KR20230057336A - 메티오니나아제의 유전자 요법의 악성 종양에의 응용 - Google Patents

Abstract

메티오니나아제의 유전자 요법의 적용이 개시된다. 유전자 요법은 바이러스를 담체로 사용하고, 외인성 메티오니나아제 유전자를 삽입하고, 종양 내부에 메티오니나아제의 발현 시스템을 형성하여, 메티오닌의 추가 소비를 위한 내인성 메커니즘을 제공한다. 체외 세포학 실험에서 메티오니나아제 유전자 요법이 세포 내 메티오닌 수치를 유의하게 감소시키고, 종양 세포의 증식을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났고, 악성 종양 약물의 표적 치료 제조에 사용할 수 있다.

Description

메티오니나아제의 유전자 요법의 악성 종양에의 응용

본 발명은 의료 기술 분야의 종양 치료 및 유전자 치료 분야, 특히 메티오니나아제의 유전자 요법의 악성 종양의 표적 치료에서의 응용에 관한 것이다.

악성 종양은 인간의 생명과 건강을 심각하게 위협하는 흔한 질병으로, 2015년 최신 통계에 따르면, 악성 종양으로 인한 사망률은 전체 주민 사망의 23.91%를 차지한다. 지난 10년 동안 중국의 악성 종양 발병률은 연간 3.9%의 증가율을 유지했으며, 사망률은 연간 2.5%의 증가율을 유지했다. 즉, 하루 평균 1만명 이상, 매분 7.5명이 암 진단을 받는다. 악성 종양으로 인한 의료비는 2,200억을 초과하였는데, 이렇게 심각한 추세를 억제해야 한다. 현재, 악성 종양의 치료를 위한 많은 방법 및 방법이 있는데, 예를 들어 외과 수술, 화학 요법, 방사선 요법 등과 같은 것이 있는데, 이러한 치료법은 악성 종양에 일정한 효과가 있으나, 각각 심각한 부작용, 치료 효과 제한, 약물 내성 등이 존재하고, 따라서 새로운 표적화, 정확한 치료 수단, 예를 들어 유전자 요법과 같은 것을 찾는 것은 악성 종양 치료의 관건이 된다. 종양 세포의 빠른 성장으로 인해, 영양분과 대사에 대한 요구가 정상 미분화 세포와 다른 양상을 가지며, 지속적인 증식을 유지하기 위해서는, 종양 세포는 대사와 영양 섭취 방법을 조정해야 한다. 수많은 기초 및 임상 시험 결과에 따르면, 메티오닌, 글루타민, 글루타민산, 아르기닌, 트립토판과 같은 종양 의존성 아미노산과 그 유도체의 대사를 표적으로 하여, 신약을 개발하면, 종양 성장을 효과적으로 억제할 수 있다. 따라서, 표적 대사 조절 요법은 종양 치료의 새로운 방향이다.

메티오닌 의존성은 절대 다수 종양 세포, 예를 들어 유방암, 전립선암, 폐암, 대장암, 신장암, 방광암, 흑색종, 신경아교종 등의 공통적인 특징이지만, 정상 세포에는 메티오닌 의존성이 없으며, 고도의 악성 종양은 메티오닌에 대한 의존도가 더 높다. 일부 체내 체외 실험을 통해, 메티오닌 결핍 음식의 직접적인 섭취는 종양 세포의 증식을 지연시킬 수 있음을 확인하였다. 그러나 음식에 메티오닌이 결핍되거나 부족하면 체내의 영양실조와 대사장애를 일으키고 장기간 DNA의 낮은 메틸화 상태로 인해 암을 악화시킬 수도 있다. 그러면 메티오니나아제 MEGL 특이성을 통해 메티오닌을 분해하고, 이에 따라 체내 메티오닌을 감소시켜, 보다 효과적으로 종양세포의 성장을 억제하거나 감퇴시킬 수 있다. 그러나, 포유동물 자체는 메티오니나아제를 발현하지 않기 때문에, 외인성 투여 방식은 일정한 부작용을 가지게 되어, 종종 신체의 면역 반응을 유발하므로, 메티오니나아제의 내인성 발현을 탐색하는 것이 더 좋은 방법이 된다. 암 유전자 요법의 목적은 치료 유전자를 종양 세포에 도입하는 것이다. 표적 세포에 도입된 이러한 치료용 유전자는 돌연변이 유전자를 교정하거나, 활성 종양 유전자를 억제하거나 세포에 다른 특성을 발휘할 수 있다. 적절한 외인성 치료 유전자는 면역치료 유전자, 항-혈관신생 유전자, 화학보호 유전자 및 “자살" 유전자를 비제한적으로 포함하고, 변형된 바이러스 담체 또는 비(非)바이러스적 방법(전기천공법, 생물학적 및 지질 또는 폴리머 코팅을 포함함)을 이용하여 세포에 도입될 수 있다. 최적의 바이러스 담체에 대한 요구 사항에는 특정 표적 세포를 찾고 표적 세포에서 바이러스 유전자를 발현하는 효율적인 능력이 포함된다. 지난 수십 년 동안 바이러스 담체의 모든 이러한 특성이 개발되었고 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 관련 바이러스 및 종양 용해 바이러스 담체 등과 같은 생의학에서 광범위하게 연구되었다.

