CN107075558A - 使用激酶的新型测定方法及组合物 - Google Patents

使用激酶的新型测定方法及组合物 Download PDF

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Abstract

一种对激酶的正反应底物、其磷酸化物以及用于衍生为前述物质的衍生前体物中的至少一种进行测定的测定方法，该方法包括下述工序：使至少激酶、激酶的第一核苷酸辅酶以及与第一核苷酸辅酶的核苷部分不同的第二核苷酸辅酶与试样接触，使酶循环反应进行反应的工序；对于与第一核苷酸辅酶及其转化物以及第二核苷酸辅酶及其转化物中的至少任一种的变化量相对应的信号进行检测的工序；以及基于检测出的信号的变化量计算出试样所含有的激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的量的工序。

Description

使用激酶的新型测定方法及组合物
技术领域
本发明涉及使用激酶的基于酶循环法的新型高灵敏度测定方法及其组合物。
背景技术
酶循环法是利用酶的作用增加极微量的物质的浓度来进行测定的方法。以往，作为辅酶的测定方法，已知有使用两种脱氢酶的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)循环法等辅酶的高灵敏度测定法(例如，参见非专利文献1)。另外，还有人报告了同样使用两种激酶来测定腺苷3磷酸(ATP)的循环法(例如，参见专利文献1)。另一方面，作为对不是辅酶的底物进行测定的酶循环法，可以举出使用两种转移酶进行测定的方法、以及利用一种酶进行测定的方法等。
作为使用两种酶的方法，可以举出使用转氨酶和多胺氧化酶的方法(例如参见专利文献2)。该方法是通过使用腐胺转氨酶和多胺氧化酶的酶循环反应(从腐胺到4-氨基丁醛方向的反应使用多胺氧化酶、反方向的反应使用腐胺转氨酶)对腐胺进行定量的方法，具体地说，将由多胺氧化酶反应生成的过氧化氢通过已知的显色法进行测定。同样地，有人报告了使用苄胺转氨酶和苄胺氧化酶的苄胺类的测定方法、以及使用苄胺转氨酶和酪胺氧化酶的酪胺的测定方法(例如参见专利文献3、4)。
另外，作为基于使用一种酶的循环法的测定方法，已知有使用脱氢酶的方法(例如参见专利文献5、6)。该方法是在氧化型辅酶NAD(P)或其类似物以及还原型辅酶NAD(P)或其类似物的存在下利用脱氢酶的可逆反应性进行酶循环反应，高灵敏度地对脱氢酶的底物进行定量的方法，其被用于在硫代NAD和还原型NAD的存在下使用3α-羟基类固醇脱氢酶进行的胆汁酸定量、使用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶进行的葡萄糖-6-磷酸定量等中。
以往，作为以底物为测定对象的使用激酶的测定方法，例如已知有对甘油三脂进行测定的方法等(例如参见非专利文献2)。另外已知有对肌酐进行测定的方法(例如参见专利文献7)。该测定法为下述方法：将肌酐在肌酐酰氨基水解酶的作用下转换为肌酸，进一步在ATP的存在下利用肌酸激酶转换为肌酸磷酸和腺苷2磷酸(ADP)，之后测定该ADP，从而对肌酐进行测定。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2006-223163号公报
专利文献2：日本特开平3-180200号公报
专利文献3：日本特开平7-155199号公报
专利文献4：日本特开平7-177898号公报
专利文献5：日本特开平3-224498号公报
专利文献6：日本特开平4-335898号公报
专利文献7：日本特开平9-285297号公报
非专利文献
非专利文献1：生化学実験講座5酵素研究法(上)(生化学实验讲座5酶研究法(上)),社团法人日本生化学会编辑,东京化学同人,1975年,P121-135
非专利文献2：酵素－バイオテクノロジーへ的指針－日本農芸化学会編集(酶-面向生物技术的指南-日本农艺化学会编辑),朝仓出版,1985年,P97-101
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于提供能够高精度地对激酶正反应底物、其磷酸化物以及用于衍生为前述物质的衍生前体物中的至少一种进行测定的方法以及组合物。
解决课题的手段
在基于酶循环法的测定法中，由于基于酶反应的信号会随着所添加的酶量而增加，因而其是能够适用于通过控制酶量而进行高灵敏度定量的技术。特别是在对底物进行定量的酶循环法中，使用激酶的方法目前尚未为人所知，在对底物进行定量的酶循环法中的测定对象受到限制。另外，在激酶反应中，通常正反应比逆反应优先进行这一点是普遍的，在利用逆反应的酶循环法中应用激酶在技术上被认为是困难的。
另一方面，如上所述，作为使用激酶的底物的测定方法，有使用肌酸激酶对肌酐进行测定的方法等(例如参见专利文献7)，但激酶只不过被用于向一个方向进行的化学计量转换反应，因此，在测定对象物的浓度低的情况下，不一定得到足够的灵敏度，需要通过增加被测物量等来进行应对。但是在增加被测物量时，容易受到共存物质的影响等，从实用性的方面考虑存在问题。
在这样的情况下，本发明人发现，在激酶中，可催化激酶反应的正反应和逆反应这两个方向的反应、且在正反应和逆反应中利用具有不同核苷部分的辅酶的激酶具有多种，在将这些激酶用于酶循环反应中时，能够出人意料地以高灵敏度测定出激酶正反应底物和/或其磷酸化物或用于衍生为前述物质的衍生前体物，从而完成了本发明。
本发明例如具有以下的构成。
[1]一种测定方法，其是对激酶的正反应底物、其磷酸化物以及用于衍生为前述物质的衍生前体物中的至少一种进行测定的测定方法，该方法包括下述工序：
(1)使激酶、激酶的第一核苷酸辅酶和与第一核苷酸辅酶的核苷部分不同的第二核苷酸辅酶与试样接触，使下式(1)的循环反应进行反应的工序，所述激酶在核苷酸辅酶的存在下催化由激酶的正反应底物生成其磷酸化物的正反应及其逆反应，且在正反应和逆反应中利用至少具有各不相同的核苷部分的核苷酸辅酶；在测定对象为衍生前体物的情况下，所述试样为进行了使衍生前体物定量地衍生为激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的处理而得到的试样；
[化1]
(2)对信号的变化量进行检测的工序，所述信号的变化量对应于第一核苷酸辅酶、第一核苷酸辅酶的转化物、第二核苷酸辅酶以及第二核苷酸辅酶的转化物中的至少任一种的变化量；以及
(3)基于检测出的信号的变化量，计算出试样所含有的激酶的正反应底物、其磷酸化物以及用于衍生为前述物质的衍生前体物中的至少一种的量的工序。
[1-1]
如上述[1]中所述的测定方法，其中，测定对象为激酶的正反应底物和/或其磷酸化物。
[1-1-1]
如上述[1]或[1-1]中所述的测定方法，其中，测定对象为激酶正反应底物和/或其磷酸化物，测定对象与激酶的组合为表1中记载的任一种组合。
[表1]
测定对象 激酶
肌酸和/或其磷酸化物 肌酸激酶
3-磷酸甘油酸和/或其磷酸化物 3-磷酸甘油酸激酶
丙酮酸和/或其磷酸化物 丙酮酸激酶
果糖-6-磷酸和/或其磷酸化物 磷酸果糖-1-激酶
甘油和/或其磷酸化物 甘油激酶
己糖和/或其磷酸化物 己糖激酶
葡萄糖和/或其磷酸化物 ADP依赖性葡萄糖激酶
[1-1-2]
如上述[1]至[1-1-1]中任一项所述的测定方法，其中，测定对象为激酶正反应底物和/或其磷酸化物，测定对象与激酶的组合为下述任一种组合。另外，在下文中，按照测定对象：激酶的顺序来记载。另外，其磷酸化物是与所记载的激酶正反应底物相对应的磷酸化物。
肌酸/其磷酸化物：肌酸激酶(EC 2.7.3.2)
3-磷酸甘油酸/其磷酸化物：3-磷酸甘油酸激酶(EC 2.7.2.3)
丙酮酸/其磷酸化物：丙酮酸激酶(EC 2.7.1.40)
果糖-6-磷酸/其磷酸化物：磷酸果糖-1-激酶(EC 2.7.1.11)
甘油/其磷酸化物：甘油激酶(EC 2.7.1.30)
己糖/其磷酸化物：己糖激酶(EC 2.7.1.1)
葡萄糖/其磷酸化物：ADP依赖性葡萄糖激酶(EC 1.7.1.147)
[1-2]
如上述[1]中所述的测定方法，其中，测定对象为衍生前体物，试样为进行了使衍生前体物定量地衍生为激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的处理而得到的试样；基于检测出的信号的变化量，计算出衍生前体物的量。
[1-2-1]
如上述[1]或[1-2]中所述的测定方法，其中，测定对象为衍生前体物，测定对象、激酶、以及激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的组合为表2中记载的任一种组合。
[表2]
[1-2-2]
如上述[1]、[1-2]和[1-2-1]中任一项所述的测定方法，其中，测定对象为衍生前体物，测定对象、激酶以及激酶正反应底物/其磷酸化物的组合为下述组合中的任一种。另外，在下文中，按照测定对象：激酶：激酶正反应底物的顺序来记载。
肌酐：肌酸激酶(EC 2.7.3.2)：肌酸/其磷酸化物
甘油醛-3-磷酸、羟基丙酮磷酸、甘油-3-磷酸、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰胆碱、果糖-1,6-双磷酸、2-磷酸甘油酸、磷酸烯醇式丙酮酸或2,3-双磷酸甘油酸：3-磷酸甘油酸激酶(EC 2.7.2.3)：3-磷酸甘油酸/其磷酸化物
葡萄糖-6-磷酸：磷酸果糖-1-激酶(EC 2.7.1.11)：磷酸果糖-6-磷酸/其磷酸化物
二羟基丙酮磷酸、甘油三脂、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酸、甘油-3-磷酸、溶血磷脂酰甘油或磷脂酰甘油：甘油激酶(EC 2.7.1.30)：甘油/其磷酸化物
葡萄糖-1-磷酸：ADP依赖性葡萄糖激酶(EC 2.7.1.147)：葡萄糖/其磷酸化物
[1-2-3]
如上述[1]、[1-2]和[1-2-2]中任一项所述的测定方法，其中，测定对象是作为衍生前体物的肌酐，激酶为肌酸激酶，激酶的正反应底物为肌酸。
[1-2-4]
如上述[1]以及[1-2]至[1-2-3]中任一项所述的测定方法，其中，在使衍生前体物定量地衍生为激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的处理中，包括以下步骤：在水的存在下使肌酐酰氨基水解酶(EC 3.5.2.10)与肌酐接触。
[2]
如上述[1]至[1-2-4]中任一项所述的测定方法，其中，上述工序(2)为对信号的变化量进行检测的工序，该信号的变化量对应于第一核苷酸辅酶的正反应转化物或第二核苷酸辅酶的逆反应转化物的增加量。
[3]
