CN102807976B - 一种核酸快速提取试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物核酸检测技术领域，具体为一种核酸快速提取试剂盒。本发明的试剂盒中包含研磨棒、提取液、抽提柱，微型超滤器和离心管；其中，所述提取液为含有chelex-100的DEPC水溶液。本发明还涉及该试剂盒的使用方法，及在用于提取病理组织石蜡切片样本、血斑精斑精液样本、组织液样本、脑脊液样本、血液样本、血清样本、血浆样本、尿液样本、积液样本、组织细胞样本中的DNA或RNA的应用。使用该试剂盒提取的核酸，其含量和质量能很好的满足后续PCR、RT-PCR和测序反应。本发明很好地克服了现有核酸提取繁琐耗时的局限性，且更加安全环保。
Description
技术领域
本发明属于生物核酸检测技术领域，具体涉及一种从生物样本中快速提取DNA或RNA的试剂盒。
背景技术
自PCR技术1985年在美国问世以来，被迅速广泛地应用于分子生物学相关领域，特别是近几年，随着个体化医疗概念的提出和在临床的推广，通过RT-PCR来研究患者样本中不同基因表达水平的差异，从而找出关键基因或者预后基因变化趋势，帮助医生指导用药，更使得RT-PCR进入了临床诊疗。
然而，RT-PCR扩增必须用RNA做模板才能进行。目前经典的RNA抽提方法是TRIZOL试剂，直接从细胞或组织中提取总RNA。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。
但是因为用TRIZOL试剂抽提RNA，需用到较多有挥发性的化学试剂，对实验者有害，因此目前也有利用吸附过柱的方法提取RNA的商业化试剂盒，因为需要蛋白酶K处理过程，一般需要经过3-4小时的抽提过程，才能进入后续的RT-PCR反应。
随着RT-PCR不断在临床推广和应用，人们对快速简便的RNA纯化方法的需求越来越强烈。RNA的完整性和纯度不再是考量RNA抽提纯化方法的唯一标准，只要快速、简便，不影响后续的RT-PCR反应，都是可以接受的RNA抽提纯化方法。
医院病理科存在大量各种疾病甲醛固定石蜡包埋组织(formalin fixed and paraffinembedded tissues，FFPET)，为分子病理研究提供了大量的信息来源。然而福尔马林固定后的蜡块包埋组织RNA降解严重，存档FFPET组织切片取量有限，传统提取RNA步骤繁杂，提取过程损失严重等都制约了石蜡组织在分子病理学中的研究应用。如何高效、高质量提取微量石蜡组织中RNA对利用石蜡组织进行分子研究及诊断至关重要。
传统从石蜡组织里抽提RNA需要先用二甲苯脱蜡，然后用无水乙醇去除二甲苯，脱蜡过程繁琐，至少需要3～4小时，而且二甲苯是有机溶剂，对实验操作者的身体有害。脱完蜡后，标本也需要再经过3～4小时的抽提，才能进入后续的RT-PCR反应。
Chelex-100是一种由苯乙烯和苯二乙烯共聚体组成的螯合树脂，其悬液在碱性环境(pH10～11)和100℃条件下，可导致细胞膜破裂并使DNA变性释放出来，并且Chelex-100可高选择性的结合多价阳离子，去除样品和缓冲液中的多价金属离子，避免煮沸过程中模板DNA的降解。Chelex-100提取DNA具有经济、简便、高效等优点，目前已广泛被用于从全血或血液、精液或精斑、混合斑、毛发、培养细胞等提取DNA。
发明内容
本发明的首要发明目的在于提供一种核酸快速提取试剂盒。
本发明的第二发明目的在于提供该试剂盒的使用方法。
本发明的第三发明目的在于提供该试剂盒的应用。
本发明涉及一种核酸快速提取试剂盒，所述试剂盒包含研磨棒、提取液、抽提柱、微型超滤器和离心管；其中，所述提取液为含有chelex-100的DEPC水溶液。
本发明的第一优选技术方案为：所述的提取液中含有2～50g/100ml的chelex-100和0.1％DEPC。
本发明的第二优选技术方案为：所述的chelex-100的浓度为2～30g/100ml，优选为3～10g/100ml。
本发明还涉及该试剂盒的使用方法，所述方法包括以下步骤：
(1)取少量生物样本，所述生物样本选自病理组织石蜡切片样本、血斑精斑精液样本、组织液样本、脑脊液样本、血液样本、血清样本、血浆样本、尿液样本、积液样本、组织细胞样本
(2)将生物样本置于chelex-100的DEPC水溶液中，所述的chelex-100的DEPC水溶液的浓度为1～80g/100ml；
(3)80～100℃条件下加热1～50分钟；
(4)将抽提柱放入离心管中，将步骤(3)中获得的液体加入到抽提柱中，1000～20000转/分钟，离心2～120秒；
(5)收集离下的液体，用于PCR或RT-PCR反应。
其中，优选的，所述的抽提柱为，在抽提柱中底部有一层起物理阻挡的膜。
该制备方法进一步优选为：所述的加热温度为90～100℃，优选90～95℃；所述的加热时间为5～30分钟，优选8～10分钟；
所述的离心的时间为2～120秒，优选10～30秒；
所述的离心的转速为5000～20000转/分钟，优选10000～20000转/分钟，更优选15000～20000转/分钟。
本发明所述的试剂盒在用于提取病理组织石蜡切片样本、血斑精斑精液样本、组织液样本、脑脊液样本、血液样本、血清样本、血浆样本、尿液样本、积液样本、组织细胞样本中的DNA或RNA的应用。
