CZ308738B6 - Způsob úpravy molekuly nukleové kyseliny pro usnadění jejího přenosu do hostitelských buněk a upravená molekula nukleové kyseliny - Google Patents

Abstract

Předložený vynález se týká zejména způsobu úpravy molekuly nukleové kyseliny pro její efektivní přenos do prokaryotické nebo eukaryotické buňky. Molekula nukleové kyseliny (NK) upravená podle vynálezu představuje nereplikativní element obsahující kódující či nekódující molekulu NK. Způsob úpravy molekuly NK spočívá v tom, že se k jedné straně molekuly NK připojí vlásenková struktura a k druhé straně se připojí transportní molekula, která snadno proniká biologickými bariérami. Dále se vynález týká upravené molekuly NK, tedy molekuly NK, která má být přenesena do hostitelské buňky, upravené způsobem podle vynálezu. Předložený vynález se také týká způsobu přenosu požadované molekuly nukleové kyseliny do hostitelské buňky, kdy se požadovaná molekula nukleové kyseliny, která má být přenesena do hostitelské buňky, upraví způsobem podle vynálezu a takto upravená molekula se uvede do kontaktu s buňkou, do které má být požadovaná molekula nukleové kyseliny přenesena. Předložený vynález poskytuje vysoce efektivní prostředky pro oblast genového inženýrství. Velmi jednoduchým a ekonomicky výhodným řešením je možné vnášet molekuly NK do buněk.

Description

Způsob úpravy molekuly nukleové kyseliny pro usnadnění jejího přenosu do hostitelských buněk a upravená molekula nukleové kyseliny

Oblast techniky

Předkládaný vynález poskytuje velice účinný prostředek pro genový přenos. Tato skutečnost je dána způsobem úpravy molekuly nukleové kyseliny (transgenu) pro její efektivní přenos do prokaryotické nebo eukaryotické buňky. Molekula nukleové kyseliny (NK) upravená podle vynálezu představuje nereplikativní element obsahující kódující či nekódující molekulu NK. Po přenosu takto modifikované NK do buňky může dojít k efektivnímu přímému ovlivnění funkcí buňky zásahem do její fyziologie. V oblasti prokaryotických buněk může být systém využit k inhibici růstu mikrobů in vivo, omezení virulence inhibicí příslušných genů, inhibici exprese genů zodpovědných za rezistenci k antibiotikům případně odstranění plazmidů nesoucích geny virulence nebo rezistence (terapeutické využití). U eukaryotických buněk může systém ovlivnit funkci buňky regulací exprese případně dalšími interakcemi v buňce, např. interakcí nukleová kyselina-protein. Tato vlastnost může být využita v oblasti inhibice růstu nádorových buněk, k ovlivnění produkce signálních proteinů, protilátek a k dalšímu ovlivnění buněk imunitního systému. Další možností je využití se systémy editace genomu (např. CRISPR/Cas9). Tyto vlastnosti mohou být rovněž využity v laboratorních podmínkách in vitro a pro terapeutické účely in vivo. U obou typů buněk mohou být na základě předloženého vynálezu vytvořeny další aplikace.

Dosavadní stav techniky

Přijetí exogenní genetické informace buňkou je jedním ze základních kroků biotechnologie a genového inženýrství. Exogenní genetická informace je do eukaryotické nebo prokaryotické buňky vnesena procesem zvaným transfekce (eukaryotické buňky), resp. horizontálním přenosem genetické informace (prokaryotické buňky). V případě prokaryotických buněk horizontální přenos genetické informace zahrnuje vnesení nukleové kyseliny metodou transformace (vnesení extracelulámí neupravené nukleové kyseliny), transdukce (vnesení nukleové kyseliny bakteriofágem), konjugace (přenos mobilních genetických elementů mezi donorovou a recipientní bakteriální buňkou). V laboratorních podmínkách se pro vnesení nukleové kyseliny do prokaryotické buňky nej častěji používá systém transformace, při němž je exogenní genetická informace vpravena do kompetentních buněk. Z terminologického hlediska nebývá u eukaryotických buněk proces označován jako transformace, neboť tím je myšlena přeměna normálních buněk v buňky nádorové. V dalším textuje pro vnesení genetické informace do obou typů buňky (prokaryotické i eukaryotické) používán obecný termín transformace. Efektivita prostupu nukleových kyselin do buňky může být zvýšena chemickými látkami nebo fyzikálními metodami. Mezi ně může patřit prostup nukleové kyseliny přes póry nebo permeabilizací buněčné membrány.

Pro zajištění transformace eukaryotických buněk a v některých případech i prokaryot v podmínkách in vivo jsou používány metody vnesení genetické informace viry nebo způsoby nevirových přenašečů (Sung Y.K., Kim S.W. Recent advances in the development of gene delivery systems, Biomater. Res., 2019, 12; 23:8). V případě virových vektorů se obvykle jedná o defektní partikule, neschopné samostatné replikace a tím i nekontrolovatelné replikace vnášené genetické informace. Především jsou využívány retro viry, adenoviry a herpes simplex viry u eukaryot a bakteriofágy u prokaryot. Skupina nevirových vektorů zahrnuje metody fyzikální a chemické. Jako příklad fyzikálních metod lze jmenovat injektáž NK pomocí jehly, při níž je nukleová kyselina vnesena přímo do buňky jehlou, balistickou metodu, která využívá vnesení NK obvykle na zlatých nanočásticích, sonoporaci, vnesení nukleových kyselin pomocí ultrazvuku, výše zmíněnou elektroporaci, fotoporaci prostřednictvím laseru, magnetickou poraci při níž je nukleová kyselina vázána na magnetické částice, nebo hydroporaci. K efektivnímu průniku do buněk je dále využíváno spojení nukleové kyseliny a chemického nosiče (molekula/polymer), který' umožní

- 1 CZ 308738 B6 efektivní prostup přes cytoplazmatickou membránu. Mezi chemické nosiče patří anorganické částice (křemík, zlato, měď, stříbro, železo apoď), biologicky odbouratelné částice (kationtové lipidy, peptidové vektory) a polymery (polyetylenimin, polymetakrylát apod.) a další. Současný intenzivní výzkum chemických nosičů je zaměřen například na molekuly s kladným nábojem (např. zmíněné polymery), které umožní prostup záporně nabité nukleové kyselině. Spojení s kladně nabitými polysacharidy, případně krátkými peptidy, které jsou používány především pro transformaci prokaryot (Sung Y.K., Kim S.W. Recent advances in the development of gene delivery Systems, Biomater. Res., 2019, 23:8; Ferrer-Miralles N., Vázquez E., Villaverde A. Membrane-active peptides for non-viral gene therapy: Making the safest easier. Trends Biotechnol. 2008, 26(5): 267-275). Krátké molekuly nukleových kyselin nebo jejich analogů mohou být do buňky vneseny i pomocí některých esenciálních látek, např. kobalaminu nebo železa (Rownicky M., Wojciechowska M., Wierzba A.J., Czamecki J., Bartošík D., Gryko D., Trylska J. Vitamin B12 as a carrier of peptide nucleic acid (PNA) into bacterial cells. Scientific Reports., 2017, 7(1): 7644; Giedyk M., Jackowska A., Rownicky M., Kolanowska M., Trylska J., Gryko D. Vitamin B12 transports modified RNA into E. coli and S. Typhimurium cells. Chemical Communications. 2018, 55(6): 763-766.).

