CN1210146A - 重组人源锰超氧化物歧化酶制备工艺 - Google Patents

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徐垚
徐愤
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Abstract

一种重组人源锰超氧化物歧化酶的制备工艺,本发明属于生物工程技术领域,其特点是先进行工程菌扩增,收集菌体,然后将菌体裂解,加热处理后离心取可溶部分,经离子交换柱层析纯化。本发明具有工艺流程简便、SOD半衰期长、质量稳定、单位成本低等特点,产品不仅可用于化妆品、保健品等民用领域,更适用于医疗领域。

Description

重组人源锰超氧化物歧化酶制备工艺
本发明涉及重组人源锰超氧化物歧化酶(rhMnSOD)的制备工艺。
超氧化物歧化酶(SOD)主要有防衰老、抗炎、防辐射三大功能，可广泛用于化妆品、保健品、食品、医疗等领域。
目前国内生产的SOD主要从天然生物体中提取。如中国专利申请号92105141、93103774、93103820公开说明了提取天然生物体SOD的方法。由于血制品SOD存在外源感染的危险性和非人源制品SOD用于人体有抗原性，在医疗领域中很难发挥其应有的作用。现在虽然能从人血红细胞中制备天然的人铜锌SOD，但是由于人血来源困难，而且人血制品SOD还有外源感染的危险性(如，爱滋病毒、肝炎病毒等)，因此不易推广使用；而动物血SOD(同样有外源感染的危险性)和其它生物制品SOD对人体有抗原性，在医用上受到限制。本发明专利发明人于97年中清的发明专利《重组人源铜锌超氧化物歧化酶制备工艺》(专利申请号97103939.9)虽然克服了从生物体中提取SOD的许多不足和人源来源问题，但是作为“铜锌超氧化物歧化酶”，其本身半衰期只有4～10分钟，这导致了在以后的临床应用中用药量会很大，因此造成肾毒性等副作用。
本发明的目的是：“重组人源锰S0D”的半衰期在6小时以上，大大超过“重组人源铜锌SOD”的半衰期。因此，本发明提供了一种半衰期长，更符合实际应用的“重组人源锰SOD”制备工艺，作为直接用于人体的药物可更好地发挥其预防、治疗作用。
本发明目的实现的技术方案要点是：
(1)挑取工程菌的单菌落接种在装有含LB培养基的摇瓶中，32℃振荡培养到OD600=0.5～0.8，转入装有含锰盐培养基的摇瓶中，32℃培养约10小时，再经42℃诱导培养2～4小时后收集菌体。
(2)取菌体，用PH8.0,50mMTrisHCL-1mMEDTA-100mMNaCl(TES缓冲液)洗两遍，沉淀悬于0.2倍原体积50mM磷酸钾缓冲液(PH7.8)，4℃超声破菌，60℃加热30～60分钟，离心取上清，4℃超滤浓缩至原体积的1％～5％，加30～50倍浓缩液体积2mM磷酸钾缓冲液(PH7.8)继续超滤浓缩至原体积的1％～3％。
(3)DE-52柱层析：将超滤平衡的溶液加在经2mM磷酸钾缓冲液(PH7.8)平衡好的DE-52柱上，先用2mM磷酸钾缓冲液(PH7.8)洗下杂蛋白，再用20mM磷酸钾缓冲液(PH7.8)洗脱。
(4)CM-52柱层析：收集含hMnSOD部分，先用40mM醋酸钾缓冲液(PH5.5)超滤后上柱，再用醋酸钾梯度洗脱，超滤浓缩，脱盐，冷冻干燥。
本发明与现有技术相比，由于锰SOD半衰期大大超过铜锌SOD，且所获锰SOD为可溶性蛋白，无需蛋白复性。因此产品质量稳定、工艺简化、单位成本低、更符合临床应用等优点。
实施例：
1．扩增工程菌：挑取工程菌(MnSOD/PRT/POP2136)的单菌落接种在含LB扩增培养基(每升含：蛋白胨10g，酵母浸膏5g，氯化钠5g，硫胺素1mg，四环素20mg)的摇瓶中，32℃振荡培养10小时到0D600=0.7，转入6个含100ml LB培养基(LB扩增培养基含0.6mM硫酸锰)的摇瓶中，32℃培养10小时，42℃继续培养4小时，离心收集菌体。
2．表达产物抽提：取湿菌体6g，用PH8.0,50mMTrisHCL-1mMEDTA-100mMNaCl(TES缓冲液)洗两遍，沉淀悬于120ml 50mM磷酸钾缓冲液(PH7.8),4℃下超声破菌60秒1～2次，待菌体破裂，加PMSF到2mM,60℃加热40分钟，4℃以10000rpm离心10分钟，收集上清，4℃超滤浓缩至10ml,加100ml,2mM磷酸钾缓冲液(PH7.8)继续超滤浓缩二遍。
3．表达产物纯化：用2mM磷酸钾缓冲液(PH7.8)充分平衡好DE-52柱后，上样，先用2mM磷酸钾缓冲液(PH7.8)洗下杂蛋白，再用20mM磷酸钾缓冲液(PH7.8)洗脱。收集含hMnSOD部分，用100ml，40mM醋酸钾缓冲液(PH5.5)超滤至2m1，加100ml,40mM醋酸钾缓冲液(PH5.5)超滤平衡，上样到预先用40mM醋酸钾缓冲液(PH5.5)充分平衡好的CM-52柱，用醋酸钾梯度洗脱，超滤浓缩，脱盐，冷冻干燥，获得rhMnSOD 36毫克，比活性3200单位/毫克(NBT法)。

Claims (3)

1．一种重组人源锰超氧化物歧化酶的制备工艺，其特征是：
(1)挑取工程菌的单菌落接种在装有含LB培养基的摇瓶中，32℃振荡培养到OD600=0.5～0.8，转入装有含锰盐培养基的摇瓶中，32℃培养约10小时，再经42℃诱导培养2～4小时收集菌体；
(2)取菌体，用PH8.0,50mMTrisHCL-1mMEDTA-100mMNaCl(TES缓冲液)洗两遍，沉淀悬于0.2倍原体积50mM磷酸钾缓冲液(PH7.8)中，4℃超声破菌，60℃加热30～60分钟，离心取上清，4℃超滤浓缩至原体积的1％～5％，加30～50倍浓缩液体积2mM磷酸钾缓冲液(PH7.8)继续超滤浓缩至原体积的1％～3％；
(3)DE-52柱层析：将超滤平衡过的溶液加在经2mM磷酸钾缓冲液(PH7.8)平衡好的DE-52柱上，先用2mM磷酸钾缓冲液(PH7.8)洗下杂蛋白，再用20mM磷酸钾缓冲液(PH7.8)洗脱；
(4)CM-52柱层析：收集含hMnSOD部分，先用40mM醋酸钾缓冲液(PH5.5)超滤，上柱，再用醋酸钾梯度洗脱，超滤浓缩，脱盐，冷冻干燥。
2．根据权利要求1所述的制备工艺，其特征是蛋白获得率为5～10毫克/克菌。
3．根据权利要求1所述的制备工艺，其特征是复性蛋白比活性为3000～3500单位/毫克(NBT法)。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100395340C (zh) * 2005-08-31 2008-06-18 中国海洋大学 条斑紫菜锰超氧化物歧化酶及其制备方法
CN101955918A (zh) * 2009-07-17 2011-01-26 华东理工大学 一种生产重组高活性锰超氧化物歧化酶的方法
CN103724425A (zh) * 2013-12-27 2014-04-16 长春圣金诺生物制药有限公司 一种新的重组人生长激素粗提中的提取方法

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