CN116200546A - PRCV、PRRSV、SIV和PRV的多重RT-qPCR试剂盒及检测方法 - Google Patents

PRCV、PRRSV、SIV和PRV的多重RT-qPCR试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪呼吸道冠状病毒（PRCV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪流感病毒（SIV）和猪伪狂犬病毒（PRV）的多重RT‑qPCR试剂盒及检测方法；所述试剂盒包括如序列表中SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12所示的引物和探针。所述的检测方法是将猪组织样品、棉拭子等样品进行总RNA/DNA提取后，以得到的总RNA/DNA作为模板，再加入如序列表SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12所示引物和探针配制得到的扩增反应液中并进行扩增，然后通过荧光定量PCR仪自带软件绘制扩增曲线并读取相应的Ct值并进行结果判定，确定并区分PRCV、PRRSV、SIV和PRV四种病毒。本发明方法具有特异性好、灵敏度高的优点，能够同时检测上述四种病毒，为实验室快速、准确的检测区分上述病毒株提供了有效的技术手段。

Description

PRCV、PRRSV、SIV和PRV的多重RT-qPCR试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种PRCV、PRRSV、SIV和PRV的多重RT-qPCR试剂盒及检测方法。
背景技术
猪呼吸道冠状病毒(Porcine respiratory coronavirus，PRCV)具有约28.5 kb的单股正链RNA基因组，是猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）的一种自然变异株，与TGEV相比，PRCV基因组在S基因N端有621-681 nt的缺失，产生一个更小的S蛋白，同时S基因下游ORF3也有缺失，这些遗传变化可能解释了PRCV组织向性的改变(从肠道到呼吸道)。PRCV感染通常是亚临床或轻微的，但当与其他病毒或细菌合并感染时，可引起严重的呼吸道疾病，造成更多的经济损失。
猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproduc-tive and respiratory syndromevirus，PRRSV)是动脉病毒科的一种正链RNA病毒，该病毒在肺中复制，感染后引起猪只高热、咳嗽、呼吸困难等症状，是全世界猪生产损失的主要原因，给养猪业造成严重的经济损失。
猪流感病毒（Swine influenza virus，SIV）属于单股负链RNA病毒，其基因组的大小约为13.6 kb，由8个独立的片段组成，大小不一，目前世界范围内流行的SIV主要是H1N1、H1N2和H3N2三种亚型。猪流感在世界各地均有报道，造成猪群生产损失，因此，有必要加强更广泛的猪流感监测。
猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)是疱疹病毒科的一员，是一种线性DNA分子。PRV在猪身上是一种高度传染性和致命的病原体，引起猪只体温升高、呼吸系统障碍等症状，同时导致新生仔猪神经症状，怀孕母猪流产，公猪睾丸肿胀、萎缩等症状，其传染性强，在养猪业中死亡率高。
国内外已有多种针对PRCV、PRRSV、SIV与PRV进行单一或两种病原体同时检测建立的PCR检测方法，但是目前尚未报道有能够同时检测PRCV、PRRSV、SIV和PRV的qPCR方法，实时定量聚合酶链式反应（real-time qPCR）在目标基因组的定量和检测方面具有很大的优势，具有特异性高、灵敏度好和可重复性强，不受人为因素干扰，通过计算机和分析软件实现PCR扩增、产物检测和定量分析一体化，可保障实验场所安全、无污染等优点，因此建立可同时、快速检测这4种病原体的qPCR方法可为实验室检测提供有力的技术手段。
发明内容
针对上述不足，本发明公开了一种PRCV、PRRSV、SIV和PRV的多重RT-qPCR试剂盒及检测方法，其具有特异性好、灵敏度高的优点，能够同时检测猪呼吸道冠状病毒（PRCV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪流感病毒（SIV）和猪伪狂犬病毒（PRV），为实验室快速、准确的检测区分上述病毒株提供了有效的技术手段。
