CN101671397A - 抗EGFR单链抗体融合Gelonin重组免疫毒素及其制备方法与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗EGFR单链抗体融合Gelonin的重组免疫毒素及其制备方法与用途。要解决的技术问题是提供一种以表皮生长因子受体为靶点的重组免疫毒素。该重组免疫毒素是由EGFR的单链抗体与毒素蛋白Gelonin融合表达而成。该技术方案利用单链抗体对EGFR高表达肿瘤的靶向性和Gelonin的细胞毒作用对肿瘤起到特异的杀伤作用，效果明显，且制备简单方便，有很好的应用前景，为肿瘤的治疗提供了一种新的选择。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗EGFR单链抗体融合Gelonin重组免疫毒素及其制备方法与用途。
背景技术
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)家族是跨膜的受体型酪氨酸激酶中最具有代表性的分子之一，在细胞生长、增殖和分化的过程中具有重要作用。研究表明，在乳腺癌、大肠癌、肺癌、头颈部鳞癌和胰腺癌等多种上皮细胞来源的肿瘤中存在EGFR基因的异常活化、扩增以及过度表达。EGFR在肿瘤中的高度表达及其在肿瘤细胞生长、分化中起着重要作用的这些特点，使EGFR成为具有良好前景的肿瘤治疗的靶点。
毒素蛋白Gelonin(Gel)是来源于大戟科植物Gelonium.multiflorum种子中的一种细胞毒蛋白。Gelonin属于单链核糖体失活蛋白，具有RNA特异性的N-糖苷酶活性，可抑制蛋白质的生物合成，导致细胞死亡。此外，Gelonin也具有类DNase活性和糖基化酶活性，可降解细胞核DNA。由于Gelonin缺少双链核糖体失活蛋白的B链，不具有双链核糖体失活蛋白的所有活性，对完整真核细胞的毒性相对很低。
目前还没有使用毒素蛋白Gelonin靶向表皮生长因子受体这一靶点的重组免疫毒素肿瘤治疗技术方案报道。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种以表皮生长因子受体为主要靶点的重组免疫毒素。该重组免疫毒素是由EGFR的单链抗体与毒素蛋白Gelonin融合表达而成。
优选的，上述重组免疫毒素具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列：
EVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSSYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSKKTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQFSSLTSEDSAVYYCARYYYRNDDYGMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMSQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVVTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGCSYPYTFGGGTKLEIKGSGGGGSGGGGSGLDTVSFSTKGATYITYVNFLNELRVKLKPEGNSHGIPLLRKKCDDPGKCFVLVALSNDNGQLAEIAIDVTSVYVVGYQVRNRSYFFKDAPDAAYEGLFKNTIKTRLHFGGSYPSLEGEKAYRETTDLGIEPLRIGIKKLDENAIDNYKPTEIASSLLVVIQMVSEAARFTFIENQIRNNFQQRIRPANNTISLENKWGKLSFQIRTSGANGMFSEAVELERANGKKYYVTAVDQVKPKIALLKFVDKDPK
本发明要解决的第二个技术问题是提供了编码上述重组免疫毒素的基因。其中，编码上述重组免疫毒素的基因为SEQ ID NO.1所示
本发明要解决的第三个技术问题是提供了含有上述基因的载体。
本发明要解决的第四个技术问题是提供了含有上述载体的宿主细胞。
本发明要解决的第五个技术问题是提供了上述重组免疫毒素、基因、载体或宿主细胞在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤辅助药物中的用途。
本发明要解决的第六个技术问题是提供了一种抗肿瘤药物或抗肿瘤辅助药物，是由上述的重组免疫毒素、基因、载体或宿主细胞添加药学上可接受的辅助性成分制备而成。
本发明创造性地将抗EGFR的单链抗体和gelonin融合表达，构成一种新型的重组毒素，利用单链抗体对肿瘤的靶向性和Gelonin的细胞毒作用对肿瘤起到特异的杀伤作用，效果明显，且毒副作用小，制备简单方便，有很好有的应用前景，为肿瘤的治疗提供了一种新的选择。
附图说明