Dosud známé techniky neposkytují dostatečnou efektivitu transformace buněk. Tyto systémy v běžných podmínkách obtížně odolávají prostředí s nukleázami a proteázami a také nesnadno pronikají bariérami, případně mohou vést k nežádoucí imunitní odpovědi (např. virové částice). Pokud není na nukleovou kyselinu vázána transportní molekula, je prostup přes membrány u většiny buněk zanedbatelný a nelze proto neupravenou nukleovou kyselinu využít ke genovému přenosu do cílových buněk.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález eliminuje výše uvedené nedostatky známých metod tak, aby byla zvýšena účinnost a bezpečnost genového přenosu. Jedná se zejména o úpravy molekuly NK, která má být použita k transformaci hostitelské buňky (tj. vnesena do buňky), kdy se k jedné straně molekuly NK připojí vlásenková struktura a k druhé straně se připojí transportní molekula, která snadno proniká biologickými bariérami a dle volby transportní molekuly má neimunogenní vlastnosti. Připojení vlásenkové struktury nukleové kyseliny na jednu stranu přenášené molekuly NK a vazba transportní molekuly na 5‘, případně 3‘ konec NK na druhé straně molekuly zajišťuje stabilitu popsaného komplexu. Volný 3‘ nebo 5‘ konec může být rovněž modifikován. Tím je zajištěna rezistence proti běžným nukleázám a využitelnost v podmínkách in vivo.

Nukleová kyselina, která má být přenesena do hostitelské buňky, transportní molekula a vlásenková struktura nukleové kyseliny tvoří základní komponenty upravené molekuly NK, tj. molekuly NK upravené pro usnadnění přenosu do hostitelské buňky.

Výhodnou vlastností výše uvedené upravené molekuly nukleové kyseliny je, že se nejedná o replikativní element, tzn. nedojde k integraci NK do genomu buňky a následnému přenosu do dalších generací. Tím je u předkládaného vynálezu omezeno riziko nepredikovatelných zásahů do genomu a tím zvýšená bezpečnost technologie.

Účinnost může být regulována koncentrací upravených molekul nukleové kyseliny v kompartmentu účinku, případně specifickou transportní molekulovou umožňující selektivní přenos do konkrétních buněk.

Systém transformace podle vynálezu může být využit u prokaryotických buněk k inhibici růstu mikrobů invivo, omezení virulence inhibici příslušných genů, inhibici exprese genů zodpovědných za rezistenci k antibiotikům, případně odstranění plazmidů nesoucích geny virulence nebo rezistence. U eukaryotických buněk může systém ovlivnit funkci buňky regulací exprese případně dalšími interakcemi v buňce, např. interakcí nukleová kyselina- protein. Tato vlastnost může být

- 2 CZ 308738 B6 využita k inhibici růstu nádorových buněk a k ovlivnění produkce signálních proteinů, imunoglobulinů apod. U obou typů buněk mohou být na základě znalosti předloženého vynálezu a znalostí odborníků v příslušném oboru vytvořeny další aplikace.

Předkládaný vynález je vysoce efektivním prostředkem v oblasti genového inženýrství. Velmi jednoduchým a ekonomicky výhodným řešením je možné vnášet molekuly nukleových kyselin (NK) do buněk. Molekula NK, která má být přenesena do buněk, jev tomto vynálezu označována také jako transgen.

Předmětem předkládaného vynálezu je zejména způsob úpravy molekuly nukleové kyseliny (NK), která má být přenesena do buňky, aby tam byla exprimována, transkribována, překládána nebo interagovala s RNA, DNA či proteiny. Nukleovou kyselinou se zde rozumí deoxyribonukleová kyselina (DNA) nebo ribonukleová kyselina (RNA). Nukleovou kyselinou se rozumí i modifikovaná DNA nebo RNA, které zahrnují různé typy nukleových kyselin, včetně RNA-DNA hybridů, PNA (peptidová nukleová kyselina / peptide nucleic acid), LNA (uzamčená nukleová kyselina / locked nucleic acid), morfblino a další hybridy, analogy, jejich deriváty a kombinace kterékoli z výše uvedených. Nukleové kyseliny uvažované v rámci tohoto dokumentu mohou být složeny ze zcela nativních nukleotidů nebo mohou obsahovat nepřírodní báze či nukleotidy (např. syntetické či upravené), které mohou být spárovány s nativními nukleotidy nebo s chemicky shodnou nebo jinou nepřírodní bází (nukleotidem). Jakákoliv z výše uvedených molekul, tvořící dvouřetězcový (double-strand, ds) fragment NK tedy může být transgenem (přenášenou molekulou), bez ohledu na to, zda se j edná nebo nej edná o „gen“ v klasické definici (DNA kóduj ící protein). DvouřetězcováNK zahrnuje i částečně dvouřetězcovouNK, tedy fragment NK sestávající ze dvou řetězců, které hybridizují jen v části své délky. V případě, že je požadován přenos molekuly primárně jednořetězcové NK (např. různé typy RNA, jako mRNA), tato molekula se snadno převede na dvouřetězcovou nebo částečně dvouřetězcovou NK postupy, které jsou odborníkovi známé.

