ES2939632A1 - Terapia génica con genes IdrB y HokD para el tratamiento del cáncer - Google Patents

Abstract

Terapia génica con genes idrB y HokD para el tratamiento del cáncer. La invención descrita está relacionada con los polinucleótidos de ARN o ADN IdrB y HokD aislados para uso en medicina, particularmente en terapia génica para el tratamiento del cáncer. También describe composiciones que comprenden dicho polinucleótido o construcciones genéticas relacionadas y un método de tratamiento de trastornos proliferativos, preferiblemente cáncer.

Description

DESCRIPCIÓN

Terapia génica con genes IdrB y HokD para el tratamiento del cáncer

CAMPO TÉCNICO

La presente invención pertenece al campo de la terapia génica. Más concretamente, describe el uso de las toxinas hokD y ldrB, con aplicación en el campo de la terapia génica y especialmente en el tratamiento del cáncer.

ESTADO DE LA TÉCNICA

El cáncer es una de las principales causas de muerte a nivel mundial, solo superada por algunas enfermedades cardiovasculares [1]. Además, se estima que los casos y muertes por cáncer crecerán exponencialmente durante los próximos años. Para ambos sexos, los lugares con más diagnósticos de cáncer son América del Norte, Oceanía y Europa. Solo en 2018 se estima que tuvo más de 18 millones de casos nuevos y casi 9 millones de muertes en todo el mundo. Entre los cánceres con más incidencia y más mortalidad se encuentran el cáncer de pulmón y bronquios, el cáncer de próstata, el cáncer de mama, el cáncer colorrectal y el de cuello uterino [2-5].

Centrándonos en las mujeres, el cáncer de mama y el de cuello uterino se encuentran en el ranking de cánceres más comunes en las mujeres. En 2018, el número de casos fue de 2,1 millones de casos de cáncer de mama y casi 0,6 millones de casos de cáncer de cuello uterino [4, 6]. En cuanto a la mortalidad, el cáncer de cuello uterino causó más de 300 mil muertes en 2018 y el cáncer de mama produjo más de 40 mil muertes en 2019, debido a que el cáncer de mama ha disminuido la mortalidad como resultado del aumento y mejora de la prevención y detección temprana [7]. Las mejores pruebas para detectar este tipo de cáncer son la prueba de papinocolau en caso de cáncer de cuello uterino y la mamografía para el cáncer de mama. A pesar de la disminución de los casos en etapas tempranas, en las etapas avanzadas estos cánceres son letales, especialmente el cáncer de cuello uterino [8].

Las complejidades que subyacen al cáncer residen en los mecanismos que provocan el desarrollo del tumor, su estadificación, diagnóstico, pronóstico y difícil tratamiento. Los tratamientos más conocidos son la cirugía, la quimioterapia y la radioterapia [9]. Sin embargo, en la mayoría de los casos estos tratamientos no son tan efectivos como se desea, pudiendo provocar la recaída en el paciente. Además, en el cáncer de cérvix, la extirpación quirúrgica del útero provoca la infertilidad de la paciente, lo que permite tener una idea de la agresividad de estas terapias. Por ello, se están expandiendo las investigaciones en nuevas terapias contra el cáncer, más efectivas y menos agresivas. Entre estas nuevas terapias se encuentran la inmunoterapia, la hormonoterapia o la terapia génica, una de las terapias más interesantes y actuales. Consiste en la utilización de ácidos nucleicos como el ADN o el ARN con el fin de curar, tratar o prevenir enfermedades humanas, incluido el cáncer. Para lograr esto, se pretende reemplazar un gen defectuoso por uno funcional, introducir un gen faltante o incluso uno terapéutico utilizando diferentes herramientas, por ejemplo, vectores virales o no virales [10, 11] Este tipo de terapias se pueden clasificar en función de la forma de administración del vector al paciente (in vivo o ex vivo), el vehículo utilizado y sus características (integrador/estable o no integrador/transitorio), entre otros [11, 12].

En la terapia génica basada en genes suicidas, con el fin de destruir la célula desde su interior, se introduce un gen responsable de la producción de una toxina, que sería la terapia directa, o de una enzima cuyo papel es la transformación de una sustancia administrada. profármaco en un fármaco, siendo la terapia indirecta [13, 14]. En esta investigación, la atención se ha centrado en la terapia génica directa, ya que presenta menos limitaciones que la indirecta. El problema principal es la necesidad de un profármaco, lo que genera problemas como la toxicidad del profármaco y la biodisponibilidad limitada debido a la falta de profármaco [13].

La terapia génica ofrece una gran ventaja frente a otras terapias. Una de ellas es que permite señalar y controlar los promotores de la expresión génica. Hay varios tipos de promotores, los promotores específicos de cáncer son aquellos promotores funcionales en varios tipos de cáncer sin ninguna especificidad especial de tejido/tumor; mientras que los promotores específicos de tejido son activos en un tipo limitado de células cancerosas [15]. Muchos estudios están relacionados con el uso de estos promotores en la terapia génica suicida, investigando, por ejemplo, el efecto del promotor de la telomerasa (hTERT), que fue el primer gen en clasificarse como específico del cáncer; promotor del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR); promotor de supervivencia; promotores de cáncer de mama 1 (BRCA1) y BRCA2, que son específicos de tumor; entre otros [15].

La survivina es una proteína que actúa como modulador del ciclo celular inhibiendo la apoptosis cuando se sobreexpresa en la fase G2/M del ciclo. Por ello, se expresa levemente en tejidos adultos no tumorales como células hematopoyéticas primitivas, células endoteliales vasculares, células de mucosa colónica y gastrointestinal, etc. [16-18]. Mientras, está relacionado con las células cancerosas, más específicamente con las células madre cancerosas (“CSC” por sus siglas en inglés), donde está sobreexpresado. En un estudio reciente basado en los mecanismos que subrayaron la formación de teratoma, la survivina se reguló al alza en células madre embrionarias humanas y teratoma [19]. Además, otros estudios se centraron en la regulación al alza de survivina en diferentes CSCs [20]. De esta forma, la survivina podría utilizarse como promotor específico de líneas celulares tumorales, dirigiendo la expresión del gen únicamente en las células diana. [21, 22].

El uso de genes que codifican proteínas tóxicas se ha propuesto como una herramienta prometedora para la terapia génica del cáncer. Su principal ventaja es la capacidad de matar incluso las células tumorales latentes, mientras que los genes clásicos utilizados en la terapia génica suicida convencional solo se dirigen a las células que se dividen rápidamente al interrumpir la síntesis de ADN [14]. En las últimas décadas se han descrito diferentes genes suicidas de bacterias como la toxina gef, la toxina estreptolisina O, la toxina diftérica y la exotoxina de pseudomonas con un potente efecto antitumoral [23-26]. En este contexto, investigaciones previas de nuestro grupo confirmaron el papel del gen ldrB como gen suicida en células eucariotas. Este gen pertenece a la familia de genes ldr/rdl presente en el genoma de Eschenchia coli. LdrB codifica una pequeña toxina cuya sobreexpresión provoca la muerte de la célula. La función de la toxina es la condensación del nucleoide, evitando la transcripción y traducción, que provocan la pérdida de viabilidad celular y la muerte [27]. Por otro lado, se ha patentado el efecto de hokD, uno de los cinco homólogos del gen hok ubicado en el plásmido R1 de E. coli codifica una proteína transmembrana de 52 aminoácidos que altera la membrana celular y provoca la inhibición de la proliferación tumoral [28].

Actualmente es bien conocido que el cáncer se considera un grupo de diferentes trastornos debido a la enorme heterogeneidad tumoral que existe. Esta heterogeneidad se puede explicar, entre otras razones, con el concepto CSC. Quiere decir que el tumor está compuesto en menor proporción por CSC, que son las responsables del mantenimiento y proliferación del tumor, siendo el único tipo celular que puede autorrenovarse y diferenciarse en células no madre. De esta forma, la CSC podría ser la causa de la resistencia a la quimioterapia, la fuente de células tumorales y la responsable de la metástasis [29-31]. Además, los diferentes tratamientos comúnmente utilizados en el cáncer tienen algunos inconvenientes y generan una gran lista de efectos secundarios para el paciente. Por ejemplo, la toxicidad de la quimioterapia y sus graves efectos secundarios pueden provocar daños crónicos. Los efectos secundarios tempranos se pueden ver en la médula ósea, el cabello, la piel, la sangre, los riñones, entre otros [32]. Teniendo esto en cuenta, se puede decir que el principal problema de las terapias contra el cáncer hoy en día es la pérdida de la diana específica del tumor. Todo lo anterior, hace necesario investigar nuevas estrategias terapéuticas más innovadoras y menos agresivas.

