CN115887439A - 一种化合物在制备多囊卵巢综合征卵巢保护药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种化合物在制备多囊卵巢综合征卵巢保护药物中的应用，涉及生物医药技术领域。所述化合物的结构式包括：
本发明以Wistar野生型大鼠为实验对象，证明该化合物给药可显著改善大鼠卵巢发情周期、卵巢结构、性激素水平和糖代谢水平。以KGN颗粒细胞为实验对象，诱导构建体外多囊卵巢综合征的人卵巢颗粒细胞KGN模型，探究该化合物对颗粒细胞的效应，结果显示，该化合物给药可显著促进KGN增殖，抑制细胞凋亡。因此，该化合物可以发挥卵巢保护作用，可用于制备多囊卵巢综合征卵巢保护药物，疗效好，毒副作用低，前景价值可观。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种化合物在制备多囊卵巢综合征卵巢保护药物中的应用。
背景技术
多囊卵巢综合征(Polycystic ovarian syndrome，PCOS)是一种内分泌代谢疾病，影响15～20％的青春期、育龄期女性健康。PCOS主要特点是高雄激素血症，排卵障碍和多囊卵巢形态，常伴有肥胖、胰岛素抵抗、血脂异常等代谢综合征。表现为月经异常、多毛、痤疮、肥胖等症状，会导致排卵障碍，引起不孕、自然流产率升高等问题。研究发现，随着PCOS病程的发展，患者代谢、血管、生殖等功能会持续受到影响，进而导致肿瘤产生、情绪障碍等负面影响，严重影响PCOS患者生理和心理健康。
传统认为仅仅补充激素可以改善月经紊乱，但长期服用往往会带来较多的副作用。长期服用性激素，不仅打乱了体内内分泌失调，影响肝肾功能及人体新陈代谢。如临床常用的忧思悦，可引起不规则子宫出血，恶心，乳房触痛，头痛等副作用。临床医生建议连续服用3个月进行肝肾功能复查。除此之外，对于乳腺疾病伴PCOS的患者，外科医生建议停止服用激素类药物以减缓对乳腺的影响，因此，如何抉择取舍是患者的一大难题。研发一种新的多囊卵巢综合征卵巢保护药物，具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种化合物在制备多囊卵巢综合征卵巢保护药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明研究发现该化合物对多囊卵巢综合征的卵巢具有良好的保护作用，可以改善卵巢发情周期和糖代谢紊乱，抗凋亡效果显著，副作用小。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种化合物及其盐在制备多囊卵巢综合征卵巢保护药物中的应用，所述化合物的结构式为：
进一步地，所述结构式的化学式是C15H11O6+，分子量为287.25。
优选地，所述化合物的盐为盐酸盐。
进一步地，所述多囊卵巢综合征的卵巢损伤为卵巢病理性损伤，包括卵泡形态破坏。
本发明还提供一种多囊卵巢综合征卵巢保护药物，活性成分包括一种化合物或其盐，所述化合物的结构式为：
优选地，所述化合物的盐为盐酸盐。
进一步地，所述多囊卵巢综合征卵巢保护药物还包括药学上可接受的辅料。
进一步地，所述多囊卵巢综合征卵巢保护药物的剂型为颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂或注射剂。
本发明还提供一种化合物及其盐在制备提高Bcl2 mRNA表达的药物中的应用，所述化合物的结构式包括：
优选地，所述化合物的盐为盐酸盐。
本发明公开了以下技术效果：
本发明公开了一种化合物及其盐在制备PCOS卵巢保护药物中的用途。本发明分别进行动物和细胞实验，动物以Wistar野生型大鼠为实验对象，通过皮下注射DHEA模拟高雄诱导的PCOS模型，化合物A灌胃给药，从而显示其在PCOS卵巢保护方面的应用，结果显示，与不加药模型组相比，化合物A给药可显著改善大鼠卵巢发情周期，卵巢结构，性激素水平和糖代谢水平。细胞实验以KGN颗粒细胞为实验对象，通过双氢睾酮(Dihydrotestosterone，DHT)诱导构建体外PCOS的人卵巢颗粒细胞KGN模型，探究化合物A对颗粒细胞的效应，结果显示，与不加化合物A相比，化合物A给药可显著促进KGN增殖，抑制细胞凋亡。因此，化合物A可以发挥卵巢保护作用，用于制备PCOS卵巢保护药物，疗效好，毒副作用低，前景价值可观。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为化合物A对PCOS大鼠卵巢组织的影响；其中，A为化合物A的化学结构式；B-D分别为对照组、DHEA组和DHEA+化合物A组的大鼠卵巢组织的代表性图像(苏木精和伊红染色；B-D中，比例尺均为200μm，CL为黄体，CF为囊状卵泡；