Způsob podle vynálezu spočívá v tom, že se transgen modifikuje tak, že se k jednomu konci molekuly transgenu připojí vlásenková struktura a na 5’ nebo 3’ konec druhé strany se vhodným procesem připojí transportní molekula, tj. molekula, která umožňuje vstup upravené molekuly NK do buňky. Volný konec (3‘ nebo 5‘ konec) druhé strany může být rovněž modifikován, například nukleotidem modifikovaným 2'-O-methoxyethylem, fosforothioátovou vazbou, nukleotidem modifikovaným aminoskupinou, invertovaným nukleotidem apod. Vlásenková struktura zajišťuje stabilitu celé upravené molekuly nukleové kyseliny vůči nukleázám. Zároveň zajišťuje linearizaci fragmentu nukleové kyseliny vstupujícího do buňky. Lineární řetězec nukleové kyseliny snáze penetruje buněčnou stěnou a zvyšuje efektivitu vstupu transgenu v porovnání s dvouvláknovou NK. Upravená molekula NK ve svém výhodném uspořádání rovněž vykazuje vyšší odolnost oproti jednovláknové (nekomplementámí) nukleové kyselině. Tím je zvýšena efektivita transformace buněk. Molekula NK, která má být přenesena do hostitelské buňky, upravená způsobem podle vynálezu, vytváří upravenou molekulu NK kyseliny uzpůsobenou pro efektivní vstup přenášené nukleové kyseliny do hostitelské buňky.

Jako transportní molekulu lze s výhodou použít jakýkoliv vhodný transportér, na příklad kobalamin (vitamin B12), železné nanočástice, stříbrné nanočástice, zlaté nanočástice, krátké transportní peptidy, transportní polymery, siderofory zajišťující transport pomocí transportérů železa a podobně, jak je známo ze stavu techniky. Transportní molekula se připojí kjedné straně přenášené nukleové kyseliny, jak bylo uvedeno výše.

Připojení vlásenkové struktury je důležité z hlediska jistého průniku jednovláknové nukleové kyseliny. Při absenci vlásenkové struktury proniká u většiny buněk do cytoplazmy pouze jedno vlákno (s přítomností transportní molekuly) z dvouvláknové NK. Tím není v buňce k dispozici genetická struktura, která by umožňovala transkripci. Tato struktura je z pravidla poměrně rychle degradována. Další výhodou připojené vlásenkové struktury je zvýšení odolnosti vůči ribonukleázám/deoxyribonukleázám, ať již na úrovni extracelulámího prostoru, nebo cytoplazmy.

- 3 CZ 308738 B6

Vlásenková struktura obsahuje dvě části - krček a smyčku, kdy krček je tvořen dvěma inverzně komplementárními úseky (invertované repetice) na koncích (lineární) molekuly a smyčka je tvořena úsekem mezi invertovanými repeticemi. Velikost smyčky vlásenkové struktury může být variabilní o velikosti minimálně 3 nukleotidů (bází) a nejvýše 25 nukleotidů (bází), neboťje známé, že vlásenková struktura o velikosti vyšší než 25 bází snižuje stabilitu celé struktury vůči vnějším fýzikálně-chemickým vlivům. Výhodně je úsek krčku velikosti 2 až 10 párů nukleotidů (párů bází, bp) a úsek smyčky 4 až 25 bází (nukleotidů). Vlásenková struktura může být tvořena, např. opakujícím se adeninem nebo thyminem, dobře známými stabilními sekvencemi, např. TTCG, TACG, TTTG, GCTT, nebo dalšími sekvencemi vykazujícími stabilitu.

Strana, na které je přítomen volný 5 ‘ a 3 ‘ konec (tj. strana, kde není navázána vlásenková struktura) molekuly transgenu (5’ a 3‘), může být modifikována. S výhodou se na 5‘ nebo 3‘ konec naváže transportní molekula vybraná z molekul uvedených výše. Druhý konec (3‘ nebo 5‘) lze zakončit modifikovaným nukleotidem. Například modifikace fosfátu či připojení aminoskupiny zajišťuje lepší stabilitu vůči exonukleázám, případně lze tento konec ponechat nemodifikovaný. Celý řetězec může být zcela komplementární, případně v oblasti obou konců mohou být obsaženy nekomplementámí sekvence. Uspořádání s částečnou nekomplementámí sekvencí může být využito především pro RNA a analogy nukleových kyselin. V tomto případě je transportní molekula vázána na různě dlouhé lineární vlákno, které pokračuje vlásenkovou strukturou v klasickém uspořádání (krček se dvěma inverzně komplementárními úseky a vlastní smyčka).

Efektivitu denaturace dvouvláknové nukleové kyseliny (tj. linearizace upravené molekuly transgenu - rozpojení vazeb mezi komplementárními nukleotidy vlásenky a připojené NK) lze zvýšit navázáním helikázy na molekulu NK (in vivo i in vitró), která má být přenesena do buňky. Helikáza může být navázána na strukturu zajištující transport transgenu (in vitro). Helikáza se může aktivovat až v blízkosti cílové buňky a zajistí tak denaturaci čili linearizaci před vstupem do buňky. Tím dochází k dalšímu zvýšení efektivity celého prostupu oproti dosud známým řešením.

Pro zvýšení stability vůči vnějším vlivům (fyzikálně-chemické vlivy) nebo endonukleázám lze molekulu transgenu ochránit navázáním vhodných proteinů. Např. SspC (smáli acid-soluble spore protein C). Tyto proteiny mohou být připraveny rekombinantně ze sporulujících bakterií, například Bacillus subtilis. Dalším příkladem jsou proteiny Dsup (damage- suppressor protein), které zajišťují vyšší odolnost NK vůči radiaci, DNA protection during starvation protein chránící NK před oxidační zátěží.

Nukleová kyselina, která se přenese do buňky využitím způsobu úpravy podle vynálezu, slouží k ovlivnění fýziologie buňky různými způsoby. K tomu mohou být využity různé mechanizmy, jako například regulace exprese na základě komplementarity sekvence. Dále může ve výhodném provedení docházet k transkripci do mRNA, která může být kódující či nekódující. Kódující RNA může být buňkou použita k translaci a vzniku žádaného peptidu/proteinu. Nekódující RNA může být s výhodou navržena a syntetizována tak, aby například aktivovala komplex RISC (z angl. RNAinduced silencing complex), který poté degraduje mRNA vzniklou při transkripci. Jinou možností je vnesení specifické molekuly, která je endoribonukleázou Dicer rozštěpena na malé fragmenty RNA. V dalším možném provedení lze využít vnesenou NK k zajištění specifické interakce s molekulami obsaženými v buňce, například peptidy/proteiny. Kromě kódujících sekvencí a promotoru lze do přenášené molekuly NK zařadit i další krátké sekvence, které mohou sloužit k regulaci exprese případně k lepšímu nasednutí a funkci DNA-dependentní RNA polymerázy. Další možností je zařazení oddělovací sekvence mezi transportní molekulu atransgen. Tato oddělovací sekvence může sloužit k lepšímu nasednutí DNA polymerázy na sekvenci promotoru. Případně se může jednat o specifickou sekvenci, kteráje štěpena intracelulámími endonukleázami. Tím v buňce dojde k oddělení transgenu od transportní molekuly. Tato vlastnost může být například použita ke zvýšení průniku transgenu do jádra eukaryotické buňky.