如上述[1]～[2]中任一项所述的测定方法，其中，第一核苷酸辅酶的核苷部分为腺苷、鸟苷、胸苷、尿苷、胞苷、黄苷、肌苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、脱氧尿苷、脱氧胞苷、脱氧黄苷以及脱氧肌苷中的任一种，第一核苷酸辅酶与第二核苷酸辅酶的核苷部分各不相同。
[4]
如上述[1]～[3]中所述的测定方法，其中，第一核苷酸辅酶的核苷部分为腺苷、肌苷、鸟苷或脱氧腺苷，第一核苷酸辅酶与第二核苷酸辅酶的核苷部分各不相同。
[5]
如上述[1]至[4]中任一项所述的测定方法，其中，第二核苷酸辅酶的核苷部分为腺苷、鸟苷、胸苷、尿苷、胞苷、黄苷、肌苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、脱氧尿苷、脱氧胞苷、脱氧黄苷和脱氧肌苷中的任一种，第一核苷酸辅酶与第二核苷酸辅酶的核苷部分各不相同。
[6]
如上述[1]至[5]中任一项所述的测定方法，其中，第二核苷酸辅酶的核苷部分为腺苷、肌苷、鸟苷或脱氧鸟苷，第一核苷酸辅酶与第二核苷酸辅酶的核苷部分各不相同。
[7]
如上述[1]至[6]中任一项所述的测定方法，其中，第一核苷酸辅酶的核苷部分为腺苷、肌苷、鸟苷或脱氧腺苷，第二核苷酸辅酶的核苷部分为腺苷、肌苷、鸟苷或脱氧鸟苷，并且第一核苷酸辅酶与第二核苷酸辅酶的核苷部分各不相同。
[7-1]
如上述[1]至[7]中任一项所述的测定方法，其中，第一核苷酸辅酶的核苷部分与第二核苷酸辅酶的核苷部分的组合为：腺苷与肌苷、鸟苷与腺苷、脱氧腺苷与鸟苷、脱氧腺苷与脱氧鸟苷、脱氧腺苷与肌苷、或肌苷与腺苷。
[7-2]
如上述[1]至[7-1]中任一项所述的测定方法，其中，第一核苷酸辅酶的核苷部分为腺苷，第二核苷酸辅酶的核苷部分为肌苷。
[7-3]
如上述[1]至[7-3]中任一项所述的测定方法，其中，第一核苷酸辅酶为腺苷3磷酸(ATP)，第二核苷酸辅酶为肌苷2磷酸(IDP)。
[8]
如上述[1]至[7-3]中任一项所述的测定方法，其中，在对信号的变化量进行检测的工序中，使用能够利用基于正反应的第一核苷酸辅酶的转化物但不能利用第二核苷酸辅酶的检测用酶、或者不能利用第一核苷酸辅酶但能够利用基于逆反应的第二核苷酸辅酶的转化物的检测用酶，对于与基于正反应的第一核苷酸辅酶的转化物或者基于逆反应的第二核苷酸辅酶的转化物的增加量相对应的信号的变化量进行检测。
[9]
如上述[1]至[8]中任一项所述的测定方法，其中，在对信号的变化量进行检测的工序中，使用腺苷2磷酸(ADP)依赖性葡萄糖激酶(EC 2.7.1.147)，在葡萄糖的存在下对于与腺苷2磷酸(ADP)的增加量相对应地变化的信号的变化量进行检测。
[10]
如上述[1]或[9]中任一项所述的测定方法，其中，在对信号的变化量进行检测的工序中，使用腺苷2磷酸(ADP)依赖性葡萄糖激酶(EC 2.7.1.147)，在硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(硫代NADP)、硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(硫代NAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)中的任一种辅酶以及葡萄糖和葡萄糖6磷酸脱氢酶的存在下，对于与腺苷2磷酸(ADP)的增加量相对应地变化的信号的变化量进行检测。
[11]
如上述[1]和[1-2]至[10]中任一项所述的测定方法，该测定方法的测定对象是作为衍生前体物的肌酐，其包括下述工序。
(1)使如下得到的试样与至少下述成分(a)～(c)接触，使下式(2)的循环反应进行反应的工序，所述试样是进行了在水的存在下使肌酐酰氨基水解酶(EC3.5.2.10)与肌酐接触、使肌酐定量地衍生为肌酸的处理而得到的试样，
(a)肌酸激酶(EC 2.7.3.2)
(b)ATP
(c)IDP
[化2]
(2)使用腺苷2磷酸依赖性葡萄糖激酶(EC 2.7.1.147)，在硫代NADP、硫代NAD、NADP或NAD中的任一种辅酶以及葡萄糖和葡萄糖6磷酸脱氢酶的存在下，对于与腺苷2磷酸的增加量相对应的信号的变化量进行检测的工序，
(3)由上述(2)的工序的检测结果计算出试样中的肌酐的量的工序。
[12]
一种组合物，其是用于对激酶的正反应底物、其磷酸化物以及用于衍生为前述物质的衍生前体物中的至少一种进行测定的测定用组合物，在测定对象为衍生前体物的情况下，该组合物在进行了使衍生前体物定量地衍生为激酶正反应底物和/或其磷酸化物的处理后使用，并且
该组合物具备下述(a)、(b)和(c)：
(a)激酶，所述激酶在核苷酸辅酶的存在下催化由该激酶的正反应底物生成其磷酸化物的正反应及其逆反应，在正反应和逆反应中利用至少具有各不相同的核苷部分的核苷酸辅酶，
(b)正反应中的第一核苷酸辅酶，
(c)与第一核苷酸辅酶的核苷部分不同的、逆反应中的第二核苷酸辅酶。
[12-1]
如上述[12]中所述的组合物，其中，测定对象为激酶正反应底物和/或其磷酸化物。
[12-1-1]
如上述[12]或[12-1]中所述的组合物，其中，测定对象为激酶的正反应底物和/或其磷酸化物，测定对象与激酶的组合为表3中记载的任一种组合。
[表3]
测定对象 激酶
肌酸和/或其磷酸化物 肌酸激酶
3-磷酸甘油酸和/或其磷酸化物 3-磷酸甘油酸激酶
丙酮酸和/或其磷酸化物 丙酮酸激酶
果糖-6-磷酸和/或其磷酸化物 磷酸果糖-1-激酶
甘油和/或其磷酸化物 甘油激酶
己糖和/或其磷酸化物 己糖激酶
葡萄糖和/或其磷酸化物 ADP依赖性葡萄糖激酶
[12-1-2]
如上述[12]至[12-1-1]中任一项所述的组合物，其中，测定对象为激酶正反应底物和/或其磷酸化物，测定对象与激酶的组合为下述组合中的任一种。另外，在下文中，按照测定对象：激酶的顺序来记载。另外，其磷酸化物是与所记载的激酶正反应底物相对应的磷酸化物。
肌酸/其磷酸化物：肌酸激酶(EC 2.7.3.2)
3-磷酸甘油酸/其磷酸化物：3-磷酸甘油酸激酶(EC 2.7.2.3)
丙酮酸/其磷酸化物：丙酮酸激酶(EC 2.7.1.40)
果糖-6-磷酸/其磷酸化物：磷酸果糖-1-激酶(EC 2.7.1.11)
甘油：甘油激酶(EC 2.7.1.30)
己糖/其磷酸化物：己糖激酶(EC 2.7.1.1)
葡萄糖/其磷酸化物：ADP依赖性葡萄糖激酶(EC 2.7.1.147)
[12-2]
如上述[12]中所述的组合物，其中，测定对象为衍生前体物，该组合物在进行了使该衍生前体物定量地衍生为激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的处理后使用。
[12-2-1]
如上述[12]或[12-2]中所述的组合物，其中，测定对象为衍生前体物，测定对象、激酶、以及激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的组合为表4中记载的任一种组合。
[表4]
[12-2-2]
如上述[12]、[12-2]和[12-2-1]中任一项所述的组合物，其中，测定对象为衍生前体物，测定对象、激酶以及激酶正反应底物/其磷酸化物的组合为下述组合中的任一种。另外，在下文中，按照测定对象：激酶：激酶正反应底物/其磷酸化物的顺序来记载。
肌酐：肌酸激酶(EC 2.7.3.2)：肌酸/其磷酸化物
甘油醛-3-磷酸、羟基丙酮磷酸、甘油-3-磷酸、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰胆碱、果糖-1,6-双磷酸、2-磷酸甘油酸、磷酸烯醇式丙酮酸或2,3-双磷酸甘油酸：3-磷酸甘油酸激酶(EC 2.7.2.3)：3-磷酸甘油酸/其磷酸化物
葡萄糖-6-磷酸：磷酸果糖-1-激酶(EC 2.7.1.11)：磷酸果糖-6-磷酸/其磷酸化物
二羟基丙酮磷酸、甘油三脂、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酸、甘油-3-磷酸、溶血磷脂酰甘油或磷脂酰甘油：甘油激酶(EC 2.7.1.30)：甘油/其磷酸化物
葡萄糖-1-磷酸：ADP依赖性葡萄糖激酶(EC 2.7.1.147)：葡萄糖/其磷酸化物
[12-2-3]
如上述[12]和[12-2]至[12-2-2]中任一项所述的组合物，其中，测定对象是作为衍生前体物的肌酐，激酶为肌酸激酶，上述激酶的正反应底物为肌酸。
[12-2-4]
如上述[12]、[12-2]至[12-2-3]中任一项所述的组合物，其中，在使衍生前体物定量地衍生为激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的处理中，在水的存在下使肌酐酰氨基水解酶(EC3.5.2.10)与肌酐接触而衍生出肌酸。
[13]
如上述[12]至[12-2-4]中任一项所述的组合物，其中，第一核苷酸辅酶的核苷部分为腺苷、鸟苷、胸苷、尿苷、胞苷、黄苷、肌苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、脱氧尿苷、脱氧胞苷、脱氧黄苷和脱氧肌苷中的任一种，第一核苷酸辅酶与第二核苷酸辅酶的核苷部分各不相同。
[14]
如上述[12]至[13]中任一项所述的组合物，其中，第一核苷酸辅酶的核苷部分为腺苷、肌苷、鸟苷或脱氧腺苷，第一核苷酸辅酶与第二核苷酸辅酶的核苷部分各不相同。
[15]
如上述[12]至[14]中任一项所述的组合物，其中，第二核苷酸辅酶的核苷部分为腺苷、鸟苷、胸苷、尿苷、胞苷、黄苷、肌苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、脱氧尿苷、脱氧胞苷、脱氧黄苷和脱氧肌苷中的任一种，第一核苷酸辅酶与第二核苷酸辅酶的核苷部分各不相同。
[16]
如上述[12]至[15]中任一项所述的组合物，其中，第二核苷酸辅酶的核苷部分为腺苷、肌苷、鸟苷或脱氧鸟苷，第一核苷酸辅酶与第二核苷酸辅酶的核苷部分各不相同。
[17]
如上述[12]至[16]中任一项所述的组合物，其中，第一核苷酸辅酶的核苷部分为腺苷、肌苷、鸟苷或脱氧腺苷，第二核苷酸辅酶的核苷部分为肌苷、鸟苷、腺苷或脱氧鸟苷，并且第一核苷酸辅酶与第二核苷酸辅酶的核苷部分各不相同。
[17-1]
如上述[12]至[17]中任一项所述的组合物，其中，第一核苷酸辅酶的核苷部分与第二核苷酸辅酶的核苷部分的组合为：腺苷与肌苷、鸟苷与腺苷、脱氧腺苷与鸟苷、脱氧腺苷与脱氧鸟苷、脱氧腺苷与肌苷、或鸟苷与腺苷。
[17-2]
如上述[12]至[17-1]中任一项所述的组合物，其中，第一核苷酸辅酶的核苷部分为腺苷，第二核苷酸辅酶的核苷部分为肌苷。
[17-3]
如上述[12]至[17-2]中任一项所述的组合物，其中，第一核苷酸辅酶为腺苷3磷酸(ATP)，第二核苷酸辅酶为肌苷2磷酸(IDP)。