下面对本发明的技术方案做进一步的解释和说明：
本发明的试剂盒含有研磨棒、提取液、抽提柱、微型超滤器和离心管；其中研磨棒、抽提柱、微型超滤器和离心管均为市售，抽提柱优选为市售圆柱形柱子，离心管优选为市售1.5mleppendorf管，微型超滤器优选市售截留分子量小于20000道尔顿的超滤器。
当采用组织细胞样本提取RNA时，研磨步骤需要在冰上进行，以减少RNA的降解。
本发明的技术优势为：
1.本发明的试剂盒的使用方法简单，时间短，且不使用有害有机溶剂。传统方法中一般从石蜡包埋组织中抽提DNA或RNA需要先用二甲苯脱蜡，然后用无水乙醇去除二甲苯，所用的时间长，过程繁琐，至少需要3～4小时才能完成，而且二甲苯是有机溶剂，对人体有害。脱完蜡后，标本需要再经过蛋白酶K的处理，以去除蛋白质，这个过程也需要3～4小时，故通常方法抽提石蜡包埋组织中DNA或RNA，进入后续PCR或RT-PCR反应，需要6～8小时以上。本发明的方法简便易行，不使用挥发性有害有机溶剂二甲苯，不会对实验人员造成伤害，并且所需时间大为缩短，仅需10余分钟即可完成；
2.本发明的试剂盒采用高温加热对DNA或RNA进行提取，不仅使石蜡变成液态，而且使组织中的蛋白质变性，从而使DNA或RNA被释放出来，省去了需要蛋白酶K水解需要3～4个小时的过程；
3.本发明的试剂盒可将液态石蜡和chelex-100截留在抽提柱的膜上，从而消除了液态石蜡和chelex-100对PCR或RT-PCR反应的不良影响，提高了PCR或RT-PCR反应的灵敏度。
下面对本发明的具体实施方式做进一步的解释和说明，但并不对本发明的内容构成限制。本发明所用的试剂均为市售试剂，所用的实验仪器均为实验室常用仪器。
具体实施方式
实施例1
1.用两种方法提取石蜡包埋组织切片中的DNA，每种方法抽提3个标本，平行比较。
1.用北京百泰克生物技术有限公司生产的石蜡组织切片DNA提取试剂盒抽提石蜡包埋组织切片中的DNA：
a)取2片5um的医用石蜡(型号：BX12M311398，北京中西远大科技有限公司生产)包埋组织切片放入1.5mL的离心管中。
b)加入1ml二甲苯，震荡混匀，55℃水浴10分钟。13000转5分钟，吸弃上清。
c)重复第2步一到三次。
d)加1ml无水乙醇，震荡混匀。13000转5分钟，吸弃上清。
e)重复第4步一次。
f)将沉降下来的标本烘干。
g)加入200μl Buffer 1，混匀。
h)加入25μl Proteinase K，震荡混匀。55℃水浴消化过夜。
i)13000转离心5分钟，上清转移到一干净的1.5mL离心管中。
j)加入220μl Buffer 2，震荡混匀。70℃水浴10分钟
k)加入220μl无水乙醇，混匀。
l)将抽提柱放入收集管中，移入第5步的混合液体，室温静置3分钟。
m)13000转离心2分钟，把液体重新转入柱子，重新过柱。
n)13000转离心2分钟，弃液体。
o)把柱子移入新的收集管内，加入500μl Buffer 3。
p)把柱子移入新的收集管内，13000转离心1分钟，弃液体。加入600μl Wash Buffer。(Wash Buffer按包装预加适量无水乙醇)
q)13000转离心1分钟，弃液体。加入600μl DNA Wash Buffer。
r)13000转离心1分钟，弃液体。13000转离心2分钟，开盖挥发4-5分钟。
s)、把柱子移入1.5mL的带盖离心管中，在膜中央加入40μl Elution Buffer(须70℃预热)。室温静置3分钟。
t)13000转离心1分钟，收集液体，取5ul用于PCR反应。
2.采用本发明的试剂盒提取石蜡包埋组织切片中的DNA
a.取2片5um的医用石蜡(型号：BX12M311398，北京中西远大科技有限公司生产)包埋组织切片；
b.置于200ul的溶液1中，所述的溶液为10％chelex-100(sigma公司)的水溶液；
c.90℃条件下加热20分钟；
d.将抽提柱放入离心管中，将步骤3中获得的液体加入到抽提柱里，12000转/分钟离心30秒；所述的抽提柱为：
e.收集离下的液体，取5ul用于PCR反应。
2.DN A鉴定方法：
2.1DNA质量的琼脂糖凝胶电泳鉴定：
因为石蜡切片中的D N A含量较低，用普通琼脂糖凝胶电泳方法不能检测到DNA的量，因此将用每种方法抽提的三个标本基因组DNA，各取20μL混合，真空抽去部分水分后，加5μL的DNA loading buffer混匀上样，在2％的琼脂糖凝胶中80V电泳30min，在紫外凝胶成像仪下观察所提取DNA基因组的质量并拍照存档。
2.2荧光定量PCR检测所提取DNA基因组的浓度
选择针对人β-2actin基因组DNA的引物和TaqMan荧光探针，采用Primer Express软件自行设计，由上海生物工程公司(Sangong)合成。引物序列见表1。
表1：引物和探针的序列表
| 上游引物 | 5′-GGACCTGACTGACTACCTCATGAA-3′ |
| 下游引物 | 5′-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3′ |
| 探针 | 5′Fam-CACCG AGCGCGGCTACAGCTTC-TAMARA 3′ |