메티오닌은 필수 아미노산으로, 메티오닌 아데노실트랜스퍼라제에 의해 촉진되며, S-아데노실메티오닌(S-adenosylmethionine, SAM)을 생성한다. 활성 메티오닌으로도 알려진 SAM은, 체내에서 가장 중요한 메틸기의 직접 제공자이며 체내 DNA, 단백질과 같은 다양한 부동(不同) 물질의 메틸 전이 촉매 반응에 참여한다. 히스톤 메틸트랜스퍼라제 EZH2는 폴리콤 억제 복합체 2(PRC2)에 구비된 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성 성분인 것으로, 주로 히스톤 3의 라이신 27(H3K27)에 SAM의 활성 메틸기를 첨가하여 염색질 축합에 관여하며, 관련 유전자(예: 종양 억제 유전자)의 전사를 억제한다. 연구 결과 EZH2 및 히스톤 H3K27의 메틸화는 암과 밀접한 관련이 있음이 밝혀졌다. EZH2는 림프종, 전이성 전립선암 및 유방암에서 최초로 높게 발현되는 것으로 밝혀졌으며, 유방암의 침습과 관련이 있다. 또한 EZH2는 폐암, 림프종, 백혈병, 췌장암, 자궁경부암, 장암, 간암, 위암, 흑색종, 신장암, 방광암 등과 같은 많은 인간 악성 종양에서 과발현되고, 그 발현 수준은 전이성 종양에서 크게 증가했고, 암 환자의 불량한 예후와 밀접한 관련이 있다. 표적 EZH2 약제의 임상 전 모델은 뇌암 및 전립선암의 진행을 억제할 수 있음을 보여준다. 따라서 EZH2는 암 전이 치료를 위한 잠재적인 약물 표적이 될 수 있고, EZH2의 발현 및 활성을 감소시킴으로써, 히스톤의 메틸화를 감소시키고, 종양 억제 유전자의 발현을 강화하여 종양을 치료한다.

출원인은 외인성 MEGL 유전자에 삽입하어 메티오니나아제를 발현하는 바이러스 담체를 제작하였으며, 상기 담체는 메틸트랜스퍼라아제 EZH2의 발현 및 활성을 억제하여, 악성 종양의 성장 및 전이를 억제하였다.

일 측면에서, 본 출원은 외인성 MEGL 유전자가 삽입된 것을 특징으로 하는 바이러스 담체를 제공한다.

진일보하게는, 외인성 MEGL 유전자는 메티오닌 γ-리아제 유전자(Genbank accession No. L43133.1)이다.

또한, 담체는 EF1A를 프로모터로 사용한다.

또한 캐리어는 mcherry 형광 단백질을 운반한다.

또한, 외인성 MEGL 유전자 서열은 서열번호 1이다.

바이러스 담체 구성 방법은 다음과 같다: MEGL 유전자는 플라스미드로 서브클로닝되었고, MEGL 발현 플라스미드를 얻었고; MEGL 발현 플라스미드 및 헬퍼 플라스미드로 293T 세포를 형질감염시키고; 상층액을 수집하여 농축, 정제하여, 바이러스 담체를 얻었다.

진일보하게는, MEGL 발현 플라스미드는 293T 세포의 동시 형질감염을 위한 MEGL 발현 플라스미드이고, 헬퍼 플라스미드는 바이러스 패키징을 위한 헬퍼 플라스미드이다.

진일보하게는, MEGL 발현 플라스미드는 mCherry 적색 형광 단백질을 운반한다.

구성 방법은 구체적으로:

(a) BP 반응 구성 진입 담체: 표적 유전자 attB1-MEGL-attB2의 서열을 포함하는 Gateway 발현 담체를 서열 attP1-ccdB-attP2를 포함하는 도너 담체와 혼합하고; Int 및 IHF를 포함하는 BP 클로나아제 효소 혼합물을 첨가하고, 25˚C에서 1시간 동안 배양하고, 37˚C에서 10분간 프로테이나제(proteinase) K로 처리하여 표적 유전자 MEGL을 포함하는 진입 담체 및 자살 유전자를 포함하는 발현 담체를 생성; 진입 담체를 대장균(E. coli) Stbl3로 형질전환하고, 양성 클론을 스크리닝하여 서열을 검증함;

(b) 표적 담체의 구성, 발현 제어 요소의 하류에 2개의 재조합 부위 attR1 및 attR2가 있고, 둘 다 크기가 125bp이고, attR1과 attR2 사이에 ccdB 자살 유전자가 있음;

(c) LR 반응을 통해 최종 발현 담체를 구성함: 진입 담체 및 표적 담체의 두 플라스미드를 혼합하고, Int, IHF, Xis 등을 포함하는 재조합 인자의 LR 클로나아제 효소 혼합물을 첨가하고, 25˚C 온도로 밤새 보관하고, 37˚C에서 10분 동안 프로테이나제 K로 처리한 다음 형질전환함; 융합 플라스미드를 생성하고,

attL1 서열은 attR1 서열과 재조합되고, 융합 플라스미드는 두 개의 새로운 플라스미드로 분해되고, 즉, 표적 유전자를 갖는 표적 담체의 최종 발현 담체를 얻음; 대상 제품을 대장균 Stbl3로 변환하고, 양성 클론을 스크리닝하여 서열을 검증함.

