JP2024061712A - 葉酸受容体１に特異的なキメラ抗原受容体 - Google Patents

Abstract

【課題】葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。【解決手段】ＣＡＲを発現するように遺伝子操作された細胞の養子細胞移入であって、当該ＣＡＲは、ＦｏｌＲ１に特異的であり（「ＦｏｌＲ１－ＣＡＲ」）、ＦｏｌＲ１を発現するがん性細胞の認識および結合をもたらす。遺伝子改変されたＣＡＲ発現細胞は、その特定の機能、例えば標的細胞の殺滅、サイトカインの分泌、および／または増殖を果たす。さらに、Ｎ末端からＣ末端へと、特定のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）、特定のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗原結合性ドメインが、他のバリアントと比較して優れた殺滅特性を示すことが見出された。【選択図】なし

Description

本発明は、特に、腫瘍抗原葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的なキメラ抗原受容体を使用することによりがんを治療するための養子免疫療法の分野に関する。

がんは、悪性細胞の無秩序な増殖を伴う広範な疾患群である。がんでは、細胞が制御不能に分裂および増殖し、悪性腫瘍を形成し、身体の近隣部分に浸潤する。がんは、リンパ系または血流を介して身体のより離れた部分にも広がる可能性がある。ヒトに影響を及ぼすことが知られている２００種類を上まわる異なるがんが存在する。多数のがんタイプには、良好な治療選択肢がある。しかしながら、依然としてアンメット・メディカル・ニーズが存在するがんもある。特に、卵巣がん、肺がん、胃がん、乳がん、腎臓がん、および膵臓がんは、治療選択肢が限られている悪性腫瘍である^８。卵巣がんは、卵巣に起源を有する腫瘍群であると定義される。卵巣がんは女性で４番目に多いがんであり、女性の婦人科がん関連死亡の主な原因である。ほとんどの臨床症例は上皮性卵巣がんであり、上皮性卵巣がんは、診断された患者のおよそ９０％を占める。上皮性卵巣がんには、漿液性、類内膜、粘液性、および明細胞の４つの主要な組織学的サブタイプがある。患者のおよそ７０％は漿液性組織学的特徴を示し、臨床治験では、患者のサブタイプが予後に重要であることが実証されている。他のあまり一般的ではないタイプの卵巣腫瘍としては、原発性腹膜腫瘍、卵管腫瘍、および悪性胚細胞腫瘍が挙げられる^９。

卵巣がん患者の５年全生存率は、およそ４９．１％である。ほとんどのがんと同様に、５年生存率は、がんであると診断された病期に応じて異なる可能性がある。がんが限局性病期（ステージＩ～ＩＩ）で早期に発見された場合、５年生存率は９２．６％である。身体の異なる部分に広がった卵巣がんは、局所卵巣がん（ステージＩＩＩ）としても知られており、５年生存率は７４．８％である。転移性（ステージＩＶ）卵巣がんでは、５年生存率は３０．３％へとさらに低下する。ほとんどの患者は診断時に進行性疾患を呈し、初期治療に対する応答が高いにも関わらず、大多数は、最終的には再発して不治の病を患うことになる^９。

ＦｏｌＲ１は膜タンパク質であり、葉酸に高い親和性で結合し、受容体媒介性エンドサイトーシスによりこのビタミンの細胞取込みを媒介する^１０。葉酸は、細胞代謝ならびにＤＮＡ合成および修復の基本成分であり、急速に分裂するがん細胞では、ＤＮＡ合成を維持するために葉酸要求量が増加する。上皮由来の特定の悪性腫瘍では、ＦｏｌＲ１レベルが正常細胞と比較して高く、腫瘍の病期および悪性度と正相関し、腫瘍の病因および進行におけるその役割が問われている。ＦｏｌＲ１は、血清からの葉酸の取込みをモジュレートすることにより、または調節シグナルを生成することにより、腫瘍に増殖優位性を付与することができることが示唆されている^１１。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、がんの養子細胞免疫療法のための有望な手法を提供する。一般的に、ＣＡＲは、スペーサーおよび膜貫通領域を介してＴ細胞シグナル伝達に関与する細胞質ドメインにカップリングされた、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な抗体の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。最も一般的なリンパ球活性化部分としては、Ｔ細胞共刺激（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、およびＣＤ２７）ドメインとＴ細胞トリガー（例えば、ＣＤ３ζ）部分との組合せが挙げられる。ＣＡＲ媒介性養子免疫療法は、ＣＡＲ発現細胞が、標的腫瘍細胞のＴＡＡを、ＨＬＡ非依存的に直接認識することを可能にする。

国際公開第２０１４１２７２６１号Ａ１パンフレット 国際公開第２０１７／０９１５４６号パンフレット

手術および化学療法の併用が依然として標準治療である。しかしながら、患者の大部分は再発し、最終的には化学療法に対する耐性を生じさせることになる。したがって、卵巣がんには満たされていない医療ニーズが根強く存在し、ＣＡＲ発現細胞を使用した免疫療法などの代替的治療手法が緊急に必要とされている。特にトリプルネガティブ乳がん、胃がん、肺がん、腎臓がん、および膵臓がんでは、腫瘍関連ＦｏｌＲ１の発現が高いことが特定されており、腫瘍関連ＦｏｌＲ１は、ＣＡＲ Ｔ細胞療法の有望な標的である。当技術分野では、ＦｏｌＲ１を発現するがんの治療に使用するための、ＦｏｌＲ１に特異的な改良型または代替的ＣＡＲが必要とされている。

細胞表面抗原ＦｏｌＲ１は、トリプルネガティブ乳がん、胃がん、肺がん、腎臓がん、膵臓がん、または卵巣がんなどのがん細胞上に発現され、標的免疫療法に使用することができる。本発明者らは、ＦｏｌＲ１に特異的なキメラ抗原受容体を発現するように遺伝子操作された免疫細胞が、ＦｏｌＲ１を発現する細胞をｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで殺滅することができることを見出した。したがって、本発明は、キメラ抗原受容体を発現するように遺伝子操作された細胞の養子細胞移入であって、当該ＣＡＲは、ＦｏｌＲ１に特異的であり（「ＦｏｌＲ１－ＣＡＲ」）、ＦｏｌＲ１を発現するがん性細胞の認識および結合をもたらす、養子細胞移入に関する。そのため、遺伝子改変された細胞、つまりＣＡＲ発現細胞は、その特定の機能、例えば標的細胞の殺滅、サイトカインの分泌、および／または増殖を果たす。さらに、本発明者らは、驚くべきことに、Ｎ末端からＣ末端へと、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）、配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗原結合性ドメインが、抗ＦｏｌＲ１－ＣＡＲの他のバリアントと比較して優れた殺滅特性を示すことを見出した（実施例２および図１７ｋを参照）。