图1为从杂交瘤细胞中提取总的RNA。
图2 Anti-EGFR的单链抗体的重、轻链(VH、VL)基因以及单链抗体SCFV(Single-chain variable fragment)基因，729bp。
图3 Anti-EGFR的单链抗体进行核糖体展示筛选后RT-PCR电泳图：856bp为目标产物，阴性对照不能扩增出单链抗体。
图4流式细胞仪检测Anti-EGFR单链抗体的亲和力。
图5用免疫印迹方法鉴定蛋白的免疫原性，55KD处为SCFV(Anti-EGFR)/Gelonin。
图6用流式细胞术鉴定SCFV(Anti-EGFR)/Gelonin对EGFR阳性细胞株的靶向性。
图7用免疫荧光鉴定SCFV(Anti-EGFR)/Gelonin对EGFR阳性细胞株的靶向性。
图8用细胞杀伤毒试验鉴定SCFV(Anti-EGFR)/Gelonin对EGFR阳性细胞株的毒性。
具体实施方式
以下结合具体实施方式详细说明但不限制本发明。
实施例一 本发明融合毒素的制备
从已知的抗EGFR杂交瘤中扩增抗体的重链和轻链可变区，构建抗EGFR的单链抗体，利用核糖体展示技术对其进行特异性鉴定和亲和力进化。将Gelonin与得到的单链抗体基因构建融合基因，然后进行大肠杆菌表达。
具体为：从抗EGFR杂交瘤细胞(本实验室保存)中提取总RNA，然后根据设计的建库及特异性引物用RT-PCR方法扩增Anti-EGFR的重、轻链(VH、VL)基因，选取扩增效果好的条带进行胶回收，插入T载体。连接产物转化DH5a，大量挑取单菌落，提质粒，送测序。测序结果利用Jellyfish软件分析，选择能正确翻译序列的再通过VBASE2和GeneBank进行序列对比。然后使用核糖体展示技术对其进行特异性鉴定和亲和力进化。得到高亲和力的抗EGFR的单链抗体的编码基因。然后将Gelonin的编码基因和与抗EGFR的单链抗体的编码基因连接得到融合毒素基因序列，用载体及宿主菌表达融合蛋白。
(1)单链抗体的构建和亲和力进化：
从能够产生抗人EGFR单克隆抗体的杂交瘤细胞(本实验室保存)中提取总RNA(参见图1)(Trizol试剂提取法，invitrogen公司)，并且合成cDNA第一链(使用SuperScript？III RTS First-Strand cDNA Synthesis Kit，Invitrogen公司)然后根据扩增人IgG重链和轻链的特异性引物利用聚合酶链反应扩增(polymerase chain reaction，PCR)方法扩增Anti-EGFR抗体的重轻链(VH和VL)基因(见图2)，对PCR产物进行胶回收，连接至T载体(Promega pGEM-T Vector)上。连接产物转化DH5a菌株，挑取多个单菌落，提质粒，送测序。测序结果利用Jellyfish软件分析，选择能正确翻译序列的再通过VBASE2(人免疫球蛋白可变区序列库)和GeneBank进行序列对比。构建成单链抗体后，使用核糖体展示技术对其进行特异性鉴定和亲和力进化(见图3)。利用流式细胞术进行亲和力鉴定，得到高亲和力的抗EGFR的单链抗体的编码基因(见图4)。
(2)工程菌的构建：
人工合成Gelonin编码核苷酸，插入在PET32a(+)载体的BamHI和HindIII位点之间。设计一对PCR引物，在单链抗体的5’端引入NdeI位点，3’端引入BamHI位点，用Taq DNA聚合酶(Pyrobest，购自TaKaRa公司)对上述得到的单链抗体进行聚合酶链反应扩增(polymerasechain reaction，PCR)，PCR产物经限制性内切酶NdeI和BamHI(Invitrogen公司)酶切后，克隆到含有Gelonin的PET32a(+)载体的NdeI和BamHI位点之间。构建重组质粒，重组质粒进行DNA序列测定(上海英骏生物技术有限公司)确认。将构建正确的质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，从而获得重组基因SCFV(Anti-EGFR)/Gelonin的表达工程菌。
(2)SCFV(Anti-EGFR)/Gelonin的表达及表达形式的确定：
挑选SCFV(Anti-EGFR)/Gelonin的单克隆工程菌于LB培养基(含氨卞青霉素(Amp))，37℃培养至OD600约为0.6-1.0时，添加异丙基-β-D硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG)至终浓度1mM诱导表达，SDS-PAGE检测并分析重组蛋白表达量。收集诱导后的菌液离心，沉淀重悬于破菌缓冲液(50mM Tris·Cl，500mMNaCl，pH8.0)，高压破菌，离心，收集上清和沉淀，SDS-PAGE检测出重组蛋白的表达形式为包涵体。
(3)用洗涤液(3M盐酸胍，50mM Tris·Cl，500mMNaCl，pH8.0)洗涤沉淀2次，再溶于变性液(7M盐酸胍，50mM Tris·Cl，500mMNaCl，780uL/Lβ-巯基乙醇pH8.0)中，4℃过夜后离心，取上清复性。将复性后的蛋白经疏水层析纯化，得到SCFV(Anti-EGFR)/Gelonin，具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