本发明是采用如下技术方案实现的：
一种PRCV、PRRSV、SIV和PRV的多重RT-qPCR试剂盒，其包括以下引物和探针：
引物F1的序列如序列表SEQ ID NO.1所示为CTGGGGYTGAAGTCGA；
引物R1的序列如序列表SEQ ID NO.2所示为GGTCATCTTTAGCAGATACT；
探针A的序列如序列表SEQ ID NO.3所示为
VIC-TCTGAAGGTGCTGAAGGGATTTCTT-BHQ1；
引物F2的序列如序列表SEQ ID NO.4所示为GCCAGATGCTGGGTAAGAT；
引物R2的序列如序列表SEQ ID NO.5所示为CATCTTCAGTCGCTAGAGGAAA；
探针B的序列如序列表SEQ ID NO.6所示为
FAM-AAACCAGTCCAGAGGCAAGGGAC-BHQ1；
引物F3的序列如序列表SEQ ID NO.7所示为TGGGATCTTGCACCTGATATTG；
引物R3的序列如序列表SEQ ID NO.8所示为CACTCTGCTGTTCCTGTTGAT；
探针C的序列如序列表SEQ ID NO.9所示为
Texas red-TACGGAAGGAGTGCCTGAGTCCAT-BHQ2；
引物F4的序列如序列表SEQ ID NO.10所示为GAGGCCCTGGAAGAAGTTG；
引物R4的序列如序列表SEQ ID NO.11所示为TCCTGGACTACAGCGAGAT；
探针D的序列如序列表SEQ ID NO.12所示为
CY5-CGATGTCGTAGAACTTGAGCGCGT-BHQ3。
所述引物F1、引物R1和探针A是用于检测PRCV中的ORF1基因；
所述引物F2、引物R2和探针B是用于检测PRRSV中的N基因；
所述引物F3、引物R3和探针C是用于检测SIV中的M基因；
所述引物F4、引物R4和探针D是用于检测PRV中的gB基因。
一种PRCV、PRRSV、SIV和PRV的多重RT-qPCR的检测方法，用于非疾病诊断和治疗目的，其包括以下步骤：
（1）样品处理：采用RNA/DNA提取试剂盒对待测样品进行总RNA/DNA的提取，得到总RNA/DNA；所述待测样品包括猪的鼻咽拭子和口咽拭子以及猪的组织样品中的任意一种或多种样品；
（2）扩增反应液配制：将步骤（1）中得到的总RNA/DNA作为模板进行qPCR扩增反应，采用如序列表SEQ ID NO.1～NO.12所示的引物和探针配制扩增反应液，所述扩增反应液总体积为25μL，其包括：12.5µL的2× One-Step PCR Buffer，0.5µL Ex Taq HS(TaKaRa)，0.5µL PrimerScript RT Enzyme Mix，2.5µL的模板，引物F1和引物R1各0.3µL，0.1μL的探针A，引物F2和引物R2各0.3µL，0.2μL的探针B，引物F3和引物R3各0.2µL，0.2μL的探针C，引物F4和引物R4各0.3µL，0.2μL的探针D，余量为无核酸酶水；
（3）qPCR扩增：将步骤（2）中配制得到的扩增反应液在荧光定量PCR仪中依次进行如下扩增反应程序：
Step1：42℃反转录5 min；
Step2：95℃预变性10 s；
Step3：95℃变性5s，57℃退火34s，共进行40个循环，同时收集荧光信号；
（4）结果检测：通过荧光定量PCR仪自带软件绘制扩增曲线并读取相应的Ct值并进行结果判定。
进一步的，步骤（1）中，所述的猪的组织样品包括猪的肺脏、气管、淋巴结、肝脏、肾脏、脾脏中的任意一种或多种。
进一步的，在步骤（1）中，当所述待测样品为猪的肺脏、气管、淋巴结、肝脏、肾脏、脾脏中任意一种或多种组织样品时，将其加入搅拌器中，再加入pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液（PBS）搅拌均匀得到混合物，取混合物并加入小钢珠摇动5分钟得到均质化的样品，接着将均质化的样品反复冻融3次，接着在4℃下以10000×g的条件离心10分钟，然后取上清液进行总RNA/DNA的提取；当所述待测样品为猪的鼻咽拭子或口咽拭子时，将其在试管中用1.0mL pH为7.2的PBS溶液稀释，接着涡旋30秒，并在4℃下以10000×g的条件离心10分钟，然后取上清液提取总RNA/DNA。