[18]
如上述[12]至[17-3]中任一项所述的组合物，其中，该组合物进一步包含能够利用基于正反应的第一核苷酸辅酶的转化物但不能利用第二核苷酸辅酶的检测用酶、或者不能利用第一核苷酸辅酶但能够利用基于逆反应的第二核苷酸辅酶的转化物的检测用酶。
[19]
如上述[18]中所述的组合物，其中，检测用酶为腺苷2磷酸(ADP)依赖性葡萄糖激酶(EC 1.7.1.147)，该组合物进一步包含葡萄糖。
[20]
如上述[18]中所述的组合物，其中，该组合物进一步包含：
硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(硫代NADP)、硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(硫代NAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)；以及
葡萄糖6磷酸脱氢酶。
[21]
如上述[12-2]至[20]中任一项所述的组合物，其中，
测定对象是作为衍生前体物的肌酐，
该组合物在进行了以下处理后使用，所述处理为在水的存在下使肌酐酰氨基水解酶(EC3.5.2.10)与该肌酐接触、使肌酐定量地衍生为肌酸的处理，
该组合物具备：
(a)肌酸激酶、
(b)腺苷3磷酸(ATP)、
(c)肌苷2磷酸(IDP)、
(d)腺苷2磷酸(ADP)依赖性葡萄糖激酶(EC 2.7.1.147)、
(e)葡萄糖、
(f)硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(硫代NADP)、硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(硫代NAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、以及
(g)葡萄糖6磷酸脱氢酶。
[22]
一种试剂盒，其包含上述[12]至[21]中任一项所述的组合物。
发明的效果
根据本发明，能够高灵敏度地测定激酶的底物、其磷酸化物以及用于衍生为前述物质的衍生前体物中的至少一种。
根据本发明，能够高灵敏度地对于难以利用现有的循环法进行高灵敏度测定的测定对象物质、例如果糖-6-磷酸以及肌酐等进行测定。
附图说明
图1是表示使用肌酸激酶的试样中的肌酸浓度与吸光度变化量的相关性的曲线图。
图2是表示使用肌酸激酶、在反应液中包含脱氧肌苷2磷酸(IDP)的实施例与在反应液中不包含IDP的比较例的试样中的肌酸浓度与吸光度变化量的相关性的曲线图。
图3是表示使用肌酸激酶的试样中的肌酐浓度与吸光度变化量的相关性的曲线图。
图4是表示使用3-磷酸甘油酸激酶的试样中的3-磷酸甘油酸浓度与吸光度变化量的相关性的曲线图。
图5是表示使用磷酸果糖-1-激酶的试样中的果糖-6-磷酸浓度与吸光度变化量的相关性的曲线图。
图6是表示使用甘油激酶的试样中的甘油浓度与吸光度变化量的相关性的曲线图。
图7是表示使用丙酮酸激酶的试样中的丙酮酸浓度与吸光度变化量的相关性的曲线图。
图8是表示使用3-磷酸甘油酸激酶的试样中的3-磷酸甘油酸浓度与吸光度变化量的相关性的曲线图。
图9是表示使用己糖激酶的试样中的葡萄糖-6-磷酸浓度与吸光度变化量的相关性的曲线图。
图10是表示使用腺苷2磷酸(ADP)依赖性葡萄糖激酶的试样中的葡萄糖-6-磷酸浓度与吸光度变化量的相关性的曲线图。
图11是表示使用丙酮酸激酶的试样中的磷酸烯醇式丙酮酸浓度与吸光度变化量的相关性的曲线图。
图12是表示使用肌酸激酶的试样中的肌酐浓度与吸光度变化量的相关性的曲线图。
具体实施方式
下面对本发明的实施方式(下文中也称为“本实施方式”)进行具体说明。但是不应理解为下述实施方式对本发明进行了限定。根据本公开，对于本领域技术人员而言，各种替代实施方式、实施例和操作技术应该是显而易见的。应当理解，本发明涵盖没有在这里记载的各种实施方式等。需要说明的是，本说明书中的EC编号(Enzyme Commission numbers，酶学委员会编号)为2014年9月12日目前所确认的编号。
本实施方式的方法是对激酶的正反应底物、其磷酸化物以及用于衍生为前述物质的衍生前体物中的至少一种进行测定的测定方法，该方法包括下述工序：
(1)使激酶、激酶的第一核苷酸辅酶和与第一核苷酸辅酶的核苷部分不同的第二核苷酸辅酶与试样接触，使下式(3)的酶循环反应进行反应的工序，所述激酶在核苷酸辅酶的存在下催化由激酶的正反应底物生成其磷酸化物的正反应及其逆反应，且在正反应和逆反应中利用至少具有各不相同的核苷部分的核苷酸辅酶；在测定对象为衍生前体物的情况下，所述试样为进行了使衍生前体物定量地衍生为上述激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的处理而得到的试样；
[化3]
(2)对信号的变化量进行检测的工序，所述信号的变化量对应于第一核苷酸辅酶、第一核苷酸辅酶的转化物、第二核苷酸辅酶以及第二核苷酸辅酶的转化物中的至少任一种的变化量；以及
(3)基于检测出的信号的变化量，计算出试样所含有的激酶的正反应底物、其磷酸化物以及用于衍生为前述物质的衍生前体物中的至少一种的量的工序。
如上述式(3)所示，本实施方式的方法中使用的激酶是能够在第一核苷酸辅酶的存在下催化由正反应底物生成其磷酸化物的正反应、且在第二核苷酸辅酶的存在下催化由正反应底物的磷酸化物生成正反应底物的逆反应的激酶。
在测定对象为衍生前体物的情况下，作为试样，使用经下述处理的试样，所述处理中，使衍生前体物定量地衍生为激酶的正反应底物和/或其磷酸化物。
关于作为本实施方式的方法的测定对象的激酶的正反应底物及其磷酸化物，只要能够利用本实施方式的方法进行测定就没有特别限定，例如可以举出肌酸、3-磷酸甘油酸、丙酮酸、果糖-6-磷酸、甘油以及它们的磷酸化物。另外，作为用于衍生为前述物质的衍生前体物，可以举出肌酐、甘油醛-3-磷酸、二羟基丙酮磷酸、甘油-3-磷酸、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰胆碱、果糖-1,6-双磷酸、2-磷酸甘油酸、磷酸烯醇式丙酮酸、2,3-双磷酸甘油酸、葡萄糖-6-磷酸、甘油三脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、溶血磷脂酰甘油以及葡萄糖-1-磷酸等，但并不限定于这些。例如，作为优选的衍生前体物，可以举出肌酐。
作为利用本实施方式的方法对于所含有的激酶的正反应底物和/或其磷酸化物或者用于衍生为前述物质的衍生前体物的量进行检査的试样没有特别限定，例如为人或动物的生物体试样，优选为人血液，进一步优选为人血清。需要说明的是，关于在试样中是否包含作为测定对象的激酶的正反应底物和/或其磷酸化物或者用于衍生为前述物质的衍生前体物，在实施上述方法之前可以为未知的，通过实施本实施方式的方法来明确试样中不含有激酶的正反应底物和/或其磷酸化物或者用于衍生为前述物质的衍生前体物也是可以的。
在本实施方式的方法中，“衍生前体物”是指可衍生为激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的物质。在直至得到激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的反应步骤具有多步的情况下，衍生前体物可以包含其起始物质以及中间物质中的全部，也可以包含它们中的任一者。
在本实施方式的方法中，“定量地衍生为……的处理”是指按照衍生前体物的减少量与作为衍生后物质的激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的增加量相对应的方式使衍生前体物衍生为激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的处理。具体地说，只要为能够利用本实施方式的方法，基于与第一核苷酸辅酶、第一核苷酸辅酶的转化物、第二核苷酸辅酶以及第二核苷酸辅酶的转化物中的至少任一种的变化量相对应的信号的变化量，计算出衍生前体物的量的处理即可。作为定量地衍生的处理的示例，使用公知的化学处理即可，但并不限定于此。作为化学处理的示例，可以举出利用水解、氧化及还原等化学反应进行的处理，但并不限定于此。作为具体例，可以举出基于酸或碱的水解。
作为化学处理以外的示例，例如可以举出酶处理等。例如，肌酐可以通过在水的存在下与肌酐酰氨基水解酶(肌酐酶)(EC 3.5.2.10)接触而衍生为肌酸。因而，在本实施方式的方法中，在通过使用肌酸激酶作为激酶对肌酸进行测定时，也能够对作为肌酸的衍生前体物的肌酐进行测定。
另外，由于甘油三脂可在脂肪酶(EC 3.1.1.3)的作用下衍生为甘油，因而在与甘油激酶的酶循环反应组合时，能够进行甘油三脂的测定。
此外，溶血卵磷脂通过溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)和甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶(EC3.1.4.2)的作用而被衍生为胆碱和甘油-3-磷酸。因而，通过将衍生出的甘油-3-磷酸作为底物进行甘油激酶的酶循环反应来测定甘油-3-磷酸时，也能够测定溶血卵磷脂。不过，酶的处理并不限定于这些。
可以在本实施方式的方法中使用的激酶只要具有在核苷酸辅酶的存在下催化由激酶的正反应底物生成其磷酸化物的正反应及其逆反应、且在该正反应和逆反应中可以利用至少具有各不相同的核苷部分的核苷酸辅酶的性质就没有特别限定。此处，本实施方式的方法中的“激酶正反应”是指在激酶所催化的高能量的磷酸转移中，磷酸由核苷酸辅酶转移到正反应底物的方向的反应，而不管所转移的磷酸的个数为多少。优选所转移的磷酸为一个。另外，“激酶逆反应”是指与上述“激酶正反应”反方向的反应。
在本实施方式中，在测定对象为激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的情况下，作为测定对象与激酶的组合，例如可以举出下述组合，但并不限定于这些。另外，在以下的例示中，按照测定对象：激酶的顺序来记载。另外，其磷酸化物是指与所记载的激酶的正反应底物相对应的磷酸化物。
肌酸和/或其磷酸化物：肌酸激酶
3-磷酸甘油酸和/或其磷酸化物：3-磷酸甘油酸激酶
丙酮酸和/或其磷酸化物：丙酮酸激酶
果糖-6-磷酸和/或其磷酸化物：磷酸果糖-1-激酶
甘油和/或其磷酸化物：甘油激酶
己糖和/或其磷酸化物：己糖激酶
葡萄糖和/或其磷酸化物：腺苷2磷酸(ADP)依赖性葡萄糖激酶
可以优选举出包含由EC编号(Enzyme Commission numbers)限定的激酶的下述组合，但并不限定于这些。
