4  TAT-N25多肽抑制炎症因子分泌
含浓度为30微克/毫升TAT-N25多肽培养液1升孵育淋巴细胞2天，测定培养液中IL-1、6、8，TNF-α和IFN-γ的含量。
结果表明TAT-N25多肽抑制淋巴细胞分泌炎症因子。
实验5  TAT-N25多肽软膏治疗银屑病人实例
0.2(wt)％的TAT-N25多肽软膏涂抹于银屑病患者患处皮肤，每日3次，结果如表5，表明TAT-N25多肽治疗银屑病效果明显。
表5：TAT-N25多肽软膏治疗银屑病病人结果总结
  患者   性别   年龄   银屑病史   使用部位   使用时间   效果
  BL   女   52   32   胳膊   1个月   改善明显
  CQJ   男   60   40   腿部   10天   改善明显
  CF   女   48   30   鬓角   1个月   改善明显
  DAR   女   35   15   腿部   1个月   改善明显
  DG   男   43   20   胳膊   1个月   改善明显
  HL   女   48   30   腿部   1个月   改善明显
  FYB   男   50   31   鬓角   10天   改善明显
  WP   男   45   19   颈部   10天   改善明显
  YGF   女   38   17   鬓角   1个月   改善明显
  ZQQ   女   46   23   胳膊   1个月   改善明显

Claims (7)

1、TAT-N25多肽在治疗与细胞生长异常相关皮肤病中的用途。
2、TAT-N25多肽在治疗银屑病的用途。
3、TAT-N25多肽药物，其特征在于：应包括含有或应用TAT-N25多肽以及药学上可接受的药剂进行组合的治疗用药物。
4、治疗细胞生长异常相关皮肤病的TAT-N25多肽药物，其特征在于：将TAT-N25多肽以及药学上可接受的药剂配制而成的多肽软膏。
5、治疗银屑病的TAT-N25多肽药物，其特征在于：将TAT-N25多肽以及药学上可接受的药剂配制而成的多肽软膏。
6、根据权利要求4或5所述的TAT-N25多肽药物，其特征在于：按重量百分比计：十八醇：3％；单硬脂酸甘油酯：6％；甘油：10％；液状石蜡：10％；白凡士林：3％；三乙醇胺：0.1％；十二烷基硫酸钠：0.2％；羟苯乙酯：0.1％；TAT-N25多肽：0.2％；水：60％；尿素：7.4％。
7、N25多肽和其他能帮助N25进入细胞膜的多肽或其他分子通过共价或非共价链接制成新的具有治疗细胞生长异常相关皮肤病及银屑病的药物。
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