WO2020080249A1 - 酵素的測定方法及び酵素的測定用試薬 - Google Patents

酵素的測定方法及び酵素的測定用試薬 Download PDF

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WO2020080249A1
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adp
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acid
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信一 酒瀬川
健司 小西
白波瀬　泰史
吉田　敏之
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旭化成ファーマ株式会社
シスメックス株式会社
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    • G01N2800/18—Dental and oral disorders

Definitions

  • the present invention relates to an enzymatic measurement method and an enzymatic measurement reagent.
  • Butyric acid naturally exists in milk fat such as butter in the form of glycerin ester. Butyric acid is also produced by butyric acid fermentation of sugars by butyric acid bacteria. In recent years, attention has been paid to the role of butyric acid in the living body. For example, butyric acid produced by enterobacteria has attracted attention as a substance that is appropriately diluted in the mucin layer to induce the differentiation of T cells into regulatory T cells. Butyric acid has a beneficial effect on the intestinal environment at an appropriately low concentration, such as being absorbed by the intestinal mucosal epithelium to serve as an energy source and promoting the growth of the mucosal epithelium.
  • Butyric acid in foods is also drawing attention because the beneficial action of butyric acid is obtained not only by butyric acid produced by bacteria in vivo but also by oral administration of butyric acid. Butyric acid is also present in saliva, but since there is no mucin layer in the oral cavity, a high concentration of butyric acid has been reported, which is an adverse event that damages cells.
  • acyl CoA synthetase As an enzymatic method for measuring fatty acids, the method using acyl CoA synthetase (ACS: EC6.2.1.) Is well known. A reagent is commercially available that can measure visible fatty acid in serum by combining acyl CoA synthetase (EC 6.2.1.3) with acyl CoA oxidase and peroxidase (POD).
  • GC-MS gas chromatography-mass spectrometry
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the present inventors generate adenosine diphosphate (ADP) from butyric acid and adenosine triphosphate (ATP) in a sample by the action of butyrate kinase, and measure the produced ADP to remove butyric acid in the sample. It was found that the measurement can be performed without being affected by acetic acid. That is, the present inventors have completed the present invention by establishing a new enzymatic assay method capable of measuring butyric acid in a sample.
  • ADP adenosine diphosphate
  • ATP adenosine triphosphate
  • the present invention provides an enzymatic measurement method including a step of contacting butyric acid, ATP, and butyrate kinase in a sample to produce ADP, and measuring the produced ADP.
  • the present invention also provides an enzymatic measurement method comprising a step of contacting a short-chain fatty acid having 3 to 6 carbon atoms, ATP, and butyrate kinase in a sample to produce ADP, and measuring the produced ADP.
  • the present invention provides a reagent for enzymatic assay containing butyrate kinase and ATP.
  • the present invention makes it possible to easily measure butyric acid in a sample.
  • the present invention is also useful for assisting the diagnosis of periodontal disease.
  • FIG. 2 is a diagram showing a pathway when reactions catalyzed by butyrate kinase, ADP-dependent hexokinase (ADP-HK) and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) are carried out in the same reaction system.
  • FIG. 3 is a diagram showing a pathway when reactions catalyzed by butyrate kinase, ADP-HK, G6PDH, and diaphorase are performed in the same reaction system. It is a schematic diagram which shows an example of the reagent in the form of one reagent. It is a schematic diagram which shows an example of the reagent in the form of two reagents.
  • thermostability of recombinant butyrate kinase derived from acetoanaerobium sticklandii It is a graph which shows the thermostability of the recombinant butyrate kinase derived from Thermosedi minibacter Oceania. It is a graph which shows the linearity of the quantification of butyric acid by the method of measuring butyric acid of this embodiment. It is a graph which shows the correlation of the measurement result by an automatic analyzer, and the measurement result by a manual method. It is a graph which shows the correlation of the measurement result by a GS-MS method, and the measurement result by an automatic analyzer.