진일보하게는, 상기 바이러스 담체는 렌티 바이러스 담체다.

다른 일 측면에 있어서, 본원은 악성 종양 치료용 약물의 제조에 있어서 상기 바이러스 담체의 응용을 제공한다.

진일보하게는, 약제는 종양 세포를 직접 죽이는 약제다.

진일보하게는, 악성 종양은 신경교종(신경아교종)이다.

다른 일 측면에 있어서, 본원은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 EZH2 억제제의 제조에서 상기 언급된 바이러스 담체의 응용을 제공한다.

다른 일 측면에 있어서, 본원은 상기 바이러스 담체를 필요로 하는 대상체에게 투여하거나, 상기 구성방법에 따라 제작된 바이러스 담체를 투여하는 것을 특징으로 하는 악성 종양 치료방법을 제공한다.

진일보하게는, 악성 종양은 신경교종이다.

바이러스 담체는 렌티 바이러스 담체, 레트로 바이러스 담체 및 아데노 바이러스 담체 등 당업계에 알려져 있거나 개발 중인 바이러스 담체고, 바람직하게는 렌티 바이러스 담체다.

상기 악성 종양은 신경교종, 유방암, 전립선암, 췌장암, 간암, 결장암, 직장암, 식도암, 후두암, 백혈병, 림프종, 흑색종, 자궁암, 난소암, 피부암, 기관지암, 세기관지암, 요도암, 신장암, 구강암, 질암, 담관암, 방광암 또는 비인두암을 비제한적으로 포함한다. 상기 언급된 약물 또는 억제제의 투여 방법은 다양한 경로를 통해 투여될 수 있으며, 경구 투여, 국소 투여, 주사 투여(정맥, 복막, 피하, 근육 내, 종양 내, 척수 투여를 포함하나 이에 제한되지 않음) 등을 비제한적으로 포함한다.

본 발명이 종래기술 대비, 가지는 장점은:

본 발명은 메티오닌 효소를 발현하는 바이러스 시스템을 제공하여, 메틸트랜스퍼라제 EZH2의 발현 및 활성을 억제함으로써, 악성 종양의 성장 및 전이를 억제한다.

레트로 바이러스 및 재조합 아데노 바이러스와 비교하여, 상기 바이러스 발현 시스템은 외인성 유전자 조각을 수용할 수 있는 큰 용량을 가지고 있으며, 안정적이고 장기적인 유전자 발현이 가능하며, 형질감염 효율이 높고, 세포 면역 반응과 같은 어떤 이점도 만들지 않는다. 동시에 mCherry 형광 단백질은 세포에 대한 독성이 적고, 세포 감염을 관찰하는 데 유용하다.

도 1은 과발현 MEGL 바이러스 담체의 구성도이다.
도 2는 과발현된 MEGL 바이러스에 감염된 신경교종 세포를 형광 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 3은 MEGL 과발현 바이러스에 감염된 표적 종양세포의 PCR 및 웨스턴 블롯 동정 결과를 나타낸 그래프이다. 위는 al time PCR 결과이고 아래는 스턴 블롯(stern blot) 결과이다. 그 중, V 그룹: 빈 대조군 바이러스군, M 그룹: MEGL 과발현 바이러스군.
도 4는 과발현 MEGL 바이러스 감염의 LC-MS 식별 후 세포 내 메티오닌 수준의 감소를 보여준다. 그 중, V 그룹: 빈 대조군 바이러스군, M 그룹: MEGL 과발현 바이러스군.
도 5는 MEGL 바이러스의 과발현이 신경교종 세포의 증식을 억제함을 보여준다. 그 중 V 그룹: 빈 담체 대조 바이러스군, M 그룹: MEGL 과발현 바이러스군. 모든 데이터는 평균 ±÷ 표준 편차로 표시된다. (n=3), *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001은 그룹 V와 비교하였다.
도 6은 MEGL 바이러스의 과발현이 종양 세포에서 EZH2의 발현을 억제함을 보여준다. 위는 l timePCR에 의해 검출된 EZH2 유전자 발현의 하향 조절이다; 다음은 스턴 블롯(stern Blot)에 의해 검출된 EZH2 단백질 발현의 하향 조절이다. V 그룹: 빈 대조군 바이러스 그룹, M 그룹: MEGL 과발현 바이러스군. 모든 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다. (n=3), *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001을 V 그룹과 비교하였다.