フローサイトメトリースクリーニングアッセイは、高悪性度漿液性卵巣癌におけるＦＯＬＲ１の発現を明らかにする。Ａ）原発性高悪性度漿液性卵巣癌試料における標的発現を分析するためのゲート制御戦略。第１のステップでは、細胞片をさらなる分析から除外する。第２には、生細胞をさらなる分析のために選択した。第３には、ダブレットを除外し、第４には、非系統細胞を、ＦＯＬＲ１発現の最終分析のために選択した。Ｂ）幾つかのヒト高悪性度漿液性卵巣癌（＃１～＃４）を解離させ、続いてＡ）に記載のゲート制御戦略に従って、ＦＯＬＲ１発現をフローサイトメトリーで分析した。 超ハイコンテントイメージングは、高悪性度漿液性卵巣がんの標的としてのＦＯＬＲ１を発見することができる。新たに凍結したヒト高悪性度漿液性卵巣がん試料（各数字は個々の患者試料を示す）を切片化し、ＦＯＬＲ１およびＥＰＣＡＭの発現をＭＩＣＳで分析した。ＤＡＰＩおよび表記の目的マーカーが示されている。スケールバーは１００μｍを表す。 卵巣がん試料はＦＯＬＲ１レベルの上昇を呈する。原発性卵巣がん組織での腫瘍マーカーＦＯＬＲ１の発現を単一細胞レベルで定量化した（試料は図２と同様に付番されている）。核、つまりＤＡＰＩシグナルおよび上皮細胞膜マーカーＥＰＣＡＭに基づき、ＭＡＣＳｉＱ Ｖｉｅｗソフトウェアを使用して画像データセットをセグメント化し、個々の細胞を特定した。単一細胞を、ＥＰＣＡＭおよびＦＯＬＲ１発現について分析した。各データ点は目的の領域を表す。 超ハイコンテントイメージングにより、健常ヒト組織におけるＦＯＬＲ１の発現が確認される。 新たに凍結したヒト組織を切片化し、アセトンで固定した。その後のスクリーニングは、抗体の連続染色を使用することにより、ＭＡＣＳｉｍａイメージングプラットフォームで実施した。健常ヒト組織、 Ａ）乳房、小脳、結腸、心房、心室、 Ｂ）腎臓、肝臓、肺、延髄、卵巣、 Ｃ）膵臓、下垂体、骨格筋、平滑筋、皮膚、および精巣を、卵巣がん標的ＦＯＬＲ１（上段列）およびＥＰＣＡＭ（上から２段目の列）の発現について分析した。ＤＡＰＩ（下から２段目の列）では核が視覚化されており、ＩｇＧ対照（最下段列）が図示されている。スケールバーは１００μｍを表す。 種々の健常組織はＦＯＬＲ１を発現しないかまたは発現レベルが低い。健常ヒト組織での腫瘍マーカーＦＯＬＲ１発現を単一細胞レベルで定量化した。画像データセットを、核、つまりＤＡＰＩシグナルおよび上皮細胞膜マーカーＥＰＣＡＭに基づき、ＭＡＣＳｉＱ Ｖｉｅｗソフトウェアを使用してセグメント化し、個々の細胞を特定した。単一細胞を、ＥＰＣＡＭおよびＦＯＬＲ１発現について分析した。各データ点は目的の領域を表す。 抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ候補は、ビオチン化ＦＯＬＲ１－Ｆｃ融合タンパク質を用いて特異的におよび用量依存的に検出される。抗ビオチンＰＥ二次染色を使用して抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ発現を決定するための、２人の独立ドナーに由来する抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞に対するビオチン化ＦＯＬＲ１－Ｆｃ融合タンパク質（ＣＡＲ ＤＲ）の滴定およびフローサイトメトリー分析。分析したフローサイトメトリーデータはすべて、生存ＣＤ３陽性集団の中から選択した。 Ａ）ドナー１に由来する形質導入細胞または未形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）におけるビオチン化ＦＯＬＲ１－Ｆｃ融合タンパク質（抗ビオチンＰＥ二次染色との組合せ）による抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ（候補ＡおよびＥ）発現のフローサイトメトリー分析の密度プロット。ＣＡＲ発現は、抗ＬＮＧＦＲ染色、および２μｇ／ｍＬのビオチン化ＦＯＬＲ１－Ｆｃタンパク質を用いない（上段列）または用いた（下段列）共染色により検出した。 Ｂ）ドナー１に由来する形質導入細胞または未形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）におけるビオチン化ＦＯＬＲ１－Ｆｃ融合タンパク質（抗ビオチンＰＥ二次染色との組合せ）による抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ（候補ＣおよびＧ）発現のフローサイトメトリー分析の密度プロット。ＣＡＲ発現は、抗ＬＮＧＦＲ染色、および２μｇ／ｍＬのビオチン化ＦＯＬＲ１－Ｆｃタンパク質を用いない（上段列）または用いた（下段列）共染色により検出した。 Ｃ）ドナー２に由来する形質導入細胞または未形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）におけるビオチン化ＦＯＬＲ１－Ｆｃ融合タンパク質（抗ビオチンＰＥ二次染色との組合せ）による抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ（候補ＡおよびＥ）発現のフローサイトメトリー分析の密度プロット。ＣＡＲ発現は、抗ＬＮＧＦＲ染色、および２μｇ／ｍＬのビオチン化ＦＯＬＲ１－Ｆｃタンパク質を用いない（上段列）または用いた（下段列）共染色により検出した。 Ｄ）ドナー２に由来する形質導入細胞または未形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）におけるビオチン化ＦＯＬＲ１－Ｆｃ融合タンパク質（抗ビオチンＰＥ二次染色との組合せ）による抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ（候補ＣおよびＧ）発現のフローサイトメトリー分析の密度プロット。ＣＡＲ発現は、抗ＬＮＧＦＲ染色、および２μｇ／ｍＬのビオチン化ＦＯＬＲ１－Ｆｃタンパク質を用いない（上段列）または用いた（下段列）共染色により検出した。 Ｅ）ドナー１に由来する形質導入細胞または未形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）におけるビオチン化ＦＯＬＲ１－Ｆｃ融合タンパク質（抗ビオチンＰＥ二次染色との組合せ）による抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ発現のフローサイトメトリー分析の定量化。点線は、ＣＤ３およびＬＮＧＦＲ二重染色により決定されたＣＡＲ発現Ｔ細胞の頻度を表す。 Ｆ）ドナー２に由来する形質導入細胞または未形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）におけるビオチン化ＦＯＬＲ１－Ｆｃ融合タンパク質（抗ビオチンＰＥ二次染色との組合せ）による抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ発現のフローサイトメトリー分析の定量化。点線は、ＣＤ３およびＬＮＧＦＲ二重染色により決定されたＣＡＲ発現Ｔ細胞の頻度を表す。 Ｇ）抗ＬＮＧＦＲ染色およびビオチン化ＦＯＬＲ１－Ｆｃ融合タンパク質染色が測定されるフローサイトメトリーによる、２人の独立ドナー（ドナー１およびドナー２）に由来するＴ細胞における抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ発現の比較。 ヒトＦＯＬＲバリアントのペアワイズタンパク質配列アラインメントにより、高度な同一性および類似性が明らかにされる。ヒトＦＯＬＲ１（Ｇｅｎｅ ＩＤ：２３４８）タンパク質配列（Ｐ１５３２８、ａａ２５～２３５）を、ＥＭＢＯＳＳ ｎｅｅｄｌｅアルゴリズム（マトリックス：ＥＢＬＯＳＵＭ６２、ｇａｐ＿ｐｅｎａｌｔｙ：１０．０、ｅｘｔｅｎｄ＿ｐｅｎａｌｔｙ：０．５）を使用してヒトＦＯＬＲバリアントとアラインした。 Ａ）ヒトＦＯＬＲ１（Ｇｅｎｅ ＩＤ：２３４８）タンパク質配列（Ｐ１５３２８、ａａ２５～２３５、配列番号６９）を、ヒトＦＯＬＲ２（Ｇｅｎｅ ＩＤ：２３５０）タンパク質配列（Ｐ１４２０７、ａａ１７～２３０、配列番号７０）とアラインした。 Ｂ）ヒトＦＯＬＲ１（Ｇｅｎｅ ＩＤ：２３４８）タンパク質配列（Ｐ１５３２８、ａａ２５～２３５、配列番号６９）を、ヒトＦＯＬＲ３（Ｇｅｎｅ ＩＤ：２３５２）アイソフォーム１タンパク質配列（Ｐ４１４３９、ａａ２３～２４５、配列番号７１）とアラインした。 Ｃ）ヒトＦＯＬＲ１（Ｇｅｎｅ ＩＤ：２３４８）タンパク質配列（Ｐ１５３２８、ａａ２５～２３５、配列番号６９）を、ヒトＦＯＬＲ３（Ｇｅｎｅ ＩＤ：２３５２）アイソフォーム２タンパク質配列（Ｐ４１４３９－４、ａａ２３～１７２、配列番号７２）とアラインした。 Ｄ）ヒトＦＯＬＲ１（Ｇｅｎｅ ＩＤ：２３４８）タンパク質配列（Ｐ１５３２８、ａａ２５～２３５、配列番号６９）を、ヒトＦＯＬＲ４（Ｇｅｎｅ ＩＤ：３９０２４３）アイソフォーム１タンパク質配列（Ａ６ＮＤ０１、ａａ２０～２２８、配列番号７３）とアラインした。 Ｅ）ヒトＦＯＬＲ１（Ｇｅｎｅ ＩＤ：２３４８）タンパク質配列（Ｐ１５３２８、ａａ２５～２３５、配列番号６９）を、ヒトＦＯＬＲ４（Ｇｅｎｅ ＩＤ：３９０２４３）アイソフォーム２タンパク質配列（Ａ６ＮＤ０１－２、ａａ２０～２４３、配列番号７４）とアラインした。 組換えジャーカット細胞株は、ヒトおよびマウスＨＡタグ付きＦＯＬＲバリアントを発現する。 ｗｔジャーカット細胞、または異なるヒト（ｈ）もしくはマウス（ｍ）ＦＯＬＲバリアントを発現するジャーカット細胞のフローサイトメトリー分析の密度プロット。ＨＡタグ付きＦＯＬＲバリアント発現は、抗３×ＨＡタグ染色により検出した。 抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ候補は、活性化マーカーを抗原依存的に発現する。 抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞候補 Ａ）ＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１ Ａ、 Ｂ）ＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１ Ｂ、 Ｃ）ＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１ Ｃ、 Ｄ）ＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１ Ｄ、 Ｅ）ＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１ Ｅ、 Ｆ）ＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１ Ｆ、 Ｇ）ＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１ Ｇ、 Ｈ）ＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１ Ｈ、または Ｉ）未形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を、ジャーカットｗｔ細胞または異なるヒト（ｈ）もしくはマウス（ｍ）ＦＯＬＲバリアントを発現するジャーカット細胞と共に、エフェクター細胞：標的細胞比２：１で共培養した。４８時間の共培養後、ＣＡＲ Ｔ細胞を、活性化マーカー発現についてフローサイトメトリーで評価した。データ点は、技術的三重重複の平均を表し、対応するＴ細胞とＦＯＬＲ欠損ジャーカットｗｔ細胞との共培養に対する変化倍数として表されている。各バーは、平均＋／－ＳＥＭを表す。 ＯＶ－９０細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９媒介性ＦＯＬＲ１ノックアウトが、ゲノムレベル、転写物レベル、およびタンパク質レベルで検証される。ＦＯＬＲ１の欠失は、ＯＶ－９０細胞におけるホモ接合性ノックアウトに結び付いた。 Ａ）ＥＭＢＯＳＳ ｎｅｅｄｌｅアルゴリズム（マトリックス：ＥＢＬＯＳＵＭ６２、ｇａｐ＿ｐｅｎａｌｔｙ：１０．０、ｅｘｔｅｎｄ＿ｐｅｎａｌｔｙ：０．５）を使用した、ＯＶ－９０ｗｔ（ｆｏｒ＿ｗｔ、配列番号１１２）ゲノムＤＮＡ配列およびＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ（ｆｏｒ＿ｆｏｌｒｋｏ；配列番号１１３）ゲノムＤＮＡ配列のアラインメント。配列決定は、特異的なＦＯＬＲ１ ｇＤＮＡプライマー（配列番号９０および配列番号９１）を使用して実施した。一点鎖線で強調された配列は、ＦＯＬＲ１のＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９媒介性ノックアウトに使用したガイドＲＮＡ配列（配列番号８９）に対応する。 Ｂ）ＯＶ－９０ｗｔ細胞と比較した、ＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯにおける葉酸受容体バリアントの相対的ｍＲＮＡ発現。ＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ細胞およびｗｔ細胞から単離されたｍＲＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲ分析。ＦＯＬＲ転写物を、配列番号９２～１０１に対応する異なる葉酸受容体バリアントに対するプライマー対を用いて増幅した。個々の遺伝子発現を、ΔΔＣｔ法で分析し、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ発現に対して正規化し、変化倍数は、ＯＶ－９０ｗｔ ｍＲＮＡレベルに対するものである。データは、二重重複の平均±ＳＥＭとして示されている。 Ｃ）ＯＶ－９０ｗｔ細胞およびＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ細胞の免疫蛍光染色。細胞を、卵巣がん標的ＦＯＬＲ１およびＥＰＣＡＭの発現について分析した。ＤＡＰＩは核を可視化する。スケールバーは１００μｍを表す。 卵巣がん細胞株はＦＯＬＲ１の発現が異なる。卵巣がん細胞株をフローサイトメトリーで分析して、ＦＯＬＲ１発現を特徴付けた。 Ａ）卵巣がん細胞株におけるＦＯＬＲ１発現を検出するためのゲート制御戦略。卵巣がん細胞株を、抗ＦＯＬＲ１－ＰＥ抗体を用いてフローサイトメトリーで染色し、密度プロットを図示されているゲートで分析した。まず細胞片を除外した（Ｉ）。続いて、選択された細胞集団のシングレットをゲート制御する（ＩＩ）。シングレット集団の生存細胞は、ネガティブ７－ＡＡＤシグナルで決定する（ＩＩＩ）。最後に、生存細胞を、ＦＯＬＲ１発現について分析する（ＩＶ）。矢印は、サブゲート制御ステップを示す。 Ｂ）未染色（上段列）のまたは抗ＦＯＬＲ１－ＰＥ抗体で染色された（最下段列）生存卵巣がん細胞（ＯＶ－９０ｗｔ、ＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ、ＯＶＣＡＲ－３）の密度プロットが示されている。（Ａ）に記載のようにゲート制御した表記の卵巣がん細胞株のフローサイトメトリー分析。 Ｃ）未染色（上段列）のまたは抗ＦＯＬＲ１－ＰＥ抗体で染色された（最下段列）生存卵巣がん細胞（ＳＫＯＶ－３、Ｃａｏｖ－３）の密度プロットが示されている。（Ａ）に記載のようにゲート制御した表記の卵巣がん細胞株のフローサイトメトリー分析。 Ｄ）細胞頻度（左）ならびに蛍光強度中央値（右）による、Ｂ）のＦＯＬＲ１発現の定量化が示されている。データ点は平均±ＳＥＭを表す。 Ｅ）未染色のまたは異なる抗ＦＯＬＲ１抗体で染色された生存卵巣がん細胞（ＯＶ－９０ｗｔ）の密度プロットが示されている。（Ａ）に記載のようにゲート制御した表記の卵巣がん細胞株のフローサイトメトリー分析。クローンの偏りを排除するために、異なる抗ＦＯＬＲ１抗体クローンを使用して種々の卵巣がん細胞株をフローサイトメトリーで分析した。 Ｆ）未染色のまたは異なる抗ＦＯＬＲ１抗体で染色された生存卵巣がん細胞（ＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ）の密度プロットが示されている。（Ａ）に記載のようにゲート制御した表記の卵巣がん細胞株のフローサイトメトリー分析。クローンの偏りを排除するために、異なる抗ＦＯＬＲ１抗体クローンを使用して種々の卵巣がん細胞株をフローサイトメトリーで分析した。 Ｇ）未染色のまたは異なる抗ＦＯＬＲ１抗体で染色された生存卵巣がん細胞（ＯＶＣＡＲ－３）の密度プロットが示されている。（Ａ）に記載のようにゲート制御した表記の卵巣がん細胞株のフローサイトメトリー分析。クローンの偏りを排除するために、異なる抗ＦＯＬＲ１抗体クローンを使用して種々の卵巣がん細胞株をフローサイトメトリーで分析した。 Ｈ）未染色のまたは異なる抗ＦＯＬＲ１抗体で染色された生存卵巣がん細胞（ＳＫＯＶ－３）の密度プロットが示されている。（Ａ）に記載のようにゲート制御した表記の卵巣がん細胞株のフローサイトメトリー分析。クローンの偏りを排除するために、異なる抗ＦＯＬＲ１抗体クローンを使用して種々の卵巣がん細胞株をフローサイトメトリーで分析した。 Ｉ）未染色のまたは異なる抗ＦＯＬＲ１抗体で染色された生存卵巣がん細胞（Ｃａｏｖ－３）の密度プロットが示されている。（Ａ）に記載のようにゲート制御した表記の卵巣がん細胞株のフローサイトメトリー分析。クローンの偏りを排除するために、異なる抗ＦＯＬＲ１抗体クローンを使用して種々の卵巣がん細胞株をフローサイトメトリーで分析した。 Ｊ）細胞頻度による、Ｄ）のＦＯＬＲ１発現の定量化が示されている。データ点は平均±ＳＥＭを表す。 抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原依存的に機能する。 ３人の独立ドナーに由来する抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞または未形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を、エフェクター細胞：標的細胞比２：１で、 ＯＶ－９０ｗｔ細胞 Ａ）ＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１候補Ａ～Ｄ、 Ｂ）ＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１候補Ｅ～Ｈと共に、または ＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ 細胞 Ｃ）ＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１候補Ａ～Ｄ、 Ｄ）ＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１候補Ｅ～Ｈと共に４８時間共培養した。 各群のデータ点は、ベースライン（最初の時点（Ｔ＝０時）を１００％密集度であると規定した）に対して正規化されており、各データ点は平均＋／－ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。 抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、活性化マーカーを抗原依存的に発現する。それぞれＯＶ－９０と共にまたはＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ細胞と共に４８時間共培養した後、ＣＡＲ Ｔ細胞を、活性化マーカー発現 Ｅ）ＣＤ２５、 Ｆ）ＣＤ６９、および Ｇ）ＣＤ１３７についてフローサイトメトリーで評価した。各バーは、３人のドナーに由来する３つの複製物の平均＋／－ＳＥＭを表す（ｎ＝９）。 抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、疲弊マーカーを抗原依存的に発現する。抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞 Ｈ）候補Ａ～Ｄ、 Ｉ）候補Ｅ～Ｈ（Ｉ）または未形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を、エフェクター細胞：標的細胞比２：１でＯＶ－９０ｗｔ細胞と共に共培養した。共培養の４８時間後、Ｔ細胞を、それぞれ疲弊マーカーＴＩＭ－３、ＰＤ１、およびＬＡＧ３発現についてフローサイトメトリーで評価した。各バーは、３人のドナーに由来する３つの複製物の平均＋／－ＳＥＭを表す（ｎ＝９）。 抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（ＣＤ８ Ｔ細胞）を、共培養後に表現型解析した。３人の独立ドナーに由来する抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞または未形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を、 Ｊ）ＯＶ－９０ｗｔ細胞、または Ｋ）ＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ細胞と共に、エフェクター細胞：標的細胞比２：１で共培養した。４８時間の共培養後、Ｔ細胞を、表現型マーカー発現についてフローサイトメトリーで評価した。Ｔ細胞サブタイプを以下のように規定した：Ｔｓｃｍ － ＣＤ４５ＲＯ－ ＣＤ１９７＋ ＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ９５＋、Ｔｎａｉｖｅ － ＣＤ４５ＲＯ－ ＣＤ１９７＋ ＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ９５－、Ｔｅｍｒａ － ＣＤ４５ＲＯ－ ＣＤ１９７－ ＣＤ６２Ｌ－ ＣＤ９５＋、Ｔｅｍ － ＣＤ４５ＲＯ＋ ＣＤ６２Ｌ－ ＣＤ９５＋、およびＴｃｍ － ＣＤ４５ＲＯ＋ ＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ９５＋。各バーは、平均＋／－ＳＥＭを表す（ｎ＝３）。 抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＯＶ－９０ｗｔ細胞との共培養実験においてサイトカインを抗原依存的に分泌するが、ＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ細胞は分泌しない。３人の独立ドナーに由来する抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞候補 Ｌ）Ａ～Ｄ、および Ｍ）Ｅ～Ｈまたは未形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を、ＯＶ－９０ｗｔ細胞またはＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ細胞と共に、エフェクター細胞：標的細胞比２：１で共培養した。共培養の２４時間後に上清を収集し、続いてサイトカイン濃度を、ヒトＭＡＣＳｐｌｅｘサイトカイン１２キットで決定した。各バーは、３人のドナーに由来する３つの複製物の平均＋／－ＳＥＭを表す（ｎ＝９）。 抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＯＶ－９０ｗｔ細胞との共培養実験においてグランザイムＢを抗原依存的に分泌するが、ＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ細胞は発現しない。 Ｎ）３人の独立ドナーに由来する抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞候補Ａ～Ｈまたは未形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を、ＯＶ－９０ｗｔ細胞またはＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ細胞と共に、エフェクター細胞：標的細胞比２：１で共培養した。２４時間の共培養後にＴ細胞を収集し、ブレフェルジンＡ（１μｇ／ｍＬ）と共に一晩インキュベーションすることによりタンパク質分泌を阻止した。続いて細胞を固定し、ＣＤ８表面マーカーを染色し、透過処理し、最後に細胞内グランザイムＢをフローサイトメトリーで検出した。各バーは、３人のドナーに由来する３つの複製物の平均＋／－ＳＥＭを表す（ｎ＝９）。 抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＦＯＬＲ１発現が異なる卵巣がん細胞株の抗原依存性溶解を媒介する。 抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞または未形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を、ＧＦＰおよびルシフェラーゼを共発現する Ａ）Ｃａｏｖ－３（高ＦＯＬＲ１発現）または Ｂ）ＯＶＣＡＲ－３（中程度ＦＯＬＲ１発現）卵巣がん細胞株と共に、エフェクター細胞：標的細胞比２：１で４８時間共培養した。４８時間の共培養後、生存標的細胞数を、７－ＡＡＤ染色で決定したフローサイトメトリーにより分析した。破線は開始標的細胞数を示し、実線は三重重複の平均を表す。 Ｃ）抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、それぞれＣａｏｖ－３またはＯＶＣＡＲ－３との共培養後に、活性化マーカーを抗原依存的に発現する。抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞または未形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を、標的細胞と共に、エフェクター細胞：標的細胞比２：１で共培養した。共培養の４８時間後、Ｔ細胞を、活性化マーカーＣＤ２５、ＣＤ６９、およびＣＤ１３７発現についてフローサイトメトリーで評価した。データ点は、平均＋／－ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。 抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで異種移植片由来ＯＶ－９０ｗｔ標的細胞に対して細胞溶解活性を示す。 ＮＳＧマウスに由来するＯＶ－９０ｗｔ細胞由来異種移植片を解離させて、単一細胞懸濁物にした。続いて、単離された腫瘍細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した。抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞 Ａ）候補Ａ～Ｄ、 Ｂ）候補Ｅ～Ｈまたは未形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を、異種移植片由来ＯＶ－９０ｗｔ細胞と共に、エフェクター細胞：標的細胞比２：１で９０時間共培養した。各群のデータ点は、ベースライン（最初の時点（Ｔ＝０時）を１００％密集度であると規定した）に対して正規化されており、各データ点は平均＋／－ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。 抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＯＶ－９０細胞を繰り返して負荷しても細胞溶解活性を保持する。連続殺滅アッセイを、抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞と、３人の個々のドナーのＯＶ－９０細胞との共培養で実施した。抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞候補（ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１ ＡおよびＥ）または未形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を、 Ａ）ＯＶ－９０ｗｔ細胞、または Ｂ）ＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ細胞と共に、初期エフェクター細胞：標的細胞比２．５：１（５０，０００個のＣＡＲ Ｔ細胞：２０，０００個のＯＶ－９０細胞）で２５０時間共培養した。９２時間後、２０，０００個のＯＶ－９０標的細胞／ウェルを共培養物に添加した。続いて、１６４時間後、総Ｔ細胞共培養物、５０，０００個のＯＶ－９０標的細胞／ウェルを、共培養物に添加した。データ点は正規化されており、各々は、単一ドナーに由来する三重重複ウェルの平均＋／－ＳＤを表す（ｎ＝３）。 Ｃ）ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖を、それぞれＯＶ－９０ｗｔ細胞およびＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ細胞との数ラウンドの共培養にわたって、フローサイトメトリーおよびＣＡＲ発現Ｔ細胞のＬＮＧＦＲ染色により分析した。データ点は、３人のドナーに由来する二重重複ウェルの平均＋／－ＳＥＭを表す（ｎ＝６）。 ほとんどの抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、無腫瘍ＮＳＧマウスにおいて耐容性が良好である。ＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１候補の耐容性を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）で産生されたＣＡＲ Ｔ細胞を異なる用量で静脈内投与したＮＳＧマウスで評価した。 Ａ）分析の時点を含む研究設計のスキーム。 Ｂ）白血球アフェレーシス（Ｏｒｉ）、単離汎Ｔ細胞（Ｐｏｓ）、および異なるＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１候補の白血球細胞組成を、ＣＡＲ Ｔ細胞生成の経過にわたってフローサイトメトリーで分析した。細胞集団を、以下のように規定した：Ｔ細胞：ＣＤ３＋、ＣＤ５６－、ＣＤ１６－；ＮＫＴ細胞：ＣＤ３＋、ＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋；単球：ＣＤ３－、ＣＤ１４＋；Ｂ細胞：ＣＤ３－、ＣＤ１９＋；好中球：ＣＤ３－、ＣＤ１４－、ＣＤ１９－、ＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋；好酸球：ＣＤ３－、ＣＤ１４－、ＣＤ１９－、ＣＤ５６－、ＣＤ１６－。 Ｃ）ＣＡＲ Ｔ細胞の生存率を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）ＴＣＴプロセス中にフローサイトメトリーで経時的にモニターし、フローサイトメトリー（７－ＡＡＤ染色）で分析した。 Ｄ）ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）ＴＣＴプロセスの終了時の最終ＣＡＲ Ｔ細胞のヒトＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞組成を、フローサイトメトリーで分析した。 Ｅ）ＣＡＲ Ｔ細胞の形質導入効率を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）ＴＣＴプロセス中にフローサイトメトリーで経時的にモニターし、フローサイトメトリー（抗ＬＮＧＦＲ染色）で分析した。 Ｆ）ＮＳＧマウスに、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）で産生された１×１０^６個の抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１ Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）または１×１０^７個の未形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を静脈内注射して、耐容性を評価した。