Při intemalizaci upravené molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu dojde primárně k prostupu transportní molekuly do cytoplazmy buňky s následnou intemalizaci nukleové kyseliny. Ta proniká

- 4 CZ 308738 B6 ve formě jednovláknové NK s možnou následnou hybridizací komplementárních částí a vytvoření dvouvláknové NK se schopností transkripce genetické informace (pokud je transgenem DNA obsahující otevřený čtecí rámec, kterému předchází promotor, popřípadě zesilovač) nebo může sama hybridizovat s cílovou strukturou (molekula DNA, mRNA, proteinu apod.). V případě některých transportních molekul, které neprochází membránou přes specifické póry (např. nanočástice některých kovů), může docházet k prostupu NK bez nutnosti rozrušení vodíkových můstků mezi bázemi (denaturace). V případě, že transgenem je molekula kódující RNA, tj. mRNA, tato může být přímo buňkou použita k translaci a vzniku žádaného peptidu/proteinu. Pokud je transgenem jedno vláknová nekódující RNA, po vstupu do buňky je vyhledána komplementární RNA sekvence, se kterou je vytvořen dimer. Poté dochází k degradaci mRNA systémem RISC (z angl. RNA-induced silencing complex).

Upravená molekula NK podle vynálezu, tj. molekula NK upravená výše naznačeným způsobem, může být vnesena do eukaryotických i prokaryotických buněk (např. HeLa, CHO, BGM nebo, např. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus). Do buňky může být jakožto transgen vnesena jakákoliv informace kódující či nekódující. Informace kódující geny peptidů/proteinů, která je následně v buňce exprimována, a může tím ovlivňovat různé funkce v buňce. Transgen může také kódovat antisense RNA, tedy RNA, která není překládána do peptidu/proteinu, ale která působí například jako transkripční inhibitor systémem RISC. Výhodou předmětné struktury NK je skutečnost, že nedochází k její replikaci, tzn. nedochází k přenosu na dceřiné buňky a tím k nepredikovatelnému zásahu do genetické informace. Jako příklad ovlivnění prokaryotické buňky lze jmenovat toxický efekt na buňku, inhibice exprese genů zodpovědných za virulenci, inhibice genů zodpovědných za rezistenci k antibiotikům, odstranění plazmidů inhibicí jejich replikačního systému. U eukaryotických buněk může transgen ovlivnit funkci buňky regulací exprese případně dalšími interakcemi v buňce, např. interakcí nukleová kyselina-protein. Tato vlastnost může být využita k inhibici růstu nádorových buněk, k ovlivnění produkce signálních proteinů, imunoglobulinů a k dalšímu ovlivnění buněk imunitního systému. Další možností je i využití transgenu k editaci genomu eukaryotické buňky, například spojením se systémem CRISPR/Cas9. Další aplikace jsou známé expertům v daném oboru s cílem potlačení patologického působení mikrobů a ovlivnění patologických buněčných procesů.

Předložený vynález se zejména týká způsobu úpravy molekuly nukleové kyseliny pro usnadnění přenosu do hostitelské buňky vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy na molekulu nukleové kyseliny, která má být přenesena do hostitelské buňky a která je ve dvouřetězcové formě nebo částečně dvouřetězcové formě nebo je na dvouřetězcovou nebo částečně dvouřetězcovou formu převedena, se na jednu stranu na 3 ’a 5 ’ konec naváže vlásenková struktura nukleové kyseliny, a na druhou stranu molekuly nukleové kyseliny se na 5 ’ nebo 3 ‘ konec řetězce nukleové kyseliny naváže transportní molekula. Přitom molekula nukleové kyseliny, která má být přenesena do hostitelské buňky, je DNA nebo RNA včetně RNA-DNA hybridů, peptidová nukleová kyselina, uzamčená nukleová kyselina, morfolino a další hybridy, analogy, jejich deriváty a kombinace kterékoli z výše uvedených a jiné molekuly fúnkčně shodné s přirozeně se vyskytujícími nukleovými kyselinami.

Vlásenková struktura nukleové kyseliny je tvořena smyčkou a krčkem, kde smyčka má velikost 3 až 25 nukleotidů a krček má velikost 2 až 10 párů nukleotidů. Transportní molekulou je vitamin B12, železná nanočástice, stříbrná nanočástice, zlatá nanočástice, krátký transportní peptid, siderofor, polymer, polysacharid či jiná molekula, která zvyšuje účinnost průniku nukleové kyseliny intracelulámě.

Výhodně může být mezi požadovanou molekulu nukleové kyseliny a transportní molekulu vložena oddělovací sekvence, která může být dvouřetězcová nebo jednořetězcová. Výhodně se 3‘ nebo 5’ volný konec bez transportní molekuly modifikuje pro ochranu proti účinkům nukleáz nukleotidem modifikovaným 2'-O-methoxyethylem, fosforothioátovou vazbou, nukleotidem modifikovaným aminoskupinou nebo invertovaným nukleotidem či jinou strukturou zabraňující působení nukleáz.

- 5 CZ 308738 B6

Hostitelskou buňkou je buňka prokaryotická nebo eukaryotická.

Předložený vynález se také týká upravené molekuly nukleové kyseliny, tj. molekuly nukleové kyseliny upravené pro usnadnění jejího přenosu do hostitelské buňky, která obsahuje molekulu nukleové kyseliny, která má být přenesena do hostitelské buňky a která je ve dvouřetězcové formě nebo částečně dvouřetězcové formě nebo byla na dvouřetězcovou nebo částečně dvouřetězcovou formu převedena, vlásenkovou strukturu nukleové kyseliny, navázanou na jednu stranu přenášené molekuly nukleové kyseliny, a transportní molekulu navázanou na druhou stranu přenášené molekuly na 5' nebo 3‘ konec nukleotidového řetězce. Molekula nukleové kyseliny, která má být přenesena do hostitelské buňky, je DNA nebo RNA včetně RNA-DNA hybridů, peptidová nukleová kyselina, uzamčená nukleová kyselina, morfolino a další hybridy, analogy, j ej ich deriváty a kombinace kterékoli z výše uvedených a jiné molekuly funkčně shodné s přirozeně se vyskytujícími nukleovými kyselinami. Vlásenková struktura nukleové kyseliny ve výše popsané upravené molekule nukleové kyseliny je tvořena smyčkou a krčkem, kde smyčka má velikost 3 až 25 nukleotidů a krček má velikost 2 až 10 párů nukleotidů. Transportní molekulou v uvedené upravené molekule nukleové kyseliny je vitamin B12, železná nanočástice, stříbrná nanočástice, zlatá nanočástice, krátký transportní peptid, siderofor, polymer, polysacharid či jiná molekula, která zvyšuje účinnost průniku nukleové kyseliny intracelulámě.