En este contexto, la terapia génica representa un buen enfoque. Los sistemas comúnmente utilizados para la terapia génica suicida son la timidina quinasa (TK) del Virus del Herpes Simple y el ganciclovir, la citosina desaminasa (CD) y la 5-fluorocitosina (5-FC), el nucleósido de purina fosforilasa y el desoxirribosido de 6-metilpurina, entre otros [33]. Sin embargo, algunas terapias génicas suicidas, en particular las indirectas, podrían provocar un daño extra o más complicaciones debido a la posible toxicidad de los profármacos teniendo en cuenta que necesitan altas concentraciones de profármacos [10]. La terapia suicida directa parece ser una buena alternativa.

Una de las ventajas más importantes de la terapia génica es la posibilidad de dirigirse a las células cancerosas utilizando promotores específicos de tejido. Puede centrarse en tres tipos de promotores específicos: específicos de tejido, específicos de cáncer y específicos de tumor. Los promotores específicos de tejido se refieren a aquellos promotores específicamente activos en ciertos tejidos; los promotores específicos de cáncer a aquellos que son activos en varios tipos de cáncer pero no en ningún tejido/tumor específico; y los promotores específicos de tumor son aquellos funcionales en diferentes tipos de células cancerosas teniendo variaciones en su actividad en función del tumor [15].

Recientemente, se han investigado diferentes promotores específicos de tejidos/tumores. En este contexto, se han llevado a cabo otros estudios relacionados con el promotor específico de cáncer/ tejido, como la investigación de Shian-Ying Sung et al., quienes estudiaron el promotor de osteonectina, que controla la expresión de la proteína osteonectina, ampliamente expresada en tejidos durante el desarrollo y en lesiones celulares. Esta proteína, que interviene en la proliferación, remodelación tisular, migración, etc., es un quimioatrayente de células de cáncer de próstata invasivas del hueso; sobreexpresado en células de cáncer de próstata derivadas de metástasis y focos metastásicos de cáncer de próstata. Por esa razón, su promotor podría ser un gran candidato para la expresión dirigida de genes suicidas en la terapia del cáncer de próstata [34, 35]. Además, Kuzmin et al., sugirieron las aplicaciones potenciales de un promotor específico de tejido altamente activo en células germinales testiculares indiferenciadas, mNUS (secuencia ascendente de NDUFV1 modificada). Este promotor se obtuvo a partir de un fragmento corto aislado y clonado de una región aguas arriba del gen NDUFV1, cuya proteína (NADH deshidrogenasa [ubiquinona] flavoproteína 1, mitocondrial) se expresa en todos los tejidos. Sin embargo, al analizar mNUS, se observó que su actividad disminuía excepto en células germinales indiferenciadas [36]. Resultados similares fueron obtenidos por Takuya Fukazawa et al. en su estudio sobre un sistema promotor TTS específico de cáncer/tejido para tratar el adenocarcinoma pulmonar de forma dirigida. En este caso, el sistema consiste en un constructo que contiene el promotor hTERT (siglas en inglés de "transcriptasa inversa de la telomerasa humana”), promotor específico del cáncer que controla la expresión del gen TTF1, codificando el factor de transcripción tiroideo 1 que transactiva la expresión de la proteína surfactante humana A1 (hSPAI), ambos expresados en epitelio respiratorio de pulmón humano normal [37].

En la presente invención, nuestro propósito fue investigar la eficacia antitumoral de los genes IdrB y hokD bajo el control de diferentes promotores (promotores inducidos o específicos de tejido) en diferentes líneas celulares como HeLa (cáncer de cuello uterino) y MCF-7 (cáncer de mama).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Con el fin de evaluar la capacidad antiproliferativa de los genes suicidas elegidos y la especificidad de los promotores utilizados, se realizaron cultivos bidimensionales y tridimensionales de líneas celulares de cérvix (HeLa) y mama (MCF-7). En primer lugar, se comprobó el efecto de los genes hokD y ldrB, de forma separada, en el promotor inducible comercial TRE3G-Dox utilizado como promotor control. Luego, se utilizó el promotor de survivina, un promotor específico de cáncer, con el fin de lograr una terapia dirigida.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. La expresión del gen hokD induce la inhibición de la proliferación de esferoides de HeLa CSCs. (A) HeLa hokD con Dox, sin Dox y HeLa control fueron cultivados durante 30 días. Las imágenes de fluorescencia y de campo claro se obtuvieron mediante un sistema EnSight con tecnología de imágenes de pocillos. (B) El gráfico de la tasa de inhibición de la proliferación se obtuvo con el software ImageJ, los valores del gráfico se obtuvieron mediante la estandarización de todos los días contra el día 0. (C) Nivel ATPlite de Control, HeLa-hokD-Dox y HeLa-hokD+Dox evaluado por el kit de ensayo ATPlite-3D. Los valores representan medias ± DE (desviación estándar) de cultivos por triplicado (*** p < 0,001 frente al control).

Figura 2. La expresión del gen IdrB induce la inhibición de la proliferación de esferoides de HeLa CSCs. (A) HeLa IdrB con Dox, sin Dox y HeLa control fueron cultivos durante 30 días. Las imágenes de fluorescencia y de campo claro se obtuvieron mediante un sistema EnSight con tecnología de imágenes de pocillos. (B) El gráfico de la tasa de inhibición de la proliferación se obtuvo con el software ImageJ; Los valores de la gráfica se obtuvieron mediante la estandarización de todos los días contra el día 0. (C) Viabilidad celular de Control, HeLa-ldrB-Dox y HeLa-ldrB+Dox evaluada mediante el kit de ensayo ATPlite-3D. Los valores representan medias ± DE (desviación estándar) de cultivos por triplicado (*** p < 0,001 frente al control).

Figura 3. La expresión del gen hokD induce la inhibición de la proliferación de esferoides de MCF-7 CSCs. (A) MCF-7 hokD con Dox, sin Dox y MCF-7 control fueron cultivados durante 30. Las imágenes de fluorescencia y de campo claro se obtuvieron mediante un sistema EnSight con tecnología de imágenes de pocillos. (B) El gráfico de la tasa de proliferación de inhibición se obtuvo con el software ImageJ; Los valores de la gráfica se obtuvieron mediante la estandarización de todos los días contra el día 0. (C) La viabilidad celular del Control, MCF-7-hokD-Dox y MCF-7-hokD+Dox se evaluó mediante el kit de ensayo ATPlite-3D. Los valores representan medias ± DE (desviación estándar) de cultivos por triplicado (*** p < 0,001 frente al control).

Figura 4. La expresión del gen ldrB induce la inhibición de la proliferación de esferoides MCF-7. (A) MCF-7 ldrB con Dox, sin Dox y MCF-7 control fueron cultivados durante 30 días para determinar la tasa de desintegración y proliferación. Las imágenes de fluorescencia y de campo claro se obtuvieron mediante un sistema EnSight con tecnología de imágenes de pocillos. (B) El gráfico de la tasa de proliferación de inhibición se obtuvo con el software ImageJ. Los valores de la gráfica se obtuvieron mediante la estandarización de todos los días contra el día 0. (C) La viabilidad celular del Control, MCF-7-ldrB-Dox y MCF-7-ldrB+Dox se determinó mediante el ensayo ATPlite. Los valores representan medias ± DE (desviación estándar) de cultivos por triplicado (*** p < 0,001 frente al control).

Figura 5. Los estudios de microscopía confocal confirman que el gen hokD induce una pérdida de viabilidad celular. La tinción DAPI de Control y HeLa hokD-Dox (B, F) mostró una tinción nuclear uniforme y un gran número de células, mientras que en la línea celular HeLa hokD+Dox mostró menos células y una tinción de núcleos irregulares (J). Las células teñidas con EthD-1 mostraron una pérdida de integridad de la membrana (L). La fluorescencia verde en GFP confirma la inducción correcta de las células transfectadas (K).