进一步的，步骤（2）中，所述引物F1、引物R1、引物F2、引物R2、引物F3、引物R3、引物F4、引物R4、探针A、探针B、探针C和探针D的浓度均为25 pmol/μL。
进一步的，在步骤（4）中，当所得到的Ct值小于等于35个周期时，判定为阳性，当Ct值大于35个周期时，判定为阴性。
本技术方案与现有技术相比较具有以下有益效果：
PRCV、PRRSV、SIV与PRV的表现存在一定的相似，使得它们很难被区分。同时，国内外目前尚无同时、快速检测并鉴别PRCV、PRRSV、SIV与PRV的方法，所以本发明针对PRCVORF1基因、PRRSV N基因、SIV M基因和PRV gB基因设计了四对特异性引物和相应的探针，并开发了一种基于TaqMan探针的多重RT-qPCR检测方法，其能够同时检测PRCV、PRRSV、SIV和PRV毒株，并且本发明检测方法的检测下限为15 copies/μL，可以特异性检测PRCV 、PRRSV、SIV 和PRV，与其他猪病毒无交叉反应，由此可见，本发明方法具有快速、特异、灵敏、准确的优点，可方便地用于猪呼吸道冠状病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流感病毒和猪伪狂犬病毒病原体的定性定量检测，为实验室检测区分这4种病毒株提供了有效的技术手段。
附图说明
图1是实验例的S4步骤中得到的pPRCV的扩增曲线图，其中曲线1～7依次表示浓度为1.5×108copies/μL、1.5×107copies/μL、1.5×106copies/μL、1.5×105copies/μL、1.5×104copies/μL、1.5×103copies/μL、1.5×102copies/μL。
图2是实验例的S4步骤中得到的pPRRSV的扩增曲线图，其中曲线1～7依次表示浓度为1.5×108copies/μL、1.5×107copies/μL、1.5×106copies/μL、1.5×105copies/μL、1.5×104copies/μL、1.5×103copies/μL、1.5×102copies/μL。
图3是实验例的S4步骤中得到的pSIV的扩增曲线图，其中曲线1～7依次表示浓度为1.5×108copies/μL、1.5×107copies/μL、1.5×106copies/μL、1.5×105copies/μL、1.5×104copies/μL、1.5×103copies/μL、1.5×102copies/μL。
图4是实验例的S4步骤中得到的pPRV的扩增曲线图，其中曲线1～7依次表示浓度为1.5×108copies/μL、1.5×107copies/μL、1.5×106copies/μL、1.5×105copies/μL、1.5×104copies/μL、1.5×103copies/μL、1.5×102copies/μL。
图5是实验例的S4步骤中得到的标准曲线图，其中曲线1～4依次表示pPRCV、pPRRSV、pSIV和pPRV。
图6是实验例的S5步骤中检测不同病毒得到的扩增曲线图，其中曲线1、2、3、4依次表示pPRCV、pPRRSV、pSIV和pPRV；曲线1a、2a、3a、4a依次表示PRCV、PRRSV、SIV和PRV在VIC、FAM、Texas Red和Cy5 荧光通道的荧光曲线；曲线5～14依次表示PEDV、PRoV、FMDV、TGEV、PCV1、PCV2、PCV3、PDCoV、APPV、阴性对照。
图7是实验例的S6步骤中得到的pPRCV的扩增曲线图，其中曲线1～9依次表示浓度为1.5×108copies/μL、1.5×107copies/μL、1.5×106copies/μL、1.5×105copies/μL、1.5×104copies/μL、1.5×103copies/μL、1.5×102copies/μL、1.5×101copies/μL、1.5×100copies/μL。
图8是实验例的S6步骤中得到的pPRRSV的扩增曲线图，其中曲线1～9依次表示浓度为1.5×108copies/μL、1.5×107copies/μL、1.5×106copies/μL、1.5×105copies/μL、1.5×104copies/μL、1.5×103copies/μL、1.5×102copies/μL、1.5×101copies/μL、1.5×100copies/μL。