肌酸和/或其磷酸化物：肌酸激酶(EC 2.7.3.2)
3-磷酸甘油酸和/或其磷酸化物：3-磷酸甘油酸激酶(EC 2.7.2.3)
丙酮酸和/或其磷酸化物：丙酮酸激酶(EC 2.7.1.40)
果糖-6-磷酸和/或其磷酸化物：磷酸果糖-1-激酶(EC 2.7.1.11)
甘油和/或其磷酸化物：甘油激酶(EC 2.7.1.30)
己糖和/或其磷酸化物：己糖激酶(EC 2.7.1.1)
葡萄糖和/或其磷酸化物：ADP依赖性葡萄糖激酶(EC 2.7.1.147)
测定对象为衍生前体物的情况下，作为测定对象、激酶以及激酶的正反应底物和/或其磷酸化物各自的组合，可以示例出下述组合，但并不限定于这些。需要说明的是，在以下的例示中，按照测定对象：激酶：激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的顺序来记载。
肌酐：肌酸激酶：肌酸和/或其磷酸化物
甘油醛-3-磷酸、羟基丙酮磷酸、甘油-3-磷酸、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰胆碱、果糖-1,6-双磷酸、2-磷酸甘油酸、磷酸烯醇式丙酮酸、或2,3-双磷酸甘油酸：3-磷酸甘油酸激酶：3-磷酸甘油酸和/或其磷酸化物
葡萄糖-6-磷酸：磷酸果糖-1-激酶：磷酸果糖-6-磷酸和/或其磷酸化物
二羟基丙酮磷酸、甘油三脂、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酸、甘油-3-磷酸、溶血磷脂酰甘油或磷脂酰甘油：甘油激酶：甘油和/或其磷酸化物
葡萄糖-1-磷酸：ADP依赖性葡萄糖激酶：葡萄糖和/或其磷酸化物
可以优选举出包含由EC编号限定的激酶的下述组合，但并不限定于这些。
肌酐：肌酸激酶(EC 2.7.3.2)：肌酸和/或其磷酸化物
甘油醛-3-磷酸、羟基丙酮磷酸、甘油-3-磷酸、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰胆碱、果糖-1,6-双磷酸、2-磷酸甘油酸、磷酸烯醇式丙酮酸或2,3-双磷酸甘油酸：3-磷酸甘油酸激酶(EC 2.7.2.3)：3-磷酸甘油酸和/或其磷酸化物
葡萄糖-6-磷酸：磷酸果糖-1-激酶(EC 2.7.1.11)：磷酸果糖-6-磷酸和/或其磷酸化物
二羟基丙酮磷酸、甘油三脂、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酸、甘油-3-磷酸、溶血磷脂酰甘油或磷脂酰甘油：甘油激酶(EC 2.7.1.30)：甘油和/或其磷酸化物
葡萄糖-1-磷酸：ADP依赖性葡萄糖激酶(EC 2.7.1.147)：葡萄糖和/或其磷酸化物
作为测定对象、激酶以及激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的优选组合，可以举出下述组合。
肌酐：肌酸激酶：肌酸和/或其磷酸化物
在测定对象为激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的情况下，本实施方式的方法的测定对象以及激酶各自的组合除了上述以外还可以利用下述方法来确定。另外，在测定对象为衍生前体物的情况下，测定对象、激酶以及激酶的正反应底物/其磷酸化物各自的组合除了上述以外还可以利用下述方法来确定。
在测定对象为激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的情况下，首先参考例如酵素ハンドブック(酶手册)(朝仓书店，1982年)等选择特定的激酶。在可获得关于是否进行逆反应或者针对核苷酸辅酶的特异性的文献信息的情况下，可参考该文献信息进行选择。另外，在得不到文献信息的情况下，若与公知的高效液相色谱(HPLC)法等方法组合，则能够实际确认这些信息。例如，在没有关于逆反应的文献信息的情况下，关于是否进行逆反应，可以针对特定的激酶按照常规方法在逆反应的底物和核苷酸辅酶过量存在的条件下添加激酶进行反应，利用现有的方法对生成物(正反应底物)或核苷酸辅酶的转化物进行检测。
例如，在研究甘油激酶的逆反应的情况下，可以过量添加作为逆反应底物的甘油-3-磷酸和ADP进行激酶反应，利用已知方法对于所生成的甘油或腺苷3磷酸(ATP)进行检测，但不限定于此。具体地说，在检测甘油的情况下，可以使用甘油氧化酶以过氧化氢的形式进行检测。另外，在检测ATP的情况下，可以与HPLC法或ATP检测用的已知的酶法进行组合。在确认了逆反应的情况下，若进一步改变反应时的pH对逆反应的最佳pH进行研究，则能够作为设定本实施方式的方法的实施条件时的参考。同样地，在与HPLC法组合时，也能够对于正反应和/或逆反应的核苷酸辅酶的特异性进行确认。本实施方式的方法中使用的激酶优选对于具有在正反应、逆反应中分别起最佳作用的各不相同的核苷部分的核苷酸辅酶具有4％以上、优选8％以上的特异性，但并不限定于此。
接着选择与这些激酶组合的正反应底物或其磷酸化物。关于正反应底物或其磷酸化物的选择，有时也可根据针对正反应底物或其磷酸化物的激酶的米氏常数Km进行选择。例如优选米氏常数Km尽可能小。具体地说，更优选Km值为100mmol/L以下、优选为50mmol/L以下，但并不限定于这些。
这些激酶的正反应底物和/或其磷酸化物为某种物质的水解物或氧化物的情况下，可以将这些衍生前体物作为测定对象。即，这些衍生前体物可以通过公知的化学处理转换为激酶的正反应底物和/或其磷酸化物。此外，若能够利用代谢谱等对转换为激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的代谢通路进行确认、反应的酶类容易获得时，则也可以将这些衍生前体物作为测定对象。
本实施方式的方法中的“核苷酸辅酶”是指作为激酶的辅酶起作用的核苷的磷酸化物。本实施方式的方法中使用的第一核苷酸辅酶和第二核苷酸辅酶是核苷部分彼此不同的核苷酸辅酶。对于本实施方式的方法中使用的核苷酸辅酶的核苷部分的种类没有特别限定，作为示例，可以举出腺苷、鸟苷、胸苷、尿苷、胞苷、黄苷、肌苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、脱氧尿苷、脱氧胞苷、脱氧黄苷以及脱氧肌苷等。另外，这些磷酸化物可以为1磷酸化物，可以为2磷酸化物，也可以为3磷酸化物。
作为核苷酸辅酶，例如可以举出核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。
关于作为核苷酸辅酶的核糖核苷酸的具体例，可以举出ATP、ADP、腺苷酸(AMP)、鸟苷3磷酸(GTP)、鸟苷2磷酸(GDP)、鸟苷酸(GMP)、5-甲基尿苷3磷酸(TTP)、5-甲基尿苷2磷酸(TDP)、5-甲基尿苷1磷酸(TMP)、尿苷3磷酸(UTP)、尿苷2磷酸(UDP)、尿苷1磷酸(UMP)、胞苷3磷酸(CTP)、胞苷2磷酸(CDP)、胞苷1磷酸(CMP)、黄苷3磷酸(XTP)、黄苷2磷酸(XDP)、黄苷1磷酸(XMP)、肌苷3磷酸(ITP)、肌苷2磷酸(IDP)以及肌苷1磷酸(IMP)等，但并不限定于这些。
另外，关于作为核苷酸辅酶的脱氧核糖核苷酸的具体例，可以举出脱氧腺苷3磷酸(dATP)、脱氧腺苷2磷酸(dADP)、脱氧腺苷1磷酸(dAMP)、脱氧鸟苷3磷酸(dGTP)、脱氧鸟苷2磷酸(dGDP)、脱氧鸟苷1磷酸(dGMP)、胸苷3磷酸(dTTP)、胸苷2磷酸(dTDP)、胸苷1磷酸(dTMP)、脱氧尿苷3磷酸(dUTP)、脱氧尿苷2磷酸(dUDP)、脱氧尿苷1磷酸(dUMP)、脱氧胞苷3磷酸(dCTP)、脱氧胞苷2磷酸(dCDP)、脱氧胞苷1磷酸(dCMP)、脱氧黄苷3磷酸(dXTP)、脱氧黄苷2磷酸(dXDP)、脱氧黄苷1磷酸(dXMP)、脱氧肌苷3磷酸(dITP)、脱氧肌苷2磷酸(dIDP)以及脱氧肌苷1磷酸(dIMP)等，但并不限定于这些。
优选的核苷酸辅酶例如为ATP、ADP、GTP、GDP、TTP、TDP、UTP、UDP、CTP、CDP、XTP、XDP、ITP、IDP、dATP、dADP、dGTP、dGDP、dTTP、dTDP、dUTP、dUDP、dCTP、dCDP、dXTP、dXDP、dITP以及dIDP等，但并不限定于这些。
根据情况可以在这些核苷酸酶上键合例如具有显色能力的取代基等。
对于在本实施方式的方法中使用的正反应中的第一核苷酸辅酶的核苷部分没有特别限定，作为示例，可以举出腺苷、鸟苷、胸苷、尿苷、胞苷、黄苷、肌苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、脱氧尿苷、脱氧胞苷、脱氧黄苷以及脱氧肌苷等。可以优选举出腺苷、肌苷、鸟苷以及脱氧腺苷等。可以进一步优选举出腺苷。另外，它们的磷酸化物可以为1磷酸化物，可以为2磷酸化物，也可以为3磷酸化物，优选为3磷酸化物。作为第一核苷酸辅酶的具体例，除了上述的具体例以外，可以进一步优选举出ATP、GTP、TTP、UTP、CTP、XTP、ITP、dATP、dGTP、dTTP、dUTP、dCTP、dXTP以及dITP等。
对于在本实施方式的方法中使用的逆反应中的第二核苷酸辅酶的核苷部分没有特别限定，作为示例，可以举出腺苷、鸟苷、胸苷、尿苷、胞苷、黄苷、肌苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、脱氧尿苷、脱氧胞苷、脱氧黄苷以及脱氧肌苷等。可以优选举出肌苷、鸟苷、腺苷以及脱氧鸟苷等。进一步优选为肌苷。另外，它们的磷酸化物可以为1磷酸化物，可以为2磷酸化物，也可以为3磷酸化物，优选为2磷酸化物。作为第二核苷酸辅酶的具体例，除了上述的具体例以外，可以进一步优选举出ADP、GDP、TDP、UDP、CDP、XDP、IDP、dADP、dGDP、dTDP、dUDP、dCDP、dXDP以及dIDP。
对于本实施方式的方法中使用的第一核苷酸辅酶和第二核苷酸辅酶的优选核苷部分没有特别限定，例如为腺苷、肌苷、鸟苷或脱氧腺苷等，并且彼此不同。例如，第一核苷酸辅酶的核苷部分与第二核苷酸辅酶的核苷部分的组合为：腺苷与肌苷、鸟苷与腺苷、脱氧腺苷与鸟苷、脱氧腺苷与脱氧鸟苷、脱氧腺苷与肌苷、或者肌苷与腺苷。进一步优选第一核苷酸辅酶的核苷部分为腺苷、第二核苷酸辅酶的核苷部分为肌苷。
在本实施方式的方法中，“基于正反应的第一核苷酸辅酶的转化物”是指，在激酶正反应中，磷酸由第一核苷酸辅酶转移到激酶的正反应底物之后的第一核苷酸辅酶的脱磷酸化物。另外，“基于逆反应的第二核苷酸辅酶的转化物”是指，在激酶逆反应中，磷酸由激酶的逆反应底物转移到第二核苷酸辅酶之后的第二核苷酸辅酶的磷酸化物。此处，所转移的磷酸的个数可以为1个，可以为2个，也可以为3个。优选为1个。
在本实施方式的方法的工序(1)中，在进行上述式(3)的循环反应时，例如按下述要点进行。