PCR反应体系：模板DNA 2μl，10×buffer(无Mg2+)2.5ul，2.5mmoL/L dNTP 2ul，25mmoL/L MgCl21.5ul，引物10mmol/L 0.5ul，10mmol/L探针0.4ul，5U/ul Taq聚合酶0.5μl，余下由灭菌去离子水补足
PCR扩增条件：94℃3min，94℃15s，60℃60s，40个循环，60℃检测荧光，每次PCR反应均设阳性、阴性对照。
共选了三个标本，每个标本重复5次，分别用荧光定量PCR检测人每个标本中β-2actin基因组DNA的量，用Ct值表示，比较两种抽提方法所获得的DNA的质和量，实验结果如表2所示。
从表2可见，用本发明方法抽提得到的基因组DNA所扩增的β-2actin的Ct值较试剂盒抽提的Ct值小，提示用本发明方法抽提得到的基因组DNA含量和质量都较试剂盒抽提的好。
表2：采用两种方法提取DNA的Ct值
实施例2
1.采用本发明的试剂盒快速提取石蜡包埋组织切片中的RNA：
1.1取3片5um的医用石蜡(型号：BX12M311398，北京中西远大科技有限公司生产)包埋组织切片在冰上研磨后，放入1.5mL的离心管中；
1.2置于200ul的溶液1中，所述的溶液为10％chelex-100的DEPC水溶液；
1.390℃条件下加热20分钟；
1.4将抽提柱管放入离心管中，将步骤3中获得的液体加入到抽提柱管里，12000转/分钟离心30秒；
1.5收集离下的液体，取5ul用于RT-PCR反应。
2.荧光定量RT-PCR检测所提取RNA的浓度
选择针对人GAPDH引物和TaqMan荧光探针，采用Primer Express软件自行设计，由上海生物工程公司(Sangong)合成。引物序列见表3。
表3为引物、探针的核苷酸序列：
| 上游引物 | 5′-CATCTTCCAGGAGCGAGA-3′ |
| 下游引物 | 5′-TGTTGTCATACTTCTCAT-3′ |
| 探针 | 5′Fam-CCTCACCACCATGGAGAAGGCT-TAMARA 3′ |
40μL反应体系中含有：2.5μL 10×PCR reaction buffer(Mg2+free)，3mmol/L Mg2+，0.125mmol/L dNTP，0.25μmol/L引物，0.156μmol/L探针，聚合酶2U，UNG酶0.2U，RT酶100u，模板量为3μL，补充水至40μL。
PCR扩增条件：42℃30min，94℃，5min；94℃15s，60℃60s，40个循环，60℃检测荧光，每次PCR反应均设阳性、阴性对照。
随机选取8个石蜡包埋组织切片，进行RT-PCR针对GAPDH的mRNA扩增，每个标本都能扩增出GAPDH，提示该方法是快速可行的，见表4。
表4为本发明样本的Ct值：
| 标本号 | Ct值 |
| 1 | 32.1382 |
| 2 | 32.694 |
| 3 | 29.1025 |
| 4 | 28.9604 |
| 5 | 24.662 |
| 6 | 24.5847 |
| 7 | 21.0877 |
| 8 | 21.1414 |
Claims (9)
1.一种核酸快速提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取少量病理组织石蜡切片样本；
（2）将样本置于chelex-100的DEPC水溶液中，所述的chelex-100的DEPC水溶液的浓度为3～10g/100ml；
（3）80～100℃条件下加热1～50分钟；
（4）将抽提柱放入离心管中，将步骤（3）中获得的液体加入到抽提柱中，1000～20000转/分钟，离心2～120秒；
（5）收集离下的液体，用于PCR或PT-PCR反应。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抽提柱为，在抽提柱中底部有一层起物理阻挡的膜。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的加热温度为90～100℃；所述的加热时间为5～30分钟。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的加热温度为90～95℃。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的加热时间为8～10分钟。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的离心的时间为10～30秒。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的离心的转速为5000～20000转/分钟。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的离心的转速为10000～20000转/分钟。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的离心的转速为15000～20000转/分钟。
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