Figura 6. Los estudios de microscopía confocal confirman que el gen IdrB induce una pérdida de viabilidad celular. La tinción DAPI de Control y HeLa IdrB-Dox (B, F) mostró una tinción nuclear uniforme y un gran número de células, mientras que en la línea celular HeLa ldrB+Dox mostró menos células y una tinción de núcleos irregulares (J). Se observaron células teñidas con EthD-1 que mostraron una pérdida de integridad de la membrana (L). La fluorescencia verde en GFP confirma la inducción correcta de las células transfectadas (K).

Figura 7. La expresión génica de hokD y ldrB bajo el control del promotor de survivina induce la inhibición de la proliferación de HeLa. (A) Se cultivaron HeLa, HeLa+lipofectamina, HeLa-hokD y HeLa-ldrB durante 5 días para determinar la tasa de crecimiento. (B) Viabilidad celular de HeLa+lipofectamina y HeLa-hokD en diferentes días (0, 2 y 5) de transfección génica. (C) Viabilidad celular de HeLa+lipofectamina y HeLa-ldrB en diferentes días (0, 2 y 5) de transfección génica. Los valores representan medias ± DE (desviación estándar) de cultivos por triplicado (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).

Figura 8. La expresión génica de hokD y ldrB bajo el control del promotor de survivina induce la inhibición de la proliferación de MCF-7. (A) MCF-7, MCF-7+lipofectamina, MCF-7-hokD y MCF-7-ldrB se cultivaron durante 7 días para determinar la tasa de crecimiento. (B) Viabilidad celular de MCF-7+lipofectamina y MCF-7-hokD en diferentes días (0, 2, 5 y 7) de transfección génica. (C) Viabilidad celular de MCF-7+lipofectamina y MCF-7-hokD en diferentes días (0, 2, 5 y 7) de transfección génica. Los valores representan medias ± DE (desviación estándar) de cultivos por triplicado (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).

Figura 9. La expresión génica de hokD y ldrB induce la inhibición de la proliferación en el esferoide HeLa bajo el control del promotor de survivina. (A) Control, HeLa hokD y HeLa ldrB fueron cultivados durante 17 días. Las imágenes de campo claro se obtuvieron mediante un sistema EnSight con tecnología de imágenes de pocillos. (B, D) El gráfico de la tasa de proliferación de inhibición se obtuvo con el software ImageJ; Los valores de la gráfica se obtuvieron mediante la estandarización de todos los días contra el día 0. (C, E) La viabilidad celular de Control, HeLa hokD y HeLa ldrB evaluados mediante el kit de ensayo ATPlite-3D. Los valores representan medias ± DE (desviación estándar) de cultivos por triplicado (** p <0,01 vs control y *** p <0,001 vs control).

Figura 10. La expresión génica de hokD y ldrB induce la inhibición de la proliferación en el esferoide MCF-7 bajo el control del promotor de survivina. (A) Control, MCF-7 hokD y MCF-7 ldrB fueron cultivados durante 17 días para determinar la tasa de desintegración y proliferación. Las imágenes de campo claro se obtuvieron mediante un sistema EnSight con tecnología de imágenes de pocillos. (B, D) El gráfico de la tasa de proliferación de inhibición se obtuvo con el software ImageJ; Los valores de la gráfica se obtuvieron mediante la estandarización de todos los días contra el día 0. (C, E) Nivel ATPlite de Control, MCF-7 hokD y MCF-7 ldrB evaluados por el kit de ensayo ATPlite-3D. Los valores representan medias ± DE (desviación estándar) de cultivos por triplicado (* p < 0,05 frente a control y *** p < 0,001 frente a control)

Figura 11. Los estudios de microscopía confocal confirman diferencias significativas en los patrones de crecimiento e inhibición de la proliferación con el gen hokD y ldrB en células HeLa. La tinción con DAPI del Control (B) mostró una tinción nuclear uniforme y un gran número de células, mientras que en la línea celular HeLa hokD mostró menos células y una tinción de núcleos irregulares (J). Se observaron células teñidas con EthD-1 que mostraron una pérdida de integridad de la membrana (L). La fluorescencia verde en GFP confirma la inducción correcta de las células transfectadas (K).

Figura 12. Los estudios de microscopía confocal confirman diferencias significativas en los patrones de crecimiento y la inhibición de la proliferación con el gen hokD y ldrB en células MCF-7. La tinción con DAPI del Control (B) mostró una tinción nuclear uniforme y un gran número de células, mientras que en la línea celular HeLa hokD mostró menos células y una tinción de núcleos irregulares (J). Se observaron células teñidas con EthD-1 que mostraron una pérdida de integridad de la membrana (L).

Figura 13. La expresión génica de hokD y ldrB induce la inhibición de la proliferación en CSCs de esferoides HeLa bajo el control del promotor de survivina. (A) Control, HeLa hokD y HeLa ldrB fueron cultivados durante 10 días para determinar la tasa de desintegración y proliferación. Las imágenes de campo claro se obtuvieron mediante un sistema EnSight con tecnología de imágenes de pocillos. (B, C) El gráfico de la tasa de proliferación de inhibición se obtuvo con el software ImageJ; Los valores de la gráfica se obtuvieron mediante la estandarización de todos los días contra el día 0. Los valores representan medias ± DE de cultivos por triplicado (* p < 0,05 frente a control y *** p < 0,001 frente a control).

Figura 14. La expresión génica de hokD y ldrB bajo el control del promotor de survivina induce la proliferación del folículo. (A) Viabilidad celular de folículo+lipofectamina y folículo-hokD en diferentes días (0, 3 y 6) de transfección génica. (B) Viabilidad celular de folículo+lipofectamina y folículo-ldrB en diferentes días (0, 3 y 6) de transfección génica. Los valores representan medias ± DE (desviación estándar) de cultivos por triplicado (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).

Figura 15. Volumen (mm3) de los tumores de HeLa CSC transfectados con hokD y IdrB bajo el control del promotor TRE3G-Dox. (A) Volumen (mm3) de los tumores de HeLa CSCs transfectados con hokD y ldrB bajo el control del promotor TRE3G-Dox en comparación con el control. (B) Imágenes in vivo de fluorescencia de tumores en ratones. (C) Tumores extirpados. Los valores representan medias ± DE (desviación estándar) de cultivos por triplicado (significados hokD: * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001; significados ldrB: # p < 0,05; ## p < 0,01; ### p < 0,001).

Figura 16. Volumen (mm3) de los tumores de HeLa CSC transfectadas con hokD y ldrB bajo el control del promotor de survivina. (A) Volumen (mm3) de los tumores de HeLa CSC transfectados con hokD y ldrB bajo el control del promotor de survivina en comparación con el control. (B) Imágenes in vivo del tamaño del tumor en ratones. (C) Tumores extirpados. Los valores representan medias ± DE (desviación estándar) de cultivos por triplicado (significados hokD: * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001; significados ldrB: # p < 0,05; ## p < 0,01; ### p < 0,001).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Materiales y métodos

Líneas celulares y cultivos

La línea celular humana de cáncer de cuello uterino HeLa se obtuvo de la ATCC; La línea celular humana de cáncer de mama MCF-7 se obtuvo del Biobanco del Sistema Público de Salud de Andalucía (BBSSPA), Granada, España. Human Hair Follicle Stem Cells se obtuvo de Quimigen S.L.

Construcciones de plásmidos

Los genes elegidos para ser expresados en las células diana fueron hokD y ldrB. Estos genes, como se ha dicho anteriormente, codifican proteínas que provocan la propia muerte celular.

Debido a la necesidad de expresar de forma específica los genes concretos en las células diana, se utilizarán unos promotores que ayuden a conseguir este objetivo.

En primer lugar, utilizamos el sistema de expresión inducible Tet-On® 3G, que contiene los vectores pTRE3G-mCherry y pCMV-Tet3G adquiridos de Clontech. Es un promotor inducible por doxiciclina. Este sistema permite la expresión de los genes bajo su control solo en el caso de que la célula tenga doxiciclina [38]. De esta forma, podríamos expresar los genes suicidas siempre que fuera necesario solo administrando doxiciclina.