图9是实验例的S6步骤中得到的pSIV的扩增曲线图，其中曲线1～9依次表示浓度为1.5×108copies/μL、1.5×107copies/μL、1.5×106copies/μL、1.5×105copies/μL、1.5×104copies/μL、1.5×103copies/μL、1.5×102copies/μL、1.5×101copies/μL、1.5×100copies/μL。
图10是实验例的S6步骤中得到的pPRV的扩增曲线图，其中曲线1～9依次表示浓度为1.5×108copies/μL、1.5×107copies/μL、1.5×106copies/μL、1.5×105copies/μL、1.5×104copies/μL、1.5×103copies/μL、1.5×102copies/μL、1.5×101copies/μL、1.5×100copies/μL。
图11是实验例的S8步骤中得到的临床样品检测试验结果。
实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：一种PRCV、PRRSV、SIV和PRV的多重RT-qPCR试剂盒，其包括以下引物和探针：
引物F1的序列如序列表SEQ ID NO.1所示为CTGGGGYTGAAGTCGA；
引物R1的序列如序列表SEQ ID NO.2所示为GGTCATCTTTAGCAGATACT；
探针A的序列如序列表SEQ ID NO.3所示为
VIC-TCTGAAGGTGCTGAAGGGATTTCTT-BHQ1；
引物F2的序列如序列表SEQ ID NO.4所示为GCCAGATGCTGGGTAAGAT；
引物R2的序列如序列表SEQ ID NO.5所示为CATCTTCAGTCGCTAGAGGAAA；
探针B的序列如序列表SEQ ID NO.6所示为
FAM-AAACCAGTCCAGAGGCAAGGGAC-BHQ1；
引物F3的序列如序列表SEQ ID NO.7所示为TGGGATCTTGCACCTGATATTG；
引物R3的序列如序列表SEQ ID NO.8所示为CACTCTGCTGTTCCTGTTGAT；
探针C的序列如序列表SEQ ID NO.9所示为
Texas red-TACGGAAGGAGTGCCTGAGTCCAT-BHQ2；
引物F4的序列如序列表SEQ ID NO.10所示为GAGGCCCTGGAAGAAGTTG；
引物R4的序列如序列表SEQ ID NO.11所示为TCCTGGACTACAGCGAGAT；
探针D的序列如序列表SEQ ID NO.12所示为
CY5-CGATGTCGTAGAACTTGAGCGCGT-BHQ3。
一种PRCV、PRRSV、SIV和PRV的多重RT-qPCR的检测方法，用于非疾病诊断和治疗目的，其包括以下步骤：
（1）样品处理：采用RNA/DNA提取试剂盒对待测样品进行总RNA/DNA的提取，得到总RNA/DNA；所述待测样品包括猪的鼻咽拭子和口咽拭子以及猪的组织样品中的任意一种或多种样品；所述的猪的组织样品包括猪的肺脏、气管、淋巴结、肝脏、肾脏、脾脏中的任意一种或多种；
当所述待测样品为猪的肺脏、气管、淋巴结、肝脏、肾脏、脾脏中任意一种或多种组织样品时，将其加入搅拌器中，再加入pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液（PBS）搅拌均匀得到混合物，取混合物并加入小钢珠摇动5分钟得到均质化的样品，接着将均质化的样品反复冻融3次，接着在4℃下以10000×g的条件离心10分钟，然后取上清液进行总RNA/DNA的提取；当所述待测样品为猪的鼻咽拭子或口咽拭子时，将其在试管中用1.0 mL pH为7.2的PBS溶液稀释，接着涡旋30秒，并在4℃下以10000×g的条件离心10分钟，然后取上清液提取总RNA/DNA；
（2）扩增反应液配制：将步骤（1）中得到的总RNA/DNA作为模板进行qPCR扩增反应，采用如序列表SEQ ID NO.1～NO.12所示的引物和探针配制扩增反应液，所述扩增反应液总体积为25μL，其包括：12.5µL的2× One-Step PCR Buffer，0.5µL Ex Taq HS(TaKaRa)，0.5µL PrimerScript RT Enzyme Mix，2.5µL的模板，引物F1和引物R1各0.3µL，0.1μL的探针A，引物F2和引物R2各0.3µL，0.2μL的探针B，引物F3和引物R3各0.2µL，0.2μL的探针C，引物F4和引物R4各0.3µL，0.2μL的探针D，余量为无核酸酶水；所述引物F1、引物R1、引物F2、引物R2、引物F3、引物R3、引物F4、引物R4、探针A、探针B、探针C和探针D的浓度均为25 pmol/μL；