  • measuring includes determining the value of the amount or concentration of the target substance, and acquiring the measurement result that reflects the amount or concentration of the target substance.
  • the measurement result may be qualitative information, quantitative information, or semi-quantitative information.
  • the qualitative information is information indicating the presence or absence of the target substance.
  • Quantitative information refers to numerical values such as measured values obtained by a measuring device.
  • the value of the amount or concentration of the target substance can be determined based on the quantitative information.
  • Semi-quantitative information refers to information that indicates the amount or concentration of a target substance stepwise by words, numbers, colors, and the like. For example, as semi-quantitative information, words such as “below detection limit”, “low”, “medium”, “high” may be used.
  • the "measurement result that reflects the amount or concentration of the target substance” means an index that changes according to the amount or concentration of the target substance. This index is preferably a visible or mechanically measurable optical change. Specifically, the absorbance, turbidity, color development and the like of the reaction solution are exemplified.
  • butyric acid includes not only butyric acid, but also isobutyric acid, which is an isomer of butyric acid.
  • the butyric acid in the sample may be in a salt or ionic state.
  • examples of butyric acid salts include alkali metal salts and calcium salts. Specific examples include sodium butyrate, lithium butyrate, and sodium isobutyrate.
  • the sample is not particularly limited as long as it may contain butyric acid, butyrate or butyrate ion.
  • the sample include biological samples and foods and drinks.
  • biological samples include saliva, gingival crevicular fluid, blood, plasma, serum, milk, urine, feces and the like.
  • the food and drink include dairy products such as milk.
  • the sample may be diluted with a suitable solvent. You may use the culture supernatant of the microorganism which produces butyric acid as a sample.
  • the sample is preferably liquid.
  • the liquid sample is not limited to a solution, and includes a suspension in which fine solid substances such as cells are suspended, a sol, and the like.
  • the liquid sample may be prepared by crushing the sample and dissolving or suspending it in an appropriate solvent, and then removing solid matter by centrifugation or filtration.
  • a liquid sample such as saliva contains insoluble impurities
  • the sample may be centrifuged or filtered to remove insoluble impurities.
  • the solvent can be appropriately selected from the aqueous solvents generally used in the biochemistry field.
  • a solvent include water, physiological saline, and a buffer solution.
  • the pH of the buffer solution is preferably 6 or more and 10 or less.
  • the buffer include MES, PIPES, BES, TES, HEPES, Good buffer such as CHES, Tris-HCl buffer (Tris-HCl), phosphate-buffered saline (PBS), imidazole-HCl buffer and the like.
  • MES Tris-HCl buffer
  • BES Tris-HCl
  • TES phosphate-buffered saline
  • imidazole-HCl buffer imidazole-HCl buffer and the like.
  • Butyrate kinase reacts poorly to acetic acid, but large amounts of acetic acid cause an increase in reagent blank over time, affecting reagent stability. Therefore, it is preferable not to use a buffer containing acetic acid or acetate
  • Butyrate kinase (also called ATP: butanoate 1-phosphotransferase or EC 2.7.2.7) is an enzyme that catalyzes the reaction represented by the following formula (1).
  • Butyrate kinase itself is known, and is known as one of the metabolic enzymes of bacteria belonging to the genus Clostridium, which are involved in acetone / butanol fermentation.
  • the amino acid sequence of butyrate kinase and the base sequence of the gene encoding butyrate kinase can be obtained from publicly known databases.
  • Butyrate kinase may be naturally derived or may be an enzyme artificially obtained by a gene recombination technique or the like. In the present embodiment, as long as the butyrate kinase has an action of catalyzing the above reaction, one or more amino acid residues may be deleted, substituted or added to the amino acid sequence of naturally-occurring butyrate kinase. .
  • butyrate kinase The origin of butyrate kinase is not particularly limited.
  • the gene encoding butyrate kinase is, for example, Acetoanaerobium sticklandii (also called Clostridium sticklandii), Thermosedi minibacter ococani, Natra naerobius. It can be cloned from microorganisms such as Thermophilus (Natrana erobius thermophilus) and Symbiobacterium thermophilum. These microorganisms and their chromosomal DNAs are generally available and can be purchased from, for example, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ).
  • DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
  • the butyrate kinase derived from Acetanaerobium sticklandii contains, for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17.
  • the butyrate kinase derived from Thermocediminibactor oceani contains, for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19.
  • the final concentration of butyrate kinase in the mixture of the sample, butyrate kinase and ATP (hereinafter, also referred to as “reaction mixture”) is not particularly limited.
  • the lower limit of the final concentration of butyrate kinase in the reaction mixture is, for example, 0.01U / mL or more, preferably 0.1U / mL or more, more preferably 0.5U / mL or more, and the upper limit of the final concentration is, for example, 150U / mL. It may be not more than mL, preferably not more than 50 U / mL, more preferably not more than 20 U / mL.
  • the final concentration of butyrate kinase is preferably low from the economical point of view, and high from the viewpoint of the effective period of the reagent.
  • U / mL is a unit of the activity value of an enzyme. 1 U of butyrate kinase is defined as the amount of enzyme that phosphorylates 1 ⁇ mol of butyrate per minute. The method itself for measuring the activity value of an enzyme is known, and those skilled in the art can easily measure the activity value by routine experiments.
  • the enzymatic reaction represented by the above formula (1) is a reversible reaction
  • the enzymatic reaction proceeds toward the production of butyryl phosphate and ADP.
  • the amount of ATP added is not particularly limited.
  • the lower limit of the final concentration of ATP in the reaction mixture at the start of the enzymatic reaction is, for example, 0.1 mM or more, preferably 0.2 mM or more, more preferably 0.5 mM or more, and the upper limit of the final concentration is For example, it may be 50 mM or less, preferably 10 mM or less, and more preferably 5 mM or less.
  • the sample, ATP, and butyrate kinase it is preferable to contact the sample, ATP, and butyrate kinase in the presence of a divalent metal ion.
  • the divalent metal ion include magnesium ion and zinc ion. Among them, magnesium ion is particularly preferable.
  • the divalent metal ion can be supplied by adding a compound that forms a divalent metal ion or an aqueous solution thereof to a mixed solution of a sample, ATP and butyrate kinase. The amount of the divalent metal ion added is not particularly limited.
  • the lower limit of the final concentration of the divalent metal ion in the reaction mixture at the start of the enzymatic reaction is, for example, 0.1 mM or more, preferably 0.5 mM or more, more preferably 1 mM or more, and the upper limit of the final concentration is, for example, 50 It may be mM or less, preferably 20 mM or less, more preferably 10 mM or less.
  • the amount of the divalent metal ion used under the above conditions is, for example, in the case of magnesium ion, the lower limit is 0.1 equivalent or more, preferably 0.5 equivalent or more, more preferably 1 equivalent or more, and the upper limit with respect to the concentration of ATP. Is 10 equivalents or less, preferably 5 equivalents or less, and more preferably 3 equivalents or less. The most preferred concentration is 1 equivalent of ATP.
  • the compound that forms a divalent metal ion is not particularly limited as long as it produces a divalent metal ion in a suitable solvent and the anion produced from the compound does not inhibit the enzymatic reaction.
  • a salt of a divalent metal and an inorganic acid is preferable, and examples thereof include salts of an acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid and the divalent metal. More preferable divalent metal salts include salts of at least one metal selected from magnesium, zinc and the like.
  • the compound forming a divalent metal ion may be an anhydride or a hydrate.
  • the sample may be contacted with ATP and butyrate kinase in the presence of a surfactant.
  • the surfactant can be appropriately selected from nonionic surfactants, cationic surfactants, anionic surfactants and amphoteric surfactants. Among them, nonionic surfactants are preferable, and polyoxyethylene alkylphenyl ether type or pothioxyethylene alkyl ether type nonionic surfactants are particularly preferable.