Por otro lado, nos centramos en el gen de la survivina, que se sobreexpresa en las células cancerosas. [21, 22] Cuando este gen se traduce, su función como inhibidor de la apoptosis es crucial en el crecimiento de las células cancerosas. Este promotor, que como ya dijimos está sobreexpresado en las células cancerosas, facilitará la expresión de los genes suicidas específicamente en los genes diana. Por esa razón, el promotor de survivina se considera un promotor de tejido específico.

Ensayo de proliferación celular bidimensional

Las líneas celulares se sembraron en placas de 96 pocillos. Las células de los ensayos 2D se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma-Aldrich), complementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 % (Sigma-Aldrich) y penicilina/estreptomicina (P/S) al 1 % (Sigma-Aldrich) las células se incubaron a 37°C bajo aire que contenía 5% de CO2.

Las transfecciones se realizaron de forma transitoria utilizando el protocolo Lipofectamine™ 3000 Reagent (Invitrogen, ThermoFisher Scientific) cada dos días en el caso de células transfectadas con promotor de survivina. Además, se probaron dos diluciones diferentes de lipofectamina (1/33 y 1/22).

Las medidas de viabilidad celular se realizaron con el protocolo alamarBlue™ Cell Viability Reagent, antes de cada nueva transfección.

Ensayo de crecimiento celular tridimensional

En cuanto a los cultivos 3D, se realizaron esferoides de células diferenciadas y CSCs. Los esferoides de células diferenciadas se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma-Aldrich), suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 % (Sigma-Aldrich) y penicilina/estreptomicina (P/S) al 1 % (Sigma-Aldrich), sin rojo fenol.

Mientras que las CSCs se prepararon en placas de 96 pocillos de base cónica con medio de esfera convencional (DMEM:F12) (Sigma-Aldrich), 1 % de penicilina/estreptomicina (P/S) (Sigma-Aldrich), B27 (Gibco Life Technologies, EE. UU.), 10 ^g/mL ITS (Gibco Life Technologies, EE. UU.), 1 ^g/mL de hidrocortisona (Sigma-Aldrich), 4 ng/mL de heparina (Sigma-Aldrich), 20 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Sigma-Aldrich), 10 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) (Sigma-Aldrich), 10 ng/ml de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) (Sigma-Aldrich), 10 ng/ml de interleucina-6 (IL-6) (Sigma-Aldrich), sin rojo fenol). Las placas se incubaron a 37°C bajo aire que contenía 5% de CO2.

Cell Carrier Spheroid ULA 96-well Microplates (PerkinElmer) según las instrucciones del fabricante. Microplacas transparentes de poliestireno de 96 pocillos recubiertas con superficie de unión ultra baja (ULA) y fondo redondo para el cultivo 3D de células de mamíferos. Este revestimiento de ULA en pocillos de fondo redondo facilita la formación de esferoides redondos después de incubar las células sembradas. Se tomaron imágenes de los esferoides utilizando un objetivo 4x en el módulo de imagen de un lector de placas EnSight TM (PerkinElmer). Las imágenes conseguidas se analizaron mediante el software ImageJ.

Las transfecciones se realizaron de forma estable o integrativa utilizando el Xfect™ Transfection Reagent Protocol-At-A-Glancein (Clontech Laboratories, Inc. A Takara Bio Company) el caso de las células transfectadas con el promotor TRE3G-Dox, el cual fue inducido con 2 ^g/ml de doxiciclina tres veces por semana; y, de forma transitoria utilizando el protocolo del Reactivo Lipofectamine™ 3000 (Invitrogen, ThermoFisher Scientific) cada dos días en el caso de células transfectadas con promotor de survivina. Además, se probaron dos diluciones diferentes de lipofectamina (1/33 y 1/22).

En cultivos tridimensionales, las mediciones se realizaron en el software ImageJ.

Imágenes confocales

Se utilizó DAPI y Ethidium homodimer-1 (EthD-1) para el punto final de los ensayos 3D para confirmar los buenos resultados de las imágenes. Al final del ensayo de crecimiento celular en 3D, los esferoides se tiñeron con DAPI (1 ^g/ml) y EthD-1 (2 ^M) en PBS a temperatura ambiente durante 20 min para EthD-1 y 5 min para DAPI. A continuación, se tomaron imágenes mediante microscopía confocal utilizando un microscopio confocal Leica SP2 (Telstar Instrumat, Terrassa, Barcelona, España).

Ensayos de luminiscencia basados en ATPlite

Se utilizó el kit ATPlite 3D (PerkinElmer, Waltham, MA, EE. UU.). Con este kit, se puede medir el contenido de ATPlite en las mediciones de punto final de cultivos tridimensionales. De acuerdo con el protocolo, se agregó un reactivo que contenía luciferasa y luciferina a los esferoides de células diferenciadas, que se lisaron al final. Haciendo uso del sistema EnSight, se midió la luminiscencia.

Estudios de xenoinjertos antitumorales in vivo

Los estudios in vivo se realizaron con un modelo de cáncer de cuello uterino.

Promotor TRE3G-Dox

En primer lugar, se evaluó la eficacia terapéutica de la terapia génica suicida con hokD y ldrB bajo el control del sistema Tet-On, realizándose con xenoinjertos de tumores heterotópicos establecidos con líneas celulares HeLa, HeLa-hokD y HeLa-ldrB. Se inyectaron subcutáneamente 6000 CSCs por ratón en ratones BALB/c. Tras la palpación del tumor, se administraron 100 mg/kg de doxiciclina 3 veces por semana mediante inyección intraperitoneal. Los controles utilizados para comparar fueron ratones con tumor HeLa pero sin la administración de doxiciclina.

Promotor de survivina

Por otro lado, el procedimiento para la evaluación de la eficacia terapéutica de la terapia génica suicida mediada por hokD y ldrB bajo el control del promotor de survivina, un sistema específico de cáncer, se inició con la inyección de 6000 CSCs por ratón con el fin de generar xenoinjertos de tumores heterotópicos establecidos con líneas celulares HeLa, HeLa-hokD y HeLa-ldrB. Las CSCs se inyectaron por vía subcutánea en ratones BALB/c. Tras la palpación del tumor, se administró el sistema in v/vo-jetPEI® del plásmido con los genes hokD y ldrB, por separado. El sistema consiste en una polietilenimina lineal, que facilita la administración eficiente de ácidos nucleicos como ADN, hcRNA, siRNA, miRNA, entre otros, con diferentes posibilidades de administración y diferentes tejidos donde se fabrican. A los ratones tratados se les administró 3 veces por semana por vía intratumoral 20 ^g de ADN en 100 ^l de una solución de sacarosa al 5% y una relación N/P=6 de jetPEI. En el caso de los ratones control, se administró la misma solución sin ADN.

Análisis estadístico

Todos los datos presentados en este trabajo se expresan como la media ± SD (desviación estándar) de tres réplicas y se comparan con las pruebas t de Student. Los valores de p < 0,05 (*, #), los valores de p < 0,01 (**, ##) y los valores de p < 0,001 (***, ###) se consideraron estadísticamente significativos en todos los casos.

La expresión génica de hokD y IdrB promueve una inhibición significativa de la proliferación en esferoides de células madre cancerosas HeLa y MCF-7

Efecto de hokD y IdrB expresado bajo el control del promotor TRE3G

Para estudiar el efecto del gen hokD y ldrB en células HeLa y MCF-7, se utilizó un sistema de expresión inducible Tet-On 3G de 3a generación con proteína verde fluorescente ("GFP” por sus siglas en inglés) y m-Cherry. Esta generación es el sistema de expresión de mamíferos inducible más poderoso, versátil y ampliamente citado disponible y permite la expresión simultánea del gen hokD o ldrB y un marcador de fluorescencia verde (HeLa) o rojo (MCF-7) bajo el control de un promotor TRE3G (PTRE3G) que se une a la proteína transactivadora Tet-On 3G en presencia de doxiciclina. Las células se transfectaron con hokD y ldrB por separado y luego se aislaron y caracterizaron las CSCs. Después de 48 h de inducción con Doxiciclyne (Dox) HeLa y MCF-7 el esferoide de CSCs mostró expresión del gen hokD y ldrB a través del fluoróforo GFP y m-Cherry respectivamente (Figura 1, 2, 3, 4). Nuestros resultados demuestran que ambos genes inducen la inhibición de la proliferación y diferencias significativas en los patrones de crecimiento, como la solidez, la redondez y el ratio del área en comparación con el control (Tabla 1, 2 y Figura 1B y 2B).