例如准备过量(具体地说为0.1mmol/L以上12mmol/L以下、更优选为0.2mmol/L至6mmol/L)的第一和第二核苷酸辅酶，向其中加入20mmol/L以上200mmol/L以下的pH缓冲剂用以维持反应中的pH，制成反应液。反应时的pH适当选择有效地进行反应的条件即可，通常调整在pH5.5以上pH8.5以下的中性附近，添加0.5mmol/L以上10mmol/L以下的作为激酶活化剂的氯化镁等金属盐。向其中加入上述激酶，将上述反应液预先加热到25℃以上42℃以下、更优选加热到37℃附近，添加与第一和第二核苷酸辅酶浓度相比为微量的正反应底物和/或其磷酸化物，即可开始反应。
下面对酶的添加量进行说明。在通常的酶循环反应中，其循环率依赖于酶量，已知酶针对底物的米氏常数(Km值)越小，越可利用少量的酶量得到更高的灵敏度。因此，作为所加入的酶量的基准，在每1mL反应液中添加正反应底物及其磷酸化物中Km值较大一方的Km值(mmol/L)的1倍以上、优选为2倍以上的酶单元(单位：u)，另外，作为其上限，添加实质上能够添加的量即可。Km值也可以利用公知的方法求出。需要说明的是，这些分量为一例，但并不限于这些。
下面举出肌酸激酶(CK)作为激酶的具体例进行说明，但激酶并不限定于此。CK是广泛存在于动物界的酶，在骨骼肌、心肌以及脑等中的含量丰富。以兔、牛、猪以及鸡等为起源的CK有市售品，关于核苷酸辅酶的特异性的信息可由文献获得。例如，有报告指出，在兔肌肉CK的情况下，在设ADP为100％时，IDP显示出29％的相对活性(J Biol Chem.,241,3116-3125,1966)。另外，使用例如ADP以外的核苷2磷酸，利用将肌酸磷酸作为底物的逆反应生成肌酸，使用肌酐酰胺水解酶(EC 3.5.3.3.)以及肌氨酸氧化酶(EC 1.5.3.1)由所生成的肌酸产生过氧化氢，通过对该过氧化氢进行定量，能够容易地确认CK对于ADP以外的核苷2磷酸的特异性。例如兔肌肉来源的CK对IDP的特异性高，因而在正反应中作为第一核苷酸辅酶可以选择ATP，在逆反应中作为第二核苷酸辅酶可以选择IDP。
为了实施本实施方式的方法的循环反应，可以研究两种核苷酸辅酶存在下的pH依赖性，适当选择有效地进行循环反应的pH。例如在为兔肌肉或人肌肉来源CK的情况下，有时均是pH6以上pH8以下的中性附近的缓冲液为最佳的。并且，可以使ADP和IDP过量(更具体地说为0.1mmol/L以上12mmol/L以下、优选为0.2mmol/L以上6mmol/L以下)存在，添加与ADP和IDP相比微量的肌酸或肌酸磷酸以及酶CK。关于酶的添加量，例如，在兔肌肉来源CK的情况下，该酶针对肌酸、肌酸磷酸的Km值据报告分别为16mmol/L、5mmol/L(J Biol Chem.210,p65,1954)。按照上文叙述的酶添加量基准，它们相当于16u/mL、32u/mL。从而可添加优选为32u/mL以上、作为上限为800u/mL的程度的酶，但并不限定于这些。
在本实施方式的方法的工序(2)中，可以对于信号的变化量进行检测，所述信号的变化量对应于第一核苷酸辅酶、基于正反应的第一核苷酸辅酶的转化物、第二核苷酸辅酶以及基于逆反应的第二核苷酸辅酶的转化物的变化量中的任一种。另外，信号的变化量可以为第一核苷酸辅酶或第二核苷酸辅酶的减少量，也可以为基于正反应的第一核苷酸辅酶的转化物或基于逆反应的第二核苷酸辅酶的转化物的增加量。优选为基于正反应的第一核苷酸辅酶的转化物或基于逆反应的第二核苷酸辅酶的转化物的增加量。对变化量进行检测的方法可以使用公知的HPLC法等。在使用HPLC法的情况下，可以在添加螯合剂等终止酶反应后，适当地选择反向柱等对基于正反应的第一核苷酸的转化物或基于逆反应的第二核苷酸辅酶的转化物进行定量。关于这些HPLC分析法的信息可以简单地由树脂制造商处获取。
另外，在本实施方式的方法的工序(2)中，可以使用能够利用基于正反应的第一核苷酸辅酶的转化物但不能利用第二核苷酸辅酶的检测用酶，对于针对正反应的第一核苷酸辅酶的转化物的增加量而变化的信号变化量进行检测。或者可以使用不能利用第一核苷酸辅酶但能够利用基于逆反应的第二核苷酸辅酶的转化物的检测用酶，对于针对基于逆反应的第二核苷酸辅酶的转化物的增加量而变化的信号变化量检测。
例如可以举出下述方法：使用腺苷2磷酸依赖性葡萄糖激酶(ADP依赖性葡萄糖激酶、EC 2.7.1.147)，在葡萄糖的存在下对于与ADP的增加量相对应的信号的变化量进行检测。对于强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)来源的ADP依赖性葡萄糖激酶来说，已知作为核苷酸辅酶除了利用ADP以外还可以利用CDP，而对于GDP、IDP仅有极小的作用。因此，在第一核苷酸辅酶使用ATP、第二核苷酸辅酶使用IDP或GDP来进行激酶循环反应时，若共存ADP依赖性葡萄糖激酶作为检测用酶，则能够特异性地仅检测出作为基于正反应的第一核苷酸辅酶的转化物的ADP。这种情况像下文所述那样得到了实际确认。
另外，有报告指出，大肠杆菌来源的甘油激酶仅利用ATP作为磷酸供体。因此，例如在将第一核苷酸辅酶使用ITP、GTP或CTP；第二核苷酸辅酶使用ADP的激酶用于本实施方式的方法的情况下，若使用大肠杆菌来源的甘油激酶作为检测用酶，则能够特异性地仅检测出ATP。作为特异性地仅检测出ATP的检测用酶，除了上述大肠杆菌来源的甘油激酶以外，还可以使用仅对ATP特异性的其他激酶，关于核苷酸辅酶的特异性，可以参考文献信息适宜地选择。另外，在属于酶编号E 6的合成酶中，有关于特异性地仅检测出ATP的酶的多篇报告，因而在检测反应中也可以使用这些酶作为检测用酶。例如，有报告指出，大肠杆菌来源的NAD合成酶(EC 6.3.1.5)不作用于ATP以外的核苷酸辅酶。如此，在本实施方式的方法的工序(2)中，可以留意本实施方式的方法中使用的激酶的第一核苷酸辅酶与第二核苷酸辅酶的组合，适当选择能够使用的检测用酶。但是，对辅酶的特异性不仅受到酶来源的影响，而且还可能受到辅酶或酶的添加量等条件的影响。因此，也会有与文献报告的结果不同的情况，在选择时实际确认特异性即可。
优选使用腺苷2磷酸依赖性葡萄糖激酶(EC 2.7.1.147)作为检测用酶。在使用ADP依赖性葡萄糖激酶的情况下，可以利用已知的方法对作为生成物的AMP或葡萄糖6磷酸进行定量。关于葡萄糖-6-磷酸，根据情况，有时在硫代NADP、硫代NAD、NADP以及NAD中的任一种辅酶；和葡萄糖及葡萄糖6磷酸脱氢酶的存在下对于与ADP的增加量相对应地变化的信号变化量进行检测。例如，关于葡萄糖6磷酸，可以在NAD(P)的存在下使用葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PDH)，以基于还原型NAD(P)的在340nm的吸光度变化量的形式进行测定。另外，也可以不使用NAD(P)而使用硫代NAD(P)等辅酶类似物。
在进行还原型NAD(P)的测定时，例如也可以在硝基四唑蓝(Nitro-NB)、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑钠盐(WST-1)以及2-(4-碘苯基)-3-(2,4-二硝基苯基)-5-二磺基苯基)-2H-四唑钠盐(WST-3)等氢受体的存在下，通过使用作为电子载体的1-甲氧基PMS或者利用黄递酶以甲臜色素的形式进行可视部吸光度的测定来进行定量。这些化合物能够容易地购得。另外，还可以与荧光试剂或发光试剂组合来进行检测。或者也可以利用使用G6PDH的酶循环法高灵敏度地对葡萄糖6磷酸进行定量(例如，参见专利文献7)。对这些变化的信号的变化量进行检测的工序可以与本实施方式的方法中的循环反应同时实施、或者也可以分别实施。同样地，在使用大肠杆菌来源的甘油激酶时，也可以利用已知的方法对作为生成物的甘油-3-磷酸进行定量。
需要说明的是，本实施方式的方法可以利用一种激酶来实施，但是循环反应也可以使用起源不同的、催化同一反应的两种以上的酶来实施。
在本实施方式的方法中，作为对于激酶的正反应底物和/或其磷酸化物或用于衍生为前述物质的衍生前体物在试样中的量进行计算的方法，可以使用公知的方法。例如，在酶循环反应中，基于正反应的第一核苷酸辅酶的转化物和基于逆反应的第二核苷酸辅酶的转化物具有随时间成比例增加的倾向。计算试样中的被检物质的量时，可以规定酶循环反应的反应时间(例如从反应开始后第5分钟到第7分钟等)，对照浓度已知的作为基准的物质(校准品)，通过对与校准品的转化物相对应的信号的变化量进行测定，来计算出试样中的被检物质的量。校准品可以使用激酶的正反应底物或其磷酸化物。
在具有将衍生前体物导向激酶的正反应底物和/或正反应底物的磷酸化物的一个或两个以上的工序的情况下，可以在实施将衍生前体物导向激酶的正反应底物和/或正反应底物的磷酸化物的工序之后实施酶循环反应。另外，在将衍生前体物导向激酶的正反应底物和/或正反应底物的磷酸化物的工序为酶反应的情况下，若过量加入催化衍生反应的酶，则能够在短时间内导向激酶的正反应底物和/或正反应底物的磷酸化物，因而也可以预先含有激酶来实施本实施方式的方法的循环反应。在这种情况下，可以将衍生反应终止后的一定时间规定为反应时间。
在试样中混存有正反应底物和其磷酸化物的情况下，在想要对正反应底物或磷酸化物中的仅任一方进行定量时，可以在酶循环反应之前使用公知的方法进行将非测定对象物转换为另外物质之类的处理。
另外，本实施方式涉及一种组合物，其是用于对激酶的正反应底物、其磷酸化物以及用于衍生为前述物质的衍生前体物中的至少一种进行测定的测定用组合物，该组合物具备下述(a)、(b)和(c)：
(a)激酶，所述激酶在核苷酸辅酶的存在下催化由该激酶的正反应底物生成其磷酸化物的正反应及其逆反应，在正反应和逆反应中利用至少具有各不相同的核苷部分的核苷酸辅酶，
(b)正反应中的第一核苷酸辅酶，
(c)与第一核苷酸辅酶的核苷部分不同的、逆反应中的第二核苷酸辅酶，
其中，在测定对象为衍生前体物的情况下，该组合物在进行了使衍生前体物定量地衍生为激酶正反应底物和/或其磷酸化物的处理后使用。
关于本实施方式的组合物的激酶，如上所述，只要具有在核苷酸辅酶的存在下能够催化由激酶的正反应底物生成其磷酸化物的正反应及其逆反应、在该正反应和逆反应中能够利用至少具有各不相同的核苷部分的核苷酸辅酶的性质，就没有特别限定。
本实施方式的组合物的测定对象为激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的情况下，作为测定对象以及激酶各自的组合，可以示例出下述组合，但并不限定于这些。需要说明的是，在以下的例示中，按照测定对象：激酶的顺序来记载。另外，其磷酸化物是指与所记载的激酶的正反应底物相对应的磷酸化物。
肌酸和/或其磷酸化物：肌酸激酶
3-磷酸甘油酸和/或其磷酸化物：3-磷酸甘油酸激酶