（3）qPCR扩增：将步骤（2）中配制得到的扩增反应液在荧光定量PCR仪中依次进行如下扩增反应程序：
Step1：42℃反转录5 min；
Step2：95℃预变性10 s；
Step3：95℃变性5s，57℃退火34s，共进行40个循环，同时收集荧光信号；
（4）结果检测：通过荧光定量PCR仪自带软件绘制扩增曲线并读取相应的Ct值并进行结果判定，当所得到的Ct值小于等于35个周期时，判定为阳性，当Ct值大于35个周期时，判定为阴性。
实验例：对实施例1所述的种PRCV、PRRSV、SIV和PRV的多重RT-qPCR试剂盒及检测方法进行特异性、敏感性和重复性的试验分析，具体试验分析过程如下：
S1、实验用各种病毒的总核酸提取及反转录：分别取PRCV、PRRSV、SIV临床阳性样品混悬液上清液及PRV (Bartha-K61株)病毒液各200 µL，采用Ex-DNA/RNA病毒核酸提取试剂盒提取总RNA/DNA，并使用FastKing cDNA第一链合成试剂盒将其RNA反转录成cDNA；分别取PEDV(弱毒CV777株)、PRoV(G5型-NX株)、TGEV(弱毒华毒株)病毒液各200 µL以及FMDV、PCV1、PCV2、PCV3、PDCoV、APPV的临床阳性样品混悬液上清液各200 µL，采用Ex-DNA/RNA病毒核酸提取试剂盒提取DNA/RNA ，将提取的DNA和经过反转录后所得到的cDNA，置于-20℃下保存备用。
S2、标准质粒的制备：分别以步骤S1中得到的PRCV、PRRSV、SIV和PRV的总RNA/DNA作为模板，采用实施例1所述扩增反应进行扩增。回收扩增产物，将纯化的扩增产物克隆至pMD18-T 载体中，转化到DH5α感受态细胞，阳性克隆体在37℃下培养12～16h，使用MiniBEST Plasmid Extraction Kit Ver.5.0提取质粒后进行酶切（Hind III +EcoR I 酶切）、PCR和测序鉴定。正确构建重组质粒后，将它们作为阳性标准品，并且分别命名为pPRCV、pPRRSV、pSIV和pPRV标准质粒，用核酸蛋白分析仪测定质粒OD260 nm值，计算质粒浓度并换算成拷贝数（copies/μL），pPRCV、pPRRSV、pSIV和pPRV标准质粒的初始浓度分别为3.30×1010copies/µL、4.41×1010 copies/µL、3.82×1010copies/µL和 4.60×1010 copies/µL。
S3、qPCR扩增反应的引物和探针浓度优化：初步设定扩增反应参数为42℃反转录5min；95℃预变性10 s；95℃变性5s，57℃退火34s，40个循环；为了确定qPCR的最佳反应条件，固定扩增反应体系中以下组分用量：12.5µL 2× One-Step PCR Buffer，0.5µL Ex TaqHS(TaKaRa)，0.5µL PrimerScript RT Enzyme Mix，2.5 μL四种标准质粒的混合物，4对不同终浓度的引物和相应的探针，余量为无核酸酶水；所述标准质粒为步骤S2中得到的pPRCV、pPRRSV、pSIV和pPRV；
依次选定不同的退火温度（55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃）、不同的引物浓度（0.2 pmol/μL、0.3 pmol/μL、0.4 pmol/μL、0.5 pmol/μL、0.6 pmol/ μL）和探针浓度（0.1pmol/μL、0.2 pmol/μL、0.3 pmol/μL、0.4 pmol/μL、0.5 pmol/μL）通过排列组合试验进行扩增，确定得到实施例1中所述的扩增反应液和扩增反应程序。
S4、标准质粒的标准曲线绘制：将步骤S2中所得到的pPRCV、pPRRSV、pSIV和pPRV标准质粒等体积混合，然后配制成溶液，所述溶液中四种标准质粒的浓度均为1.5×109 copies/μL的溶液，然后连续稀释10倍依次得到四种标准质粒的浓度为1.5×108 copies/μL、1.5×107 copies/μL、1.5×106 copies/μL、1.5×105 copies/μL、1.4×104 copies/μL、1.5×103 copies/μL、1.5×102 copies/μL的溶液，将上述溶液作为模板，按照实施例1中所述方法进行扩增，得到四种标准质粒的扩增曲线（参见图1～4）和并绘制标准曲线（参见图5），其中pPRCV对应的标准曲线为y=-3.337x+38.581，R2=0.999；pPRRSV对应的标准曲线为y=-3.263x+39.28，R2=0.999；pSIV对应的标准曲线为y=-3.212x+37.967，R2=1.000；pPRV对应的标准曲线为y=-3.283x+38.724，R2=0.999。