HeLa

En HeLa que expresa el gen hokD, observamos que las células sufren un 52,8% de inhibición de la proliferación a los 15 días llegando a una desintegración total a los 30 días de tratamiento en comparación con el control sin Dox (Figura 1A, B).

Para HeLa que expresa el gen ldrB, observamos que el esferoide sufre una inhibición del crecimiento pero no una desintegración total. La inhibición de la proliferación alcanzó 52,28% y 61,64% a los 15 y 30 días de tratamiento en relación al control sin Dox (Figura 2A, B). Esta inhibición concordaba con la disminución del nivel de ATPlite observada al final de los experimentos con el kit de ensayo ATP lite (Sistema de monitoreo de trifosfato de adenosina (ATP)) para el 99,45 % del gen hokD (Figura 1C) y el 99,16 % del gen ldrB (Figura 2C).

Tabla 1. Valores de redondez y solidez del control de HeLa CSC y transfectados con hokD y ldrB obtenidos como media de las mediciones de punto final. Los valores de redondez y solidez van de 0 a 1, siendo más redondo y sólido cuanto más cercano a 1 es el valor. Los valores de la tabla se obtuvieron mediante la estandarización de todos los días frente a 0 días.

MCF-7

El esferoide de MCF-7 CSCs que expresa el gen hokD sufre un 31,54 % de inhibición de la proliferación de esferas de CSCs después de 10 días de tratamiento y una desintegración total a partir del día 15 en comparación con el control transfectado con hokD sin inducción de Dox (Figura 3A, B). Estos resultados están en concordancia con los obtenidos a través del estudio de supervivencia utilizando el kit de ensayo ATPlite-3D obteniendo un 71,7% de inhibición de la viabilidad celular al final del experimento (Figura 3C).

MCF-7 que expresa el gen ldrB mostró una ligera disminución del área de la esfera de las CSC alcanzando solo el 13,7 % y el 23,46 % después de 10 y 30 días de tratamiento en comparación con el control transfectado con el gen ldrB sin inducción Dox (Figura 4A, B). Además, como en HeLa que expresa el gen ldrB, no se observó la desintegración total del esferoide. Sin embargo, la viabilidad celular determinada por el ensayo ATPlite al final del experimento mostró una clara disminución de la viabilidad alcanzando el 72,07% (Figura 4C). Esto indica que aunque la esfera de las CSCs no se ha desintegrado, la mayoría de las células están muertas.

Tabla 2. Valores de redondez y solidez del control de MCF-7 CSC y transfectados con hokD y ldrB obtenidos como media de las mediciones de punto final. Los valores de redondez y solidez van de 0 a 1, siendo más redondo y sólido cuanto más cercano a 1 es el valor. Los valores de la tabla se obtuvieron mediante la estandarización de todos los días frente a 0 días.

Ensayo confocal

Se realizaron estudios de microscopía confocal para demostrar diferencias significativas en los patrones de crecimiento y la inhibición de la proliferación. La tinción DAPI de Control, HeLa hokD-Dox y HeLa-ldrB-Dox (Figura 5B, F) (Figura 6B, F) mostró una tinción nuclear uniforme y un alto número de células. Por el contrario, la tinción con EthD-1 mostró solo aquellas células que presentan una pérdida de integridad de la membrana, como se puede observar en HeLa hokD+Dox y HeLa ldrB+Dox (Figura 5L y 6L). GFP representa la expresión del marcador de fluorescencia bajo el control del promotor TRE3G (PTRE3G) solo expresado en células transfectadas con hokD y ldrB inducidas por doxiciclina (Figura 5K y 6K) y ausente en células transfectadas sin Dox y células control (Figura 5C, G) (Figura 6C, G).

Las imágenes combinadas mostraron células en las que la tinción de DAPI y EthD-1 coinciden, lo que indica células que presentan núcleos pero han perdido la integridad de la membrana; este es el caso de las células transfectadas e inducidas HeLa hokD+Dox, HeLa ldrB+Dox. En el caso de las células HeLa hokD-Dox, HeLa ldrB-Dox y Control, encontramos una gran cantidad de núcleos teñidos con DAPI pero sin superposición de EthD-1, lo que indica la viabilidad celular.

Efecto de hokD y ldrB expresado bajo el control del promotor de survivina

Para dirigir la expresión de los genes ldrB y hokD al tejido tumoral en general, y a las CSCs en particular, hemos construido un plásmido cuya expresión depende del promotor de la survivina. De hecho, se ha demostrado que la survivina se sobreexpresa en las células tumorales en comparación con el tejido sano. Por lo tanto, las células HeLa y MCF-7 se transfectaron transitoriamente con el gen hokD y ldrB por separado para cultivos 2D y 3D. Utilizamos lipofectamina como vehículo para la transfección que utiliza nanopartículas de lípidos para proporcionar un rendimiento de transfección superior con resultados de aplicación mejorados y resultados reproducibles.

En cultivos 2D, encontramos diferencias significativas en los patrones de crecimiento. Después de 48 h de transfección de células HeLa, el gen hokD fue capaz de inducir un 76,89 % y un 95,78 % de inhibición de la proliferación a los 2 y 5 días respectivamente. De la misma manera, el gen ldrB fue capaz de inducir un 52,68 % y un 99,36 % de inhibición de la proliferación en el día 2 y 5, respectivamente (Figura 7).

La misma tendencia se observó en MCF-7, los resultados mostraron una inhibición de la proliferación del 61,46 %, 98,17 % y 99,63 % en los días 2, 5 y 7, respectivamente, después de la inducción del gen hokD; y 63,87%, 94,48% y 99,85% en el día 2, 5 y 7 respectivamente después de la expresión del gen ldrB (Figura 8).

Para verificar el efecto del gen hokD y ldrB bajo el control del promotor de survivina en el esferoide HeLa y MCF-7 de células diferenciadas y CSCs, llevamos a cabo ensayos de proliferación 3D. Como se muestra en la figura 9, encontramos diferencias significativas en la proliferación y en los patrones de crecimiento, como la solidez, la redondez y la tasa de área. En el caso del área, los valores parecen disminuir en el caso de hokD mientras permanece más bajo que el control en ldrB. En redondez y solidez los parámetros son similares a los de control (Tabla 3) (Figura 9B).

HeLa con gen hokD, se observó que las células sufren una desintegración alrededor del esferoide e inhibición de la proliferación a los 13 días (19,66%). Esta inhibición alcanzó el 61,29% después de 17 días de transfección en comparación con el control (Figura 9A, B). Para HeLa con gen ldrB hubo una alta desintegración alrededor de la esfera y un alto porcentaje de inhibición de la proliferación. Las células sufren inhibición del crecimiento después de 13 días, la inhibición muestra valores del 87,69%. Esta inhibición se incrementó a los 17 días alcanzando el 92,82% con relación al control (Figura 9A, D). Esta inhibición concordaba con la disminución del nivel de ATPlite observada al final de los experimentos con el kit de ensayo ATP lite para el 0,8 % del gen hokD (Figura 9C) y el 41,44 % del gen ldrB (Figura 9E).

El estudio de proliferación mostró una inhibición significativa del crecimiento de los esferoides MCF-7 en comparación con las células de control. Después de 13 días de inducción del gen hokD y ldrB, el tamaño de los esferoides se redujo en comparación con el control. Los resultados obtenidos mostraron que después de 13 días de expresión génica hubo una inhibición de la proliferación del 36,87% y del 64,14% para hokD y ldrB. Esta inhibición aumentó, alcanzando el 66,08 % y el 74,65 % después de 17 días de tratamiento para hokD y ldrB respectivamente (Figura 10 A, B, D). Además, esta inhibición concordaba con la disminución del nivel de ATPlite observada al final de los experimentos con el kit de ensayo ATP lite para el 85,75 % del gen hokD (Figura 10C) y el 91,59 % del gen ldrB (Figura 10E).