  • nonionic surfactants examples include Triton (registered trademark) X-100, TN-100 (ADEKA Co., Ltd.), Emulgen 1150s-60 (Kao Co., Ltd.), Newcol 710 (Nippon Emulsifier Co., Ltd.) And so on.
  • ADP produced by the reaction catalyzed by butyrate kinase is measured.
  • the amount of ADP produced is proportional to the amount of butyric acid which is a substrate of butyrate kinase. Therefore, the butyric acid in the sample can be measured by measuring the produced ADP. That is, the method of the present embodiment can be said to be a method of measuring butyric acid in a sample based on the measurement result of ADP produced by contacting the sample, ATP, and butyrate kinase.
  • the amount or concentration of butyric acid in the sample can be determined based on the measurement value that reflects the amount or concentration of ADP generated (hereinafter, also referred to as “measurement value of ADP”).
  • a butyric acid aqueous solution of known concentration is measured in the same manner as the sample to create a calibration curve showing the relationship between the measured value of ADP and the butyric acid concentration.
  • the value of butyric acid concentration in the sample can be determined from the measured value of ADP of the reaction mixture.
  • An aqueous solution of butyric acid having a known concentration can be used as a calibration reagent, and the concentration of butyric acid in the calibration reagent and the conditions such as the type and concentration of components can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • the method for measuring ADP is not particularly limited, but an enzymatic measurement method is simple and preferable.
  • Various methods for enzymatically measuring ADP are known, and reagents for measuring ADP are commercially available.
  • any enzymatic measurement method may be used.
  • a method using pyruvate kinase (PyK) and lactate dehydrogenase (LDH) can be mentioned.
  • PyK pyruvate kinase
  • LDH lactate dehydrogenase
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide reduced form
  • NADH has an absorption peak near 340 nm
  • the absorption spectrum of NAD does not have an absorption peak near 340 nm.
  • the change in absorbance around 340 nm due to the decrease in NADH reflects the amount or concentration of ADP in the reaction mixture.
  • ADP is measured based on the absorbance around 340 nm. Since NADH has autofluorescence, ADP may be measured based on the change in fluorescence intensity (excitation wavelength 530 to 570 nm) generated at 590 to 600 nm due to the decrease in NADH.
  • the method using ADP-dependent hexokinase (ADP-HK) and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) is preferable.
  • ADP, glucose, and ADP-HK are contacted with each other to produce glucose-6-phosphate (G6P).
  • G6P glucose-6-phosphate
  • This reaction is preferably carried out in the presence of divalent metal ions.
  • the produced G6P, NAD + and G6PDH are contacted with each other to produce 6-phosphoglucono- ⁇ -lactone and NADH.
  • NADP + nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidation type
  • NADPH nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced form
  • NADH or NADPH can be performed by measuring the absorbance of the reaction mixture containing NADH or NADPH produced.
  • the increase in NADH or NADPH increases the absorbance around 340 nm in the reaction mixture.
  • ADP can be measured based on this change in absorbance. Since NADH and NADPH have autofluorescence, higher sensitivity measurement can be achieved by measuring the fluorescence intensity generated at 590 to 600 nm at the excitation wavelength of 530 to 570 nm.
  • NADH or NADPH may be measured by contacting the produced NADH or NADPH, a coloring reagent, and an electron carrier to produce a dye, and measuring the absorbance of the reaction mixture containing the produced dye. .
  • the coloring reagent and the electron carrier are commercially available as a reagent for NAD / NADH (or NADP / NADPH) measurement.
  • the electron carrier is not particularly limited as long as it is a substance capable of accepting an electron from NADH or NADPH and donating the electron to the coloring reagent.
  • electron carriers include diaphorase, phenazine methosulfate, methoxyphenazine methosulfate, dimethylaminobenzophenoxazinium chloride (Meldora blue), and the like. Among them, diaphorase is particularly preferable.
  • the coloring reagent is not particularly limited as long as it is a substance that is reduced by receiving an electron from an electron carrier to generate a dye.
  • examples of such a substance include a tetrazolium compound.