注射後２１日間にわたって体重をモニターした。各線は単一のマウスに対応する。 Ｇ）ＮＳＧマウスに、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）で産生された１×１０^７個の抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１ Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）または１×１０^７個の未形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を静脈内注射して、耐容性を評価した。注射後２１日間にわたって体重をモニターした。各線は単一のマウスに対応する。 Ｈ）それぞれ１×１０^６個のＣＡＲ Ｔ細胞（左）または１×１０^７個のＣＡＲ Ｔ細胞（右）の用量の表記ＣＡＲ候補で処置したマウスの末梢血試料に由来するヒトＴ細胞におけるＣＡＲ発現を経時的に分析した。ＣＡＲ Ｔ細胞を、注射前（ｄ０）およびＴ細胞注射後の８、１５、および２１日目に収集した血液試料中のＬＮＧＦＲ（ＣＡＲとの共発現）発現についてフローサイトメトリーで分析した。データは、１群あたり６匹マウスの値の平均±ＳＥＭとして示されている（ｎ＝６）。 Ｉ）ＣＡＲ Ｔ細胞処置マウスの末梢血中のマウスおよびヒト白血球組成を分析した。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）で産生された抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞または未形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を、１×１０^６または１×１０^７個ＣＡＲ Ｔ細胞用量で注射した。マウス血液試料を、Ｔ細胞注射後の８、１５、および２１日目に、それぞれマウスまたはヒトＣＤ４５発現についてフローサイトメトリーで分析した。各データ点は個々のマウスを表し、水平の線は対応する群の平均を表す。 Ｊ）ＣＡＲ Ｔ細胞処置マウスの末梢血中のヒトＴ細胞組成（ＣＤ４、ＣＤ８）を評価した。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）で産生された抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞または未形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を、１×１０^６または１×１０^７個ＣＡＲ Ｔ細胞用量で注射した。ヒトＴ細胞を、Ｔ細胞注射後の８、１５、および２１日目に収集した血液試料中の、それぞれヒトＣＤ４およびＣＤ８発現についてフローサイトメトリーで分析した。各データ点は個々のマウスを表し、水平の線は対応する群の平均を表す。 Ｋ）マウス骨髄（左）および脾臓（右）におけるマウスおよびヒト白血球組成を分析した。Ｔ細胞注射後２１日目にマウスを犠牲死させ、それぞれの臓器を収集し、解離させた。臓器の単一細胞懸濁物を、それぞれマウスまたはヒトＣＤ４５発現についてｅｘ ｖｉｖｏでフローサイトメトリーにより分析した。各データ点は個々のマウスを表し、水平の線は対応する群の平均を表す。 Ｌ）マウス骨髄（左）および脾臓（右）におけるヒトＴ細胞組成（ＣＤ４、ＣＤ８）を評価した。Ｔ細胞注射後２１日目にマウスを犠牲死させ、それぞれの臓器を収集し、解離させた。臓器の単一細胞懸濁物を、それぞれヒトＣＤ４およびＣＤ８発現についてｅｘ ｖｉｖｏでフローサイトメトリーにより分析した。各データ点は個々のマウスを表し、水平の線は対応する群の平均を表す。 Ｍ）マウス骨髄および脾臓に由来するヒトＴ細胞におけるＣＡＲ発現を分析した。ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＬＮＧＦＲ（ＣＡＲとの共発現）発現についてフローサイトメトリーで分析した。Ｔ細胞注射後２１日目にマウスを犠牲死させ、それぞれの臓器を収集し、解離させた。臓器の単一細胞懸濁物を、ＬＮＧＦＲ発現についてｅｘ ｖｉｖｏでフローサイトメトリーにより分析した。各データ点は単一のマウスを表し、水平の線は対応する群の平均を表す。 Ｎ）ＣＡＲ Ｔ細胞処置マウスの末梢血試料におけるヒトサイトカインの分泌を経時的に分析した。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）で産生された抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞または未形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を、１×１０^６個ＣＡＲ Ｔ細胞用量で注射した。Ｔ細胞注射後８、１５、および２１日目に収集した血液試料から血漿を単離し、続いてヒトＭＡＣＳｐｌｅｘサイトカイン１２キットを用いてサイトカインレベルを決定した。データは、１群あたり６匹マウスの値の平均±ＳＥＭとして示されている（ｎ＝６）。 Ｏ）ＣＡＲ Ｔ細胞処置マウスの末梢血試料におけるヒトサイトカインの分泌を経時的に分析した。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）で産生された抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞または未形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を、１×１０^７個ＣＡＲ Ｔ細胞用量で注射した。Ｔ細胞注射後８、１５、および２１日目に収集した血液試料から血漿を単離し、続いてヒトＭＡＣＳｐｌｅｘサイトカイン１２キットを用いてサイトカインレベルを決定した。データは、１群あたり６匹マウスの値の平均±ＳＥＭとして示されている（ｎ＝６）。 Ｐ）末梢血試料におけるマウスサイトカインの分泌を経時的に分析した。抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞または未形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を、１×１０^７個ＣＡＲ Ｔ細胞用量で注射した。Ｔ細胞注射後８、１５、および２１日目に収集した血液試料から血漿を単離し、続いてヒトＭＡＣＳｐｌｅｘサイトカイン１２キットを用いてサイトカインレベルを決定した。データは、１群あたり６匹マウスの値の平均±ＳＥＭとして示されている（ｎ＝６）。 抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ候補は、ＮＳＧマウスにおいてＯＶ－９０ｗｔ腫瘍を効率的に根絶する。ＮＳＧマウスにＯＶ－９０細胞を皮下注射し、２１日後にＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）で産生された抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（総Ｔ細胞１×１０^７個；ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１ Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）または未形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を静脈内注射して、抗腫瘍機能を評価した。 Ａ）分析の時点を含む研究設計のスキーム。 Ｂ）白血球アフェレーシス（Ｏｒｉ）、単離汎Ｔ細胞（Ｐｏｓ）、および異なるＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１候補の白血球細胞組成を、ＣＡＲ Ｔ細胞生成の経過にわたってフローサイトメトリーで分析した。細胞集団を以下のように規定した：Ｔ細胞：ＣＤ３＋、ＣＤ５６－、ＣＤ１６－；ＮＫＴ細胞：ＣＤ３＋、ＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋；単球：ＣＤ３－、ＣＤ１４＋；Ｂ細胞：ＣＤ３－、ＣＤ１９＋；好中球：ＣＤ３－、ＣＤ１４－、ＣＤ１９－、ＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋；好酸球：ＣＤ３－、ＣＤ１４－、ＣＤ１９－、ＣＤ５６－、ＣＤ１６－。 Ｃ）ＣＡＲ Ｔ細胞の生存率を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）ＴＣＴプロセス中にフローサイトメトリーで経時的にモニターし、フローサイトメトリー（７ＡＡＤ染色）で分析した。 Ｄ）ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）ＴＣＴプロセスの終了時の最終ＣＡＲ Ｔ細胞のヒトＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞組成を、フローサイトメトリーで分析した。 Ｅ）ＣＡＲ Ｔ細胞の形質導入効率を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）ＴＣＴプロセス中にフローサイトメトリーで経時的にモニターし、フローサイトメトリー（抗ＬＮＧＦＲ染色）で分析した。 Ｆ）最終ＣＡＲ Ｔ細胞のベクターコピー数を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）ＴＣＴプロセスの終了時にｑＰＣＲで決定した。 Ｇ）ＣＡＲ Ｔ細胞産物の機能性および特異性を、それぞれ０．５：１（左パネル）または２：１（右パネル）の異なるエフェクター細胞：標的細胞比のＯＶ－９０ｗｔ（上段パネル）およびＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ細胞（下段パネル）との４８時間にわたるｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養実験により評価した。各群のデータ点は、ベースライン（最初の時点（Ｔ＝０時）を１００％密集度であると規定した）に対して正規化されており、各データ点は平均＋／－ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。 Ｈ）ＣＡＲ Ｔ細胞注射後、マウスの体重を２１日間モニターした。各線は個々のマウスに対応する。 Ｉ）ＣＡＲ Ｔ細胞注射後の個々のＯＶ－９０異種移植片腫瘍担持ＮＳＧマウスの代表的な生物発光画像。すべての画像のカラースケール、最小＝１．０８×１０^８、最大＝１．２７×１０^１０。 Ｊ）２１日間にわたるＣＡＲ Ｔ細胞注射後の異なる実験群における個々のマウスの１秒当たりの光子（ｐ／ｓ）の全光束としての生物発光の定量化。各線は個々のマウスを表す。 Ｋ）２１日間にわたるＣＡＲ Ｔ細胞注射後の異なる実験群の１秒当たりの光子（ｐ／ｓ）の全光束としての生物発光の定量化。データ点は平均±ＳＥＭを表す。 Ｌ）ＣＡＲ Ｔ細胞処置マウスの末梢血中のマウスおよびヒト白血球組成を分析した。マウス血液試料を、Ｔ細胞注射後の７、１４、および２１日目に、それぞれマウスまたはヒトＣＤ４５発現についてフローサイトメトリーで分析した。各データ点は個々のマウスを表し、水平の線は対応する群の平均を表す。 Ｍ）ＣＡＲ Ｔ細胞処置マウスの末梢血中のヒトＴ細胞組成（ＣＤ４、ＣＤ８）を評価した。ヒトＴ細胞を、Ｔ細胞注射後の７、１４、および２１日目に収集した血液試料中の、それぞれヒトＣＤ４およびＣＤ８発現についてフローサイトメトリーで分析した。各データ点は個々のマウスを表し、水平の線は対応する群の平均を表す。 Ｎ）ＣＡＲ Ｔ細胞処置マウスの末梢血中のヒト白血球を、フローサイトメトリーで経時的に分析した。Ｔ細胞注射後の７、１４、および２１日目に収集した血液試料中のヒトＣＤ４５発現を測定した。データは平均±ＳＥＭとして示されている。 Ｏ）表記ＣＡＲ候補で処置したマウスの末梢血試料に由来するヒトＴ細胞におけるＣＡＲ発現を経時的に分析した。ＣＡＲ Ｔ細胞を、Ｔ細胞注射後の７、１４、および２１日目に収集した血液試料中のＬＮＧＦＲ（ＣＡＲとの共発現）発現についてフローサイトメトリーで分析した。データは平均±ＳＥＭとして示されている。 Ｐ）マウス骨髄、脾臓、肺、および腫瘍におけるマウスおよびヒト白血球組成を分析した。Ｔ細胞注射後２１日目にマウスを犠牲死させ、それぞれの臓器を収集し、解離させた。臓器の単一細胞懸濁物を、それぞれマウスまたはヒトＣＤ４５発現についてｅｘ ｖｉｖｏでフローサイトメトリーにより分析した。各データ点は個々のマウスを表し、水平の線は対応する群の平均を表す。 Ｑ）マウス骨髄、脾臓、肺、および腫瘍におけるヒトＴ細胞組成（ＣＤ４、ＣＤ８）を評価した。Ｔ細胞注射後２１日目にマウスを犠牲死させ、それぞれの臓器を収集し、解離させた。臓器の単一細胞懸濁物を、それぞれヒトＣＤ４およびＣＤ８発現についてｅｘ ｖｉｖｏでフローサイトメトリーにより分析した。各データ点は個々のマウスを表し、水平の線は対応する群の平均を表す。 Ｒ）マウス血液、肺、骨髄、脾臓、および腫瘍に由来するヒトＴ細胞におけるＣＡＲ発現を分析した。Ｔ細胞注射後２１日目にマウスを犠牲死させ、それぞれの臓器を収集し、解離させた。臓器の単一細胞懸濁物ならびに血液試料を、ＬＮＧＦＲ発現（ＣＡＲとの共発現）についてｅｘ ｖｉｖｏでフローサイトメトリーにより分析した。各データ点は個々のマウスを表し、水平の線は対応する群の平均を表し、±ＳＥＭのエラーバーが共に示されている。 Ｓ）マウス血液、骨髄、脾臓、肺、および腫瘍に由来するヒトＣＤ４ Ｔ細胞を表現型解析した。Ｔ細胞注射後２１日目にマウスを犠牲死させ、それぞれの臓器を収集し、解離させた。臓器の単一細胞懸濁物をｅｘ ｖｉｖｏで分析した。Ｔ細胞の表現型マーカー発現を、フローサイトメトリーで評価した。Ｔ細胞サブタイプを以下のように規定した：Ｔｓｃｍ：ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＤ１９７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ９５＋；Ｔｎａｉｖｅ：ＣＤ８＋またはＣＤ４＋、ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＤ１９７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ９５－；Ｔｅｍｒａ：ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＤ１９７－、ＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ９５＋；Ｔｅｍ：ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ９５＋；およびＴｃｍ：ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ９５＋。各バーは、対応する群の平均＋／－ＳＥＭを表す。 Ｔ）マウス血液、骨髄、脾臓、肺、および腫瘍に由来するヒトＣＤ８ Ｔ細胞を表現型解析した。Ｔ細胞注射後２１日目にマウスを犠牲死させ、それぞれの臓器を収集し、解離させた。臓器の単一細胞懸濁物をｅｘ ｖｉｖｏで分析した。Ｔ細胞の表現型マーカー発現をフローサイトメトリーで評価した。Ｔ細胞サブタイプを以下のように規定した：Ｔｓｃｍ：ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＤ１９７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ９５＋；Ｔｎａｉｖｅ：ＣＤ８＋またはＣＤ４＋、ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＤ１９７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ９５－；Ｔｅｍｒａ：ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＤ１９７－、ＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ９５＋；Ｔｅｍ：ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ９５＋；およびＴｃｍ：ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ９５＋。各バーは、対応する群の平均＋／－ＳＥＭを表す。 Ｕ）末梢血試料におけるヒトサイトカインの分泌を経時的に分析した。Ｔ細胞注射後の７、１４、および２１日目に収集した血液試料から血漿を単離し、続いてヒトＭＡＣＳｐｌｅｘサイトカイン１２キットを用いてサイトカインレベルを決定した。データは平均±ＳＥＭとして示されている。 ＦＯＬＲ１特異的ＣＡＲ候補は、初代ヒトＴ細胞において代替レンチウイルスベクターから発現される。抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ発現を決定するために抗ビオチンＰＥ二次染色を使用した、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）ＴＣＴプロセスで産生されたＣＡＲ Ｔ細胞でのビオチン化ＦＯＬＲ１－Ｆｃ融合タンパク質染色による抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ発現のフローサイトメトリー分析。分析したフローサイトメトリーデータは、生存細胞のＣＤ３陽性集団の中から選択した。 ＦＯＬＲ１特異的ＣＡＲ Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原依存的に機能する。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）ＴＣＴプロセスで産生されたＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１候補ＡおよびＥまたは未形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を、エフェクター細胞：標的細胞比２：１で卵巣がん細胞株と共に４８時間共培養した。 Ａ）ＧＦＰ発現標的細胞株ＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ、ＯＶ－９０ｗｔ、Ｃａｏｖ－３、ＳＫＯＶ－３、およびＯＶＣＡＲ－３細胞とＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１候補ＡおよびＥとの共培養実験。各群のデータ点は、ベースライン（最初の時点（Ｔ＝０時）を１００％密集度であると規定した）に対して正規化されており、各データ点は平均＋／－ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。 抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、種々のレベルの活性化マーカーおよび疲弊マーカーを発現する。異なる標的細胞との４８時間の共培養後、ＣＡＲ Ｔ細胞を、フローサイトメトリーで、 Ｂ）活性化マーカーＣＤ２５、ＣＤ６９、およびＣＤ１３７、ならびに Ｃ）疲弊マーカーＴＩＭ－３、ＰＤ１、およびＬＡＧ３の発現について評価した。 各バーは、平均＋／－ＳＥＭを表す（ｎ＝３）。 Ｄ）抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ、ＯＶ－９０ｗｔ、Ｃａｏｖ－３、ＳＫＯＶ－３、およびＯＶＣＡＲ－３細胞との共培養時にサイトカインを抗原依存的に分泌する。共培養の２４時間後に上清を収集し、続いてサイトカイン濃度を、ヒトＭＡＣＳｐｌｅｘサイトカイン１２キットで決定した。各バーは、平均＋／－ＳＥＭを表す（ｎ＝３）。 Ｅ）抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ、ＯＶ－９０ｗｔ、Ｃａｏｖ－３、ＳＫＯＶ－３、およびＯＶＣＡＲ－３細胞との共培養時にグランザイムＢを抗原依存的に発現する。２４時間の共培養後にＴ細胞を収集し、ブレフェルジンＡ（１μｇ／ｍＬ）と共に一晩インキュベーションすることによりタンパク質分泌を阻止した。続いて細胞を固定し、ＣＤ８表面マーカーを染色し、透過処理し、最後に細胞内グランザイムＢをフローサイトメトリーで検出した。各バーは、平均＋／－ＳＥＭを表す（ｎ＝３）。 ＭＢ－ＦＯＬＲ１ ＣＡＲＴ Ａ Ｔ細胞は、ＮＳＧマウスにおいてＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１発現腫瘍のみを特異的に根絶し、ＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ腫瘍を根絶しない。 ＮＳＧマウスにＯＶ－９０ｗｔ細胞またはＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ細胞を皮下注射し、２１日後にＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）で産生された抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（総Ｔ細胞１×１０^７個；ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１ Ａ）または未形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を静脈内注射して、抗腫瘍機能を評価した。 Ａ）分析の時点を含む研究設計のスキーム。 Ｂ）白血球アフェレーシス（Ｏｒｉ）、単離汎Ｔ細胞（Ｐｏｓ）、およびＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１候補Ａ（ＣＡＲＴ Ａ）の白血球細胞組成を、ＣＡＲ Ｔ細胞生成の経過にわたってフローサイトメトリーで分析した。細胞集団を以下のように規定した：Ｔ細胞：ＣＤ３＋、ＣＤ５６－、ＣＤ１６－；ＮＫＴ細胞：ＣＤ３＋、ＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋；単球：ＣＤ３－、ＣＤ１４＋；Ｂ細胞：ＣＤ３－、ＣＤ１９＋；好中球：ＣＤ３－、ＣＤ１４－、ＣＤ１９－、ＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋；好酸球：ＣＤ３－、ＣＤ１４－、ＣＤ１９－、ＣＤ５６－、ＣＤ１６－。 Ｃ）ＣＡＲ Ｔ細胞の生存率を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）ＴＣＴプロセス中にフローサイトメトリーで経時的にモニターし、フローサイトメトリー（７ＡＡＤ染色）で分析した。 Ｄ）ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）ＴＣＴプロセスの終了時の最終ＣＡＲ Ｔ細胞のヒトＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞組成を、フローサイトメトリーで分析した。 Ｅ）ＣＡＲ Ｔ細胞の形質導入効率を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）ＴＣＴプロセス中にフローサイトメトリーで経時的にモニターし、フローサイトメトリー（ＦＯＬＲ１－Ｆｃ融合タンパク質染色）で分析した。 Ｆ）最終ＣＡＲ Ｔ細胞のベクターコピー数を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）ＴＣＴプロセスの終了時にｑＰＣＲで決定した。 Ｇ）マウス（ＯＶ－９０ｗｔ細胞を注射）の体重を、ＣＡＲ Ｔ細胞注射後２１日間にわたってモニターした。各線は個々のマウスに対応する。 Ｈ）マウス（ＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ細胞を注射）の体重を、ＣＡＲ Ｔ細胞注射後２１日間にわたってモニターした。各線は個々のマウスに対応する。 Ｉ）ＣＡＲ Ｔ細胞注射後の個々のＯＶ－９０異種移植片腫瘍担持ＮＳＧマウスの代表的な生物発光画像。すべての画像のカラースケール、最小＝１．０８×１０^８、最大＝１．２７×１０^１０。 Ｊ）２１日間にわたるＣＡＲ Ｔ細胞注射後の個々のマウス（ＯＶ－９０ｗｔ細胞を注射）の１秒当たりの光子（ｐ／ｓ）の全光束としての生物発光の定量化。各線は個々のマウスを表す。 Ｋ）２１日間にわたるＣＡＲ Ｔ細胞注射後の個々のマウス（ＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ細胞を注射）の１秒当たりの光子（ｐ／ｓ）の全光束としての生物発光の定量化。各線は個々のマウスを表す。 Ｌ）２１日間にわたるＣＡＲ Ｔ細胞注射後の異なる実験群の１秒当たりの光子（ｐ／ｓ）の全光束としての生物発光の定量化。データ点は平均±ＳＥＭを表す。 Ｍ）ＣＡＲ Ｔ細胞処置マウスの末梢血中のマウスおよびヒト白血球組成を分析した。マウス血液試料を、Ｔ細胞注射後の７、１４、および２１日目に、それぞれマウスまたはヒトＣＤ４５発現についてフローサイトメトリーで分析した。ＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ腫瘍を有する未処置群では、マウスがエンドポイント基準に達し、したがって１４日目に摘出されたため、２１日目のデータは表示されていない。各データ点は個々のマウスを表し、水平の線は対応する群の平均を表す。 Ｎ）ＣＡＲ Ｔ細胞処置マウスの末梢血中のヒトＴ細胞組成（ＣＤ４、ＣＤ８）を評価した。ヒトＴ細胞を、Ｔ細胞注射後の７、１４、および２１日目に収集した血液試料中の、それぞれヒトＣＤ４およびＣＤ８発現についてフローサイトメトリーで分析した。各データ点は個々のマウスを表し、水平の線は対応する群の平均を表す。 Ｏ）ＣＡＲ Ｔ細胞処置マウスの末梢血中のヒト白血球を、フローサイトメトリーで経時的に分析した。Ｔ細胞注射後の７、１４、および２１日目に収集した血液試料中のヒトＣＤ４５発現を測定した。データは平均±ＳＥＭとして示されている。 Ｐ）表記ＣＡＲ候補で処置したマウスの末梢血試料に由来するヒトＴ細胞におけるＣＡＲ発現を経時的に分析した。Ｔ細胞注射後の７、１４、および２１日目に収集した血液試料中のＣＡＲ Ｔ細胞を、ＦＯＬＲ１－Ｆｃ融合タンパク質染色を用いたフローサイトメトリーで分析した。データは平均±ＳＥＭとして示されている。 Ｑ）マウス骨髄、脾臓、肺、および腫瘍におけるマウスおよびヒト白血球組成を分析した。Ｔ細胞注射後２１日目にマウスを犠牲死させ、それぞれの臓器を収集し、解離させた。臓器の単一細胞懸濁物を、それぞれマウスまたはヒトＣＤ４５発現についてｅｘ ｖｉｖｏでフローサイトメトリーにより分析した。各データ点は個々のマウスを表し、水平の線は対応する群の平均を表す。 Ｒ）マウス骨髄、脾臓、肺、および腫瘍におけるヒトＴ細胞組成（ＣＤ４、ＣＤ８）を評価した。Ｔ細胞注射後２１日目にマウスを犠牲死させ、それぞれの臓器を収集し、解離させた。臓器の単一細胞懸濁物を、それぞれヒトＣＤ４およびＣＤ８発現についてｅｘ ｖｉｖｏでフローサイトメトリーにより分析した。各データ点は個々のマウスを表し、水平の線は対応する群の平均を表す。 Ｓ）マウス血液、肺、骨髄、脾臓、および腫瘍におけるマウスＣＤ４５細胞と比べたＣＡＲ発現細胞の定量化。Ｔ細胞注射後２１日目にマウスを犠牲死させ、それぞれの臓器を収集し、解離させた。臓器の単一細胞懸濁物ならびに血液試料のＦＯＬＲ１－Ｆｃ融合タンパク質染色を、ｅｘ ｖｉｖｏでフローサイトメトリーにより分析した。各データ点は個々のマウスを表し、水平の線は対応する群の平均を表し、±ＳＥＭのエラーバーが共に示されている。 Ｔ）研究エンドポイントにおける残りの腫瘍組織におけるＦＯＬＲ１発現および細胞組成。 ＧＦＰ陽性腫瘍細胞および他の細胞（ヒトまたはマウス免疫細胞）の割合として表されている異種移植片組織の組成が右パネルに図示されている。 ＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ腫瘍を有する未処置群を除くすべての群について、ＣＡＲ Ｔ細胞注射の２１日後の研究エンドポイント時点で、ｅｘ ｖｉｖｏ分析を実施した。こうした場合、マウスはより早期にエンドポイント基準に達したため、１４日目に摘出した。 Ｕ）マウス血液、骨髄、脾臓、肺、および腫瘍に由来するヒトＣＤ４ Ｔ細胞を表現型解析した。Ｔ細胞注射後２１日目にマウスを犠牲死させ、それぞれの臓器を収集し、解離させた。臓器の単一細胞懸濁物をｅｘ ｖｉｖｏで分析した。Ｔ細胞の表現型マーカー発現をフローサイトメトリーで評価した。Ｔ細胞サブタイプを以下のように規定した：Ｔｓｃｍ：ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＤ１９７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ９５＋；Ｔｎａｉｖｅ：ＣＤ８＋またはＣＤ４＋、ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＤ１９７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ９５－；Ｔｅｍｒａ：ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＤ１９７－、ＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ９５＋；Ｔｅｍ：ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ９５＋；およびＴｃｍ：ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ９５＋。各バーは、対応する群の平均＋／－ＳＥＭを表す。 Ｖ）マウス血液、骨髄、脾臓、肺、および腫瘍に由来するヒトＣＤ８ Ｔ細胞を表現型解析した。Ｔ細胞注射後２１日目にマウスを犠牲死させ、それぞれの臓器を収集し、解離させた。臓器の単一細胞懸濁物をｅｘ ｖｉｖｏで分析した。Ｔ細胞の表現型マーカー発現をフローサイトメトリーで評価した。Ｔ細胞サブタイプを以下のように規定した：Ｔｓｃｍ：ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＤ１９７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ９５＋；Ｔｎａｉｖｅ：ＣＤ８＋またはＣＤ４＋、ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＤ１９７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ９５－；Ｔｅｍｒａ：ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＤ１９７－、ＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ９５＋；Ｔｅｍ：ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ９５＋；およびＴｃｍ：ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ９５＋。各バーは、対応する群の平均＋／－ＳＥＭを表す。 Ｗ）末梢血試料におけるヒトサイトカインの分泌を経時的に分析した。Ｔ細胞注射後の７、１４、および２１日目に収集した血液試料から血漿を単離し、続いてヒトＭＡＣＳｐｌｅｘサイトカイン１２キットを用いてサイトカインレベルを決定した。データは、値の平均±ＳＥＭとして示されている。