아래 실시예에 기초하여, 본 발명을 더 잘 이해할 수 있다. 물론, 통상의 기술자가 용이하게 이해할 수 있는 바와 같이, 실시예가 묘사하는 내용은 단지 본 발명을 설명할 뿐인 것으로, 청구범위에 상세히 설명된 본 발명을 제한하지 않으며 제한해서도 안 된다.

실시예 1: MEGL 발현 담체 구성

사용된 MEGL/3xFLAG 서열은 다음과 같다(서열번호 1):

바이러스 담체는 Cyagen(

)에서 제공되고, 주로 Gateway 클로닝 기술을 채용하여 발현 담체를 구성한다. 게이트웨이 기술은 BP와 LR의 두 가지 반응을 포함하며, BP 반응은 attB DNA 단편 또는 발현 클론과 attP 도너 담체 사이의 재조합 반응을 사용하여 진입 클론을 생성한다. LR 반응은 attL 항목 클론과 attR 대상 담체 사이의 재조합 반응이다. 세부 사항은 다음과 같다:

1) BP 반응 구성 진입 담체(Entry Vector): 표적 유전자를 포함하는 게이트웨이 발현 담체(attB1-MEGL-attB2 서열)를 attP1-ccdB(자살 유전자)-attP2 서열을 갖는 도너 담체(pDONR)와 혼합하고, Int, IHF를 포함한 BP 클로나아제 효소 혼합물을 첨가하고, 25˚C에서 1시간 동안 보온시키고, 37˚C에서 10분 동안 프로테이나제 K로 처리하고, 이때, attP 및 attB 서열은 재조합이 발생하고, 표적 유전자(MEGL)가 포함된 진입 담체(Entry Vector)와 자살 유전자가 포함된 발현 담체를 생성하였다. 진입 담체를 대장균 Stbl3로 변환하고, 양성 클론을 스크리닝하여 서열을 검증함.

2) 표적 담체(Destination Vector)도 게이트웨이 시스템과 일치하는데, 즉, 표적 담체의 발현 제어 요소의 다운스트림에 두 개의 재조합 사이트 attR1 및 attR2가 있으며, 둘 다 크기가 125bp이고, 또한 ccdB 자살 유전자를 끼운다.

3) 최종 발현 담체를 구성하기 위한 LR 반응: 진입 담체(Entry Vector)와 표적 담체(Destination Vector)의 두 플라스미드를 혼합하고, Int, INF, Xis 등 재조합 유전자를 포함하는 LR 클로나아제 효소 혼합물을 첨가하고, 25˚C에서 밤새 보존하고, 37˚C에서 10분 동안 프로테이나제 K로 처리하여 형질전환시킨다. 이때 attR2 서열과 attL2 서열이 재조합되고, 융합 플라스미드를 생성한다. attL1 서열은 attR1 서열과 재조합되고, 융합 플라스미드는 두 개의 새로운 플라스미드로 분되는데, 즉 표적 유전자를 갖는 표적 담체의 최종 발현 담체를 얻을 수 있다. 대상 제품을 대장균 Stbl3으로 형질전환시키고, 양성 클론을 스크리닝하여 서열을 검증함.

실시예 2: 과발현 MEGL 바이러스의 제조(렌티 바이러스를 예로 함)

1) 바이러스 패키징: 형질감염 하루 전, 293T 세포를 배양 접시에 접종하고, 접종된 세포의 수는 바람직하게는 형질감염 당일의 세포 생장이 90% ~ 95% 융합에 달하는 것이 바람직함; 형질감염 당일, 293T 세포에서 배지를 제거하고, 바이러스 패키징용 배지 10mL(10cm 페트리 접시)를 첨가하였다. 아래 방법에 따라 인산칼슘-DNA 침전물을 제조함: A. 칼슘-DNA 혼합물: 5mL 멸균 EP 튜브에 CaCl₂를 먼저 넣고, 그런 다음 보조 플라스미드, 표적 유전자 플라스미드를 추가하고 균일하게 혼합한다. B. 칼슘-DNA 혼합물을 포함하는 원심분리 튜브를 와류 진탕기에 넣고, 액체를 와동시킨 다음, 2ХHBS를 한 방울씩 첨가하고, 적가 완료 후 몇 초 동안 와동시키고, 5분 동안 정치시킨다. 인산칼슘-DNA 현탁액을 상기 세포의 세포배양액에 붓고, 매체를 부드럽게 섞고,

37 리버스, 5% CO2 포화 습도 인큐베이터에 배치하여 배양하고; 형질감염 4 - 6시간 후, 원래의 배양액을 흡인하고, 바이러스 패키징용 배양 배지 10 mL를 추가하고, 37개의 5% CO2 포화 습도 인큐베이터에 지속하여 배양하였다.