Tabla 3. Redondez y de solidez del esferoide HeLa y MCF-7, transfectados con hokD y ldrB bajo el control del promotor de survivina, obtenidos como media de las mediciones de punto final. Los valores de redondez y solidez van de 0 a 1, siendo más redondo y sólido cuanto más cercano a 1 es el valor. Los valores de la tabla se obtuvieron mediante la estandarización de todos los días frente a 0 días.

Ensayo confocal

Una vez más, se realizaron estudios de microscopía confocal para probar diferencias significativas en los patrones de crecimiento y la inhibición de la proliferación. La tinción DAPI de Control, HeLa y MCF-7 hokD y HeLa y MCF-7 ldrB (Figura 11B, F, J) (Figura 12B, F, J) mostró una tinción nuclear uniforme y un alto número de células. Por el contrario, la tinción con EthD-1 mostró solo aquellas células que presentan una pérdida de integridad de la membrana, como se puede observar en HeLa y MCF-7 hokD y HeLa y MCF-7 ldrB (Figura 11L, H) (Figura 12L, H). GFP representa la expresión del marcador de fluorescencia bajo el control del promotor de survivina, expresado únicamente en células transfectadas con hokD y ldrB (Figura 11K) (Figura 12K).

Las células fusionadas mostradas donde coinciden las tinciones de DAPI y EthD-1 son células que presentan núcleos pero han perdido la integridad de la membrana y no expresan fluorescencia, es el caso de las células transfectadas HeLa y MCF-7 hokD, HeLa y MCF-7 ldrB. Consideramos que estas células están muertas y una confirmación de los resultados de la inhibición de la proliferación. En el caso de las células HeLa de control, encontramos una gran cantidad de núcleos teñidos con DAPI pero ninguna superposición de EthD-1, lo que indica la viabilidad de las células.

Finalmente, para verificar el efecto del gen hokD y ldrB sobre las células madre cancerosas, se realizó un ensayo de proliferación 3D en la línea celular HeLa.

El estudio de proliferación muestra una inhibición significativa del crecimiento de los esferoides HeLa en comparación con las células de control. Después de 8 días de expresión de los genes hokD y ldrB, el tamaño de los esferoides fue del 37,87 % para hokD y del 24,04 % para ldrB. Esta inhibición aumentó hasta el 95,5% y el 83,99% a los 10 días de tratamiento para hokD y IdrB respectivamente observándose una desintegración completa de la esfera en ambos genes (Figura 13A, B, D).

Los valores de solidez y redondez refuerzan los datos presentados, debido a su pérdida de forma y mostrando que la esfera se desintegró por dentro (Tabla 4).

Tabla 4. Redondez y solidez de las CSC de esferoides HeLa, transfectadas con hokD y ldrB bajo el control del promotor de survivina, obtenidos como media de las mediciones de punto final. Los valores de redondez y solidez van de 0 a 1, siendo más redondo y sólido cuanto más cercano a 1 es el valor. Los valores de la tabla se obtuvieron mediante la estandarización de todos los días frente a 0 días.

La expresión génica de hokD y ldrB bajo el control del promotor de survivina no afecta la proliferación de células foliculares

Con el fin de verificar la acción tisular específica del constructo y su seguridad en células sanas, se transfectaron células no tumorales de células madre foliculares con el mismo protocolo.

El objetivo principal de estas transfecciones fue determinar la especificidad de las células cancerosas promotoras de survivina, con el fin de corroborar la seguridad del tratamiento, debido a su escasa expresión en células no tumorales. Los resultados obtenidos muestran que las células no tumorales crecen con normalidad, lo que confirma la seguridad del uso del promotor de survivina en la terapia génica suicida, debido a la acción tumoral específica del promotor. El porcentaje de proliferación muestra un crecimiento 1,5 veces mayor que el control, con un 143,76% y 174,12% de crecimiento celular en células transfectadas con hokD y ldrB respectivamente después de 6 días de tratamiento (Figura 14A, B).

Estudios de xenoinjertos antitumorales in vivo

Para corroborar los resultados obtenidos en cultivos bidimensionales y tridimensionales y evaluar la eficacia terapéutica de la terapia génica suicida, se realizaron estudios in vivo en ratones. Estos experimentos se realizaron siguiendo las recomendaciones del comité de ética; consiguiendo la reducción del número de animales y evitando sufrimientos innecesarios.

Efecto in vivo de hokD y ldrB bajo el control del promotor TRE3G-Dox

Los resultados obtenidos en este experimento in vivo demostraron la inhibición significativa de la proliferación tumoral en CSCs HeLa que expresan hokD y ldrB bajo el control del promotor TRE3G-Dox y activadas con doxiciclina tras 42 días de tratamiento. No observamos diferencias significativas en el crecimiento de los tumores HeLa y HeLa-Dox. La proliferación de tumores HeLa hokD y HeLa ldrB se inhibió significativamente después de 35 días con un 91,6 % y un 95,7 % respectivamente. Este efecto antitumoral se mantuvo hasta el final del experimento, manteniendo un volumen tumoral promedio alrededor de un 80% menor en comparación con el grupo control para el gen hokD y alrededor del 98% para el gen ldrB (Figura 15A). Las imágenes in vivo de tumores reseccionados y de ratones portadores de tumores confirmaron la expresión del gen hokD y ldrB en el tumor HeLa hokD-Dox y HeLa ldrB-Dox (Figura 15B, C). Los ratones tratados no mostraron pérdida de peso ni otro comportamiento inusual, ni toxicidad detectable ni metástasis en el hígado, los pulmones, el corazón o los riñones. Estos eventos señalan la efectividad de los genes suicidas sin ningún daño sistémico.

Efecto in vivo de hokD y ldrB bajo el control del promotor de survivina

Los resultados obtenidos en este experimento in vivo demostraron la inhibición significativa de la proliferación tumoral en CSCs HeLa que expresan hokD y ldrB bajo el control del promotor de survivina después de 54 días de tratamiento. La proliferación de tumores HeLa hokD y HeLa ldrB se inhibió significativamente después de 32 días con un 76,21 % y un 79,3 % respectivamente. Este efecto antitumoral se mantuvo hasta el final del experimento, manteniendo un volumen tumoral promedio alrededor de un 66% menor en comparación con el grupo control para el gen hokD y alrededor del 67% para el gen ldrB (Figura 16A). Las imágenes in vivo de tumores reseccionados y de ratones portadores de tumores confirmaron la expresión del gen hokD y ldrB en el tumor HeLa hokD-Dox y HeLa ldrB-Dox (Figura 16B, C). Los ratones tratados no mostraron pérdida de peso ni otro comportamiento inusual, ni toxicidad detectable, ni metástasis en el hígado, los pulmones, el corazón o los riñones. Estos eventos señalan la efectividad de los genes suicidas sin ningún daño sistémico.

Como era de esperar, la eficacia del promotor TRE3G-Dox es mucho más potente que la del promotor de survivina. No obstante, los ratones no habían presentado ningún daño o metástasis, lo que significa que el promotor de survivina podría usarse como un promotor específico de tejido contra el cáncer de mama y de cuello uterino de forma segura.

En la presente memoria, la expresión de los genes hokD y ldrB estaba bajo el control de TRE3G-Dox y de survivina. El uso del promotor inducido TRE3G controlado por doxiciclina, un promotor muy potente, también respalda la eficacia de la expresión del gen suicida en nuestras líneas celulares. Solo con la administración de este antibiótico, la cascada de señalización se desencadenará debido a una proteína transactivadora de unión a doxiciclina [38, 39]. En caso de que se suprimiera la administración de doxiciclina, la expresión de genes controlados por este promotor permanecería silenciada. El sistema Tet-On es ampliamente utilizado en este tipo de investigaciones sobre terapia génica suicida. Por citar un ejemplo, podemos mencionar el estudio realizado por Senthilkumar Kalimuthu et al., en el que crearon y analizaron la citotoxicidad potencial de un sistema de genes suicidas basado en MSC (células madre mesenquimales) con HSV1-sr39TK inducible por Dox (una forma mutante de la timidina quinasa del virus del herpes simple) en el cáncer de colon (CT26/Rluc) [40].