抗原ＦｏｌＲ１に特異的なＣＡＲを発現する遺伝子操作された免疫細胞により直接的に標的とされるＦｏｌＲ１発現がん性細胞は、そうした細胞が増殖できなくなるようなおよび／または殺滅が促進されるような影響を受けることを見出した。それに加えて、驚くべきことに、抗原結合性ドメインをコードする特定の配列、ならびに抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）の配向性が、抗ＦｏｌＲ１－ＣＡＲの他のバリアントと比較してより効果的であることを見出した（実施例２）。

第１の態様では、本発明は、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを提供する。細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインおよび／または一次刺激ドメインを含んでいてもよい。

前記細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む少なくとも１つの一次シグナル伝達ドメインおよび／または少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。前記ＣＡＲの当該一次細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータであってもよい。

抗原結合性ドメインは、例えば、単一ドメイン抗体、全長重鎖、Ｆａｂ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、ＶＨＨ断片、二価単鎖抗体、またはダイアボディを含んでいてもよく、これらの各々は、標的抗原ＦｏｌＲ１に特異的であってもよい。

前記ＣＡＲの前記抗原結合性ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含んでいてもよい。本発明の一実施形態では、抗原結合性ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へと、配列番号２を含むＶＨおよび配列番号４を含むＶＬを含んでいてもよい。

前記ＣＡＲの前記抗原結合性ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むｓｃＦｖであってもよい。本発明の一実施形態では、抗原結合性ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へと、配列番号２を含むＶＨおよび配列番号４を含むＶＬを含むｓｃＦｖであってもよい。

本発明の一実施形態では、前記ＣＡＲの抗原結合性ドメインは、配列番号１０３のアミノ酸配列を含んでいてもよい。

前記ＣＡＲは、スペーサーとしてヒンジドメインを含んでもよく、ヒンジドメインは、例えば、ＣＤ８アルファ（配列番号３４）またはＩＧＧ４（配列番号３６）のヒンジの配列を含んでもよい。好ましい実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８アルファのヒンジドメインを含んでもよく、ＣＤ８アルファのヒンジドメインは、配列番号３４を含んでもよい。

本発明の別の実施形態では、前記ＣＡＲは、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むｓｃＦｖなどの抗原結合性ドメイン、ならびにＣＤ８アルファの前記ヒンジを含んでいてもよい。

本発明の好ましい実施形態では、前記ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端へと、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むｓｃＦｖなどの前記抗原結合性ドメイン、ならびにＣＤ８アルファの前記ヒンジを含んでいてもよい。

本発明の別の好ましい実施形態では、前記ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端へと、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む前記抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、ならびに配列番号３４を含むＣＤ８アルファの前記ヒンジを含んでいてもよい。

本発明の一実施形態では、前記ＣＡＲは、配列番号１０３を含む前記抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）およびＣＤ８アルファの前記ヒンジを含んでいてもよい。

本発明の別の実施形態では、前記ＣＡＲは、配列番号１０３を含む前記抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）および配列番号３４を含むＣＤ８アルファの前記ヒンジを含んでいてもよい。

前記ＣＡＲは、ＣＤ８アルファ（配列番号３８）またはＣＤ２８（配列番号１０７）に由来する膜貫通ドメインの配列を含む膜貫通ドメインを含んでいてもよい。

本発明の一実施形態では、前記ＣＡＲは、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む前記抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、ＣＤ８アルファの前記ヒンジ、ならびにＣＤ８アルファの前記膜貫通ドメインを含んでいてもよい。

本発明の別の実施形態では、前記ＣＡＲは、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む前記抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、ならびに配列番号３４を含むＣＤ８アルファの前記ヒンジ、ならびに配列番号３８を含むＣＤ８アルファの前記膜貫通ドメインを含んでいてもよい。

本発明の好ましい実施形態では、前記ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端へと、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む前記抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、ならびにＣＤ８アルファの前記ヒンジ、ならびにＣＤ８アルファの前記膜貫通ドメインを含んでいてもよい。

本発明の別の好ましい実施形態では、前記ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端へと、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む前記抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、ならびに配列番号３４を含むＣＤ８アルファの前記ヒンジ、ならびに配列番号３８を含むＣＤ８アルファの前記膜貫通ドメインを含んでいてもよい。

本発明の一実施形態では、前記ＣＡＲは、配列番号１０３を含む前記抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、ＣＤ８アルファの前記ヒンジ、およびＣＤ８アルファの前記膜貫通ドメインを含んでいてもよい。

本発明の好ましい実施形態では、前記ＣＡＲは、配列番号１０３を含む前記抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、および配列番号３４を含むＣＤ８アルファの前記ヒンジ、および配列番号３８を含むＣＤ８アルファの前記膜貫通ドメインを含んでいてもよい。

前記ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＣＤ３ゼータ（配列番号４２）ならびに／またはＣＤ２８（配列番号１０９）、ＣＤ１３７（４１ＢＢ；配列番号４０）、およびＯＸ４０（配列番号１１１）の１つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメインの配列を含んでいてもよい。好ましい実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８アルファの膜貫通ドメイン、ＣＤ３ゼータの細胞内一次（刺激）シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ１３７（４１ＢＢ）の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含む。

本発明の一実施形態では、前記ＣＡＲは、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む前記抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、ＣＤ８アルファの前記ヒンジ、ＣＤ８アルファの前記膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ１３７の共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータの刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。

本発明の好ましい実施形態では、前記ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端へと、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む前記抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、ならびにＣＤ８アルファの前記ヒンジ、ならびにＣＤ８アルファの前記膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ１３７の共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータの刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。

本発明の別の好ましい実施形態では、前記ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端へと、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む前記抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、ならびに配列番号３４を含むＣＤ８アルファの前記ヒンジ、ならびに配列番号３８を含むＣＤ８アルファの前記膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ１３７の共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータの刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。

本発明の一実施形態では、前記ＣＡＲは、配列番号１０３を含む前記抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、ならびにＣＤ８アルファの前記ヒンジ、ＣＤ８アルファの前記膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ１３７の共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータの刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。

本発明の好ましい実施形態では、前記ＣＡＲは、配列番号１０３を含む前記抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、ならびに配列番号３４を含むＣＤ８アルファの前記ヒンジ、ならびに配列番号３８を含むＣＤ８アルファの前記膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ１３７の共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータの刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。

前記ＣＡＲは、配列番号１０５のアミノ酸配列を含んでいてもよい。

別の態様では、本発明は、本明細書に開示される本発明のＦｏｌＲ１－ＣＡＲをコードする単離された核酸配列を提供する。

本発明の一実施形態では、核酸は、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードしていてもよく、前記抗原結合性ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へと、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）、ならびにＣＤ８アルファの前記ヒンジを含んでいてもよい。

本発明の別の実施形態では、核酸は、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードしていてもよく、前記抗原結合性ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へと、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）、ならびに配列番号３４を含むＣＤ８アルファの前記ヒンジを含んでいてもよい。