  • NADPH may be used instead of NADH.
  • the tetrazolium compound is not particularly limited as long as it is a compound having a tetrazole ring or a salt thereof.
  • various compounds are commercially available as a coloring reagent.
  • WST-1 (2- (4-iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium monosodium salt
  • WST-8 (2- (2-Methoxy-4-nitrophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium
  • NBT nitrogen blue tetrazolium
  • MTT (3- (4 , 5-Dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide
  • XTT (2,3-bis- (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl) -2H
  • a biological sample may contain endogenous adenylate kinase (also called myokinase). Since adenylate kinase catalyzes the reaction represented by the formula (8) to repeatedly react ADP, the method of the present embodiment receives positive interference.
  • the inhibitor of adenylate kinase P1, P5-di (adenosine-5 '-) pentaphosphate (Ap5A), may be added to the sample or reaction mixture. .
  • the amount of Ap5A added is represented by the final concentration of Ap5A in the reaction mixture at the start of the enzymatic reaction, and is, for example, 1 ⁇ M or more and 200 ⁇ M or less, and more preferably 5 ⁇ M or more and 50 ⁇ M or less.
  • the reaction system means a limited environment in which components necessary for an enzymatic reaction are present and the reaction occurs.
  • the reaction with butyrate kinase and the enzymatic assay of ADP can be performed in the same reaction system. it can.
  • ADP produced by the enzymatic reaction with butyrate kinase is immediately consumed by the enzymatic assay method for ADP. Therefore, the enzymatic reaction represented by the above formula (1) is further promoted toward the production of butyryl phosphate and ADP.
  • This reaction system contains a sample, ATP, butyrate kinase (BK), glucose, NAD or NADP, ADP-HK and G6PDH.
  • the reaction system further comprises a divalent metal ion.
  • butyryl phosphate and ADP are produced by contacting the sample with ATP and BK.
  • G6P and adenosine monophosphate (AMP) are produced by contacting the produced ADP, glucose and ADP-HK.
  • FIG. 2 shows a route when the reactions represented by the above formulas (1) and (5) to (7) are carried out in the same reaction system.
  • FIG. 1 shows a route when the reactions represented by the above formulas (1) and (5) to (7) are carried out in the same reaction system.
  • the formazan dye and NAD are produced by contacting NADH (or NADPH) produced by the action of G6PDH with a tetrazolium compound and diaphorase.
  • ADP is measured based on the change in absorbance due to an increase in formazan dye.
  • the ADP measurement based on the change in absorbance may be performed by a rate assay or an endpoint assay.
  • ADP in the reaction mixture is measured based on the amount of change in absorbance per unit time after the start of the reaction.
  • ADP in the reaction mixture is measured based on the difference between the absorbance before the start of the reaction and the absorbance after the end of the reaction.
  • the reaction temperature may be in a temperature range such as room temperature or normal temperature at which the enzyme used acts, and is usually 10 ° C. or higher and 60 ° C. or lower, preferably 15 ° C. or higher and 50 ° C. or lower, and more preferably 20 °C or more and 40 °C or less.
  • 37 ° C is preferable.
  • the reaction time is not particularly limited as long as butyric acid in the sample can be accurately measured, but is 30 seconds or more and 60 minutes or less, and preferably 1 minute or more and 30 minutes or less.
  • 10 minutes is particularly preferable.
  • the pH of the reaction mixture may be in the pH range in which the enzyme used acts, and is usually 6 or more and 10 or less, preferably 6.5 or more and 9.5 or less, and more preferably 7 or more and 8.5 or less.
  • a coloring system using a tetrazolium salt is affected by an endogenous reducing substance at a pH of 8 or higher, so it is better to react at a pH of 8 or lower. Even when the reaction with butyrate kinase and the enzymatic measurement method of ADP are performed in the same reaction system, the reaction temperature, reaction time and pH can be appropriately selected from the above range.
  • the above buffer may be added to the sample or reaction mixture to adjust the pH.