丙酮酸和/或其磷酸化物：丙酮酸激酶
果糖-6-磷酸和/或其磷酸化物：磷酸果糖-1-激酶
甘油和/或其磷酸化物：甘油激酶
己糖和/或其磷酸化物：己糖激酶
葡萄糖和/或其磷酸化物：ADP依赖性葡萄糖激酶
可以优选举出包含由EC编号限定的下述激酶的下述组合，但并不限定于这些。
肌酸和/或其磷酸化物：肌酸激酶(EC 2.7.3.2)
3-磷酸甘油酸和/或其磷酸化物：3-磷酸甘油酸激酶(EC 2.7.2.3)
丙酮酸和/或其磷酸化物：丙酮酸激酶(EC 2.7.1.40)
果糖-6-磷酸和/或其磷酸化物：磷酸果糖-1-激酶(EC 2.7.1.11)
甘油和/或其磷酸化物：甘油激酶(EC 2.7.1.30)
己糖和/或其磷酸化物：己糖激酶(EC 2.7.1.1)
葡萄糖和/或其磷酸化物：ADP依赖性葡萄糖激酶(EC 2.7.1.147)
测定对象为衍生前体物的情况下，作为测定对象、激酶以及激酶的正反应底物和/或其磷酸化物各自的组合，可以示例出下述组合，但并不限定于这些。需要说明的是，在以下的例示中，按照测定对象：激酶：激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的顺序来记载。
肌酐：肌酸激酶：肌酸和/或其磷酸化物
甘油醛-3-磷酸、羟基丙酮磷酸、甘油-3-磷酸、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰胆碱、果糖-1,6-双磷酸、2-磷酸甘油酸、磷酸烯醇式丙酮酸或2,3-双磷酸甘油酸：3-磷酸甘油酸激酶：3-磷酸甘油酸和/或其磷酸化物
葡萄糖-6-磷酸：磷酸果糖-1-激酶：磷酸果糖-6-磷酸和/或其磷酸化物
二羟基丙酮磷酸、甘油三脂、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酸、甘油-3-磷酸、溶血磷脂酰甘油或磷脂酰甘油：甘油激酶：甘油和/或其磷酸化物
葡萄糖-1-磷酸：ADP依赖性葡萄糖激酶：葡萄糖和/或其磷酸化物
可以优选举出包含由EC编号限定的激酶的下述组合，但并不限定于这些。
肌酐：肌酸激酶(EC 2.7.3.2)：肌酸和/或其磷酸化物
甘油醛-3-磷酸、羟基丙酮磷酸、甘油-3-磷酸、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰胆碱、果糖-1,6-双磷酸、2-磷酸甘油酸、磷酸烯醇式丙酮酸或2,3-双磷酸甘油酸：3-磷酸甘油酸激酶(EC 2.7.2.3)：3-磷酸甘油酸和/或其磷酸化物
葡萄糖-6-磷酸：磷酸果糖-1-激酶(EC 2.7.1.11)：磷酸果糖-6-磷酸/其磷酸化物
二羟基丙酮磷酸、甘油三脂、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酸、甘油-3-磷酸、溶血磷脂酰甘油或磷脂酰甘油：甘油激酶(EC 2.7.1.30)：甘油和/或其磷酸化物
葡萄糖-1-磷酸：ADP依赖性葡萄糖激酶(EC 2.7.1.147)：葡萄糖和/或其磷酸化物
作为测定对象、激酶以及激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的进一步优选的组合，可以举出下述示例。
肌酐：肌酸激酶：肌酸和/或其磷酸化物
在本实施方式的组合物中，在测定对象为激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的情况下，测定对象以及激酶各自的组合可以利用与涉及本实施方式的方法的上述说明相同的方法来确定。另外，在测定对象为衍生前体物的情况下，测定对象、激酶以及激酶的正反应底物和/或其磷酸化物各自的组合也可以利用与涉及本实施方式的方法的上述说明相同的方法来确定。
第一核苷酸辅酶和第二核苷酸辅酶是核苷部分不同的核苷酸辅酶。对核苷部分的种类没有特别限定，作为示例，可以举出腺苷、鸟苷、胸苷、尿苷、胞苷、黄苷、肌苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、脱氧尿苷、脱氧胞苷、脱氧黄苷以及脱氧肌苷等。另外，它们的磷酸化物可以为1磷酸化物，可以为2磷酸化物，也可以为3磷酸化物。
作为核苷酸辅酶的具体例，可以举出ATP、ADP、AMP、GTP、GDP、GMP、TTP、TDP、TMP、UTP、UDP、UMP、CTP、CDP、CMP、XTP、XDP、XMP、ITP、IDP、IMP、dATP、dADP、dAMP、dGTP、dGDP、dGMP、dTTP、dTDP、dTMP、dUTP、dUDP、dUMP、dCTP、dCDP、dCMP、dXTP、dXDP、dXMP、dITP、dIDP以及dIMP等，但并不限定于此。优选ATP、ADP、GTP、GDP、TTP、TDP、UTP、UDP、CTP、CDP、XTP、XDP、ITP、IDP、dATP、dADP、dGTP、dGDP、dTTP、dTDP、dUTP、dUDP、dCTP、dCDP、dXTP、dXDP、dITP以及dIDP等。根据情况可以在这些核苷酸酶上键合例如具有显色能力的取代基等。
作为在本实施方式的组合物中使用的正反应中的第一核苷酸辅酶的核苷部分没有特别限定，作为示例，可以举出腺苷、鸟苷、胸苷、尿苷、胞苷、黄苷、肌苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、脱氧尿苷、脱氧胞苷、脱氧黄苷以及脱氧肌苷等。可以优选举出腺苷、肌苷、鸟苷、脱氧腺苷以及脱氧腺苷等。可以更优选举出腺苷。另外，这些磷酸化物可以为1磷酸化物，可以为2磷酸化物，也可以为3磷酸化物，优选为3磷酸化物。作为第一核苷酸辅酶的具体例，除了上述的具体例以外，可以进一步优选举出ATP、GTP、TTP、UTP、CTP、XTP、ITP、dATP、dGTP、dTTP、dUTP、dCTP、dXTP以及dITP等。
对于在本实施方式的组合物中使用的逆反应中的第二核苷酸辅酶的核苷部分没有特别限定，作为示例，可以举出腺苷、鸟苷、胸苷、尿苷、胞苷、黄苷、肌苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、脱氧尿苷、脱氧胞苷、脱氧黄苷以及脱氧肌苷等。可以优选举出肌苷、鸟苷、腺苷以及脱氧鸟苷等。进一步优选为肌苷。另外，它们的磷酸化物可以为1磷酸化物，可以为2磷酸化物，也可以为3磷酸化物，优选为2磷酸化物。作为第二核苷酸辅酶的具体例，除了上述的具体例以外，可以进一步优选举出ADP、GDP、TDP、UDP、CDP、XDP、IDP、dADP、dGDP、dTDP、dUDP、dCDP、dXDP以及dIDP。
在本实施方式的上述组合物中，作为第一核苷酸辅酶与第二核苷酸辅酶的核苷部分的组合，只要相互不同就没有特别限定，例如为腺苷与肌苷、鸟苷与腺苷、脱氧腺苷与鸟苷、脱氧腺苷与脱氧鸟苷、脱氧腺苷与肌苷、或肌苷与腺苷。优选第一核苷酸辅酶的核苷部分为腺苷、第二核苷酸辅酶的核苷部分为肌苷。
使用本实施方式的组合物例如能够实施本实施方式的方法，能够利用循环法使上述式(3)的反应进行反应。
若使用本实施方式的组合物，则能够对于信号的变化量进行检测，所述信号的变化量对应于第一核苷酸辅酶、基于正反应的第一核苷酸辅酶的转化物、第二核苷酸辅酶以及基于逆反应的第二核苷酸辅酶的转化物中的任一种的变化量。另外，信号的变化量可以为第一核苷酸辅酶或第二核苷酸辅酶的减少量，也可以为基于正反应的第一核苷酸辅酶的转化物或基于逆反应的第二核苷酸辅酶的转化物的增加量。优选的是，信号的变化量为基于正反应的第一核苷酸辅酶的转化物或基于逆反应的第二核苷酸辅酶的转化物的增加量。对变化量进行检测的方法可以使用公知的HPLC法等。在使用HPLC法的情况下，与本实施方式的方法的说明相同。
若使用本实施方式的组合物，则能够计算出试样中含有的激酶的正反应底物和/或其磷酸化物或者用于衍生为前述物质的衍生前体物的量。计算方法与本实施方式的方法的说明相同，可以使用公知的方法。
本实施方式的组合物可以任意包含能够利用基于正反应的第一核苷酸辅酶的转化物但不能利用第二核苷酸辅酶的检测用酶、或者不能利用第一核苷酸辅酶但能够利用基于逆反应的第二核苷酸辅酶的转化物的检测用酶。作为检测用酶的示例，可以举出腺苷2磷酸依赖性葡萄糖激酶(EC 2.7.1.147)等，但并不限定于此。进而，除了这些以外，有时还在本实施方式的组合物中添加硫代NADP、硫代NAD、NADP或NAD中的任一种辅酶；和葡萄糖以及葡萄糖6磷酸脱氢酶。若使用这些，则能够对于与基于正反应的第一核苷酸辅酶的转化物、基于逆反应的第二核苷酸辅酶的转化物的增加量相对应的任一种信号的变化量进行检测、测定。具体内容与本实施方式的方法的上述说明相同。
本实施方式的组合物可以制成被分成为多个的试剂盒。例如，可以将包含第二核苷酸辅酶的组合物适当地分配在被分成二个或三个以上的试剂盒中。这种情况下，进一步地，可以将包含下述检测用酶的组合物适当地分配在上述的二个或三个以上的试剂盒中，所述检测用酶是能够利用例如硫代NADP、硫代NAD、NADP或NAD以及葡萄糖和基于正反应的第一核苷酸辅酶的转化物但不能利用第二核苷酸辅酶的检测用酶；或者是不能利用第一核苷酸辅酶但能够利用基于逆反应的第二核苷酸辅酶的转化物的检测用酶。这些成分均可以重复包含在被各自分开的试剂盒中。
在优选使用CK的情况下，可以将包含ATP、CK以及IDP的组合物适当地分成二个试剂盒。进而，可以将NADP、ADP依赖性葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶适当地分配在二个试剂盒中。这些成分均可以重复包含在被各自分开的试剂盒中。
下面通过实施例进一步具体地说明本发明，但本发明并不受以下示例的限定。
(ADP-HK的核苷酸特异性的确认)
关于强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)来源的ADP依赖性己糖激酶(ADP-HKPII(T-92)旭化成制药株式会社)，已经确认到，作为核苷-2-磷酸，除了ADP以外，IDP、GDP无法作为磷酸供体。即，使由ADP-HKPII反应生成的葡萄糖在NADP的存在下与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH：东洋纺)共存，在37℃以基于还原型NADP的340nm的吸光度变化的形式进行测定。
制备下述组成的反应液。
关于试剂空白，不加入核苷-2-磷酸而加入生理盐水制成试剂。
首先，在反应液中按照1.25u/mL添加ADP-HKPII，结果每1分钟的吸光度变化在ADP、IDP、GDP中分别为110.4、-0.2、-0.1(均为吸光度×1000)，在IDP和GDP中几乎未确认到吸光度的变化量。接着，按照80倍量、即在反应液中达到100u/mL的方式添加酶。在ADP的情况下，吸光度瞬时超过3000(吸光度×1000)；与此相对，IDP、GDP在9分钟的吸光度的变化量分别为4.8、0.7(吸光度×1000)，确认到ADP-HKII实质上未将IDP和GTP作为磷酸供体。