El promotor específico de tejido elegido en este caso es el promotor de survivina, cuya actividad aumenta durante el ciclo celular. Esta elección se debe al Instituto Nacional del Cáncer que descubrió que entre las 60 líneas de cáncer humano en las que se sobreexpresa la survivina, el cáncer de mama es una de las que tiene los niveles más altos, así como el cáncer de pulmón y las CSCs [22]. Como comentábamos, las líneas de cáncer en las que se ha centrado este trabajo son el cáncer de mama (MCF-7) y de cérvix (HeLa), por lo que el promotor de survivina es un gran candidato. Además, es necesario destacar que la survivina también se sobreexpresa en las CSCs, siendo este tipo de células el principal objetivo de nuestra terapia [20].

Los genes suicidas que elegimos en esta investigación son hokD y ldrB. Cuando estos genes se expresan en la célula, se obtienen proteínas de 52 y 35 aminoácidos, respectivamente. Estos tamaños son una gran ventaja en comparación con toxinas más grandes como la toxina diftérica A [41], con 535 aminoácidos; o estertolisina O, con 571 aminoácidos, utilizada en un estudio de Wan Seok Yang et al. sobre terapia génica del cáncer suicida con esta toxina [24, 42], en el que obtuvieron más del 70-90% de reducción de la viabilidad celular in vitro en algunas líneas celulares de cáncer e in vivo en carcinoma de cérvix, pero sin el uso de la Sistema Tet-On o promotor específico de cáncer/tejido. Como hemos dicho, debido a esta diferencia de tamaño, estos genes podrían ser más seguros y efectivos como terapia génica.

Enla presente memoria, en primer lugar, nos centramos en el estudio del efecto de hokD y IdrB como genes suicidas bajo el control del promotor TRE3G-Dox inducido con Dox, que no es un antibiótico tóxico [43] en CSCs HeLa y MCF-7 como tres cultivos dimensionales e in vivo utilizando HeLa CSCs en ratones BALB/c. Las CSCs HeLa y MCF-7 transfectadas con hokD presentan un porcentaje de inhibición de la proliferación de aproximadamente el 100% en ambas líneas celulares al final del experimento; mientras que HeLa y MCF-7 transfectadas con ldrB presentan entre 61,64% y 23,46% de inhibición, respectivamente, al final del experimento. Aunque el porcentaje de inhibición de MCF-7 transfectado con ldrB parece ser insuficiente, los niveles de ATPlite indican un 72,07% de muerte celular en comparación con el control. Podemos comparar los resultados obtenidos con este promotor en nuestros experimentos con los presentados en el estudio de Senthilkumar Kalimuthu et al. [40], en el que utilizaron el sistema Tet-On con el objetivo de expresar el HSV1-sr39TK en combinación con MSCs en células de cáncer de colon, podemos destacar algunas diferencias y similitudes. En el estudio, midieron la proliferación en función de la actividad de la luciferasa y la representaron como fotones/segundo relativos (p/s) (%). Así, administrando 1 ^M de ganciclovir después de 48 horas de MSC y CT26/Rluc cocultivadas en este ensayo, obtuvieron un 35% de p/s relativo en relación con la no administración de ganciclovir. Este dato se podría traducir en un 65% de inhibición de la proliferación aproximadamente. Teniendo eso en cuenta, podríamos decir que este resultado es similar al nuestro en CSCs HeLa y MCF-7 transfectadas con hokD; pero superior a las CSCs HeLa y MCF-7 transfectadas con ldrB. Sin embargo, es necesario recalcar que nuestros resultados se obtuvieron en cultivos 3D. Así, si consideramos los resultados obtenidos en trabajos previos de nuestro grupo, en los que encontramos un porcentaje de inhibición de la proliferación en esferoides MCF-7-ldrB-Dox tras 15 días de tratamiento en torno al >70% [27].

Los valores de área, redondez y solidez de estos cultivos 3D muestran resultados diferentes de cada gen suicida utilizado en este trabajo. En el caso de CSCs transfectadas con hokD, el esferoide se iba desintegrando progresivamente, disminuyendo los parámetros medidos en comparación con el control. En el caso de CSCs transfectadas con ldrB, el valor del área permanece significativamente más bajo que los de control, mientras que los valores de redondez y solidez permanecen como los de control. Estos resultados parecen indicar el efecto real de cada gen. hokD es el responsable de la muerte celular y la destrucción de esferoides; mientras que ldrB provoca la inhibición del crecimiento así como la muerte celular, lo cual se corroboró con los niveles de ATPlite.

Además, en estas investigaciones se realizaron experimentos in vivo. En nuestro caso, obtuvimos un 91,6% y un 95,7% de inhibición de la proliferación en las CSCs HeLa que expresan hokD y IdrB, respectivamente, a los 35 días. El volumen tumoral medio después de 35 días de tratamiento se redujo en un 80% y 98% en las CSCs HeLa que expresaban hokD y ldrB, respectivamente, en comparación con el grupo control. Además, los ratones tratados no presentaron efectos secundarios. A pesar de Senthilkumar Kalimuthu et al. no indican el porcentaje de reducción del volumen tumoral, parece que también se obtiene una reducción del crecimiento tumoral en ratones; pero, por el contrario, los ratones tratados perdieron peso [40].

Dados estos resultados, no solo se confirma la potencia del sistema Tet-On y el promotor TRE3G-Dox, sino que también se obtienen mejores resultados en combinación con hokD y ldrB.

A pesar de ello, el objetivo principal de esta investigación consiste en analizar el efecto del promotor específico del cáncer. En este caso, optamos por investigar sobre el promotor de survivina específico del cáncer. Los primeros experimentos fueron con células diferenciadas HeLa y MCF-7 cultivadas en monocapa y transfectadas con genes hokD y ldrB. Muestran la inhibición significativa de la proliferación celular, siendo más del 95% de inhibición con los genes hokD y ldrB en ambas líneas celulares al final del experimento; siendo un aumento progresivo del porcentaje. Si analizamos los resultados obtenidos en los estudios mencionados anteriormente sobre otros promotores específicos de tejido, se puede decir que nuestro posible tratamiento presenta mejores resultados que otros. A modo de ejemplo, Shian-Ying Sung et al. [34] presentan un trabajo sobre el promotor de osteonectina (hON-522E) que controla la expresión de tirosina quinasa (TK) en cáncer de próstata humano independiente de andrógenos (PC3M) transfectado por vectores adenovirales. En esta investigación obtuvieron que PC3M infectado con Ad-522E-TK a valores de Multiplicidad de Infección (MOI) de 10, 30 y 100, y administrado con ganciclovir, presenta porcentajes de supervivencia en torno al 50, 20 y 10%. En otras palabras, los porcentajes de inhibición de la proliferación son del 50, 80 y 90%, respectivamente. Denis Kuzmin et al. [36] en su trabajo sobre mNUS controlando la expresión de una citosina desaminasa recombinante (RCD) [44] obtuvieron aproximadamente un 60% de células Tera-1 muertas transfectadas con mNUS-RCD 5-FC (un profármaco transformado por CD en un compuesto tóxico). Otro caso es el de Takuya Fukazawa et al. [37] trabajan sobre el sistema TTS que controla la expresión del gen proapoptótico asociado a la proteína X Bcl-2 (Bax) utilizado para transfectar células de adenocarcinoma pulmonar (PC3), lo que indica que en estas células el contenido de ADN sub-G1 aumenta en un 42,16%, lo que sugiere que Ad-TTS/Bax induce la muerte celular debido a la expresión de Bax.

Además, se pueden realizar comparaciones con otros estudios en los que se utilizó el promotor de survivina. La investigación mencionada es la realizada por Baoshun Lin et al., en la que utilizan el promotor de survivina (Surp1430) controlando la expresión de la toxina diftérica A (DTA) [45]. En este caso, la reducción de la viabilidad de las células malignas fue del 42 % y del 92 % con 0,1 y 0,3 ^g del vector lentiviral recombinante utilizado para transfectar la construcción Surp1430-DTA, sin afectar a las células normales.

Como se puede observar, hokD y ldrB bajo el control del promotor de survivina parecen producir resultados más eficientes en cultivos bidimensionales que otros promotores específicos de cáncer/tejido o incluso otros genes suicidas controlados por el promotor de survivina.