  • ADP may be measured after stopping the enzymatic reaction by adding a reaction stop solution.
  • the reaction stop solution is not particularly limited as long as it is a solution containing a modifier.
  • the modifier include hydrochloric acid, sulfuric acid, sodium dodecyl sulfate (SDS), lithium dodecyl sulfate and the like.
  • an enzymatic measurement method comprises a step of contacting a short-chain fatty acid having 3 to 6 carbon atoms in a sample, ATP, and butyrate kinase to produce ADP, and measuring the produced ADP.
  • a biological sample obtained from an environment in which a microorganism exists such as saliva or feces, contains various short-chain fatty acids produced by the microorganism.
  • Examples of the short-chain fatty acid in such a biological sample include acetic acid, propionic acid, butyric acid and the like, but generally, acetic acid tends to be contained more than other fatty acids.
  • acetic acid tends to be contained more than other fatty acids.
  • the action of short chain fatty acids other than acetic acid, such as butyric acid and propionic acid produced by bacteria in the oral cavity and intestine has been attracting attention.
  • butyrate kinase reacts with a short chain fatty acid having 3 to 6 carbon atoms as a substrate, including butyric acid, as shown in Reference Example 7 described later.
  • butyrate kinase does not substantially use acetic acid as a substrate.
  • the enzymatic measurement method using butyrate kinase measures short-chain fatty acids having 3 to 6 carbon atoms without measuring acetic acid. It becomes possible to do.
  • Butyrate kinase is an enzyme that catalyzes the reaction represented by the above formula (1), but it also catalyzes the same phosphorylation reaction for short-chain fatty acids having 3 to 6 carbon atoms other than butyric acid. That is, when a short-chain fatty acid having 3 to 6 carbon atoms and ATP come into contact with each other in the presence of butyrate kinase, the phosphate group of ATP is transposed to the fatty acid to produce phosphorylated fatty acid and ADP.
  • the details of butyrate kinase are as described above.
  • the “short chain fatty acid” includes acetic acid, propionic acid, butyric acid, isobutyric acid, valeric acid, isovaleric acid and caproic acid. Lactic acid and succinic acid have very different properties, so they are not included in "short-chain fatty acids” (Takata Sakata, Hirofumi Ichikawa, "Bioactivity of short-chain fatty acids” Journal of Japan Oil Chemists' Society Vol.46 (1997) No.10. , Pp.1205-1212).
  • the short-chain fatty acid having 3 to 6 carbon atoms may be linear or branched.
  • Examples of the short-chain fatty acid having 3 to 6 carbon atoms include propionic acid, butyric acid, isobutyric acid, valeric acid, isovaleric acid, caproic acid and the like.
  • the short-chain fatty acid having 3 to 6 carbon atoms in the sample may be in a salt or ionic state.
  • Examples of the fatty acid salts include alkali metal salts and calcium salts.
  • Examples of the alkali metal salt of fatty acid include sodium salt, potassium salt, lithium salt and the like.
  • the sample is not particularly limited as long as it may contain a short-chain fatty acid having 3 to 6 carbon atoms, a salt thereof, or an ion.
  • the short-chain fatty acid having 3 to 6 carbon atoms contained in the sample may be one type or two or more types. Examples of such a sample include the above biological samples, foods and drinks, and the like.
  • a culture supernatant of a microorganism that produces a short chain fatty acid having 3 to 6 carbon atoms may be used as a sample.
  • the sample may be diluted with a suitable solvent. The details of the solvent are as described above.
  • the sample is preferably liquid. The details of the liquid sample and its preparation are as described above.
  • the step of producing ADP by contacting a short-chain fatty acid having 3 to 6 carbon atoms, ATP, and butyrate kinase in the sample should be performed in the same manner as the step of producing ADP of the method of the present embodiment.
  • the sample may be brought into contact with ATP and butyrate kinase in the presence of a divalent metal ion and / or a surfactant.
  • the details of the divalent metal ion, the compound forming the same, and the surfactant are as described above.