Výhodně upravená molekula nukleové kyseliny dále obsahuje navázanou helikázu. V jiném provedení výhodně obsahuje alespoň jeden protein vybraný ze Ssp a Dsup navázaný na molekulu nukleové kyseliny.

Předložený vynález se také týká způsobu přenosu molekuly nukleové kyseliny do hostitelské buňky, kdy se molekula nukleové kyseliny, která má být přenesena do hostitelské buňky, upraví výše popsaným způsobem a takto upravená molekula se uvede do kontaktu s buňkou, do které má být požadovaná molekula nukleové kyseliny přenesena.

Objasnění výkresů

Obrázek č. 1: Schematické znázornění molekuly NK (transgenu), která má být přenesena do hostitelské buňky, s připojenou transportní molekulou (TM), vlásenkovou strukturou a modifikovaným volným koncem (M) například aminoskupinou.

Obrázek č. 2: Kombinace upravené molekuly NK (transgenu s připojenou transportní molekulou (TM) a vlásenkovou strukturou) s helikázou pro usnadnění vstupu do buňky prostřednictvím převedení na jedno vláknovou NK. Transgenem je v tomto případě dvouřetězcová DNA obsahující otevřený čtecí rámec, kterému předchází regulační sekvence a promotor, případně se zesilovačem. Transgen může být dále doplněn vícečetným klonovacím místem (multiple cloning sítě). Mezi promotorem/zesilovačem a transportní molekulou je umístěna oddělovací sekvence.

Obrázek č. 3: Molekula NK, která má být přenesena do hostitelské buňky, s připojenou transportní molekulou (TM) a vlásenkovou strukturou a navázanými proteiny za účelem ochrany NK před fýzikálními, chemickými, fýzikálně-chemickými, biologickými vlivy včetně účinků ribonukleáz/deoxyribonukleáz.

Obrázek č. 4: Příklady upravené molekuly NK podle vynálezu obsahující expresní systém dvoušroubovice NK, transportní molekulu (TM) a vlásenkovou strukturu. Expresní systém obsahuje otevřený čtecí rámec, regulační sekvenci a promotor, případně se zesilovačem. Dále může být doplněn vícečetným klonovacím místem. Obsahuje také oddělovací sekvenci mezi promotorem/zesilovačem a transportní molekulou. Expresní systém může být umístěn v komplexu NK podle vynálezu ve dvou orientacích.

-6CZ 308738 B6

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Vnesení genu beta-laktamázy typu KPC-2 s vlásenkovou strukturou a transportní molekulou vitaminu B12 do buněk Escherichia coli

Gen pro beta-laktamázu KPC-2 (bla^cE) s vlastním promotorem byl amplifikován z templátu č. GenBank MF497781.1 pomocí oligonukleotidů 5‘-TCAGGGGTAAAGTGGGTCAG-3‘ (oligonukleotid Ol) a 5‘-GTGGTTGGTAATCCATGCCG-3‘ (oligonukleotid 02). Oligonukleotid 1 byl na svém 5‘ konci modifikován aminoskupinou (C6 amino-modifier), oligonukleotid 2 byl na svém 5‘ konci modifikován molekulou fosfátu. PCR produkt o velikosti 1170 bp byl přečištěn (zbavení PCR reakční směsi a oligonukleotidů) a vizualizován pomocí gelové elektroforézy. Následně byla provedena ligace pomocí DNA ligázy vlásenkové struktury k přečištěnému PCR produktu o sekvenci 5‘ATGTCTCTCAAAAAAAAAAAAAAAGAGAGACAT-3‘. (invertované repetice vytvářející krček jsou podtrženy). Vlásenková struktura byla na 5’ konci modifikována molekulou fosfátu.

Vitamín B12 byl rozpuštěn v IN roztoku kyseliny chlorovodíkové a inkubován při teplotě 37 °C po dobu 4 hodin. Tímto postupem je zajištěna parciální hydrolýza vitaminu B12 za vzniku karboxylových skupin na postranních řetězcích molekuly. Následně byl roztok neutralizován přidáním 0,lN roztoku hydroxidu sodného s výsledným pH 7,5. Vitamin B12 s vytvořenými karboxylovými skupinami byl purifikován pomocí extrakce fenolem s následným odstraněním fenolu pomocí chloroformu a etheru. Neutralizovaný roztok byl smíchán s vodou nasycenou fenolem v poměru 1:1. Roztok byl důkladně protřepán a centrifugován k oddělení fází. Vodná fáze byla smíchána v poměru 1:1 s roztokem acetonu s etherem (1:3). Vodná fáze byla následně 2x promyta roztokem acetonu s etherem. Následně byla vodná fáze s modifikovaným vitaminem B12 lyofilizována. V další možné variantě byla purifikace provedena pomocí sorbentu Amberllte XAD.

Vazba na PCR produkt s ligovanou vlásenkovou strukturou byla provedena ligací prostřednictvím EDC (l-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]karbodiimid hydrochlorid) tak, že k 20 pl DNA o koncentraci 25 ng/|pl rozpuštěné ve vodě bylo přidáno 20 μΐ modifikovaného vitamin B12 o koncentraci 0,5 mmol/1 rozpuštěného v pufiru kyseliny 2-(N-morfolino)-ethansulfonové (MES) o koncentraci 50 mmol/1, pH 4,5. Směs byla následně přidána k 7 mg EDC a ponechána inkubovat 4 h při pokojové teplotě. Poté byl nenavázaný vitamin B12 a EDC odstraněn pomocí promytí na centrifiigačních filtračních kolonkách schopných zachytit látky o relativní molekulové hmotnosti > 10 000.

Struktura s navázanou transportní molekulou (125 ng; 5 μΐ o koncentraci DNA 25 ng/|pl) byla přidána ke 100 μΐ rostoucí kultury Escherichia coli TOP 10 (AODeoonm = 0,2) s následnou kultivací 2 hodiny. Buňky byly následně promyty 3x 1 ml fyziologického roztoku. RNA byla izolována komerčním kitem s obsaženým krokem odstranění RNA pomocí RNázy.

Exprese byla ověřena pomocí reverzní transkripce s následnou PCR v reálném čase s barvou SYBR green za použití oligonukleotidů ATCTGACAACAGGCATGACG (oligonukleotid RT1) a GCGCGGCGATGAGGTAT (oligonukleotid RT2). Možnost kontaminace DNA byla ověřena pomocí PCR za použití oligonukleotidů RT1 a RT2 s negativním výsledkem. Exprese genu bla^cbyla prokázána.