本発明の好ましい実施形態では、核酸は、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードしていてもよく、前記抗原結合性ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へと、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）、ＣＤ８アルファの前記ヒンジ、ＣＤ８アルファの前記膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ１３７の共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータの刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。

本発明の一実施形態では、核酸は、配列番号１０３を含む前記抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）およびＣＤ８アルファの前記ヒンジを含むＣＡＲをコードしていてもよい。

本発明の好ましい実施形態では、核酸は、配列番号１０３を含む前記抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）および配列番号３４を含むＣＤ８アルファの前記ヒンジを含むＣＡＲをコードしていてもよい。

本発明のさらに別の好ましい実施形態では、核酸は、配列番号１０３を含む前記抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、ＣＤ８アルファの前記ヒンジ、ＣＤ８アルファの前記膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ１３７の共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータの刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードしていてもよい。

本明細書に開示のＣＡＲをコードする核酸配列は、ウイルスベクターなどのベクターに含まれていてもよい。ベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミドベクター、コスミドベクター、ヘルペスウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、もしくはレトロウイルスベクター、またはそれらの組合せであってもよい。

本発明の一部の実施形態では、ベクターはプロモーターをさらに含み、プロモーターは、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、構成的プロモーター、自殺プロモーター、またはそれらの任意の組合せである。

本発明の別の実施形態では、ＣＡＲをコードするベクターをさらに改変して、ＣＡＲ Ｔ細胞の発現を制御するためのまたは自殺スイッチによりＣＡＲ－Ｔ細胞を排除するための１つまたは複数の作動性エレメントを含めることができる。自殺スイッチとしては、例えば、アポトーシス誘導性シグナル伝達カスケード、または細胞死を誘導する薬物を挙げることができる。好ましい実施形態では、ＣＡＲを発現するベクターをさらに改変して、チミジンキナーゼ（ＴＫ）またはシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）などの酵素を発現させることができる。

別の態様では、本発明は、本明細書に開示のＦｏｌＲ１に特異的な前記ＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞を提供する。

本発明の一実施形態では、遺伝子操作された細胞は、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現することができ、前記抗原結合性ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含んでいてもよい。

本発明の別の実施形態では、遺伝子操作された細胞は、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現することができ、前記抗原結合性ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へと、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）、ならびにＣＤ８アルファの前記ヒンジを含んでいてもよい。

本発明の好ましい実施形態では、遺伝子操作された細胞は、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現することができ、前記抗原結合性ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へと、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）、ならびに配列番号３４を含むＣＤ８アルファの前記ヒンジを含んでいてもよい。

本発明の別の好ましい実施形態では、遺伝子操作された細胞は、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現することができ、前記抗原結合性ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へと、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）、ＣＤ８アルファの前記ヒンジ、ＣＤ８アルファの前記膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ１３７の共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータの刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。

本発明の一実施形態では、遺伝子操作された細胞は、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現することができ、前記抗原結合性ドメインは、配列番号１０３およびＣＤ８アルファの前記ヒンジを含んでいてもよい。

本発明の別の実施形態では、遺伝子操作された細胞は、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現することができ、前記抗原結合性ドメインは、配列番号１０３、および配列番号３４を含むＣＤ８アルファの前記ヒンジを含んでいてもよい。

本発明の好ましい実施形態では、遺伝子操作された細胞は、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現することができ、前記抗原結合性ドメインは、配列番号１０３、ならびにＣＤ８アルファの前記ヒンジ、ＣＤ８アルファの前記膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ１３７の共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータの刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。

本発明の一実施形態では、前記細胞は免疫細胞であってもよい。本発明の好ましい実施形態では、前記細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはＮＫ細胞であってもよい。本発明のより好ましい実施形態では、前記細胞はＴ細胞である。

一態様では、本発明は、免疫療法で使用するための、前記ＦｏｌＲ１ ＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞を提供する。免疫療法は、がんに罹患している対象のがんを治療するためであってもよく、前記がんのがん性細胞はＦｏｌＲ１を発現する。免疫療法は、がんに罹患している対象のがんを治療するためであってもよく、前記がんのがん性細胞の少なくとも部分集団はＦｏｌＲ１を発現する。

本発明の一実施形態では、ＦｏｌＲ１に特異的なＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞は、免疫療法に使用するためのものであってもよく、ＣＡＲは、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合性ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）、ならびにＣＤ８アルファの前記ヒンジを含んでいてもよい。

本発明の別の実施形態では、ＦｏｌＲ１に特異的なＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞は、免疫療法に使用するためのものであってもよく、ＣＡＲは、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合性ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へと、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）、ならびにＣＤ８アルファの前記ヒンジを含んでいてもよい。

本発明の好ましい実施形態では、ＦｏｌＲ１に特異的なＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞は、免疫療法に使用するためのものであってもよく、ＣＡＲは、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合性ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へと、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）、ならびに配列番号３４を含むＣＤ８アルファの前記ヒンジを含んでいてもよい。

本発明の一実施形態では、ＦｏｌＲ１に特異的なＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞は、免疫療法に使用するためのものであってもよく、ＣＡＲは、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合性ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へと、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）、ＣＤ８アルファの前記ヒンジ、ＣＤ８アルファの前記膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ１３７の共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータの刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。

本発明の別の実施形態では、ＦｏｌＲ１に特異的なＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞は、免疫療法に使用するためのものであってもよく、ＣＡＲは、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合性ドメインは、配列番号１０３、およびＣＤ８アルファの前記ヒンジを含んでいてもよい。

本発明の好ましい実施形態では、ＦｏｌＲ１に特異的なＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞は、免疫療法に使用するためのものであってもよく、ＣＡＲは、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合性ドメインは、配列番号１０３、および配列番号３４を含むＣＤ８アルファの前記ヒンジを含んでいてもよい。

本発明のより好ましい実施形態では、ＦｏｌＲ１に特異的なＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞は、免疫療法に使用するためのものであってもよく、ＣＡＲは、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合性ドメインは、配列番号１０３、ならびにＣＤ８アルファの前記ヒンジ、ＣＤ８アルファの前記膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ１３７の共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータの刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。

ＦｏｌＲ１を発現するがん性細胞の前記部分集団は、前記がんに罹患している対象のすべてのがん性細胞のうち、ＦｏｌＲ１を発現する少なくとも１つの細胞を含んでいてもよい。優先的には、ＦｏｌＲ１を発現するがん性細胞の前記部分集団は、前記がんに罹患している対象のすべてのがん性細胞の少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％を含んでいてもよい。

一態様では、本発明は、本明細書に開示のＦｏｌＲ１－ＣＡＲを発現する細胞を含む細胞の集団を提供する。

本発明の一実施形態では、細胞の集団は、ＦｏｌＲ１－ＣＡＲを発現する細胞を含んでいてもよく、ＣＡＲは、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合性ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）、ならびにＣＤ８アルファの前記ヒンジを含んでいてもよい。

本発明の別の実施形態では、細胞の集団は、ＦｏｌＲ１－ＣＡＲを発現する細胞を含んでいてもよく、ＣＡＲは、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合性ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へと、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）、ならびにＣＤ８アルファの前記ヒンジを含んでいてもよい。

本発明の好ましい実施形態では、細胞の集団は、ＦｏｌＲ１－ＣＡＲを発現する細胞を含んでいてもよく、ＣＡＲは、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合性ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へと、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）、ならびに配列番号３４を含むＣＤ８アルファの前記ヒンジを含んでいてもよい。

本発明のより好ましい実施形態では、細胞の集団は、ＦｏｌＲ１－ＣＡＲを発現する細胞を含んでいてもよく、ＣＡＲは、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合性ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へと、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）、ＣＤ８アルファの前記ヒンジ、ＣＤ８アルファの前記膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ１３７の共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータの刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。

本発明の別の実施形態では、細胞の集団は、ＦｏｌＲ１－ＣＡＲを発現する細胞を含んでいてもよく、ＣＡＲは、配列番号１０３を含む前記抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、およびＣＤ８アルファの前記ヒンジを含んでいてもよい。

本発明の好ましい実施形態では、細胞の集団は、ＦｏｌＲ１－ＣＡＲを発現する細胞を含んでいてもよく、ＣＡＲは、配列番号１０３を含む前記抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、および配列番号３４を含むＣＤ８アルファの前記ヒンジを含んでいてもよい。

本発明のより好ましい実施形態では、細胞の集団は、ＦｏｌＲ１－ＣＡＲを発現する細胞を含んでいてもよく、ＣＡＲは、配列番号１０３を含む前記抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、ＣＤ８アルファの前記ヒンジ、ＣＤ８アルファの前記膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ１３７の共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータの刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。

遺伝子操作された細胞の前記集団または単離された集団は、前記免疫療法で使用する前に、治療有効量の細胞へと増殖させる。前記がんは、トリプルネガティブ乳がん、胃がん、肺がん、腎臓がん、膵臓がん、または卵巣がんからなる群から選択することができる。前記がんは卵巣がんであってもよい。前記細胞は、免疫細胞または免疫細胞サブセット、優先的にはＴ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはＮＫ細胞、より優先的にはＴ細胞であってもよい。

一態様では、本発明は、がんを治療するための方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に開示のＦｏｌＲ１－ＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞を投与することを含む方法を提供する。がんの治療は、がんに罹患している対象においてであってもよく、前記がんのがん性細胞の少なくとも部分集団はＦｏｌＲ１を発現する。

本発明の一実施形態では、対象のがんを治療するための方法は、それを必要とする対象に、ＦｏｌＲ１に特異的なＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞を投与することを含んでいてもよく、ＣＡＲは、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合性ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）、ならびにＣＤ８アルファの前記ヒンジを含んでいてもよい。

本発明の別の実施形態では、対象のがんを治療するための方法は、それを必要とする対象に、ＦｏｌＲ１に特異的なＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞を投与することを含んでいてもよく、ＣＡＲは、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合性ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へと、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）、ならびにＣＤ８アルファの前記ヒンジを含んでいてもよい。

本発明の好ましい実施形態では、対象のがんを治療するための方法は、それを必要とする対象に、ＦｏｌＲ１に特異的なＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞を投与することを含んでいてもよく、ＣＡＲは、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合性ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へと、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）、ならびに配列番号３４を含むＣＤ８アルファの前記ヒンジを含んでいてもよい。

本発明のより好ましい実施形態では、対象のがんを治療するための方法は、それを必要とする対象に、ＦｏｌＲ１に特異的なＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞を投与することを含んでいてもよく、ＣＡＲは、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合性ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へと、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）、ＣＤ８アルファの前記ヒンジ、ＣＤ８アルファの前記膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ１３７の共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータの刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。

本発明の一実施形態では、対象のがんを治療するための方法は、それを必要とする対象に、ＦｏｌＲ１に特異的なＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞を投与することを含んでいてもよく、ＣＡＲは、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合性ドメインは、配列番号１０３、およびＣＤ８アルファの前記ヒンジを含む。

本発明の好ましい実施形態では、対象のがんを治療するための方法は、それを必要とする対象に、ＦｏｌＲ１に特異的なＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞を投与することを含んでいてもよく、ＣＡＲは、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合性ドメインは、配列番号１０３、および配列番号３４を含むＣＤ８アルファの前記ヒンジを含む。

本発明のより好ましい実施形態では、対象のがんを治療するための方法は、それを必要とする対象に、ＦｏｌＲ１に特異的なＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞を投与することを含んでいてもよく、ＣＡＲは、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合性ドメインは、配列番号１０３、ＣＤ８アルファの前記ヒンジ、ＣＤ８アルファの前記膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ１３７の共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータの刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

前記がんは、トリプルネガティブ乳がん、胃がん、肺がん、腎臓がん、膵臓がん、および卵巣がんからなる群から選択することができる。前記細胞は、免疫細胞もしくは免疫細胞サブセット、優先的には、Ｔ細胞もしくはＴ細胞サブセット、またはＮＫ細胞もしくはＮＫ細胞サブセットであってもよい。

一態様では、本発明は、本明細書に開示の抗原ＦｏＬＲ１に特異的なＣＡＲを発現する遺伝子改変細胞および任意選択の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

本発明の一実施形態では、医薬組成物は、ＦｏｌＲ１に特異的なＣＡＲを発現する遺伝子改変細胞であって、ＣＡＲは、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合性ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）、ならびにＣＤ８アルファの前記ヒンジを含んでいてもよい、遺伝子改変細胞、ならびに任意選択の薬学的に許容される担体を含んでいてもよい。

本発明の別の実施形態では、医薬組成物は、ＦｏｌＲ１に特異的なＣＡＲを発現する遺伝子改変細胞であって、ＣＡＲは、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合性ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へと、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）、ならびにＣＤ８アルファの前記ヒンジを含んでいてもよい、遺伝子改変細胞、ならびに任意選択の薬学的に許容される担体を含んでいてもよい。

本発明の好ましい実施形態では、医薬組成物は、ＦｏｌＲ１に特異的なＣＡＲを発現する遺伝子改変細胞であって、ＣＡＲは、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合性ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へと、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）、ならびに配列番号３４を含むＣＤ８アルファの前記ヒンジを含んでいてもよい、遺伝子改変細胞、ならびに任意選択の薬学的に許容される担体を含んでいてもよい。

本発明のより好ましい実施形態では、医薬組成物は、ＦｏｌＲ１に特異的なＣＡＲを発現する遺伝子改変細胞であって、ＣＡＲは、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合性ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へと、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）、ＣＤ８アルファの前記ヒンジ、ＣＤ８アルファの前記膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ１３７の共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータの刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい、遺伝子改変細胞、ならびに任意選択の薬学的に許容される担体を含んでいてもよい。

本発明の一実施形態では、医薬組成物は、ＦｏｌＲ１に特異的なＣＡＲを発現する遺伝子改変細胞であって、ＣＡＲは、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合性ドメインは、配列番号１０３、およびＣＤ８アルファの前記ヒンジを含んでいてもよい、遺伝子改変細胞、ならびに任意選択の薬学的に許容される担体を含んでいてもよい。

本発明の好ましい実施形態では、医薬組成物は、ＦｏｌＲ１に特異的なＣＡＲを発現する遺伝子改変細胞であって、ＣＡＲは、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合性ドメインは、配列番号１０３、および配列番号３４を含むＣＤ８アルファの前記ヒンジを含んでいてもよい、遺伝子改変細胞、ならびに任意選択の薬学的に許容される担体を含んでいてもよい。

本発明の別の好ましい実施形態では、医薬組成物は、ＦｏｌＲ１に特異的なＣＡＲを発現する遺伝子改変細胞であって、ＣＡＲは、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン（ｓｃＦｖなど）、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合性ドメインは、配列番号１０３、ＣＤ８アルファの前記ヒンジ、ＣＤ８アルファの前記膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ１３７の共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータの刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい、遺伝子改変細胞、ならびに任意選択の薬学的に許容される担体を含んでいてもよい。

薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤は、中性緩衝食塩水およびリン酸緩衝食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；ならびに保存剤を含んでいてもよい。

前記医薬組成物は、がんに罹患している対象のがんを治療するために使用することができ、前記がんの前記がん性細胞はＦｏｌＲ１を発現する。前記がんは、トリプルネガティブ乳がん、胃がん、肺がん、腎臓がん、膵臓がん、および卵巣がんの群から選択することができる。好ましい実施形態では、前記がんは卵巣がんである。前記細胞は、免疫細胞もしくは免疫細胞サブセット、優先的には、Ｔ細胞もしくはＴ細胞サブセット、またはＮＫ細胞もしくはＮＫ細胞サブセットであってもよい。

別の実施形態では、本発明は、本明細書に開示のＦｏｌＲ１－ＣＡＲを発現する遺伝子改変細胞、および薬学的に許容される担体、および前記がんの併用療法用の化学療法剤を含む医薬組成物を提供する。

本明細書に開示の本発明の第１の態様に関して本明細書で規定されるすべての定義、特徴、および実施形態は、本明細書に開示の本発明の他の態様の状況においても必要な変更を加えて適用される。

定義
別様に定義されていない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

本明細書で使用される場合、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、組成物、方法、ならびにそうした方法および組成物に不可欠であるそれらのそれぞれの成分に関して使用されるが、不可欠であるか否かに関わりなく特定されていない要素を含むことがさらに許容される。

葉酸受容体１、ＦｏｌＲ１、ＦＯＬＲ、ＦＯＬＲ１、およびＦＲ１という用語は、同義的に使用することができる。これには、葉酸受容体アルファ、ＦＲａｌｐｈａ、ＦＲα、葉酸結合タンパク質、またはＦＢＰなど、他の技術水準の同義語も含まれることが理解される。