ScFv(Anti-EGFR)/rGel核酸序列(SEQ ID NO1)：
GAGGTTCAGCTTCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTACTGGCTACACATTCAGTAGTTACTGGATAGAGTGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTTACCGGGAAGTAAAAAAACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACATTCACTGCAGATACATCCTCCAACACAGCCTACATGCAATTTAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCAAGATATTACTATAGGAACGACGACTATGGTATGGACTACTGGGGTCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGACATTGTGATGTCACAGTCTCCCAAATCCATGTCCATGTCAGTAGGGGAGAGGGTCACCTTGACCTGCAAGGCCAGTGAGAATGTGGTTACTTATGTTTCCTGGTATCAACAGAAACCAGAGCAATCTCCTAAACTGCTGATATACGGGGCATCCAACCGGTACACTGGGGTCCCCGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGCAACAGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTTGCAGATTATCACTGTGGACAGGGTTGCAGCTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAAGGATCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCCTGGACACCGTGAGCTTTAGCACTAAAGGTGCCACTTATATTACCTACGTGAATTTCTTGAATGAGCTGCGTGTTAAATTGAAACCGGAAGGTAACAGCCATGGAATCCCATTGCTGCGCAAAAAATGTGATGATCCTGGAAAGTGTTTCGTTTTGGTAGCGCTTTCAAATGACAATGGACAGTTGGCGGAAATTGCTATTGATGTTACAAGTGTTTATGTGGTGGGCTATCAAGTACGTAACCGTTCTTACTTCTTTAAAGATGCTCCAGATGCTGCTTACGAAGGCCTCTTCAAAAACACAATTAAAACACGTCTTCATTTTGGCGGCAGCTATCCGTCGCTGGAAGGTGAGAAGGCATATCGTGAGACAACAGACTTGGGCATTGAACCATTACGTATTGGCATCAAGAAACTTGATGAAAATGCGATTGACAATTATAAACCAACGGAGATTGCTAGTTCTCTGTTGGTTGTTATTCAAATGGTGTCTGAAGCAGCTCGTTTCACCTTTATTGAGAACCAAATTCGTAATAACTTTCAACAGCGTATTCGCCCGGCGAATAATACAATCAGCCTTGAGAATAAATGGGGTAAACTCTCGTTCCAGATCCGTACATCAGGTGCAAATGGAATGTTTTCGGAGGCAGTTGAATTGGAACGTGCAAATGGCAAAAAATACTATGTCACCGCAGTTGATCAAGTAAAACCGAAAATTGCACTCTTGAAGTTCGTCGATAAAGATCCTAAATAA
其表达的ScFv(Anti-EGFR)/rGel蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO2：
EVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSSYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSKKTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQFSSLTSEDSAVYYCARYYYRNDDYGMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMSQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVVTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGCSYPYTFGGGTKLEIKGSGGGGSGGGGSGLDTVSFSTKGATYITYVNFLNELRVKLKPEGNSHGIPLLRKKCDDPGKCFVLVALSNDNGQLAEIAIDVTSVYVVGYQVRNRSYFFKDAPDAAYEGLFKNTIKTRLHFGGSYPSLEGEKAYRETTDLGIEPLRIGIKKLDENAIDNYKPTEIASSLLVVIQMVSEAARFTFIENQIRNNFQQRIRPANNTISLENKWGKLSFQIRTSGANGMFSEAVELERANGKKYYVTAVDQVKPKIALLKFVDKDPK
该重组免疫毒素具有506个氨基酸残基，其中第1到第243aa为EGFR单链抗体段ScFv(Anti-EGFR)，第244到第255aa为连接段，第256到第506aa为Gelonin段。
以下对ScFv(Anti-EGFR)/rGel融合毒素蛋白进行鉴定及功能验证实验。
试验例一ScFv(Anti-EGFR)/rGel的鉴定
(1)对制备的SCFV(Anti-EGFR)/Gelonin进行免疫原性的检测：通过免疫印迹法(Anti-Gelonin Antibody，按常规方法自制)，用Anti-rGel抗体进行Western Blot检测ScFv(Anti-EGFR)/rGel表明融合蛋白正确表达。
将复性纯化的ScFv(Anti-EGFR)/rGel利用Western Blot的方法进行免疫原性的鉴定，一抗为自制的抗重组Gelonin血清，二抗为辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗：样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，取出凝胶，切去凝胶边缘，浸于转移缓冲液中30分钟，用半干胶转仪进行转移：在电极板上依次放上湿滤纸3张、硝酸纤维膜1张、电泳凝胶、湿滤纸3张，盖上电极板，按80V恒电压转移40分钟。封闭：取硝酸纤维膜，浸入10％小牛血清的TTBS缓冲液封闭60分钟。弃去液体。加一抗体：加入10ml TTBS缓冲液，一抗体2μl，室温1小时。加二抗体：硝酸纤维膜用TTBS缓冲液浸洗3次，每次8分钟。弃去液体，更换10ml TTBS缓冲液，加入二抗体1μl，室温放置60分钟。显色：硝酸纤维膜用TTBS缓冲液浸洗3次，每次8分钟。弃去液体，加入底物缓冲液室温显色，显色程度适量时水洗终止反应。结果见图5：样品呈阳性结果，具有正确的免疫原性。
(2)ScFv(Anti-EGFR)/rGel的靶向性和毒性：通过对人肺癌细胞株A549进行免疫荧光、流式细胞术，检测ScFv(Anti-EGFR)/rGel的靶向性，通过细胞杀伤实验检测ScFv(Anti-EGFR)/rGel的毒性。其结果显示，本室制备的SCFV(Anti-EGFR)/Gelonin相对于Gelonin，能够特异地靶向A549细胞株，其对肿瘤细胞的杀伤性比Gelonin有明显地提高。
免疫荧光检测靶向性：胰酶消化A549细胞，离心收集后用培养基将其重悬，定量至5～10×104cells/ml；.取预处理的盖玻片在酒精灯火焰上灼烧数秒，将其置于6孔板中，吸取1ml上述细胞悬液加至6孔板中，并补1ml培养基，轻轻摇晃，使细胞均匀平铺在板内盖玻片上，37℃，5％CO2培养箱中培养过夜；取出6孔板，用PBS洗涤细胞3次；用PBS将SCFV(anti-EGFR)/Gelonin稀释至5μg/ml，同时rGel按与SCFV(anti-EGFR)/Gelonin等摩尔量稀释，向6孔板盖玻片分别加200μl稀释后蛋白，并设置空白对照(只加PBS)；37℃孵育5min，PBS洗涤细胞3次；用PBS按1∶200比例稀释兔抗Gelonin血清，向6孔板盖玻片上各加200μl稀释后血清；37℃孵育5min，PBS(含Ca Mg)洗涤细胞3次；避光条件下用PBS按1∶200比例稀释FITC标记羊抗兔IgG二抗(中杉金桥)，向6孔板盖玻片上各加50μl稀释后二抗；37℃孵育5min，PBS洗涤细胞3次；避光条件下用PBS按1∶3000比例稀释DAPI染液，向6孔板盖玻片上各加50μl稀释后染液；37℃孵育5min，PBS洗涤细胞3次；取出盖玻片，反向放于滴有数滴PBS载玻片上，置于湿盒使细胞保持形态，荧光显微镜下镜检。免疫荧光结果显示(见图6)：相比重组Gelonin，ScFv(Anti-EGFR)/rGel对EGFR高表达细胞株A549表现出明显的膜阳性，说明单独的Gelonin没有靶向性，在与靶向EGFR的单链抗体融合成免疫毒素以后，具有了A549人肺癌细胞的靶向性。