图2为化合物A对PCOS大鼠发情周期的影响；其中A为对照组、DHEA组和DHEA+化合物A组的发情周期代表性图片，A中P表示发情前期(Proestrus)，E表示发情期(Estrus)，M表示发情后期(Metestrus)，D表示发情间期(Diestrus)；B为不同发情周期(发情前期，发情期，发情后期和发情间期)的H&E染色结果；比例尺均为200μm)；
图3为化合物A对PCOS大鼠性激素水平的影响(均数±SEM，n＝8)；其中，A-C分别为血清T、LH和FSH水平，****P<0.0001；D为LH与FSH的比值，*P<0.05；
图4为化合物A对PCOS大鼠IPGTT和IPITT的影响(平均±SEM，每组n＝8)；其中，A为大鼠腹腔注射胰岛素的实验结果；B为大鼠腹腔注射葡萄糖的实验结果；C为大鼠腹腔注射胰岛素实验的AUC曲线下面积统计图；D为大鼠腹腔注射葡萄糖实验的AUC曲线下面积统计图；E为大鼠体重；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，####P<0.0001；
图5为化合物A对DHT诱导KGN细胞增殖和凋亡的影响；其中，A-B分别为24h和48h化合物A抑制DHT的作用；C为Western Bolt检测化合物A对凋亡蛋白Bax/Bcl2的影响；D为qPCR检测化合物A对BCL2 mRNA水平的影响；E为qPCR检测化合物A对BAX mRNA水平的影响；F为Western Bolt的定量分析结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中使用的化合物A的结构式如图1中A所示。
实施例1
一、方法
1.1动物实验
(1)动物饲养：雌性Wistar大鼠24只，购自北京维盛河实验动物科技有限公司。所有大鼠均在武汉大学人民医院进行特异性无病原培养(SPF)。将24只雌性Wistar大鼠分为3组(每组n＝8)：对照组(Control)、DHEA(即脱氢表雄酮)组和DHEA+化合物A组。
(2)给药方式：
对照组大鼠每日给予蒸馏水；DHEA组大鼠每日皮下注射含6mg/100g DHEA的甘油0.2mL，诱导PCOS状态；DHEA+化合物A组大鼠每日皮下注射含6mg/100gDHEA的0.2mL甘油，并每日口服化合物A 50mg/kg。各组持续时间21d。
1.2细胞实验
(1)细胞培养：KGN细胞(购自厦门逸漠生物有限公司)在添加10wt％胎牛血清和1wt％青霉素-链霉素的DMEM/F-12培养基中培养，在含5％CO2的37℃恒温箱中培养；
(2)细胞造模：将双氢睾酮500nM作用于KGN细胞，测定24h和48h的细胞增殖率来确定为PCOS细胞模型。
(3)给药：将浓度为100μM的化合物A作用于DHT处理的KGN细胞中，检测细胞在24h和48h的活力值。
二、结果
2.1动物实验
(1)对大鼠卵巢组织的HE检测
21d后，分别留取各实验组卵巢组织于甲醛组织固定液中，行石蜡包埋，切片，HE染色。结果如图1中B-D所示，对照组在显微镜下观察到不同阶段的多个黄体和卵泡，少见囊性扩张卵泡。DHEA组卵巢多囊样改变，卵泡囊性扩张，与对照组相比，卵泡中黄体和颗粒细胞层数量明显减少。化合物A治疗可有效改善上述病理改变，与DHEA组比较，卵巢囊性扩张卵泡数量减少，黄体数量增加，卵巢颗粒细胞层增厚(图1中B-D)。
在PCOS中，卵巢结构发生病理性改变，卵巢内见囊状扩张卵泡并呈现多囊样病理改变，锁闭卵泡多发，潴留囊肿明显，颗粒细胞减少，卵泡膜细胞增多。实验表明，化合物A减轻了DHEA诱导的大鼠卵巢病理性损伤，改善了卵巢形态，由此提供了化合物A在制备卵巢保护性药物中的用途。
(2)对大鼠发情周期的检测