S5、特异性试验：取步骤S1中得到的总RNA/DNA以及步骤S2中得到的四种标准质粒，各取2.5μL作为模板，并且以无菌蒸馏水（NTC）和无核酸酶水（WTC）为阴性对照，按照实施例1中所述方法进行检测，结果见图6。
结果显示，仅有PRCV、PRRSV、SIV和PRV四种标准质粒的样本以及相对应的临床阳性样本显示出阳性扩增曲线，而其他样本没有显示出扩增曲线，表明本发明的检测方法与其它病毒没有交叉反应，可以检测PRCV、PRRSV、SIV和PRV，具有较强的特异性。
S6、敏感性试验：将步骤S2中所得到的pPRCV、pPRRSV、pSIV和pPRV标准质粒等体积混合，然后配制成溶液，所述溶液中四种标准质粒的浓度均为1.5×109 copies/μL的溶液，然后连续稀释10倍依次得到四种标准质粒的浓度为1.5×108 copies/μL、1.5×107 copies/μL、1.5×106 copies/μL、1.5×105 copies/μL、1.5×104 copies/μL、1.5×103 copies/μL、1.5×102 copies/μL、1.5×101 copies/μL、1.5×100 copies/μL的溶液，将上述溶液作为模板，按照实施例1中所述方法进行扩增，得到四种标准质粒的扩增曲线（参见图7～10）。
结果显示，四种标准质粒的qPCR的检测下限均为1.5×101copies/μL，说明本发明方法具有较高的敏感度。
S7、重复性试验：将步骤S2中所得到的pPRCV、pPRRSV、pSIV和pPRV标准质粒等体积混合，然后配制成溶液，所述溶液中四种标准制粒的浓度均为1.5×109copies/μL的溶液，然后连续稀释依次得到四种标准制粒的浓度为1.5×107 copies/μL、1.5×105 copies/μL、1.5×103 copies/μL的溶液，将上述溶液作为模板，按照实施例1中所述方法进行扩增，得到四种标准质粒的扩增曲线，而且组内及组间重复性试验各进行3次，具体结果见表1。
结果显示，组内和组间的变异系数CV均小于1.8%，说明本发明方法具有良好的重复性。
表1 重复性试验数据
Figure SMS_1
S8、临床样品检测试验：在2022年7月到2022年12月期间，在广西采集临床样本2924份，临床样本包括猪的鼻咽拭子和口咽拭子、猪的肺脏、气管、淋巴结、肝脏、肾脏、脾脏等组织样品；
将采集猪的组织样品加入搅拌器中，pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液（PBS）搅拌均匀得到混合物，取混合物并加入小钢珠摇动5分钟得到均质化的样品，接着将均质化的样品反复冻融3次，接着在4℃下以10000×g的条件离心10分钟，然后取上清液提取总RNA/DNA；
将鼻咽拭子或口咽拭子样品放入试管中用1.0 mL PBS（pH 7.2）稀释，涡旋30秒，并在4℃下以10000×g离心10分钟，然后取上清液提取总RNA/DNA；
以无菌蒸馏水为阴性对照，按照实施例1所述方法进行检测，具体结果参见图11。
根据图11数据可知，在2924份样本中有PRCV 阳性24份，阳性率为0.82%。有PRRSV阳性179份，阳性率为6.12%。有SIV阳性53份，阳性率为1.81%。有PRV 阳性1份，阳性率为0.03%。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (7)

1.一种PRCV、PRRSV、SIV和PRV的多重RT-qPCR试剂盒，其特征在于：包括以下引物和探针：
引物F1的序列如序列表SEQ ID NO.1所示为CTGGGGYTGAAGTCGA；
引物R1的序列如序列表SEQ ID NO.2所示为GGTCATCTTTAGCAGATACT；
探针A的序列如序列表SEQ ID NO.3所示为
VIC-TCTGAAGGTGCTGAAGGGATTTCTT-BHQ1；
引物F2的序列如序列表SEQ ID NO.4所示为GCCAGATGCTGGGTAAGAT；
引物R2的序列如序列表SEQ ID NO.5所示为CATCTTCAGTCGCTAGAGGAAA；
探针B的序列如序列表SEQ ID NO.6所示为