2) 바이러스 수집 및 농축: 형질전환 48시간 후, 바이러스가 포함된 배양 배지를 50mL 원심분리기 튜브에 수집하였다; 바이러스 상층액을 저속으로 원심분리하여, 세포 파편을 제거하고, 상층액을 회수하였다; 0.45μm 소형 필터를 사용하여 여과하고, 여과액을 수집하였다; 여과액의 부피에 따라 상응하는 양의 PEG6000 및 NaCl 용액을 첨가하였다. 충분히 균일하게 혼합하여, 정치 상태로 4˚C로 밤새 두고, 다음날, 4˚C, 1500 x g에서 30분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하였다; HBSS을 사용하여 바이러스 펠릿을 용해시키고, 펠릿을 단일 바이러스 현탁액으로 충분히 피펫팅하고, 그런 다음 바이러스를 동결 튜브로 분취하였다.

3) 바이러스 역가의 실시간 PCR 식별: 바이러스 감염 1일 전, 6웰 플레이트 상의 플레이트 293T, 웰당 5개의 플레이트, 웰당 5×10⁵ 개/웰, 세포 접종 24시간 후, 두 개의 웰에 있는 세포를 혈구 계산기로 계수하였고, 감염 당시 세포 수의 실제 수치를 결정하여 N으로 기록하였다. 다른 배양 플레이트의 배지를 버리고 최종 농도 5 μg/mL의 폴리브렌을 포함하는 새로운 배지로 교체하였다. 농축된 바이러스를 배지 200배, 즉 1μL로, 기본배지 199μL에 바이러스를 첨가하였다. 3개의 배양 웰에 각각 0.5 μL, 5 μL 및 5 μL의 희석된 바이러스를 추가하고; 감염이 시작된 후 20시간 후에 배양 상층액을 제거하고, DNaseI가 포함된 신선한 배지 500 μL로 교체하였다. 37˚C에서 15분 동안 분해, 이 단계는 잔류 플라스미드 DNA를 제거하는 것이다. 그런 다음 2mL의 일반 배지로 변경하고, 48시간 동안 배양을 계속하고, 0.5mL 0.25% 트립신-EDTA 용액을 사용하여 세포를 분해하고, 원심분리하여 세포를 수집하였다. DNeasy 키트의 지침에 따라 게놈 DNA를 추출하고 실시간 형광 PCR로 증폭시켰다. 역가 계산 공식(integration units per mL，IU/mL)은 다음과 같다:

IU/mL＝(C×N×D×1000)/V

여기서: C = 게놈당 통합된 평균 바이러스 카피 수; N = 감염 시 세포 수(약 1×10⁶ ) D = 바이러스 담체의 희석 배수, V = 추가된 희석된 바이러스의 부피 수.

실시예 3: MEGL 바이러스 과발현의 항종양 효과.

1. 대수 성장기의 신경교종 세포 U87, snb19를 6웰 플레이트에 접종하였고, 세포 밀도가 약 30% ~ 50%로 성장하면, MOI=10에 따라 대조군 빈 바이러스 담체(이하 둘 다 V 그룹으로 정의됨) 및 과발현된 MEGL 렌티 바이러스(이하 둘 다 M 그룹으로 정의됨)를 추가하고, 최종 농도 5μg/mL 폴리브렌 시약을 첨가하고, 24시간 후, 배양용 일반 배지로 교체하고, 48시간 동안 배양을 계속한 후, 최종 농도 2 μg/mL1의 퓨로마이신을 채용하여 스크리닝하였고, 24시간마다 형광 현미경으로 형광 강도와 세포 비율을 관찰하였고, 적색 형광이 되는 세포의 양이 95%를 초과하여 스크리닝이 성공적임을 나타내었다. 세포 스크리닝 결과는 도 2에 도시된 바와 같다.

2. 실시간 PCR 및 웨스턴 블롯을 사용하여 과발현 MEGL 바이러스로 감염된 세포에서 메티오니나아제의 발현을 확인하였다.

바이러스 감염 후 성장이 양호한 세포를 채취하여 트리졸 (Trizol) 방법에 따라 총 RNA를 추출한 후 체외 (in vitro) 에서 총 RNA 템플릿 1 μg을 cDNA로 역전사시켰다. cDNA를 템플릿으로 하여, 예비 변성 (94 변성, 2분), 변성 (94 변성, 30초), 접합 (annealing) (55 접합, 30초), 확장 (extension) (72 확장, 1분) 순환 30회, 최종 확장 (final extension) (72 최종 확장, 10분) 증폭을 완료하였다. 증폭된 산물은 아가로스 젤 전기영동을 통해 실행되었고, 젤 이미징 시스템 하에서 노출 및 촬영되었다.