(实施例1在ATP、IDP共存下是否进行可逆反应的确认)
如上所述，已经确认到了ADP-HKPII实质上未将IDP作为供氢体，因而作为第一核苷酸辅酶的核苷-3-磷酸选择ATP、作为第二核苷酸辅酶的核苷-2-磷酸选择IDP，研究在两者的存在下CK反应是否进行。
制备下述组成的反应液。
将1mL上述反应液加热到37℃。按照反应液中的浓度为0.05mmol/L加入肌酸磷酸后，按照10u/mL添加CK(兔肌肉来源、东方酵母公司制造)，观察在37℃是否产生340nm的吸光度变化。其结果确认到，基于还原型NAD生成的吸光度随着时间而增加。该情况表示，利用CK可连续地进行下述两反应。
肌酸磷酸+IDP→肌酸+ITP
肌酸+ATP→肌酸+ADP
(实施例2肌酸的定量)
制备下述组成的反应液。
在1mL上述反应液中，按照100u/mL添加CK(旭化成制药株式会社制造，HC-CKII，商品目录No.T-74)。在37℃进行预加热，添加0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、1.2mmol/L的肌酸溶液0.05mL，结果340nm的吸光度随时间成比例地增加。于是记录了在340nm从第3分钟到第5分钟的吸光度变化量。将结果示于图1。由图1可知，吸光度变化量与试样中的肌酸浓度成比例。
(实施例3兔辅酶组合)
制备下述组成的反应液。
在上述反应液中，作为核苷-3-磷酸(1mmol/L)与核苷-2-磷酸(4mmol/L)的组合，选择dATP/IDP、dATP/GDP、dATP/dGDP，对于各组合，求出添加0.1mmol/L肌酸0.05mL的情况下的吸光度增加量、与不添加肌酸而添加纯净水的情况下的吸光度增加量之差。尽管5分钟的吸光度变化量(吸光度×103)分别观察到了34.6(dATP/IDP)、11.2(dATP/GDP)、8.7(dATP/dGDP)这种程度的差异，但在任一组合中均确认到了反应的进行。
(实施例4肌酸的测定)
制备下述组成的反应液。
在1mL上述反应液中，加入0mmol/L、0.01mmol/L、0.02mmol/L、0.03mmol/L、0.05mmol/L的肌酸水溶液0.05mL，于37℃监测340nm的吸光度变化。作为比较例，使用由上述反应液中除去了IDP的反应液，实施同样的测定。对于本实施例测定5分钟的吸光度变化量，对于比较例测定反应开始10分钟后的吸光度，分别从试剂空白中减去。将两者的结果示于图2。在本实施例中，与比较例相比，吸光度变化量提高约10倍。
(实施例5肌酐的定量)
制备下述组成的反应液1。
另外，制备下述组成的反应液2。
在0.75mL的反应液1中分别添加0.01mmol/L、0.02mmol/L、0.03mmol/L、0.05mmol/L肌酐溶液0.05mL，在37℃加热5分钟。其后加入0.25mL的反应液2，监测400nm的吸光度。测定从反应液2添加后的第2分钟到第7分钟的吸光度变化量。其结果，如图3所示，吸光度变化量与肌酐浓度相应地定量增加。
(实施例6 3-磷酸甘油酸的定量)
制备下述组成的反应液。
20u/mL 3-磷酸甘油酸激酶(PGK)(Sigma公司制造：酵母来源)
在1mL上述反应液中，加入0mmol/L、0.0025mmol/L、0.005mmol/L、0.0125mmol/L、0.025mmol/L、0.05mmol/L的3-磷酸甘油酸水溶液0.02mL，在37℃添加3-磷酸甘油酸后，测定从第1分钟到第6分钟的340nm的吸光度变化量。将结果示于图4。作为比较对象，在从反应液中除去了IDP的通常的测定体系的情况下，利用50μmol/L的3-磷酸甘油酸水溶液的吸光度为0.006。若考虑还原型NAD的分子吸光系数，则本实施例中的吸光度变化量是与通常的测定体系相比约为50倍的0.3。
(实施例7基于磷酸果糖-1-激酶(PFK)的果糖-6-磷酸的定量)
制备下述组成的反应液。
在1mL上述反应液中，加入0mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L的果糖-6-磷酸溶液0.02mL，在37℃预加热。对于各反应液，按照30u/mL加入磷酸果糖-1-激酶(旭化成制药株式会社，T-142：嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)来源)，在37℃开始反应。添加磷酸果糖-1-激酶后，测定从第1分钟到第6分钟的340nm的吸光度变化量。将结果示于图5。如图5所示，吸光度变化量与果糖-6-磷酸的浓度相应地定量增加。
(实施例8基于GK的甘油的定量)
制备下述组成的反应液。作为甘油激酶，使用如下微生物来源的酶。
将1mL上述反应液预加热后，加入0mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L的甘油溶液0.02mL，在37℃开始反应。添加甘油溶液后，测定从第1分钟到第6分钟的340nm的吸光度变化量。接着，将ATP置换为脱氧ATP，实施同样的测定。将它们的结果示于图6。相比于ATP与IDP的组合，dATP与IDP的组合得到了约3倍的灵敏度。
(实施例9PK IDP添加的效果)
使用兔肌肉来源的丙酮酸激酶，制备下述组成的反应液。
在1mL的上述反应液中按照0.5mmol/L加入丙酮酸，于37℃监测340nm的吸光度。对于1mmol/L的丙酮酸也实施同样的操作。340nm的吸光度达到反应平衡，显示出恒定值。接着，向该反应液中进一步加入1mmol/L的IDP，结果吸光度直线增加。添加IDP后，测定从第1分钟到第11分钟的吸光度变化量，将结果示于图7。如图7所示，确认到了定量性。由该情况确认到产生了丙酮酸激酶(PK)藉由ATP和IDP的可逆反应。
(实施例10 3-磷酸甘油酸的定量(基于大肠杆菌GK的检测反应))
制备下述组成的反应液。
在1mL上述反应液中，加入0mmol/L、0.02mmol/L的3-磷酸甘油酸水溶液0.005mL、0.01mL、0.015mL，在37℃进行反应。添加3-磷酸甘油酸后，测定从第3分钟到第5分钟的基于TOOS与4-氨基安替吡啉的氧化缩合色素的555nm吸光度变化量。在实施例6中，核苷酸辅酶使用ATP和IDP，但此处选择GTP与ADP的组合。并且，使用大肠杆菌来源的GK对所生成的ATP进行定量。将不添加3-磷酸甘油酸水溶液的反应液作为试剂空白，在各吸光度变化量中减去该空白，将所得到的结果示于图8。如图8所示，吸光度变化量与3-磷酸甘油酸的浓度相应地定量增加。
(实施例11基于己糖激酶的葡萄糖6磷酸定量)
制备下述组成的反应液。
测定原理为：在ADP、GTP的共存下，使用大肠杆菌来源的甘油激酶，对于由HKIII反应生成的ATP进行特异性定量。在1mL上述反应液中，按照反应液中的浓度为1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L、5μmol/L加入葡萄糖-6-磷酸溶液并进行预加热。接下来，按照反应液中的浓度为1mmol/L加入GTP水溶液，在37度开始反应。添加GTP溶液后，测定从第3分钟到第8分钟的555nm吸光度变化量。将减去试剂空白得到的各吸光度变化量的结果示于图9。如图9所示，吸光度变化量与葡萄糖-6-磷酸的浓度相应地定量增加。
(实施例12ADP依赖性葡萄糖激酶的逆反应)
制备下述组成的反应液。
作为ADP依赖性葡萄糖激酶使用ADP-HKPII(旭化成制药株式会社：T-92)，作为2种核苷酸辅酶选择CDP和AMP。在由本实施例生成的ADP的检测中，首先利用CK将ADP转换为ATP后，将其利用NAD合成酶转换为NAD，最终在340nm检测基于12α-HSDII的还原型NAD的生成速度。将1mL反应液分注到石英池中，在37℃加热后，分别添加0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、1mmol/L的葡萄糖-6-磷酸溶液0.01mL。在添加了各浓度的葡萄糖-6-磷酸的石英池中分别添加20u的ADP-HKPII，测定340nm的吸光度变化量。读取添加酶后第5分钟到第7分钟的吸光度变化量，将葡萄糖-6-磷酸溶液为零的反应液作为空白减去，相对于葡萄糖-6-磷酸溶液的浓度作图。将结果示于图10。如图10所示，吸光度变化量与葡萄糖-6-磷酸的浓度相应地定量增加。
(实施例13基于PK的磷酸烯醇式丙酮酸的定量)
制备下述组成的反应液。
在1mL上述反应液中，加入0mmol/L、0.02mmol/L、0.04mmol/L、0.08mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L的磷酸烯醇式丙酮酸钾水溶液0.02mL，在37℃预加热。其后向各反应液中加入10mmol/L IDP溶液0.05mL，开始反应。添加IDP后，测定从第3分钟到第8分钟的340nm吸光度变化量。结果如图11所示，吸光度变化量与磷酸烯醇式丙酮酸浓度成比例地定量增加。
(实施例14肌酐的定量)
利用常规方法获取编码小鼠B型同工酶的DNA。在CK(旭化成制药株式会社制造，商品目录No.T-74)生产中使用的宿主-载体系统中插入该基因进行克隆化，按照常规方法获取CK-B(人来源B型同工酶)。
另外，制备下述组成的反应液1。
进一步制备下述组成的反应液2。
将基于肌酐酰胺水解酶的由肌酐向肌酸转换的反应与CK循环反应同时实施。在0.75mL的反应液1中加入0.04mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L的肌酐水溶液0.05mL，在37℃预加热3分钟。接下来加入0.25mL的反应液2，开始反应。对于添加反应液2后第3分钟到第4分钟的400nm吸光度变化量进行测定。结果如图12所示，吸光度变化量与肌酐浓度相应地定量增加。

Claims (32)

1.一种测定方法，其是对激酶的正反应底物、其磷酸化物以及用于衍生为前述物质的衍生前体物中的至少一种进行测定的测定方法，该方法包括下述工序：
(1)使激酶、所述激酶的第一核苷酸辅酶和与所述第一核苷酸辅酶的核苷部分不同的第二核苷酸辅酶与试样接触，使下式(1)的循环反应进行反应的工序，所述激酶在核苷酸辅酶的存在下催化由激酶的正反应底物生成其磷酸化物的正反应及其逆反应，且在所述正反应和所述逆反应中利用至少具有各不相同的核苷部分的核苷酸辅酶；在测定对象为衍生前体物的情况下，所述试样为进行了使所述衍生前体物定量地衍生为所述激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的处理而得到的试样；