从给药开始，连续12天对各实验组进行大鼠阴道涂片，HE染色分辨大鼠发情周期。DHEA组大鼠失去了正常的发情周期，大部分大鼠停留在发情期，白细胞大量增多。对照组发情周期规律。化合物A治疗可缩短延长的发情周期，纠正不规则的发情周期，提示化合物A对PCOS大鼠的发情周期具有调节作用(图2中A和B)。
正常大鼠的发情周期包括四个连续的周期，发情前期(P)、发情期(E)、发情后期(M)和发情间期(D)，由三种类型的阴道上皮细胞(角质形成细胞、核细胞和白细胞)比例决定。
(3)对大鼠激素水平的检测
各实验组大鼠，处死当日(第21d)最后一次给药后24h，采集心脏血，采集血清测定T/LH/FSH。采用ELISA试剂盒分别大鼠血清T、LH、LH及FSH水平进行检测，结果见图3。发现与对照组比较，DHEA组血清中T、LH及LH/FSH水平显著升高(P<0.001)，FSH水平差异无统计学意义(P>0.05)。与DHEA组相比，DHEA+化合物A组大鼠血清T、LH及LH/FSH水平显著降低(P<0.05)，而血清FSH水平无统计学差异(图3中A和B，P>0.05)。
高雄激素血症和LH分泌过多是PCOS病理生理的重要特征，激素测定结果说明本研究成功构建了PCOS模型。化合物A治疗可显著降低PCOS大鼠血清T、LH和LH/FSH水平，提示化合物A可提高PCOS大鼠生殖激素水平。这些结果表明，化合物A可能对PCOS女性生殖内分泌紊乱有矫正作用。
(4)对糖代谢水平的影响
给药21d后，采用葡萄糖计对各实验组大鼠进行IPGTT和IPITT试验，结果见图4。结果显示，腹腔注射胰岛素30min后，DHEA组血糖水平显著高于对照组，而DHEA+化合物A组从0min起血糖水平显著低于DHEA组。血糖值变化趋势与对照组相似(图4中A，P<0.05)。DHEA组IPITT的AUC显著高于对照组(P<0.01)，而DHEA+化合物A组的AUC显著低于DHEA组(图4中B，P<0.001)。另外，腹腔内注射葡萄糖后，三组患者的变化趋势均无统计学意义，AUC结果相同(图4中C和D)。有可能是葡萄糖剂量不足或诱导的大鼠没有糖耐量受损。
2.2细胞实验
对DHT化的KGN细胞增殖和凋亡检测：
采用CCK8检测24h和48h化合物A对KGN细胞增殖的影响，结果见图5。结果提示，500nM DHT可显著抑制细胞增殖水平(图5中A，P<0.001)，100μM化合物A可以逆转DHT对细胞的抑制作用，促进细胞增殖(图5中B，P<0.001)。采用Western Blot和qPCR检测对凋亡蛋白的影响，结果提示，DHT可以抑制Bcl2/Bax比例，促进凋亡，而化合物A可提高Bcl2 mRNA和蛋白表达水平，提高Bcl2/Bax比例，抑制细胞凋亡。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种化合物及其盐在制备多囊卵巢综合征卵巢保护药物中的应用，其特征在于，所述化合物的结构式为：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述化合物盐为盐酸盐。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述多囊卵巢综合征的卵巢损伤为卵巢病理性损伤，包括卵泡形态破坏。
4.一种多囊卵巢综合征卵巢保护药物，其特征在于，活性成分包括一种化合物或其盐，所述化合物的结构式为：
5.根据权利要求4所述的多囊卵巢综合征卵巢保护药物，其特征在于，所述化合物的盐为盐酸盐。
6.根据权利要求1或2所述的多囊卵巢综合征卵巢保护药物，其特征在于，所述多囊卵巢综合征卵巢保护药物还包括药学上可接受的辅料。
7.根据权利要求6所述的多囊卵巢综合征卵巢保护药物，其特征在于，所述多囊卵巢综合征卵巢保护药物的剂型为颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂或注射剂。
8.一种化合物及其盐在制备提高Bcl2 mRNA表达的药物中的应用，其特征在于，所述化合物的结构式为：
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述化合物的盐为盐酸盐。
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