Previamente, nuestro grupo describió alrededor del 70% de inhibición de la proliferación en células MCF-7 y HCT-116 transfectadas con ldrB pero bajo el control del promotor TRE3G-Dox. Esto nos da una idea del prometedor efecto específico del promotor de survivina como una posible terapia génica suicida contra el cáncer.

En los cultivos 3D, realizamos los experimentos con esferoides de células diferenciadas HeLa y MCF-7 y esferoides HeLa CSCs. Los resultados mostraron una inhibición progresiva de la proliferación, alcanzando después de 17 días entre el 60% de inhibición de la proliferación en esferoides de células diferenciadas tanto HeLa como MCF-7 transfectadas con hokD; 92,82% en esferoides de células diferenciadas HeLa transfectadas con ldrB; y 74,65% en esferoides de células diferenciadas MCF-7 transfectadas con ldrB. Comparando con los resultados obtenidos en el trabajo previo de nuestro grupo sobre ldrB [27], se puede observar un efecto similar con hokD; sin embargo, en este caso, el promotor de survivina y otro gen suicida permiten realizar una acción específica con los mismos resultados de inhibición. Por otro lado, los resultados obtenidos con esferoides de células diferenciadas HeLa transfectadas con ldrB indican un mayor efecto, pudiendo considerarse como una de las mejores combinaciones en estos casos.

Aunque, el efecto explícito de cada gen parecía ser claro en las CSCs transfectadas con hokD bajo el control del promotor TRE3G-Dox; en el caso del promotor de survivina, la efectividad es casi completa con hokD y ldrB. En estas ocasiones, las CSCs HeLa transfectadas con hokD a los 8 días presentan un 37,87% de inhibición de la proliferación, alcanzando el 95,5% a los 10 días; mientras que las CSCs HeLa transfectadas con ldrB a los 8 días presentan un 24,04% de inhibición de la proliferación, alcanzando el 83,99% a los 10 días. Los resultados corroboran la especificidad del promotor de survivina en las CSCs, ya que estos cultivos 3D presentan una mayor inhibición de la proliferación que los de células diferenciadas.

Además, los valores de área, redondez y solidez presentan un patrón similar al de las CSCs transfectadas con hokD bajo el control del promotor TRE3G-Dox, lo que permite confirmar el efecto específico de cada gen suicida utilizado en este trabajo. Sin embargo, en las CSCs HeLa y MCF-7 transfectadas con ldrB bajo el control del promotor TRE3G-Dox, estos parámetros parecen ser los mismos que los del control, pudiendo confundirse sobre el efecto antitumoral de este gen. Sin embargo, se puede refutar con niveles de ATPlite como se comentó anteriormente, presentando 99,16% y 72,07% de muerte celular en CSCs HeLa y MCF-7 transfectadas con ldrB bajo el control del promotor TRE3G-Dox.

Como se ha dicho, la seguridad en células no tumorales se demostró en células foliculares, y los resultados determinan que, a pesar de ser transfectadas con genes suicidas bajo el control del promotor de survivina, las células foliculares proliferan alrededor de >1,5 veces más que el control (143,76% y 174,12% en células foliculares transfectadas con hokD y ldrB, respectivamente). Significa que hokD y ldrB bajo el control del promotor de survivina solo tiene un efecto antitumoral en las células cancerosas, pudiendo ser una opción más segura y menos tóxica en la terapia génica contra el cáncer. Además, cuanto más específico era el tratamiento del cáncer, menos efectos secundarios tiene el tratamiento. De esta forma, y teniendo en cuenta que hokD y ldrB bajo el control del promotor de survivina no afectan a las células foliculares, uno de los efectos secundarios más destacables de la radio y la quimioterapia como es la caída del cabello podría evitarse con esta terapia específica.

Finalmente, con el objetivo de conocer el efecto de esta particular terapia génica suicida en un organismo completo, se realizaron experimentos in vivo en ratones. A los ratones con tumores HeLa CSCs se les inyectó por vía intratumoral plásmido que contenía hokD o ldrB bajo el control del promotor de survivina. Después de 32 días de tratamiento, los ratones experimentan un descenso en el volumen tumoral medio, siendo alrededor de un 65% menos que el grupo control en tumores HeLa CSCs tratados con hokD y ldrB bajo el control del promotor de survivina, presentando una inhibición de la proliferación del 76,21% y 79,3% a los 32 días, respectivamente. Otros trabajos comentados anteriormente con otros promotores específicos de cáncer/tejidos [34], incluso el promotor de survivina que controla la expresión de otros genes [45], también presentan buenos resultados in vivo. En el caso de Ad-522E-TK combinado con GCV en un modelo de xenoinjerto subcutáneo PC3M en ratones desnudos [34], el volumen tumoral desciende en un 80% aproximadamente después de 35 días de tratamiento. Mientras que el modelo de xenoinjerto de ratones desnudos con tumor de cáncer de mama ZR7530 tratados con el vector lentiviral Surp1430-DTA [45] parece reducir el volumen del tumor en más del 95% aproximadamente.

Si bien estos otros resultados parecen ser más efectivos en la disminución del volumen tumoral, en ningún caso los tumores fueron erradicados en su totalidad. A pesar de ello, los ratones no presentan ningún efecto secundario como metástasis, pérdida de cabello, pérdida de peso, entre otros, en ninguno de estos casos; contrario a lo que sucede en Senthilkumar Kalimuthu et al. [40], donde los ratones perdieron peso durante el tratamiento.

Recopilando todos los resultados obtenidos, podríamos decir que hokD y IdrB tienen un efecto específico de cáncer en las líneas celulares HeLa y MCF-7 siendo controladas por el promotor de survivina, mostrando mejores resultados en cultivos bidimensionales que otras investigaciones. En especial, podemos corroborar con resultados en cultivos 3D lo comentado anteriormente sobre el efecto individual de hokD, que puede ser la muerte celular, y ldrB, que puede ser la inhibición de la proliferación. Por ello, esta investigación abre la puerta a la posibilidad de utilizar la combinación de los genes hokD o ldrB con el promotor de survivina como terapia génica suicida en cáncer de mama y cérvix, debido al efecto antitumoral específico y potente in vitro e in vivo, y evitando los efectos secundarios de los tratamientos usados recientemente para estos cánceres. No obstante, se deben realizar más estudios con más líneas celulares tumorales y no tumorales para confirmar la seguridad y eficacia del tratamiento.

En conclusión, los resultados obtenidos en nuestros experimentos in vitro e in vivo sugieren que la transfección de genes hokD o ldrB bajo el control del promotor de survivina, un promotor específico del cáncer, parece ser una gran opción en futuras terapias contra el cáncer de mama y de cuello uterino debido a a su selectividad y alto efecto antiproliferativo solo en células tumorales sin afectar al resto del organismo.

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Claims (8)

REIVINDICACIONES

1.- Una construcción genética que comprende una secuencia de nucleótidos correspondiente a un sistema o vector de expresión génica que comprende al menos un polinucleótido de ARN o ADN de ldrB y/o hokD, operativamente enlazado con, al menos, un promotor de survivina que dirija la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar para su transcripción in vitro o in vivo.

2 - Una célula que comprende una construcción genética según la reivindicación 1.

3. - Una composición que comprende:

a) una construcción genética según la reivindicación 1, y/o

b) una célula según la reivindicación 2.

4. - La construcción genética según la reivindicación 1, la célula según la reivindicación 2, y/o la composición según la reivindicación 3, para su uso como medicamento.

5. - La construcción genética según la reivindicación 1, la célula según la reivindicación 2, y/o la composición según la reivindicación 3 para la prevención, mejora, alivio o tratamiento de una enfermedad proliferativa.

6. - La construcción genética, la célula y/o la composición para su uso según la reivindicación 5, donde la enfermedad proliferativa es el cáncer.

7. - El polinucleótido, la construcción genética, la célula y/o la composición para su uso según la reivindicación 6, donde la enfermedad proliferativa es el cáncer de mama.

8. - El polinucleótido, la construcción genética, la célula y/o la composición para su uso según la reivindicación 7, donde la enfermedad proliferativa es el cáncer de cuello uterino.