流式细胞术检测靶向性结果：(a)收集对数生长期细胞，用PBS溶液清洗两次1500rpm，3min，分装入四个1.5mlEP管，每管细胞数量106左右。(b)1500rpm，3min，离心弃上清。1号空白管，4号管加入300ul PBS，室温放置。将rGel，EG分别稀释成等摩尔(100umol/L)溶液加入2号，3号管，200ul/管，重悬，室温放置1h。(c)2号，3号管PBS洗一次，2000rpm，3min，离心，弃上清。4号管离心，弃上清。(d)2号，3号，4号管分别加入兔抗血清(1∶200稀释)100ul，重悬，室温放置1h。(e)2号，3号，4号管PBS洗两次，2000rpm，3min，离心，弃上清。(f)2号，3号，4号管分别加入羊抗兔IgG-FITC(1∶100稀释)50ul，重悬，室温放置30min。(g)2号，3号，4号管PBS洗两次后300ul PBS重悬，与1号管一同上机检测。流式细胞术结果见图7，结果显示：ScFv(Anti-EGFR)/rGel具有明显的细胞膜靶向性，而rGel不具有靶向性。
细胞杀伤毒性检测结果：收集对数生长期A549细胞，制成单细胞悬液后调节细胞密度，以2×103/孔接种于96孔板，贴壁过夜以后，换为加入ScFv(Anti-EGFR)/rGel的新鲜培养基，每孔100ul，以等摩尔数的rGel为阴性对照，每组设立3个平行孔，培养72小时后，加入20μl的MTT孵育3-4h，加入10％SDS 100μl过夜，酶标仪测定570nm波长吸光度A值。结果见图8，表明其对肿瘤细胞的杀伤性比Gelonin有明显地提高。
SEQUENCE LISTING
<110>四川大学
<120>抗EGFR单链抗体与Gelonin重组的免疫毒素及其制备方法与用途
<130>A090343k
<150>200810304811.5
<151>2008-10-09
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<170>PatentIn version 3.4
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gaggttcagc ttcagcagtc tggagctgag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagata 60
tcctgcaagg ctactggcta cacattcagt agttactgga tagagtgggt aaagcagagg 120
cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttaccgg gaagtaaaaa aactaactac 180
aatgagaagt tcaagggaaa ggccacattc actgcagata catcctccaa cacagcctac 240
atgcaattta gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtgc aagatattac 300
tataggaacg acgactatgg tatggactac tggggtcaag ggaccacggt caccgtctcc 360
tcaggtggcg gtggctcggg cggtggtggg tcgggtggcg gcggatctga cattgtgatg 420
tcacagtctc ccaaatccat gtccatgtca gtaggggaga gggtcacctt gacctgcaag 480
gccagtgaga atgtggttac ttatgtttcc tggtatcaac agaaaccaga gcaatctcct 540
aaactgctga tatacggggc atccaaccgg tacactgggg tccccgatcg cttcacaggc 600
agtggatctg caacagattt cactctgacc atcagcagtg tgcaggctga agaccttgca 660
gattatcact gtggacaggg ttgcagctat ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg 720
gaaataaaag gatccggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcct ggacaccgtg 780
agctttagca ctaaaggtgc cacttatatt acctacgtga atttcttgaa tgagctgcgt 840
gttaaattga aaccggaagg taacagccat ggaatcccat tgctgcgcaa aaaatgtgat 900
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Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Lys Lys Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Tyr Arg Asn Asp Asp Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro
130 135 140
Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys
145 150 155 160
Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
180 185 190
Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys
210 215 220
Gly Gln Gly Cys Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Ile Lys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
245 250 255
Leu Asp Thr Val Ser Phe Ser Thr Lys Gly Ala Thr Tyr Ile Thr Tyr
260 265 270
Val Asn Phe Leu Asn Glu Leu Arg Val Lys Leu Lys Pro Glu Gly Asn
275 280 285
Ser His Gly Ile Pro Leu Leu Arg Lys Lys Cys Asp Asp Pro Gly Lys
290 295 300
Cys Phe Val Leu Val Ala Leu Ser Asn Asp Asn Gly Gln Leu Ala Glu
305 310 315 320
Ile Ala Ile Asp Val Thr Ser Val Tyr Val Val Gly Tyr Gln Val Arg
325 330 335
Asn Arg Ser Tyr Phe Phe Lys Asp Ala Pro Asp Ala Ala Tyr Glu Gly
340 345 350
Leu Phe Lys Asn Thr Ile Lys Thr Arg Leu His Phe Gly Gly Ser Tyr
355 360 365
Pro Ser Leu Glu Gly Glu Lys Ala Tyr Arg Glu Thr Thr Asp Leu Gly
370 375 380
Ile Glu Pro Leu Arg Ile Gly Ile Lys Lys Leu Asp Glu Asn Ala Ile
385 390 395 400
Asp Asn Tyr Lys Pro Thr Glu Ile Ala Ser Ser Leu Leu Val Val Ile
405 410 415
Gln Met Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe Thr Phe Ile Glu Asn Gln Ile
420 425 430
Arg Asn Asn Phe Gln Gln Arg Ile Arg Pro Ala Asn Asn Thr Ile Ser
435 440 445
Leu Glu Asn Lys Trp Gly Lys Leu Ser Phe Gln Ile Arg Thr Ser Gly
450 455 460
Ala Asn Gly Met Phe Ser Glu Ala Val Glu Leu Glu Arg Ala Asn Gly
465 470 475 480
Lys Lys Tyr Tyr Val Thr Ala Val Asp Gln Val Lys Pro Lys Ile Ala
485 490 495
Leu Leu Lys Phe Val Asp Lys Asp Pro Lys
500 505
Claims (7)
1.重组免疫毒素，其特征在于由EGFR的单链抗体与毒素蛋白Gelonin融合表达而成。
2.根据权利要求1所述的重组免疫毒素，其特征在于具有SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列。
3.编码权利要求1或2所述的重组免疫毒素的基因。
4.含有权利要求3所述的基因的载体。
5.含有权利要求4所述的载体的宿主细胞。
6.权利要求1或2所述的重组免疫毒素、权利要求3所述的基因、权利要求4所述的载体或权利要求5所述的宿主细胞在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤辅助药物中的用途。
7.抗肿瘤药物或抗肿瘤辅助药物，是由权利要求1或2所述的重组免疫毒素、权利要求3所述的基因、权利要求4所述的载体或权利要求5所述的宿主细胞添加药学上可接受的辅助性成分制备而成。
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