FAM-AAACCAGTCCAGAGGCAAGGGAC-BHQ1；
引物F3的序列如序列表SEQ ID NO.7所示为TGGGATCTTGCACCTGATATTG；
引物R3的序列如序列表SEQ ID NO.8所示为CACTCTGCTGTTCCTGTTGAT；
探针C的序列如序列表SEQ ID NO.9所示为
Texas red-TACGGAAGGAGTGCCTGAGTCCAT-BHQ2；
引物F4的序列如序列表SEQ ID NO.10所示为GAGGCCCTGGAAGAAGTTG；
引物R4的序列如序列表SEQ ID NO.11所示为TCCTGGACTACAGCGAGAT；
探针D的序列如序列表SEQ ID NO.12所示为
CY5-CGATGTCGTAGAACTTGAGCGCGT-BHQ3。
2.所述引物F1、引物R1和探针A是用于检测PRCV中的ORF1基因；
所述引物F2、引物R2和探针B是用于检测PRRSV中的N基因；
所述引物F3、引物R3和探针C是用于检测SIV中的M基因；
所述引物F4、引物R4和探针D是用于检测PRV中的gB基因。
3.一种PRCV、PRRSV、SIV和PRV的多重RT-qPCR的检测方法，用于非疾病诊断和治疗目的，其特征在于：包括以下步骤：
（1）样品处理：采用RNA/DNA提取试剂盒对待测样品进行总RNA/DNA的提取，得到总RNA/DNA；所述待测样品包括猪的鼻咽拭子和口咽拭子以及猪的组织样品中的任意一种或多种样品；
（2）扩增反应液配制：将步骤（1）中得到的总RNA/DNA作为模板进行qPCR扩增反应，采用如序列表SEQ ID NO.1～NO.12所示的引物和探针配制扩增反应液，所述扩增反应液总体积为25μL，其包括：12.5µL的2× One-Step RT-PCR Buffer，0.5µL Ex Taq HS(TaKaRa)，0.5µL PrimerScript RT Enzyme Mix，2.5µL的模板，引物F1和引物R1各0.3µL，0.1μL的探针A，引物F2和引物R2各0.3µL，0.2μL的探针B，引物F3和引物R3各0.2µL，0.2μL的探针C，引物F4和引物R4各0.3µL，0.2μL的探针D，余量为无核酸酶水；
（3）RT-qPCR扩增：将步骤（2）中配制得到的扩增反应液在荧光定量PCR仪中依次进行如下扩增反应程序：
Step1：42℃反转录5 min；
Step2：95℃预变性10 s；
Step3：95℃变性5s，57℃退火34s，共进行40个循环，同时收集荧光信号；
（4）结果检测：通过荧光定量PCR仪自带软件绘制扩增曲线并读取相应的Ct值并进行结果判定。
4.根据权利要求2所述的PRCV、PRRSV、SIV和PRV的多重RT-qPCR的检测方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的猪的组织样品包括猪的肺脏、气管、淋巴结、肝脏、肾脏、脾脏中的任意一种或多种。
5. 根据权利要求2所述的PRCV、PRRSV、SIV和PRV的多重RT-qPCR的检测方法，其特征在于：在步骤（1）中，当所述待测样品为猪的肺脏、气管、淋巴结、肝脏、肾脏、脾脏中任意一种或多种组织样品时，将其加入搅拌器中，再加入pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液（PBS）搅拌均匀得到混合物，取混合物并加入小钢珠摇动5分钟得到均质化的样品，接着将均质化的样品反复冻融3次，接着在4℃下以10000×g的条件离心10分钟，然后取上清液进行总RNA/DNA的提取；当所述待测样品为猪的鼻咽拭子或口咽拭子时，将其在试管中用1.0 mL pH为7.2的PBS溶液稀释，接着涡旋30秒，并在4℃下以10000×g的条件离心10分钟，然后取上清液提取总RNA/DNA。
6. 根据权利要求2所述的PRCV、PRRSV、SIV和PRV的多重RT-qPCR的检测方法，其特征在于：步骤（2）中，所述引物F1、引物R1、引物F2、引物R2、引物F3、引物R3、引物F4、引物R4、探针A、探针B、探针C和探针D的浓度均为25 pmol/μL。
7.根据权利要求2所述的PRCV、PRRSV、SIV和PRV的多重RT-qPCR的检测方法，其特征在于：在步骤（4）中，当所得到的Ct值小于等于35个周期时，判定为阳性，当Ct值大于35个周期时，判定为阴性。
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