여기서, MEGL 프라이머 서열은 다음과 같다:

MEGL-F：CACTTCTACAGCCGCATCTCCAAC

MEGL-R：GACCACCACAAGCACATCACTCC

결과는 도 3A에 도시된 바와 같이, PCR 결과에 따르면, M 그룹이 300 ~ 400bp에서 특정 MEGL 표적 유전자 조각(387bp)을 검출하였고, 과발현된 MEGL 바이러스가 성공적으로 신경교종을 감염시켰음을 나타내었다. 바이러스 감염 후 성장이 양호한 세포를 취하여 200 μl RIPA 용해액, 2μl PMSF를 첨가하고, 깨끗한 세포 스크래퍼로 세포를 긁어내어, 새 1.5ml EP 튜브에 옮겼다. 10분 동안 얼음 위에서 용해, 초음파 처리, 3초 동안 초음파 처리 및 3초 동안 휴식, 총 30초. 4˚C, 12000rpm, 15분 동안 원심분리기, 상층액을 다른 깨끗한 EP 튜브에 옮기고 -20에 보관하였다. 총 단백질 농도를 검출하는 BCA 방법. 웨스턴 블롯을 사용하여 MEGL을 검출하였고, 내부 참조로 튜블린을 사용하였다. 도 3B에 도시된 바와 같이, M 그룹은 43KD 부근에서 특정 밴드(*는 메티오니나아제 단백질 밴드를 의미함)가 검출되어, MEGL 과발현 바이러스가 성공적으로 감염되었음을 나타내었다.

3. 과발현 MEGL 바이러스로 감염된 후의 세포의 메티오니나아제 활성을 확인하였다. 과발현 MEGL 바이러스에 의해 감염된 악성 종양 세포에서 세포 내 메티오닌 수준을 확인하기 위해 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LC-MS) 을 사용하였다.

바이러스 감염 후 대수 성장기의 신경교종 세포 U87-V, U87-M, snb19-V, snb19-M을 취하여 각각 1.5×10⁶ 개/ml 단일 세포 현탁액을 준비하고, 150mm 페트리 접시에 1ml를 취하여, 3일 동안 배양하고, 트립신 처리하여 세포를 수집하고, 미리 냉각된 PBS로 2회 세척하였다. 미리 냉각된 60% 메탄올수 2 mL를 첨가하여 추출하고, 초음파를 이용하여 세포를 파쇄하고, 초음파 3초, 3초 휴식, 총 5회, 얼음욕에 주의한다. 원심분리하여 상층액을 시료병에 넣고, 침전물에 60% 메탄올 1mL를 첨가하여, 추출을 반복한다. 상층액을 병합하고, 냉동 건조하여, 밤새 보관한다. 300ul의 사전 냉각된 60% 메탄올 물을 추가하여 재용해하고, 초음파로 와동하고, 0.22μm 멤브레인으로 여과하고, 기계에서 테스트하였다. 그 결과 도 4에 도시된 바와 같이: snb19 세포에서, M 그룹은 V 그룹 대비, 세포 내 메티오닌 수준은 19.9배 감소하였고; U87 세포에서는 M 그룹이 V 그룹에 비해 3.15배 감소하였다. 상기 결과는 과발현된 MEGL 바이러스가 성공적으로 세포를 감염시키고 세포 내 메티오닌 함량을 감소시키는 역할을 한다는 것을 나타낸다.

4. CCK8 방법을 사용하여 MEGL 바이러스의 과발현이 신경교종 세포 증식 억제에 미치는 영향을 검사하였다.

바이러스 감염의 대수 성장기에 있는 신경교종 세포 U87-V, U87-M, snb19-V, snb19-M을 취하여 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 96웰 플레이트에 웰당 100 μL 세포 현탁액(1.5×10³ 개 세포 포함)을 접종하고, 각 그룹에 5개의 보조 웰을 접종하였다; 1일째, 3일째, 4일째, 5일째, 7일째에 각각 세포 증식 상태를 테스트하였고, 즉 각 공간에 10ul CCK-8 용액을 추가하여, 기포를 발생을 피면하였고; 세포를 37˚C, 5% CO₂ 에서, 1시간 동안 계속 인큐베이팅하고, 배양 플레이트를 꺼내고, 마이크로 플레이트 리더로 450nm에서 세포의 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 도 5에 도시된 바와 같이, MEGL 바이러스의 과발현은 신경교종 세포의 증식을 유의하게 억제하였다.

5. 실시간 PCR은 MEGL 바이러스의 과발현이 종양 세포에서 EZH2 유전자의 발현을 감소시키는 것을 테스트하였다.

바이러스 감염 후 성장이 양호한 세포를 채취하여 트리졸 (Trizol) 방법에 따라 총 세포 RNA를 추출한 후 체외 (in vitro) 에서 1 μg의 RNA 템플릿을 cDNA로 역전사시켰다. cDNA를 템플릿으로 하여, 실시간 PCR 반응 조건은: 50˚C에서 2분, 95˚C에서 10분, 95˚C에서 15초, 60˚C에서 1분, 72˚C에서 1분(총 40 사이클), 마지막으로 제품의 용해 곡선을 테스트하였는데, 2^-△△Ct 방법을 사용하여 계산하였다. 그 결과는 도 6A에 도시된 바와 같이, MEGL을 과발현하는 바이러스는 세포 내 EZH2 유전자 발현을 감소시켰다. 도 6B에 도시된 바와 같이, 웨스턴 블롯의 결과는 MEGL 바이러스의 과발현이 세포에서 EZH2 단백질의 발현을 감소시킨다는 것을 추가로 확인하였다.