一般に、ＣＡＲは、抗原結合性ドメインを含む細胞外ドメイン（細胞外部分）、膜貫通ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメイン（細胞内シグナル伝達ドメイン）を含んでいてもよい。抗原結合性ドメインは、スペーサー（ヒンジドメイン）により膜貫通ドメインに連結されている。また、細胞外ドメインは、シグナルペプチドを含んでもよい。

「シグナルペプチド」は、細胞内での、例えばある特定の細胞小器官（小胞体など）へのおよび／または細胞表面へのタンパク質の輸送および局在化を指図するペプチド配列を指す。

一般に、「抗原結合性ドメイン」は、抗原に、例えば腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）に特異的に結合するＣＡＲの領域を指す。本発明のＣＡＲは、１つまたは複数の抗原結合性ドメインを含んでいてもよい（例えば、タンデムＣＡＲ）。一般に、ＣＡＲの標的指向性領域は、細胞外に局在化している。抗原結合性ドメインは、抗体、単一ドメイン抗体、またはそれらの抗原結合性断片を含んでいてもよい。抗原結合性ドメインは、例えば、Ｆａｂ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、ＶＨＨ断片、二価単鎖抗体、またはダイアボディを含んでいてもよい。アフィボディなど、所与の抗原に特異的に結合する任意の分子、または天然に存在する受容体に由来するリガンド結合性ドメインを、抗原結合性ドメインとして使用することができる。多くの場合、抗原結合性ドメインはｓｃＦｖである。通常、ｓｃＦｖでは、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域が可撓性リンカーにより融合されてｓｃＦｖを形成する。このようなリンカーは、例えば、「（Ｇ_４／Ｓ）_３－リンカー」または「ｗｈｉｔｌｏｗリンカー」であってもよい。

ある場合には、抗原結合性ドメインは、ＣＡＲが使用されることになるものと同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトにおいて治療的に使用することが計画されている場合、ＣＡＲの抗原結合性ドメインは、ヒト抗体もしくはヒト化抗体またはその抗原結合性断片を含むことが有益であり得る。ヒト抗体もしくはヒト化抗体またはそれらの抗原結合性断片は、当技術分野で周知の様々な方法により製作することができる。

「スペーサー」または「ヒンジ」は、本明細書で使用される場合、ＣＡＲの抗原結合性ドメインと膜貫通ドメインとの間に存在する親水性領域を指す。ＣＡＲは、細胞外スペーサードメインを含んでいてもよいが、そのようなスペーサーを省略することも可能である。本発明のＣＡＲは、そのようなスペーサーを含む。スペーサーは、例えば、抗体のＦｃ断片もしくはそれらの断片、抗体のヒンジ領域もしくはそれらの断片、抗体のＣＨ２領域もしくはＣＨ３領域、アクセサリータンパク質、人工スペーサー配列、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。スペーサーの顕著な例は、ＣＤ８アルファヒンジまたはＩｇＧ４ヒンジである。

ＣＡＲの膜貫通ドメインは、そのようなドメインの任意の所望の天然供給源または合成供給源に由来してもよい。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来してもよい。膜貫通ドメインは、例えば、ＣＤ８アルファまたはＣＤ２８に由来してもよい。主要シグナル伝達および抗原認識モジュール（ドメイン）が２つ（またはそれよりもさらに多く）のポリペプチドに存在する場合、ＣＡＲは、２つ（またはそれよりもさらに多く）の膜貫通ドメインを有してもよい。主要シグナル伝達および抗原認識モジュールを分割することは、例えば、ＣＡＲの各ポリペプチドにおける小分子依存性ヘテロ二量体化ドメインにより、ＣＡＲ細胞発現に対する、小分子依存性で滴定可能の可逆的な制御を可能にする（例えば、国際公開第２０１４１２７２６１号Ａ１パンフレット）。

ＣＡＲの細胞質シグナル伝達ドメイン（細胞内シグナル伝達ドメインまたは活性化エンドドメイン）は、対応するＣＡＲが活性化ＣＡＲである場合（通常、本明細書に記載のＣＡＲは、活性化ＣＡＲを指す）、ＣＡＲが発現される免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与する。「エフェクター機能」は、細胞の特化機能を意味し、例えば、Ｔ細胞では、エフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性またはヘルパー活性であってもよい。細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達し、ＣＡＲを発現する細胞に特化機能を実施するように指図するタンパク質の部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫細胞エフェクター機能を開始または阻止するシグナルの伝達に十分な、所定のタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの任意の完全な、突然変異した、または短縮された部分を含んでいてもよい。

ＣＡＲに使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの顕著な例としては、抗原受容体係合後にシグナル伝達を開始するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および共受容体の細胞質シグナル伝達配列が挙げられる。

一般に、Ｔ細胞活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列、第１には、ＴＣＲを介して抗原依存性一次活性化を開始させるもの（一次細胞質シグナル伝達配列、一次細胞質シグナル伝達ドメイン）、第２には、抗原非依存的に作用して二次または共刺激シグナルをもたらすもの（二次細胞質シグナル伝達配列、共刺激シグナル伝達ドメイン）により媒介され得る。したがって、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、１つもしくは複数の一次細胞質シグナル伝達ドメインおよび／または１つもしくは複数の二次細胞質シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。

刺激性様式で作用する一次細胞質シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭ（免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ）を含んでいてもよい。ＣＡＲに使用されることが多いＩＴＡＭ含有一次細胞質シグナル伝達ドメインの例は、ＴＣＲゼータ（ＣＤ３ゼータ）、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものである。最も顕著なのは、ＣＤ３ゼータに由来する配列である。

ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを、単独でまたは任意の他の所望の細胞質ドメインと組み合わせて含むように設計することができる。ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分および共刺激シグナル伝達領域（ドメイン）を含んでいてもよい。共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要な、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子の例は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３である。

ＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質シグナル伝達配列は、リンカーを用いてまたは用いずに、無作為にまたは指定の順序で互いに連結されていてもよい。好ましくは長さが２～１０アミノ酸である短いオリゴまたはポリペプチドリンカーが連結を形成することができる。顕著なリンカーは、グリシン－セリンダブレットである。

一例として、細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。別の例では、細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ１３７のシグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。さらなる例では、細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメイン、およびＣＤ１３７のシグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。

上述のように、ＣＡＲの細胞外部分または膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインはいずれも、ＣＡＲの主要シグナル伝達および抗原認識モジュールを分割するために、ヘテロ二量体化ドメインを含んでもよい。

一部の実施形態では、エンドドメインは、一次細胞質シグナル伝達ドメインまたは共刺激領域を含むことができるが、両方を含むことはできない。こうした実施形態では、ＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞は、欠落ドメインを含む別のＣＡＲもその対応する抗原に結合する場合にのみ活性化される。

ＣＡＲは、「ＳＵＰＲＡ」（スプリット、ユニバーサル、およびプログラマブル）ＣＡＲであって、細胞内共刺激ドメインおよび細胞外ロイシンジッパーが「ｚｉｐＣＡＲ」ドメインにより連結されていてもよい、ＣＡＲであってもよい（国際公開第２０１７／０９１５４６号パンフレット）。このジッパーは、例えばｓｃＦｖ領域に融合された相補的ジッパーで標的化して、ＳＵＰＲＡ ＣＡＲ Ｔ細胞に腫瘍特異性を付与することができる。この手法は、種々の腫瘍に対するユニバーサルＣＡＲ Ｔ細胞を生成するのに特に有用であると考えられ、アダプター分子は、腫瘍特異性を考慮して設計することができ、選択圧力および抗原回避の状況で重要である養子移入後の特異性変更のための選択肢を提供するだろう。

ＣＡＲは、例えば自殺スイッチによりＣＡＲ発現免疫細胞を排除するための１つまたは複数の作動性エレメントを含むように、ＣＡＲをコードする核酸のレベルでさらに改変されていてもよい。自殺スイッチとしては、例えば、アポトーシス誘導性シグナル伝達カスケード、または細胞死を誘導する薬物を挙げることができる。一実施形態では、ＣＡＲを発現およびコードする核酸をさらに改変して、チミジンキナーゼ（ＴＫ）またはシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）などの酵素を発現させることができる。また、ＣＡＲは、免疫細胞におけるＣＡＲの制御された発現を可能にする遺伝子発現系の一部であってもよい。そのような遺伝子発現系は、誘導性遺伝子発現系であってもよく、誘導剤が、前記誘導性遺伝子発現系で形質導入されている細胞に投与されると、遺伝子発現系が誘導され、前記形質導入された細胞の表面で前記ＣＡＲが発現される。

本発明のＣＡＲを、本明細書に記載の上記で言及されているドメインの任意の部分または一部を任意の順序および／または組合せで含むように設計して、機能的ＣＡＲ、つまり本明細書に開示のＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞の免疫エフェクター応答を媒介したＣＡＲをもたらすことができる。

「遺伝子操作された」という用語は、本明細書で使用される場合、核酸、例えば生物のゲノム内の核酸の１つまたは複数の人為的に設計された変更を指すことができる。「遺伝子操作された細胞」または「遺伝子改変細胞」は、遺伝子が追加、欠失、および／または変更された細胞を指すことができる。特に、この用語は、細胞、優先的にはＴ細胞を、当技術分野で周知の組換え法により操作して、天然状態のこうした細胞では発現されないペプチドまたはタンパク質を安定的にまたは一過性に発現させることができるという事実を指す。例えば、Ｔ細胞、優先的にはヒトＴ細胞は、それらの細胞表面にキメラ抗原受容体などの人工構築物を発現するように遺伝子操作されている。

ＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞は、当技術分野で周知の方法、例えば、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＣｒｉｓｐｒＣａｓ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ｓｈＲＮＡ、および／またはｍｉＲＮＡを使用する遺伝子工学によりさらに改変されていてもよい。前記細胞は、細胞で通常発現される特定の遺伝子、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＭＨＣ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、Ｔｉｍ－３、ＣＤ２４４、ＬＡＩＲ、Ｌａｇ－３、ＣＤ１６０、ＨＶＥＭのような共阻害分子の発現を低減または欠如させるように改変されてもよい。

前記細胞は、治療対照、サイトカインおよび／もしくは断片、サイトカイン受容体および／もしくは断片、サイトカイン受容体融合タンパク質、共刺激受容体、またはアーマーリング分子（ａｒｍｏｒｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）などの追加の導入遺伝子を発現するように改変されていてもよい。

「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、これらに限定されないが、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体（全長抗体を含む）、単一ドメイン抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体断片、つまり抗体の抗原結合性断片、抗原を特異的に認識する（つまり結合する）イムノアドヘシンおよび抗体－イムノアドヘシンキメラを含む、種々の形態の抗体構造を網羅する最も幅広い意味で使用される。「抗原結合性断片」は、全長抗体の部分、好ましくはその可変ドメイン、または少なくともその抗原結合部位（「抗体の抗原結合性断片」）を含む。抗原結合性断片の例としては、Ｆａｂ（抗原結合性断片）、ｓｃＦｖ（単鎖可変断片）、ＶＨＨ断片、ダイアボディ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ’、ダイアボディ、単鎖抗体分子、および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。

抗体、その断片の、またはＣＡＲの抗原結合性ドメインに関して「～に対して特異性を有する」、「～に特異的に結合する」、または「～に特異的」という用語は、特定の抗原を認識しそれに結合するが、試料中の他の分子を実質的に認識もせずそれらに結合もしない抗原結合性ドメインを指す。抗原に特異的に結合する抗原結合性ドメインは、別の種に由来するその抗原にも結合する可能性がある。この種間反応性は、その抗原結合性ドメインが特異的であるという定義に反するものではない。抗原に特異的に結合する抗原結合性ドメインは、その抗原の異なる対立遺伝子型（対立遺伝子バリアント、スプライスバリアント、アイソフォームなど）にも結合する可能性がある。この交差反応性は、その抗原結合性ドメインが特異的であるという定義に反するものではない。

「免疫細胞」または「免疫エフェクター細胞」という用語は、同義的に使用することができ、免疫系の一部であってもよく、Ｔ細胞、アルファ－ベータＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、自然リンパ球（ＩＬＣ）、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、単球、またはマクロファージなどの特定のエフェクター機能を発揮する細胞を指す。優先的には、こうした免疫細胞はヒト免疫細胞である。好ましい免疫細胞は、Ｔ細胞、アルファ－ベータＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＩＬＣ、ＣＩＫ細胞、ＬＡＫ細胞、マクロファージ、またはガンマ－デルタＴ細胞などの、細胞傷害性エフェクター機能を有する細胞である。最も好ましい免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞である。「エフェクター機能」は、細胞の特化機能を意味し、例えば、Ｔ細胞では、エフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性またはヘルパー活性であってもよい。

本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、１つまたは複数の抗体に結合するか、またはそれらの産生を誘発する物質を含むことが意図されており、これらに限定されないが、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、脂質、デキストランなどの炭水化物、ハプテン、およびそれらの組合せ、例えば、グリコシル化タンパク質または糖脂質を含んでいてもよい。「抗原」という用語は、本明細書で使用される場合、標的細胞の表面に発現され得、これらに限定されないが、抗体もしくはＴＣＲを含む適応免疫系、またはこれらに限定されないが、内因性もしくはトランスジェニックＴＣＲ、ＣＡＲ、ｓｃＦｖもしくはそれらの多量体、Ｆａｂ断片もしくはそれらの多量体、抗体もしくはそれらの多量体、単鎖抗体もしくはそれらの多量体、または構造に対する高親和性結合をなすことができる他の任意の分子を含む遺伝子操作された細胞により認識され得る分子実体を指す。

「エピトープ」という用語は、抗体またはそれらの抗原結合性断片（抗原結合性ドメイン）により認識および特異的に結合し得る抗原、例えば可溶性抗原の一部を意味する。

腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、本明細書で使用される場合、腫瘍細胞により産生される抗原性物質を指す。腫瘍関連抗原は、診断検査で腫瘍／がん細胞を特定する際に有用な腫瘍マーカーまたはがんマーカーであり、がん治療に使用するための潜在的な候補である。優先的には、ＴＡＡは、本明細書に開示の抗原結合性受容体により認識され得るように、腫瘍／がん細胞の細胞表面に発現され得る。

「標的細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書で開示のＣＡＲの抗原結合性ドメインにより、または本明細書で開示のタグ付きポリペプチドのタグの抗原結合性ドメインにより認識される（それに結合する）はずである抗原をその細胞表面に発現する細胞を指す。

前記標的細胞は、例えば、がん性細胞、または自己免疫疾患に関連する細胞、または感染性疾患に関連する細胞であってもよい。

免疫療法は、「免疫応答を誘導、増強、または抑制することによる疾患の治療」であると定義される医学用語である。免疫応答を誘発または増幅するように設計された免疫療法は、活性化免疫療法として分類され、免疫応答を低減または抑制する免疫療法は、抑制性免疫療法として分類される。活性化免疫療法としてのがん免疫療法は、免疫系を刺激して腫瘍を拒絶および破壊させることを試みる。養子細胞移入では、細胞ベースの、優先的にはＴ細胞ベースまたはＮＫ細胞ベースの細胞傷害性応答を使用して、がん細胞を攻撃する。患者のがんに対して天然のまたは遺伝的に操作された反応性を有するＴ細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成し、次いでがん患者に移入して戻す。この場合、免疫療法は「ＣＡＲ免疫療法」と呼ばれるか、またはＴ細胞のみを使用する場合は「ＣＡＲ Ｔ細胞療法」もしくは「ＣＡＲ Ｔ細胞免疫療法」と呼ばれる。

「治療」という用語は、本明細書で使用される場合、疾患の少なくとも１つの兆候または症状の頻度または重症度を低減することを意味する。

「治療有効量」または「治療有効集団」という用語は、対象に治療上の利益をもたらす細胞集団の量を意味する。

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は動物を指す。優先的には、対象は、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ヤギ、ニワトリ、イヌ、サル、またはヒトなどの哺乳動物である。より好ましくは、個体はヒトである。対象は、がんなどの疾患に罹患している対象であってもよい。

「発現」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞内でそのプロモーターにより駆動される、特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳であると定義される。

「単離された」という用語は、本明細書では、ポリペプチド、核酸、または宿主細胞が、自然界で生じる環境とは異なる物理的環境に存在することを示すために使用される。例えば、単離されたポリペプチドは、例えば粗抽出物中などの、それが天然に存在する複雑な細胞環境から実質的に単離されていてもよい（例えば、濃縮または精製されていてもよい）。

「がん」という用語は、医学的には、悪性新生物として知られている。がんは、無秩序な細胞増殖を伴う広範な疾患群であり、あらゆる種類の白血病を含む。がんでは、細胞（がん性細胞）が制御不能に分裂および増殖し、悪性腫瘍を形成し、身体の近隣部分に浸潤する。がんは、リンパ系または血流を介して身体のより離れた部分にも広がる可能性がある。ヒトに影響を及ぼすことが知られている２００種類を上まわる異なるがんが存在する。