[化1]
(2)对信号的变化量进行检测的工序，所述信号的变化量对应于所述第一核苷酸辅酶、所述第一核苷酸辅酶的转化物、所述第二核苷酸辅酶以及所述第二核苷酸辅酶的转化物中的至少任一种的变化量；以及
(3)基于所述检测出的信号的变化量，计算出所述试样所含有的激酶的正反应底物、其磷酸化物以及用于衍生为前述物质的衍生前体物中的至少一种的量的工序。
2.如权利要求1所述的测定方法，其中，测定对象为所述激酶的正反应底物和/或其磷酸化物。
3.如权利要求1或2所述的测定方法，其中，测定对象为所述激酶的正反应底物和/或其磷酸化物，所述测定对象与所述激酶的组合为表1中记载的任一种组合。
[表1]
测定对象 激酶 肌酸和/或其磷酸化物 肌酸激酶 3-磷酸甘油酸和/或其磷酸化物 3-磷酸甘油酸激酶 丙酮酸和/或其磷酸化物 丙酮酸激酶 果糖-6-磷酸和/或其磷酸化物 磷酸果糖-1-激酶 甘油和/或其磷酸化物 甘油激酶 己糖和/或其磷酸化物 己糖激酶 葡萄糖和/或其磷酸化物 ADP依赖性葡萄糖激酶
4.如权利要求1所述的测定方法，其中，
测定对象为所述衍生前体物，所述试样为进行了使所述衍生前体物定量地衍生为所述激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的处理而得到的试样，
基于所述检测出的信号的变化量，计算出所述衍生前体物的量。
5.如权利要求1或4所述的测定方法，其中，
测定对象为所述衍生前体物，所述测定对象、所述激酶以及所述激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的组合为表2中记载的任一种组合。
[表2]
6.如权利要求1、4和5中任一项所述的测定方法，其中，测定对象是作为所述衍生前体物的肌酐，所述激酶为肌酸激酶，所述激酶的正反应底物为肌酸。
7.如权利要求1以及4至6中任一项所述的测定方法，其中，在使所述衍生前体物定量地衍生为所述激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的处理中，包括以下步骤：在水的存在下使肌酐酰氨基水解酶(EC3.5.2.10)与肌酐接触。
8.如权利要求1至7中任一项所述的测定方法，其中，所述第一核苷酸辅酶的核苷部分为腺苷、鸟苷、胸苷、尿苷、胞苷、黄苷黄苷、肌苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、脱氧尿苷、脱氧胞苷、脱氧黄苷以及脱氧肌苷中的任一种。
9.如权利要求1至7中任一项所述的测定方法，其中，所述第二核苷酸辅酶的核苷部分为腺苷、鸟苷、胸苷、尿苷、胞苷、黄苷、肌苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、脱氧尿苷、脱氧胞苷、脱氧黄苷和脱氧肌苷中的任一种。
10.如权利要求1至9中任一项所述的测定方法，其中，所述第一核苷酸辅酶的核苷部分与所述第二核苷酸辅酶的核苷部分的组合为：腺苷与肌苷、鸟苷与腺苷、脱氧腺苷与鸟苷、脱氧腺苷与脱氧鸟苷、脱氧腺苷与肌苷、或肌苷与腺苷。
11.如权利要求1至10中任一项所述的测定方法，其中，所述第一核苷酸辅酶的核苷部分为腺苷，所述第二核苷酸辅酶的核苷部分为肌苷。
12.如权利要求1至权利要求11中任一项所述的测定方法，其中，所述第一核苷酸辅酶为腺苷3磷酸(ATP)，所述第二核苷酸辅酶为肌苷2磷酸(IDP)。
13.如权利要求1至12中任一项所述的测定方法，其中，在所述对信号的变化量进行检测的工序中，使用能够利用基于正反应的所述第一核苷酸辅酶的转化物但不能利用所述第二核苷酸辅酶的检测用酶、或者不能利用所述第一核苷酸辅酶但能够利用基于逆反应的所述第二核苷酸辅酶的转化物的检测用酶，对于与所述基于正反应的第一核苷酸辅酶的转化物或者所述基于逆反应的第二核苷酸辅酶的转化物的增加量相对应的所述信号的变化量进行检测。
14.如权利要求1至13中任一项所述的测定方法，其中，在所述对信号的变化量进行检测的工序中，使用腺苷2磷酸(ADP)依赖性葡萄糖激酶(EC 2.7.1.147)，在葡萄糖的存在下对于与腺苷2磷酸(ADP)的增加量相对应地变化的信号的变化量进行检测。
15.如权利要求1至14中任一项所述的测定方法，其中，在所述对信号的变化量进行检测的工序中，使用腺苷2磷酸(ADP)依赖性葡萄糖激酶(EC 2.7.1.147)，在硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(硫代NADP)、硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(硫代NAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)中的任一种辅酶以及葡萄糖和葡萄糖6磷酸脱氢酶的存在下，对于与腺苷2磷酸(ADP)的增加量相对应地变化的信号的变化量进行检测。
16.一种组合物，其是用于对激酶的正反应底物、其磷酸化物以及用于衍生为前述物质的衍生前体物中的至少一种进行测定的测定用组合物，在测定对象为衍生前体物的情况下，该组合物在进行了使所述衍生前体物定量地衍生为所述激酶正反应底物和/或其磷酸化物的处理后使用，并且
该组合物具备下述(a)、(b)和(c)：
(a)激酶，所述激酶在核苷酸辅酶的存在下催化由该激酶的正反应底物生成其磷酸化物的正反应及其逆反应，在所述正反应和所述逆反应中利用至少具有各不相同的核苷部分的核苷酸辅酶，
(b)所述正反应中的第一核苷酸辅酶，
(c)与所述第一核苷酸辅酶的核苷部分不同的、所述逆反应中的第二核苷酸辅酶。
17.如权利要求16所述的组合物，其中，测定对象为所述激酶的正反应底物和/或其磷酸化物。
18.如权利要求16或17所述的组合物，其中，测定对象为所述激酶的正反应底物和/或其磷酸化物，所述测定对象与所述激酶的组合为表3中记载的任一种组合。
[表3]
测定对象 激酶 肌酸和/或其磷酸化物 肌酸激酶 3-磷酸甘油酸和/或其磷酸化物 3-磷酸甘油酸激酶 丙酮酸和/或其磷酸化物 丙酮酸激酶 果糖-6-磷酸和/或其磷酸化物 磷酸果糖-1-激酶 甘油和/或其磷酸化物 甘油激酶 己糖和/或其磷酸化物 己糖激酶 葡萄糖和/或其磷酸化物 ADP依赖性葡萄糖激酶
19.如权利要求16所述的组合物，其中，测定对象为衍生前体物，该组合物在进行了使该衍生前体物定量地衍生为所述激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的处理后使用。
20.如权利要求16或19所述的组合物，其中，测定对象为所述衍生前体物，所述测定对象、所述激酶以及所述激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的组合为表4中记载的任一种组合。
[表4]
21.如权利要求16、19和20中任一项所述的组合物，其中，测定对象是作为所述衍生前体物的肌酐，所述激酶为肌酸激酶，所述激酶的正反应底物为肌酸。
22.如权利要求16以及19至21中任一项所述的组合物，其中，在使所述衍生前体物定量地衍生为所述激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的处理中，在水的存在下使肌酐酰氨基水解酶(EC3.5.2.10)与肌酐接触而衍生出肌酸。
23.如权利要求16至22中任一项所述的组合物，其中，所述第一核苷酸辅酶的核苷部分为腺苷、鸟苷、胸苷、尿苷、胞苷、黄苷、肌苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、脱氧尿苷、脱氧胞苷、脱氧黄苷以及脱氧肌苷中的任一种。
24.如权利要求16至22中任一项所述的组合物，其中，所述第二核苷酸辅酶的核苷部分为腺苷、鸟苷、胸苷、尿苷、胞苷、黄苷、肌苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、脱氧尿苷、脱氧胞苷、脱氧黄苷以及脱氧肌苷中的任一种。
25.如权利要求16至24中任一项所述的组合物，其中，所述第一核苷酸辅酶的核苷部分与所述第二核苷酸辅酶的核苷部分的组合为：腺苷与肌苷、鸟苷与腺苷、脱氧腺苷与鸟苷、脱氧腺苷与脱氧鸟苷、脱氧腺苷与肌苷、或肌苷与腺苷。
26.如权利要求16至25中任一项所述的组合物，其中，所述第一核苷酸辅酶的核苷部分为腺苷，所述第二核苷酸辅酶的核苷部分为肌苷。
27.如权利要求16至26中任一项所述的组合物，其中，所述第一核苷酸辅酶为腺苷3磷酸(ATP)，所述第二核苷酸辅酶为肌苷2磷酸(IDP)。
28.如权利要求16至27中任一项所述的组合物，其中，该组合物进一步包含能够利用基于正反应的所述第一核苷酸辅酶的转化物但不能利用所述第二核苷酸辅酶的检测用酶、或者不能利用所述第一核苷酸辅酶但能够利用基于逆反应的所述第二核苷酸辅酶的转化物的检测用酶。
29.如权利要求28所述的组合物，其中，所述检测用酶为腺苷2磷酸(ADP)依赖性葡萄糖激酶(EC 2.7.1.147)，该组合物进一步包含葡萄糖。
30.如权利要求28所述的组合物，其中，该组合物进一步包含：
硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(硫代NADP)、硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(硫代NAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)；以及
葡萄糖6磷酸脱氢酶。
31.如权利要求16以及19至22中任一项所述的组合物，其中，
测定对象是作为所述衍生前体物的肌酐，
该组合物在进行了以下处理后使用，所述处理为在水的存在下使肌酐酰氨基水解酶(EC3.5.2.10)与该肌酐接触、使肌酐定量地衍生为肌酸的处理，
该组合物具备：
(a)肌酸激酶、
(b)腺苷3磷酸(ATP)、
(c)肌苷2磷酸(IDP)、
(d)腺苷2磷酸(ADP)依赖性葡萄糖激酶(EC 2.7.1.147)、
(e)葡萄糖、
(f)硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(硫代NADP)、硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(硫代NAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、以及
(g)葡萄糖6磷酸脱氢酶。
32.一种试剂盒，其包含权利要求16至31中任一项所述的组合物。
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