상기 시험관내 실험은 본 발명에 사용된 바이러스 매개 메티오니나아제 시스템이 EZH2를 억제함으로써 종양 성장을 억제하고, 우수한 항종양 효과를 갖는다는 것을 추가로 설명한다.

SEQUENCE LISTING <110> Guangzhou Sinogen Pharmaceutical Co., Ltd. <120> APPLICATION OF METHIONINASE GENE THERAPY IN TREATMENT OF MALIGNANT TUMOR <130> HP202000172P <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1263 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MEGL <400> 1 atgcgcgact cccataacaa caccggtttt tccacacggg ccattcacca cggctacgac 60 ccgctttccc acggtggtgc cttggtgcca ccggtgtacc agaccgcgac ctatgccttc 120 ccgactgtcg aatacggcgc tgcgtgcttc gccggggagg aggcggggca cttctacagc 180 cgcatctcca accccaccct ggccttgctc gagcaacgca tggcctcgtt ggagggtggt 240 gaggcgggat tggcgctggc gtcggggatg ggagccatta cttcgaccct ctggaccctg 300 ctgcggcctg gtgatgagct gatcgtgggg cgcaccttgt atggctgcac ctttgcgttc 360 ctgcaccatg gcattggcga gttcggggtc aagatccacc atgtcgacct taacgatgcc 420 aaggccctga aagcggcgat caacagcaaa acgcggatga tctacttcga aacaccggcc 480 aaccccaaca tgcaactggt ggatatagcg gcggtcgtcg aggcagtgcg ggggagtgat 540 gtgcttgtgg tggtcgacaa cacctactgc acgccctacc tgcagcggcc actggaactg 600 ggggcagacc tggtggtgca ttcggcaacc aagtacctca gtggccatgg cgacatcact 660 gcgggcctgg tggtggggcg caaggctttg gtcgaccgca ttcggctgga agggctgaaa 720 gacatgaccg gggcagcctt gtcaccgcat gacgctgcgt tgttgatgcg cggcatcaag 780 accctggcgc tgcgcatgga ccggcattgc gccaacgccc tggaggtcgc gcagttcctg 840 gccgggcagc cccaggtgga gctgatccac tacccgggct tgccgtcgtt tgcccagtac 900 gaactggcac agcggcagat gcgtttgccg ggcgggatga ttgcctttga gctcaagggc 960 ggtatcgagg ccgggcgcgg cttcatgaat gccctgcagc tttttgcccg tgcggtgagc 1020 ctgggggatg ccgagtcgct ggcacagcac ccggcgagca tgacgcactc cagttacacg 1080 ccacaagagc gggcgcatca cgggatatca gaggggctgg tgaggttgtc agtggggctg 1140 gaggatgtgg aggacctgct ggcagatatc gagttggcgt tggaggcgtg tgcagactac 1200 aaagaccatg acggtgatta taaagatcat gatatcgatt acaaggatga cgatgacaag 1260 tga 1263 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MEGL-F <400> 2 cacttctaca gccgcatctc caac 24 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MEGL-R <400> 3 gaccaccaca agcacatcac tcc 23

Claims (20)