以下の実施例は、本発明をより詳細に説明することを目的とするが、本発明をそうした実施例に限定するものではない。

実施例１：組み合わせるとＦＯＬＲ１発現がん細胞とＦＯＬＲ１非発現細胞との区別を可能にする蛍光部分および抗原認識部分を含むコンジュゲートの特定
ＣＡＲ Ｔ細胞療法の標的分子を特定するために、本発明者らは、以下のステップを使用した。高悪性度漿液性卵巣癌（ＯｖＣａ）切除片を解離させ、単一細胞懸濁物をフローサイトメトリーで分析した（図１Ａ）。偏りのない表面マーカースクリーニングライブラリーを使用することにより、高悪性度卵巣癌患者の大部分でＦＯＬＲ１が発現されていることを明らかになった（図１Ｂ）。続いて、この明確な標的をサイクリック免疫蛍光顕微鏡法（ｃｙｃｌｉｃ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で検証した。新たに凍結した高悪性度漿液性卵巣癌切除片を切片化し、アセトンで固定した。個々の生物学的試料の完全自動サイクリック蛍光イメージング（ｃｙｃｌｉｃ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ）を可能にする新規ハイコンテントイメージングプラットフォームを使用してスクリーニングを実施した。蛍光部分にコンジュゲートされた幾つかの抗原認識部分によるＯｖＣａ標本の連続染色により、多数の抗原の発現が明らかになった。ヒト上皮組織および癌腫の周知のマーカーであるＥＰＣＡＭとＦＯＬＲ１との共発現を、分析したすべての患者で検証した（図２）。データ分析およびさらなる共染色により、ＦＯＬＲ１レベルの上昇を示す上皮細胞の９０％よりも多くにおいて、ＦＯＬＲ１およびＥＰＣＡＭの発現が相関することが確認された（図３）。

ＣＡＲ Ｔ細胞療法のオンターゲットオフ腫瘍毒性（ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ ｔｏｘｉｃｉｔｙ）、つまりＣＡＲ Ｔ細胞が、生理的条件下でＣＡＲ標的を発現する非腫瘍細胞に結合してそれらを溶解することが、幾つかのＣＡＲ Ｔ細胞産物で報告されている^１。したがって、健常組織でのＦＯＬＲ１発現を分析した（図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ）。健常組織での発現は、少なくとも部分的に区別可能であることが見出され、ＦＯＬＲ１発現ＯｖＣａを健常細胞と区別するための細胞の選択的標識化を得る可能性が開かれた（図５）。健常組織は、ＦＯＬＲ１を発現しないか、発現レベルが低い。この知見は、最近の研究を裏付けた^２。

したがって、ＦＯＬＲ１の標的化は、ＯｖＣａのＣＡＲ Ｔ細胞治療の可能性を開くものである。ＦＯＬＲ１は、ＯｖＣａ細胞の大部分で発現されるが、健常組織では発現が制限されるか、または発現されないか、または発現の程度がより少ない。したがって、ＦＯＬＲ１の検出により活性化されるが、マーカーの非存在下では活性化されないＣＡＲ Ｔ細胞を使用すると、健常細胞には影響を及ぼさずに、ＦＯＬＲ１発現ＯｖＣａ細胞の効率的な殺滅をもたらすことができるはずである。

実施例２：ＦＯＬＲ１発現がん細胞とＦＯＬＲ１非発現細胞とを区別するＦＯＬＲ１特異的ＣＡＲ Ｔ細胞の設計および生成。
最良のＣＡＲアーキテクチャを特定するために、本発明者らは、２つの既存のモノクローナル抗体ＭＯＲＡｂ－００３３（配列番号１～４、配列番号９～２０）およびＭ９３４６Ａ４（配列番号５～８、配列番号２１～３２）にそれぞれ由来する幾つかのＣＡＲ構築物を設計した。合計で８つの異なるＣＡＲ構築物を、様々なＶｈ－Ｖ１配向性および異なるヒンジ（ヒトＣＤ８アルファヒンジ 配列番号３３～３４、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ 配列番号３５～３６）を用いて生成した。構築物はすべて、ヒトＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン（配列番号３７～３８）、ヒト４１ＢＢ共刺激ドメイン（配列番号３９～４０）、およびヒトＣＤ３ゼータドメイン（配列番号４１～４２）を含む。Ｖｈ（配列番号４５、４６、４９、５０）およびＶｌ（配列番号４７、４８、５１、５２）は、（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号４３～４４）を介して連結した。

こうした構築物（表１）をレンチウイルス移入プラスミドにクローニングし、対応するプラスミド混合物によるＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションによりレンチウイルス粒子を産生した。続いて、レンチウイルス粒子を細胞培養上清から回収した。

様々なレンチウイルス粒子の機能力価を決定するために、ＳＵＰ－Ｔ１または活性化初代ヒトＴ細胞を、様々な量のレンチウイルスベクターで形質導入し、２人の独立ドナーに対するフローサイトメトリーで、共発現ＬＮＧＦＲマーカーを検出することにより、またはビオチン化ＦＯＬＲ１－Ｆｃタンパク質を使用してＦＯＬＲ１特異的ＣＡＲを検出するＣＡＲ自体の検出により形質導入効率を決定した（図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ）。

構築物はすべて、適用した検出方法、つまり２人の独立ドナーに対する直接および間接ＣＡＲ標識によるフローサイトメトリーとは無関係に、対応する細胞型で発現された（図６Ｅ、６Ｆ）。直接ＣＡＲ検出と間接ＣＡＲ検出との間の発現レベルは、各ドナーで同等だった（図６Ｇ）。

実施例３：ＦＯＬＲ１発現がん細胞とＦＯＬＲ１非発現細胞との区別を可能にするＦＯＬＲ１特異的ＣＡＲ Ｔ細胞の使用。
最も効率的で特異的なＣＡＲ構築物を特定するために、幾つかのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを実施した。ＣＡＲ設計の違い、つまりｓｃＦｖ配向性またはヒンジバリアントが、ＣＡＲ特異性に影響を及ぼすか否かを検討するために、８つの構築物を、異なるヒトおよびマウスＦＯＬＲバリアントを発現する細胞と共に共培養した。ＦＯＬＲ１は、高度な同一性を有するＦＯＬＲファミリーの一部であるため（図７）、本発明者らは、異なるＣＡＲ構築物の特異的反応性、つまりヒトまたはマウスＦＯＬＲバリアントを発現する対応する標的細胞株のＣＡＲ Ｔ細胞媒介性殺滅の評価を試みた。そうした標的細胞株は、それぞれ、ヒトＦＯＬＲ１（配列番号７５、７６）、ヒトＦＯＬＲ２（配列番号７７、７８）、ヒトＦＯＬＲ３（配列番号７９、８０）、ヒトＦＯＬＲ３（配列番号７９、８０）、ヒトＦＯＬＲ４（配列番号８１、８２）、マウスＦＯＬＲ１（配列番号８３、８４）、マウスＦＯＬＲ２（配列番号８５、８６）、またはマウスＦＯＬＲ４（配列番号８７、８８）によるジャーカット細胞のレンチウイルス形質導入により生成した。バリアントの発現は、抗３×ＨＡタグ抗体を使用したフローサイトメトリーで確認した（図８）。

共培養実験用のＣＡＲ Ｔ細胞を以下のように生成した。ＰＢＭＣを、密度勾配遠心分離による全血またはバフィーコートから導き出し、Ｔ細胞を、ＭＡＣＳ（登録商標）技術を使用してネガティブ単離した。その後、精製したヒトＴ細胞をＴｅｘＭＡＣＳ（商標）培地で培養し、Ｔ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）試薬で活性化した。その後、Ｔ細胞を、ＣＡＲコードレンチウイルス粒子で形質導入し、補充されたＴｅｘＭＡＣＳ（商標）培地で１２日間培養した。

共培養実験は、ＴｅｘＭＡＣＳ（商標）培地中でエフェクター対標的比２：１にて４８時間実施した。実験の終了時に、ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＡＲ Ｔ細胞機能性の指標としての活性化マーカーＣＤ１３７、ＣＤ２５、ＣＤ６９の発現についてフローサイトメトリーで分析した（図９）。試験したＣＡＲ構築物（図９Ａ～９Ｉ）はいずれも、ヒトＦＯＬＲ１以外のいかなるＦＯＬＲバリアントに対しても反応性を示さなかった。

第２のステップでは、様々なＣＡＲ候補を、ＧＦＰおよびルシフェラーゼを発現するヒト卵巣がん細胞株ＯＶ－９０と共に共培養した。ＯＶ－９０細胞は、それぞれＦＯＬＲ１有能またはＦＯＬＲ１欠損のいずれかだった。ＯＶ－９０細胞における特異的ＦＯＬＲ１ノックアウトは、ＣＡＳ９のリボヌクレオ粒子およびＦＯＬＲ１に対するガイドＲＮＡ（配列番号８９）のエレクトロポレーションにより実施した。ＦＯＬＲ１ノックアウトは、ゲノムＤＮＡの配列決定（配列番号９０、９１）（図１０Ａ）により、ｑＰＣＲ（プライマーＳ配列番号９２～１０１）（図１０Ｂ）および免疫蛍光（図１０Ｃ）により確認した。ＯＶ－９０ｗｔ細胞およびＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ細胞ならびにさらなる卵巣がん細胞株、つまりＯＶＣＡＲ－３、ＳＫＯＶ－３、およびＣａｏｖ－３でのＦＯＬＲ１発現を、フローサイトメトリーでさらに分析した（図１１Ａ）。ＦＯＬＲ１発現は、分析した様々な細胞株にわたって異なり、ＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ細胞ではＦＯＬＲ１発現は検出可能ではなかった（図１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ）。続いて、本発明者らは、様々な抗ＦＯＬＲ１クローンを使用して細胞株でのＦＯＬＲ１発現を確認した（図１１Ｅ、１１Ｆ、１１Ｇ、１１Ｈ、１１Ｉ、１１Ｊ）。

加えて、ＦＯＬＲ１指向性ＣＡＲ Ｔ細胞の様々な共培養実験を、ＴｅｘＭＡＣＳ（商標）培地中で、ＧＦＰを発現する卵巣がん細胞株を用いて、エフェクター対標的比２：１にて４８時間実施した。卵巣がん細胞株のＧＦＰ発現を、ＩｎｃｕＣｙｔｅシステムを使用して経時的に測定した。ＣＡＲ Ｔ細胞媒介性標的細胞殺滅を、ＧＦＰシグナルの減少により経時的に測定する。

まず、ＯＶ－９０細胞（ＦＯＬＲ１発現を有するかまたは有しない）を、共培養実験の標的細胞として使用し、ＯＶ－９０細胞のＧＦＰ発現を経時的に測定した（ＯＶ－９０ｗｔ細胞：図１２Ａ、１２Ｂ；ＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ細胞：図１２Ｃ、１２Ｄ）。効率的な標的細胞溶解は、ＧＦＰシグナルの減少を引き起こすが、非効率的なまたは現時点での標的細胞溶解は、ＧＦＰシグナルを経時的に増加させる。ここで、ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１候補Ｂ、Ｄ、Ｆ、およびＨ（ｓｃＦｖのＶｌ－Ｖｈ配向性を有する候補）は、ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１候補Ａ、Ｃ、Ｅ、およびＧ（ｓｃＦｖのＶｈ－Ｖｌ配向性を有する候補）よりも効率が低い傾向があった。加えて、ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１候補ＦおよびＨは、ＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ細胞を抗原非依存的に制御する傾向がある。実験の終了時に、ＣＡＲ Ｔ細胞をフローサイトメトリーで分析して、活性化マーカー発現（図１２Ｅ、１２Ｆ、１２Ｇ）、疲弊マーカー発現（図１２Ｈ、１２Ｉ）、およびＴ細胞の表現型（ＯＶ－９０ｗｔ細胞：図１２Ｊ；ＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ細胞：図１２Ｋ）を評価した。活性化マーカーＣＤ２５、ＣＤ６９、およびＣＤ１３７は、抗原依存的に誘導された（図１２Ｅ～１２Ｇ）。さらに、ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１候補Ａ、Ｂ、Ｆ、およびＨは、より低いレベルの疲弊マーカーＴＩＭ－３、ＰＤ１、およびＬＡＧ３を発現する（図１２Ｈ、１２Ｉ）。ＣＡＲ Ｔ細胞をＯＶ－９０細胞とｉｎ ｖｉｔｒｏで共培養した後、より多くのＴ_ｅｍ、およびＴ_ｃｍまたはＴ_ｓｃｍ様のより少数の低分化サブタイプが抗原依存的に存在した（ＯＶ－９０ｗｔ細胞：図１２Ｊ；ＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ細胞：図１２Ｋ）。２４時間後に、ＭＡＣＳｐｌｅｘ（商標）アッセイを使用して共培養培地を分析してヒトサイトカインの存在を調べた。試験したＣＡＲ構築物は異なる挙動を示した。ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１構築物は、サイトカインＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－２、およびＴＮＦ－アルファを抗原依存的に分泌した（図１２Ｌ、図１２Ｍ）。最後に、ＦＯＬＲ１指向性ＣＡＲ Ｔ細胞は、抗原が存在した場合、有意により多くのグランザイムＢを発現した（図１２Ｎ）。

ＦＯＬＲ１特異的ＣＡＲ Ｔ細胞と、異なるレベルのＦＯＬＲ１を発現する代替ヒト卵巣がん細胞株（Ｃａｏｖ－３、ＯＶＣＡＲ－３）とのさらなる共培養実験（図１１）も、ｉｎ ｖｉｔｒｏで効率的な殺滅を示した。ＭＢ－ＣＡＲＴＦＯＬＲ１候補は、高レベルのＦＯＬＲ１を発現するＣａｏｖ－３細胞を効率的に溶解した（図１３Ａ）。しかしながら、ＭＢ－ＣＡＲＴＦＯＬＲ１候補Ａ～Ｄは、ＦＯＬＲ１の発現がより低い卵巣がん細胞に対してより良好に応答した（ＯＶＣＡＲ－３、図１３Ｂ）。つまり、がん細胞は、ＦＯＬＲ１発現レベルがより低い場合でもＣＡＲ Ｔ細胞により溶解された。この知見は、対応するＦＯＬＲ１特異的ＣＡＲ Ｔ細胞上の活性化マーカーの増加によりさらに確認された（図１３Ｃ）。

最後に、ＦＯＬＲ１特異的ＣＡＲ Ｔ細胞と異種移植片から単離されたＯＶ－９０ｗｔ細胞との共培養実験でも、ＣＡＲ Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで効率的な殺滅をもたらした（図１４）。これは、ＯＶ－９０細胞のｉｎ ｖｉｖｏ継代が、ＣＡＲ候補の効率的なｉｎ ｖｉｔｒｏ殺滅能力に著しい影響を及ぼさないことを示している。ここで、ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１候補Ａ～Ｄは、異種移植片由来のＯＶ－９０腫瘍細胞を効率的に殺滅した（図１４Ａ）。ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１候補Ｅ～Ｈも、異種移植片由来のＯＶ－９０腫瘍細胞を殺滅した。しかしながら、ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１ Ｆは、他の候補よりも効率が低かった（図１４Ｂ）。

加えて、より負荷の高いｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて連続殺滅実験を実施した。つまり、共培養のそれぞれ９６時間後（標的細胞２０，０００個）および１９２時間後（標的細胞５０，０００個）に新たな標的細胞を追加することにより、ＣＡＲ Ｔ細胞を再負荷した。これは、ＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１有能細胞（図１５Ａ）またはＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１欠損細胞（図１５Ｂ）のいずれかを使用して行った。ここでは、本発明者らは、ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１候補ＡおよびＥの機能性を評価した。ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１ Ａは、ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１ Ｅよりも効率的な殺滅をもたらし、より多く増殖した。興味深いことに、候補ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１ Ｅは、ＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１欠損細胞の増殖を阻害する傾向があった（図１５Ｂ）。ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１候補ＡおよびＥは、ＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ細胞との共培養の場合には増殖しなかったが（図１５Ｃ）、ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１候補Ｅは、ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１候補Ａとは対照的に、ＦＯＬＲ１発現ＯＶ－９０細胞との共培養では増殖しなかった（図１５Ｃ）。

抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の機能性をｉｎ ｖｉｖｏで評価するために、自動細胞処理システムＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）でＣＡＲ Ｔ細胞を生成した。第１の手法では、４つのＣＡＲ構築物（ｉｎ ｖｉｔｒｏで最も優れた性能を示したＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１候補Ａ、Ｃ、Ｅ、およびＧ、つまりＶｈ－Ｖｌ配向候補）を、２つの用量（１×１０^６個および１×１０^７個のＣＡＲ Ｔ細胞）でＮＳＧマウスにそれぞれ静脈内注射して、こうしたＣＡＲ Ｔ細胞産物の耐容性を、週１回の採血を含む２１日間の期間にわたって分析した（図１６Ａ）。様々なＣＡＲ構築物の注射前に、対応する細胞産物を、細胞組成（図１６Ｂ）、生存率（図１６Ｃ）、ヒトＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の頻度（図１６Ｄ）、ならびに形質導入効率（図１６Ｅ）について分析した。ＣＡＲ Ｔ細胞産物はすべて、９７％よりも多くのＴ細胞（主にＣＤ４ Ｔ細胞）で構成され、生存率は９５％と高かった。形質導入効率はおよそ６０％だった。

ＣＡＲ候補はすべて、１×１０^６個のＣＡＲ Ｔ細胞用量では耐容性が良好だった（図１６Ｆ）。しかしながら、より高用量の１×１０^７個のＣＡＲ Ｔ細胞では、試験した構築物の１つ（ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１－Ｃ）は、一時的な体重減少を誘導した（図１６Ｇ）。これは、抗原非依存性ＣＡＲ Ｔ細胞活性化を示している可能性があった。この仮説と一致して、ＣＡＲ発現細胞およびヒトＣＤ４５発現細胞の一時的な増加が１５日目に検出された（図１６Ｈ、１６Ｉ）。特に、ヒトＣＤ８ Ｔ細胞が増殖した（図１６Ｊ）。２１日後、骨髄および脾臓を、異なる群から収集し、ヒト白血球の存在についてフローサイトメトリーで分析した。ヒト白血球は、高用量のＣＡＲ Ｔ細胞注射では骨髄および脾臓で検出することができたが、低用量では検出することができなかった（図１６Ｋ）。同様に、高ＣＡＲ Ｔ細胞用量では、骨髄および脾臓にてヒトＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞がより頻繁に検出された（図１６Ｌ）。その結果、高ＣＡＲ Ｔ細胞用量では、ＣＡＲ Ｔ細胞も、骨髄および脾臓でより頻繁に検出された（図１６Ｍ）。

マウス血液試料中のヒトサイトカイン分泌の分析を、２１日間にわたって週１回測定した。低用量のＣＡＲ Ｔ細胞で処置した実験群は、ＵＴＤ対照と有意な差を示さなかった（図１６Ｎ）。

より高用量のＣＡＲ Ｔ細胞で処置した第２の実験群内では、ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１－Ｃを注射した群においてヒトＩＦＮガンマが８日目に上昇した（図１６Ｏ）。これは、一時的な体重減少およびＴ細胞増殖を示す群である。２１日後、ＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１ ＣおよびＥを受け取った群では、ＵＴＤ対照群と比較して血漿中のヒトＩＦＮガンマのレベルが上昇した。マウスサイトカインは両群とも、２１日間中、非常に低いレベルでしか分泌されなかった（図１６Ｐ）。しかしながら、一時的な体重減少およびＴ細胞増殖を示した群である、ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１－Ｃを注射した群では、８日目にマウスＧＭ－ＣＳＦが増加した。

第２の手法では、ＮＳＧマウスにＯＶ－９０細胞を皮下注射した。腫瘍確立後、同じ４つのＣＡＲ構築物（ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１ Ａ、Ｃ、Ｅ、およびＧ）を単一用量（合計Ｔ細胞１×１０^７個）で静脈内注射して、こうしたＣＡＲ Ｔ細胞産物の抗腫瘍有効性を、週１回の採血を含む２１日間の期間にわたって評価した（図１７Ａ）。様々なＣＡＲ構築物の注射前に、対応する細胞産物を、細胞組成（図１７Ｂ）、生存率（図１７Ｃ）、ヒトＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の頻度（図１７Ｄ）、形質導入効率（図１７Ｅ）、ならびにベクターコピー数（図１７Ｆ）について分析した。ＣＡＲ Ｔ細胞産物はすべて、９６％よりも多くのＴ細胞で構成され、生存率は９７％と高かった。形質導入効率はおよそ５５％であり、ベクターコピー数は３を下まわっていた。

動物実験と並行して、様々なＣＡＲ Ｔ細胞産物を、それぞれＦＯＬＲ１有能ＯＶ－９０細胞およびＦＯＬＲ１欠損ＯＶ－９０細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養実験でも試験して、注射したＣＡＲ Ｔ細胞産物のＣＡＲ Ｔ細胞機能性を確認した（図１７Ｇ）。ここで、候補ＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１ Ｇは、エフェクター対標的比２：１にて、ＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ細胞を抗原非依存的に溶解した。

さらに、試験した構築物の１つ（ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１－Ｃ）は、１×１０^７個のＣＡＲ Ｔ細胞を投与した耐容性研究群（図１６Ｈ）と同等の一時的な体重減少を誘導した（図１７Ｈ）。

ＣＡＲ構築物はすべて、腫瘍量を効率的に低減させた（図１７Ｉ、１７Ｊ、１７Ｋ）。特に、候補ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１ Ａは、２１日目にＴ細胞集団におけるヒトＣＤ４およびＣＤ８比の変化を示すヒトＣＤ４５およびＣＡＲ発現細胞の増殖（図１７Ｌ、１７Ｎ、１７Ｏ）を伴う優れた抗腫瘍有効性を示した（図１７Ｍ）。

研究の終了時に、ヒトおよびマウス白血球（図１７Ｐ）、ヒトＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞（図１７Ｑ）、ならびにＣＡＲ Ｔ細胞（図１７Ｒ）が、脾臓、骨髄、肺、および異種移植片腫瘍において検出可能だった。興味深いことに、ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１ Ａは、腫瘍組織におけるヒトＣＤ４５およびＣＤ８ Ｔ細胞の存在の増加を示した。異なる臓器のＴ細胞は、主にＴＥＭ表現型だったが（ＣＤ４ Ｔ細胞：図１７Ｓ；ＣＤ８ Ｔ細胞：図１７Ｔ）、ＴＣＭ表現型は、末梢血においてより頻繁に提示された（ＣＤ４ Ｔ細胞：図１７Ｓ；ＣＤ８ Ｔ細胞：図１７Ｔ）。ＣＡＲ Ｔ細胞注入後２１日間のサイトカイン分泌の分析により、ＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１ Ａ群では、ＩＦＮガンマの分泌は中程度で安定していたことが明らかになった（図１７Ｕ）。そのため、本発明者らは、候補ＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１ Ａが、迅速な腫瘍根絶、顕著な増殖、ＣＡＲ発現、および短期持続性を示したと結論付けた。

さらに、候補ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１ Ａは、骨髄および脾臓への顕著な帰巣、および腫瘍浸潤を示した。

実施例４：ＦＯＬＲ１発現がん細胞とＦＯＬＲ１非発現細胞との区別を可能にする代替レンチウイルスベクターベースのＦＯＬＲ１特異的ＣＡＲ Ｔ細胞の使用。
補完的な手法では、ＬＮＧＦＲレポーターを欠如する代替レンチウイルスベクターを用いてＣＡＲ Ｔ細胞を生成した。候補ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１ Ａ（配列番号５３、５４）およびＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１ Ｅ（配列番号６１、６２）を、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ性能により、この修飾ベクターを用いて評価した。まず、ＣＡＲ Ｔ細胞を、レンチウイルスベクターを用いた形質導入により初代ヒトＴ細胞から、自動細胞処理システムＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）で生成し、形質導入効率、つまりＣＡＲ発現を、ビオチン化ＦＯＬＲ１－Ｆｃタンパク質を使用したＣＡＲの検出（図１８）およびＦＯＬＲ１特異的ＣＡＲを検出するための抗ビオチン二次染色によりフローサイトメトリーで決定した。候補ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１ Ａおよび ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１ Ｅは両方とも、同等の高いレベルで発現された。

第２のステップでは、こうした最適化および自動化製造されたＣＡＲ Ｔ細胞を、種々の卵巣がん細胞株と共に、エフェクター対標的比２：１で４８時間共培養した（図１９）。殺滅動力学を実施例３と同様に評価した。候補ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１ ＡおよびＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１ Ｅは両方とも、卵巣がん細胞ＯＶ－９０ｗｔ、ＯＶＣＡＲ３、およびＣａｏｖ－３を効率的に溶解したが、ＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯは、共培養中のＣＡＲ Ｔ細胞の存在とは無関係に増殖した（図１９Ａ）。しかしながら、候補ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１ Ａは、候補ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１ Ｅと比較して、ＳＫＯＶ－３細胞の溶解がより効率的だった（図１９Ａ）。実験の終了時に、ＣＡＲ Ｔ細胞をフローサイトメトリーで分析して、活性化マーカー発現（図１９Ｂ）および疲弊マーカー発現（図１９Ｃ）を評価した。活性化マーカーおよび疲弊マーカーは、両ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ候補とも、抗原依存的に同様の発現レベルへと上方制御された。しかしながら、ＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１ Ｅは、候補Ａと比較してＳＫＯＶ－３との共培養においてより低い活性化マーカーおよびＰＤ１レベルを示し（図１９Ｂ、１９Ｃ）、この細胞株で観察された細胞溶解動力学の低減との相関性を示した（図１９Ａ）。

２４時間後に、ＭＡＣＳｐｌｅｘ（商標）アッセイを使用して共培養培地を分析し、ヒトサイトカインの存在を調べた。ＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ １構築物は両方とも、サイトカインＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－２、およびＴＮＦ－アルファを抗原依存的に分泌したが、ＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１ Ｅは、ＧＭ－ＣＳＦおよびＴＮＦ－アルファの分泌がより少ない傾向があった（図１９Ｄ）。

最後に、ＦＯＬＲ１指向性ＣＡＲ Ｔ細胞候補は両方とも、同様のレベルのグランザイムＢを抗原依存的に発現した（図１９Ｅ）。

まとめると、代替レンチウイルスベクター中の候補ＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１ ＡおよびＥは両方とも、ｉｎ ｖｉｔｒｏで機能的および特異的である。ＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１ Ａは、以前のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ実験（実施例３を参照）ならびに代替レンチウイルスベクターおよび自動細胞処理システムＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）によるＣＡＲ製造に基づくこの一連のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、より良好な性能を示したため、ＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１候補Ａのみをさらに特徴付けた。

抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の機能性をｉｎ ｖｉｖｏで評価するために、ＮＳＧマウスに、ＯＶ－９０ｗｔ細胞またはＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ細胞をそれぞれ皮下注射した。腫瘍確立後、ＣＡＲ構築物ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１ Ａを、単一用量（合計Ｔ細胞１×１０^７個）で静脈内注射して、週１回の採血を含む２１日間の期間にわたって、このＣＡＲ Ｔ細胞産物の有効性を分析した（図２０Ａ）。様々なＣＡＲ構築物の注射前に、対応する細胞産物を、細胞組成（図２０Ｂ）、生存率（図２０Ｃ）、ヒトＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞組成（図２０Ｄ）、形質導入有効性（図２０Ｅ）、ならびにベクターコピー数（図２０Ｆ）について分析した。ＣＡＲ Ｔ細胞産物は、９６％よりも多くのＴ細胞で構成され、生存率は９９％と高かった。形質導入効率はおよそ８０％であり、ベクターコピー数は２．１だった。

研究の過程を通じて、マウスはすべての条件にわたって安定した体重を維持した（ＯＶ－９０ｗｔ：図２０Ｇ、ＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ：図２０Ｈ）。ＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１ Ａは、ＯＶ－９０ｗｔ腫瘍量を効率的に低減させたが（図２０Ｉ、２０Ｊ、２０Ｌ）、ＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯ腫瘍では腫瘍排除は観察されなかった（図２０Ｉ、２０Ｋ、２０Ｌ）。

候補ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１ Ａは、ヒトＣＤ４５発現細胞およびＣＡＲ発現細胞の増殖（図２０Ｍ、２０Ｏ、２０Ｐ）ならびにヒトＣＤ８ Ｔ細胞の増加（図２０Ｎ）を伴う抗腫瘍有効性（図２０Ｉ、２０Ｌ）を抗原依存的に示した。

研究の終了時に、骨髄、脾臓、肺、および残りの腫瘍組織を収集し、解離させて単一細胞懸濁物にした。続いて、ヒトおよびマウス免疫細胞（図２０Ｑ）、ヒトＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞（図２０Ｒ）、およびＣＡＲ Ｔ細胞（図２０Ｓ）が、脾臓、骨髄、および異種移植片腫瘍において、フローサイトメトリーで検出された。

ヒトＣＤ４５細胞は、脾臓、肺、および腫瘍に抗原依存的に濃縮されていた（図２０Ｑ）。ヒトＣＤ８細胞も、骨髄、肺、および腫瘍組織に抗原依存的に濃縮されていたが（図２０Ｒ）、ヒトＣＤ４細胞は、分析した組織では濃縮に差異はなかった。

残りの腫瘍組織の分析により、ＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１ Ａでの処置後のＯＶ－９０ｗｔ担持マウスにおいてＦＯＬＲ１発現細胞の頻度が大幅に低減したことが明らかになった（図２０Ｔ左パネル）。加えて、腫瘍組織の細胞組成は、ＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１処置後に変化する（図２０Ｔ右パネル）。腫瘍は、ＧＦＰ発現ＯＶ－９０がん細胞で主に構成されている。しかしながら、ＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１ Ａによる処置は、細胞組成を、主に非がん細胞、つまり非ＧＦＰ発現細胞ベースの組成に変化させる。ＦＯＬＲ１発現細胞およびＧＦＰ発現細胞の頻度の低減は、効率的な腫瘍根絶および腫瘍組織組成の変化を示す。

ＣＤ４ ＣＡＲ Ｔ細胞は、骨髄、腫瘍、および脾臓ではＴＥＭ表現型で、血液および肺ではＴＣＭ表現型で主に構成されていたのに対して、対応する対照である、ＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯを有するＭＢ－ＦＯＬＲ１ ＣＡＲＴ Ａ細胞または両腫瘍タイプを有する未形質導入Ｔ細胞は、腫瘍および肺ではＴｎａｉｖｅ表現型で、脾臓および骨髄ではＴＥＭで、血液ではより分散した表現型組成で主に構成されていた（図２０Ｕ）。

ＣＤ８ ＣＡＲ Ｔ細胞は、骨髄、腫瘍、および脾臓ではＴＥＭ表現型で、血液および肺ではより分散した表現型組成で主に構成されていたのに対して、対応する対照である、ＯＶ－９０ ＦＯＬＲ１ ＫＯを有するＭＢ－ＦＯＬＲ１ ＣＡＲＴ Ａ細胞または両腫瘍タイプを有する未形質導入Ｔ細胞は、血液、肺、腫瘍、骨髄、および脾臓ではより分散した表現型組成で主に構成されていた（図２０Ｖ）。

ＣＡＲ Ｔ細胞注入後２１日間にわたるサイトカイン分泌の分析により、ＯＶ－９０ｗｔ異種移植片を担持するＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１ Ａ処置群において７日目にＩＦＮ－ガンマおよびＩＬ－９レベルが上昇したことが明らかになった（図２０Ｗ）。

まとめると、候補ＭＢ－ＣＡＲＴ－ＦＯＬＲ１ Ａは、迅速な腫瘍根絶、ＣＡＲ Ｔ細胞増殖、および短期持続性を誘導した。さらに、候補ＭＢ－ＣＡＲＴ ＦＯＬＲ１ Ａは、顕著な腫瘍浸潤およびサイトカイン放出を示した。

参考文献
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Claims (13)

1. ａ．葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的な抗原結合性ドメイン
   ｂ．スペーサー
   ｃ．膜貫通ドメイン、および
   ｄ．細胞内シグナル伝達ドメイン
   を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
2. 前記抗原結合性ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号４のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
3. 前記抗原結合性ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へと、配列番号２を含むＶＨおよび配列番号４を含むＶＬを含む、請求項２に記載のＣＡＲ。
4. 前記抗原結合性ドメインは、配列番号１０３のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のＣＡＲ。
5. 前記スペーサーは、ＣＤ８アルファのヒンジドメインを含む、請求項１～４のいずれかに記載のＣＡＲ。
6. 前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８アルファの膜貫通ドメインを含み、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７の共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータの刺激ドメインを含む、請求項１～５のいずれかに記載のＣＡＲ。
7. 配列番号１０５のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のＣＡＲ。
8. 請求項１～７のいずれかに記載のＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞。
9. 前記細胞は免疫細胞である、請求項８に記載の遺伝子操作された細胞。
10. 免疫療法に使用するための、請求項８または９に記載の遺伝子操作された細胞。
11. がんの治療に使用するためのものであり、前記がんのがん性細胞はＦｏｌＲ１を発現する、請求項８～１０のいずれかに記載の遺伝子操作された細胞。
12. 請求項８～９のいずれかに記載のＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞を含む医薬組成物。
13. 請求項１～７のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする核酸配列。