Příklad 2

Vnesení genu beta-laktamázy typu KPC-2 s vlásenkovou strukturou a transportní molekulou nanočástice železa do Escherichia coli

Gen pro beta-laktamázu KPC-2 (bla^c-i) s vlastním promotorem byl amplifikován z templátu č.

- 7 CZ 308738 B6

GenBank MF497781.1 pomocí oligonukleotidů 5‘-TCAGGGGTAAAGTGGGTCAG-3‘ (oligonukleotid Ol) a 5‘-GTGGTTGGTAATCCATGCCG-3‘ (oligonukleotid 02). Oligonukleotid 1 byl na svém 5‘ konci modifikován aminoskupinou (C6 amino-modifier), oligonukleotid 2 byl na svém 5‘ konci modifikován molekulou fosfátu. PCR produkt o velikosti 1170 bp byl přečištěn (zbavení PCR reakční směsi a oligonukleotidů) a vizualizován pomocí gelové elektroforézy. Následně byla provedena ligace pomocí DNA ligázy vlásenkové struktury k přečištěnému PCR produktu o sekvenci 5‘ATGTCTCTCAAAAAAAAAAAAAAAGAGAGACAT-3‘. Vlásenková struktura byla na 5’ konci modifikována molekulou fosfátu.

Komerčně dostupné 5nm částice oxidu žele žitého fimkcionalizované N-hydroxysukcinimid esterem (NHS ester) byly použity k navázání na PCR produkt s ligovanou vlásenkovou strukturou inkubací 12 hodin při pokojové teplotě v pufiru kyseliny 2-(N-morfolino)-ethansulfonové (MES) o koncentraci 50 mmol/1, pH 4,5.

Struktura s navázanou transportní molekulou (125 ng; 5 pl o koncentraci DNA 25 ng/|pl) byla přidána ke 100 μΐ rostoucí kultury Escherichia coli TOP 10 (AODeoonm = 0,2) s následnou kultivací 2 hodiny. Buňky byly následně promyty 3x 1 ml fyziologického roztoku. RNA byla izolována komerčním kitem s obsaženým krokem odstranění RNA pomocí RNázy.

Exprese byla ověřena pomocí reverzní transkripce s následnou PCR v reálném čase s barvou SYBR green za použití oligonukleotidů ATCTGACAACAGGCATGACG (oligonukleotid RT1) a GCGCGGCGATGAGGTAT (oligonukleotid RT2). Možnost kontaminace DNA byla ověřena pomocí PCR za použití oligonukleotidů RT1 a RT2 s negativním výsledkem. Exprese genu bla^cbyla prokázána.

Příklad 3

Vnesení genu beta-laktamázy typu KPC-2 s vlásenkovou strukturou a transportní molekulou nanočástice zlata do Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae a Pseudomonas aeruginosa

Gen pro beta-laktamázu KPC-2 (6/í7kpc-2) s vlastním promotorem byl amplifikován z templátu č. GenBank MF497781.1 pomocí oligonukleotidů 5‘-TCAGGGGTAAAGTGGGTCAG-3‘ (oligonukleotid Ol) a 5‘-GTGGTTGGTAATCCATGCCG-3‘ (oligonukleotid 02). Oligonukleotid 1 byl na svém konci modifikován aminoskupinou (C6 amino-modifier), oligonukleotid 2 byl na svém 5‘ konci modifikován molekulou fosfátu. PCR produkt o velikosti 1170 bp byl přečištěn (zbavení PCR reakční směsi a oligonukleotidů) a vizualizován pomocí gelové elektroforézy. Následně byla provedena ligace pomocí DNA ligázy vlásenkové struktury k přečištěnému PCR produktu o sekvenci 5‘ATGTCTCTCAAAAAAAAAAAAAAAGAGAGACAT-3‘. Vlásenková struktura byla na 5’ konci modifikována molekulou fosfátu.

Komerčně dostupné 5nm částice zlata fimkcionalizované N-hydroxysukcinimid esterem (NHS ester) byly použity k navázání na PCR produkt s ligovanou vlásenkovou strukturou inkubací 12 hodin při pokojové teplotě v 50mM kyselině 2-(N-morfolino)-ethansulfonové (MES).

Struktura s navázanou transportní molekulou (125 ng; 5 μΐ o koncentraci DNA 25 ng/|ml) byla přidána ke 100 μΐ rostoucí kultury (AODeoonm = 0,2) Escherichia coli TOP 10 nebo Klebsiella pneumoniae nebo Pseudomonas aeruginosa s následnou kultivací 2 hodiny. Buňky byly následně promyty 3x 1 ml fýziologického roztoku. RNA byla izolována komerčním kitem s obsaženým krokem odstranění RNA pomocí RNázy.

Exprese byla ověřena pomocí reverzní transkripce s následnou PCR v reálném čase s barvou SYBR green za použití oligonukleotidů ATCTGACAACAGGCATGACG (oligonukleotid RT1) a GCGCGGCGATGAGGTAT (oligonukleotid RT2). Možnost kontaminace DNA byla ověřena

-8CZ 308738 B6 pomocí PCR za použití oligonukleotidů RT1 a RT2 s negativním výsledkem. Exprese genu bla^c-2 byla prokázána.

Příklad 4

Vnesení syntetického genu kódujícího bradykinin do prokaryotických buněk

DNA kódující bradykinin spolu s promotorem inserční sekvence ISEcpl (sekvence č. CP046445.1, GenBank) byla syntetizována komerčně dostupnou službou ve struktuře oligonukleotidů:

03: 5 ‘-GCAGTCTAAATTCTTCGTGAAATAGTGATTTTTGAAGCTAATAAAAAACAC

ACGTGGAATTTAGGTTTCATTCTGGCGACGTCCGTATTTGCCTTTCGGAAGCATAA

AATCGGACGCGTTGTGGCTCGCTTCAGGTAAAATATTGACTATTCATGTTGTTGTT

ATTTCGTCTCTTCCAGAATAAGGAATCCC-3E

04: 5 - ATGCGTCCTCCTGGTTTTTCTCCTTTTCGTTA A ATGTCTCTAAAA ACA A A A A

AAAACGTTGTTGTTGTTGAGAGACATTTAACGAAAAGGAGAAAAACCAGGAGGA

CGCATGGGATTCCTTATTCTGGAAGAGACGAAATAA-3⁴,

05: 5 ‘-CAACAACATGAATAGTCAATATTTTACCTGAAGCGAGCCACAACGCGTCC

GATTTTATGCTTCCGAAAGGCAAATACGGACGTCGCCAGAATGAAACCTAAATTC

CACGTGTGTTTTTTATTAGCTTCAAAAATCACTATTTCACGAAGAATTTAGACTGC -3‘. Konec 5‘ oligonukleotidů 03 byl modifikován aminoskupinou (C6 amino-modifier), konec 5‘ oligonukleotidů 04 a 05 byl modifikován vazbou fosfátu. V reakční směsi bylo smícháno 10 μΐ vodného roztoku každého oligonukleotidů o koncentraci 0,1 mmol/1 spolu s T4 DNA ligázou a inkubováno při 8 °C po dobu 12 h.