1. 바이러스 담체에 있어서,
   외부 MEGL 유전자가 삽입된 것을 특징으로 하는,
   바이러스 담체.
2. 제1항에 있어서,
   외부 MEGL 유전자는 메티오닌 γ-리아제 유전자인, 바이러스 담체.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 담체는 EF1A를 프로모터로 하는, 바이러스 담체.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 담체는 mcherry 형광 단백질을 보유하는, 바이러스 담체.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   외부 MEGL 유전자의 서열은 서열번호 1인, 바이러스 담체.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 바이러스 담체는 아래 방법에 따라 구성됨:
   MEGL 유전자를 플라스미드에 서브클로닝하여, MEGL 발현 플라스미드를 얻고; MEGL 발현 플라스미드 및 헬퍼 플라스미드를 293T 세포에 형질감염시키고; 상층액을 수집하여 농축, 정제하여, 바이러스 담체를 얻음.
7. 제6항에 있어서,
   MEGL 발현 플라스미드는 293T 세포의 동시 형질감염을 위한 MEGL 발현 플라스미드이고, 헬퍼 플라스미드는 바이러스 패키징을 위한 헬퍼 플라스미드인, 바이러스 담체.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
   MEGL 발현 플라스미드는 mCherry 적색 형광 단백질을 포함하는, 바이러스 담체.
9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 바이러스 담체는 아래 방법에 따라 구성됨:
   (a) BP 반응 구성 진입 담체: 표적 유전자 attB1-MEGL-attB2의 서열을 포함하는 Gateway 발현 담체를 서열 attP1-ccdB-attP2를 포함하는 도너(donor) 담체와 혼합하고; Int 및 IHF를 포함하는 BP 클로나아제 효소 혼합물을 첨가하고, 25˚C에서 1시간 동안 배양하고, 37˚C에서 10분간 프로테이나제(proteinase) K로 처리하여 표적 유전자 MEGL을 포함하는 진입 담체 및 자살 유전자를 포함하는 발현 담체를 생성; 진입 담체를 대장균(E. coli) Stbl3로 형질전환하고, 양성 클론을 스크리닝하여 서열을 검증함;
   (b) 표적 담체의 구성, 발현 제어 요소의 하류에 2개의 재조합 부위 attR1 및 attR2가 있고, 둘 다 크기가 125bp이고, attR1과 attR2 사이에 ccdB 자살 유전자가 있음;
   (c) LR 반응을 통해 최종 발현 담체를 구성함: 진입 담체 및 표적 담체의 두 플라스미드를 혼합하고, Int, IHF, Xis 등을 포함하는 재조합 인자의 LR 클로나아제 효소 혼합물을 첨가하고, 25˚C 온도로 밤새 보관하고, 37˚C에서 10분 동안 프로테이나제 K로 처리한 다음 형질전환함; 융합 플라스미드를 생성하고,
   attL1 서열은 attR1 서열과 재조합되고, 융합 플라스미드는 두 개의 새로운 플라스미드로 분해되고, 즉, 표적 유전자를 갖는 표적 담체의 최종 발현 담체를 얻음; 대상 제품을 대장균 Stbl3로 변환하고, 양성 클론을 스크리닝하여 서열을 검증함.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    렌티 바이러스 담체인, 바이러스 담체.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 바이러스 담체의 구성 방법에 있어서,
    플라스미드에 MEGL 유전자를 서브클로닝하여, MEGL 발현 플라스미드를 얻는 단계, MEGL 발현 플라스미드 및 헬퍼 플라스미드를 293T 세포에 형질감염시키는 단계, 상층액을 수집하여 농축, 정제하여 표적 바이러스를 얻는 단계를 포함하는, 방법.
12. 제11항에 있어서,
    MEGL 발현 플라스미드는 293T 세포에 공동 형질감염된 MEGL 발현 플라스미드이고, 헬퍼 플라스미드는 바이러스 패키징용 헬퍼 플라스미드인, 방법.
13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 MEGL 발현 플라스미드는 mCherry 적색 형광 단백질을 운반하는 것인, 방법.
14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    아래 단계를 포함하는, 방법.
    (a) BP 반응 구성 진입 담체: 표적 유전자 attB1-MEGL-attB2의 서열을 포함하는 Gateway 발현 담체를 서열 attP1-ccdB-attP2를 포함하는 도너 담체와 혼합하고; Int 및 IHF를 포함하는 BP 클로나아제 효소 혼합물을 첨가하고, 25˚C에서 1시간 동안 배양하고, 37˚C에서 10분간 프로테이나제(proteinase) K로 처리하여 표적 유전자 MEGL을 포함하는 진입 담체 및 자살 유전자를 포함하는 발현 담체를 생성; 진입 담체를 대장균(E. coli) Stbl3로 형질전환하고, 양성 클론을 스크리닝하여 서열을 검증함;
    (b) 표적 담체의 구성, 발현 제어 요소의 하류에 2개의 재조합 부위 attR1 및 attR2가 있고, 둘 다 크기가 125bp이고, attR1과 attR2 사이에 ccdB 자살 유전자가 있음;
    (c) LR 반응을 통해 최종 발현 담체를 구성함: 진입 담체 및 표적 담체의 두 플라스미드를 혼합하고, Int, IHF, Xis 등을 포함하는 재조합 인자의 LR 클로나아제 효소 혼합물을 첨가하고, 25˚C 온도로 밤새 보관하고, 37˚C에서 10분 동안 프로테이나제 K로 처리한 다음 형질전환함; 융합 플라스미드를 생성하고,
    attL1 서열은 attR1 서열과 재조합되고, 융합 플라스미드는 두 개의 새로운 플라스미드로 분해되고, 즉, 표적 유전자를 갖는 표적 담체의 최종 발현 담체를 얻음; 대상 제품을 대장균 Stbl3로 변환하고, 양성 클론을 스크리닝하여 서열을 검증함.
15. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 바이러스 담체, 또는 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항의 구성 방법으로 구성된 바이러스 담체의 악성 종양 치료용 약제의 제조에의 응용.
16. 제15항에 있어서,
    상기 약제는 종양 세포를 직접 사멸시키는 약제인, 용도.
17. 제15항 또는 제16항에 있어서,
    악성 종양은 신경교종인, 용도.
18. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 바이러스 담체, 또는 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항의 구성 방법으로 구성된 바이러스 담체의, 메틸트랜스퍼라제 EZH2 억제제의 제조에 있어서의 응용.
19. 악성 종양의 치료 방법에 있어서,
    제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 바이러스 담체, 또는 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항의 구성 방법으로 구성된 바이러스 담체를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 것을 특징으로 하는, 방법.
20. 제19항에 있어서,
    악성 종양은 신경교종인, 방법.

Images