Následně byla provedena ligace pomocí DNA ligázy vlásenkové struktury k přečištěnému PCR produktu o sekvenci 5‘-ATGTCTCTCAAAAAAAAAAAAAAAGAGAGACAT-3‘. Vlásenková struktura byla na 5’ konci modifikována molekulou fosfátu.

Jako transportní molekula byl užit vitamín B12. Vitamín B12 byl rozpuštěn v 1N roztoku kyseliny chlorovodíkové a inkubován při teplotě 37 °C po dobu 4 hodin. Tímto postupem je zajištěna parciální hydrolýza vitaminu B12 za vzniku karboxylových skupin na postranních řetězcích molekuly. Následně byl roztok neutralizován přidáním O,1N roztoku hydroxidu sodného s výsledným pH 7,5. Vitamin B12 s vytvořenými karboxylovými skupinami byl purifikován pomocí extrakce fenolem s následným odstraněním fenolu pomocí chloroformu a etheru. Neutralizovaný roztok byl smíchán s vodou nasycenou fenolem v poměru 1:1. Roztok byl důkladně protřepán a centrifugován k oddělení fází. Vodná fáze byla smíchána v poměru Els roztokem acetonu s etherem (1:3). Vodná fáze byla následně 2x promyta roztokem acetonu s etherem. Následně byla vodná fáze s modifikovaným vitaminem B12 lyofilizována. V další možné variantě byla purifikace provedena pomocí sorbentu Amberllte XAD.

Vazba na PCR produkt s ligovanou vlásenkovou strukturou byla provedena ligací prostřednictvím EDC (l-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]karbodiimid hydrochlorid) tak, že k 20 μΐ DNA o koncentraci 25 ng/ΙμΙ rozpuštěné ve vodě bylo přidáno 20 μΐ modifikovaného vitaminu B12 o koncentraci 0,5 mmol/1 rozpuštěného v pufiru kyseliny 2-(N-morfolino)-ethansulfonové (MES) o koncentraci 50 mmol/1, pH 4,5. Směs byla následně přidána k 7 mg EDC a ponechána inkubovat 4 hodiny při pokojové teplotě. Poté byl nenavázaný vitamin B12 a EDC odstraněn pomocí promytí na centrifugačních filtračních kolonkách schopných zachytit látky o relativní molekulové hmotnosti > 10 000.

-9CZ 308738 B6

Struktura s navázanou transportní molekulou (125 ng; 5 pl o koncentraci DNA 25 ng/|ml) byla přidána ke 100 μΐ rostoucí kultury Escherichia coli TOP 10 (AODeoonm = 0,2) s následnou kultivací 2 hodiny. Buňky byly následně promyty 3x 1 ml fyziologického roztoku. DNA byla izolována komerčním kitem.

Přítomnost nukleové kyseliny v buňce byla ověřena pomocí PCR v reálném čase s barvou SYBR green za použití oligonukleotidů TTCGTGAAATAGTGATTTTTGAAGC (oligonukleotid RT3) a AGAAAAACCAGGAGGACGCA (oligonukleotid RT4). Možnost kontaminace DNA byla ověřena pomocí PCR za použití oligonukleotidů RT3 a RT4 s negativním výsledkem. Přítomnost genu kódujícího bradykinin v buňkách E. coli byla prokázána.

Příklad 5

Vnesení genu GFP (Green Fluorescent Protein) do eukaryotických buněk

Pro amplifikaci cílové sekvence byl použit plazmid pcDNA3-EGFP (plasmid #13031, Addgene) s genem proteinu EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) a promotorem CMV. Molekula DNA byla amplifikována pomocí oligonukleotidů 5‘-CTTGTGTGTTGGAGGTCGCT-3‘ (oligonukleotid 06) a 5‘-AACAACAGATGGCTGGCAAC-3‘ (oligonukleotid 07). Oligonukleotid 06 byl na svém konci modifikován aminoskupinou (C6 amino-modifier), oligonukleotid 07 byl na svém 5‘ konci modifikován molekulou fosfátu. PCR produkt o velikosti 1170bp byl přečištěn (zbavení PCR reakční směsi a oligonukleotidů) a vizualizován pomocí gelové elektroforézy. Následně byla provedena ligace pomocí DNA ligázy vlásenkové struktury k přečištěnému PCR produktu o sekvenci 5‘ATGTCTCTCAAAAAAAAAAAAAAAGAGAGACAT-3‘. Vlásenková struktura byla na 5’ konci modifikována molekulou fosfátu.

Vitamín B12 byl rozpuštěn v 1N roztoku kyseliny chlorovodíkové a inkubován při teplotě 37 °C po dobu 4 hodin. Tímto postupem je zajištěna parciální hydrolýza vitaminu B12 za vzniku karboxylových skupin na postranních řetězcích molekuly. Následně byl roztok neutralizován přidáním O,1N roztoku hydroxidu sodného s výsledným pH 7,5. Vitamin B12 s vytvořenými karboxylovými skupinami byl purifikován pomocí extrakce fenolem s následným odstraněním fenolu pomocí chloroformu a etheru. Neutralizovaný roztok byl smíchán s vodou nasycenou fenolem v poměru 1:1. Roztok byl důkladně protřepán a centrifůgován k oddělení fází. Vodná fáze byla smíchána v poměru Els roztokem acetonu s etherem (1:3). Vodná fáze byla následně 2x promyta roztokem acetonu s etherem. Následně byla vodná fáze s modifikovaným vitaminem B12 lyofilizována. V další možné variantě byla purifikace provedena pomocí sorbentu Amberllte XAD.

Vazba na PCR produkt s ligovanou vlásenkovou strukturou byla provedena ligací prostřednictvím EDC (l-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]karbodiimid hydrochlorid) tak, že k 20 μΐ DNA o koncentraci 25 ng/|pl rozpuštěné ve vodě bylo přidáno 20 μΐ modifikovaného vitamin B12 o koncentraci 0,5 mmol/1 rozpuštěného v pufiru kyseliny 2-(N-morfolino)-ethansulfonové (MES) o koncentraci 50 mmol/1, pH 4,5. Směs byla následně přidána k 7 mg EDC a ponechána inkubovat 4 hodiny při pokojové teplotě. Poté byl nenavázaný vitamin B12 a EDC odstraněn pomocí promytí na centrifugačních filtračních kolonkách schopných zachytit látky o relativní molekulové hmotnosti > 10 000.

Struktura s navázanou transportní molekulou (125 ng; 5 μΐ o koncentraci DNA 25 ng/|pl) byla přidána ke 200 μΐ kultury BGM Cell Line (buněčná linie opičích ledvin, Sigma-Aldrich. kat. č. 90092601) v kultivačním médiu (EMEM (Minimum Essential Medium Eagle) + 2mM L-Glutamin + 1% NEAA (Non-essential Amino Acid Solution) + 10% FBS / FCS (Fetal Bovine Sérum)) s následnou inkubací 8 hodin. Buňky byly následně promyty 3x 1 ml fýziologického roztoku. RNA byla izolována komerčním kitem s obsaženým krokem odstranění RNA pomocí RNázy.

Exprese byla ověřena pomocí reverzní transkripce s následnou PCR v reálném čase s barvou SYBR

- 10 CZ 308738 B6 green za použití oligonukleotidů 5‘-CACAAGTTCAGCGTGTCCG-3‘ (oligonukleotid RT5) a 5‘TTCAGCTCGATGCGGTTCAC-3 ‘ (oligonukleotid RT6). Možnost kontaminace DNA byla ověřena pomocí PCR za použití oligonukleotidů RT5 aRT6 s negativním výsledkem. Exprese genu EGFP v buňkách BGM byla prokázána.

Claims (14)

1. Způsob úpravy molekuly nukleové kyseliny pro usnadnění jejího přenosu do hostitelské buňky vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy na molekulu nukleové kyseliny, která má být přenesena do hostitelské buňky a která je ve dvouřetězcové formě nebo částečně dvouřetězcové formě neboje na dvouřetězcovou nebo částečně dvouřetězcovou formu převedena, se na jednu stranu na 3’ a 5’ konec naváže vlásenková struktura nukleové kyseliny, a na druhou stranu molekuly nukleové kyseliny se na 5 ’ nebo 3 ‘ konec řetězce nukleové kyseliny naváže transportní molekula.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že molekula nukleové kyseliny, která má být přenesena do hostitelské buňky, je DNA nebo RNA včetně RNA-DNA hybridů, peptidová nukleová kyselina, uzamčená nukleová kyselina, morfolino a další hybridy, analogy, j ej ich deriváty a kombinace kterékoli z výše uvedených a jiné molekuly fúnkčně shodné s přirozeně se vyskytujícími nukleovými kyselinami.

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že vlásenková struktura nukleové kyseliny je tvořena smyčkou a krčkem, kde smyčka má velikost 3 až 25 nukleotidů a krček má velikost 2 až 10 párů nukleotidů.

4. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že transportní molekulou je vitamin B12, železná nanočástice, stříbrná nanočástice, zlatá nanočástice, krátký transportní peptid, siderofor, polymer, polysacharid či jiná molekula, která zvyšuje účinnost průniku nukleové kyseliny intracelulámě.

5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že mezi molekulu nukleové kyseliny, která má být přenesena do hostitelské buňky, a transportní molekulu se vloží oddělovací sekvence, která může být dvouřetězcová nebo jednořetězcová.

6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že 3‘ nebo 5’ volný konec bez transportní molekuly se modifikuje pro ochranu proti účinkům nukleáz nukleotidem modifikovným 2'-O-methoxyethylem, fosforothioátovou vazbou, nukleotidem modifikovaným aminoskupinou nebo invertovaným nukleotidem či jinou strukturou zabraňující působení nukleáz.

7. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že hostitelskou buňkou je buňka prokaryotická nebo eukaryotická.

8. Molekula nukleové kyseliny upravená pro usnadnění přenosu do hostitelské buňky vyznačující se tím, že obsahuje molekulu nukleové kyseliny, která má být přenesena do hostitelské buňky a která je ve dvouřetězcové formě nebo částečně dvouřetězcové formě nebo byla na dvouřetězcovou nebo částečně dvouřetězcovou formu převedena, vlásenkovou strukturu nukleové kyseliny, navázanou na jednu stranu přenášené molekuly nukleové kyseliny, a transportní molekulu navázanou na druhou stranu přenášené molekuly na 5’ nebo 3‘ konec nukleotidového řetězce.

9. Molekula nukleové kyseliny upravená pro usnadnění přenosu do hostitelské buňky podle nároku 8, vyznačující se tím, že molekula nukleové kyseliny, která má být přenesena do hostitelské buňky, je DNA nebo RNA včetně RNA-DNA hybridů, peptidová nukleová kyselina, uzamčená nukleová kyselina, morfolino a další hybridy, analogy, jejich deriváty a kombinace kterékoli z výše uvedených a jiné molekuly funkčně shodné s přirozeně se vyskytujícími nukleovými kyselinami.

- 12 CZ 308738 B6

10. Molekula nukleové kyseliny upravená pro usnadnění přenosu do hostitelské buňky podle nároku 8 nebo 9, vyznačující se tím, že vlásenková struktura nukleové kyseliny je tvořena smyčkou a krčkem, kde smyčka má velikost 3 až 25 nukleotidů a krček má velikost 2 až 10 párů nukleotidů.

11. Molekula nukleové kyseliny upravená pro usnadnění přenosu do hostitelské buňky podle kteréhokoliv z nároků 8 až 10, vyznačující se tím, že transportní molekulou je vitamin B12, železná nanočástice, stříbrná nanočástice, zlatá nanočástice, krátký transportní peptid, siderofor, polymer, polysacharid či jiná molekula, která zvyšuje účinnost průniku nukleové kyseliny intracelulámě.

12. Molekula nukleové kyseliny upravená pro usnadnění přenosu do hostitelské buňky podle kteréhokoliv z nároků 8 až 11, vyznačující se tím, že dále obsahuje navázanou helikázu.

13. Molekula nukleové kyseliny upravená pro usnadnění přenosu do hostitelské buňky podle kteréhokoliv z nároků 8 až 12, vyznačující se tím, že dále obsahuje alespoň jeden protein vybraný ze Ssp a Dsup navázaný na molekulu nukleové kyseliny.

14. Způsob invitro přenosu molekuly nukleové kyseliny do hostitelské buňky vyznačující se tím, že molekula nukleové kyseliny, která má být přenesena do hostitelské buňky, se upraví způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 a takto upravená molekula se uvede do kontaktu s hostitelskou buňkou, do které má být molekula nukleové kyseliny přenesena.