  • ADP produced by the reaction catalyzed by butyrate kinase is measured.
  • the details of the ADP measurement method are the same as those described in the method of the present embodiment.
  • the amount of ADP produced is proportional to the amount of short-chain fatty acid having 3 to 6 carbon atoms, which is a substrate for butyrate kinase. Therefore, the short-chain fatty acid having 3 to 6 carbon atoms in the sample can be measured by measuring the produced ADP. That is, the measured value of the produced ADP indicates the total amount of short-chain fatty acids having 3 to 6 carbon atoms or the total amount of short-chain fatty acids having 3 to 6 carbon atoms in the sample.
  • the enzymatic measurement method of the present embodiment is a method for measuring a short-chain fatty acid having 3 to 6 carbon atoms in a sample based on the measurement result of ADP produced by contacting the sample, ATP, and butyrate kinase. Can also be said.
  • the value of the total amount of short-chain fatty acids having 3 to 6 carbon atoms in the sample or the total amount of short-chain fatty acids having 3 to 6 carbon atoms in the sample is calculated from the measured value of ADP using a calibration curve. The value of may be determined.
  • a standard solution for preparing a calibration curve may be prepared.
  • an aqueous solution containing any one selected from short-chain fatty acids having 3 to 6 carbon atoms at a predetermined concentration is prepared.
  • the short-chain fatty acid having 3 to 6 carbon atoms is not particularly limited, and for example, the short-chain fatty acid considered to be most contained in the sample to be measured may be selected.
  • an aqueous solution of butyric acid having a known concentration is used as a standard solution for creating a calibration curve. By measuring the standard solution in the same manner as the sample, a calibration curve showing the relationship between the measured value of ADP and the concentration of short-chain fatty acid can be prepared.
  • the enzymatic measurement reagent of the present embodiment (hereinafter, also simply referred to as “reagent”) contains butyrate kinase and ATP.
  • the reagent of this embodiment is used in the above-described enzymatic measurement method of this embodiment.
  • the reagent of the present embodiment may be in the form of one reagent containing both butyrate kinase and ATP in one reagent.
  • the reagent of the present embodiment may be in the form of two reagents including a first reagent containing ATP and a second reagent containing butyrate kinase.
  • the container containing the reagent may be packed in a box and provided to the user.
  • the box may include a package insert describing how to use the reagent and the like.
  • 3 and 4 show examples of the reagent of this embodiment.
  • 10 represents a reagent in the form of one reagent
  • 11 represents a first container containing the reagent
  • 12 represents a packaging box
  • 13 represents a package insert.
  • 20 represents a reagent in the form of two reagents
  • 21 represents a first container containing a first reagent
  • 22 represents a second container containing a second reagent
  • 23 Indicates a packing box
  • 24 indicates an attached document.
  • the reagent of this embodiment may contain butyrate kinase and ATP in a solid state (powder, crystal, lyophilized product, etc.).
  • the reagent of the present embodiment may be contained in the form of a solution in which butyrate kinase and ATP are dissolved in a suitable solvent.
  • the reagents are in the form of two reagents, one of the first reagent and the second reagent may be in a solid state and the other one may be in a solution state.
  • both the first reagent and the second reagent are in solution.
  • the solvent include aqueous solvents such as water, physiological saline and buffer solutions. The details of the buffer solution are as described above.
  • the concentration of butyrate kinase in the reagent may be a concentration that allows the final concentration of butyrate kinase when the reagent and sample are mixed to be within the above numerical range. Therefore, the concentration of butyrate kinase in the reagent can be determined from the mixing ratio of the reagent and the sample.
  • the lower limit of the concentration of butyrate kinase in the reagent is, for example, 0.02 U / mL or more, preferably 0.2 U / mL or more, more preferably 1 U / mL or more
  • the upper limit of the concentration is, for example, 750 U / mL. mL or less, preferably 250 U / mL or less, and more preferably 100 U / mL or less.
  • the concentration of ATP in the reagent may be a concentration that allows the final concentration of ATP when the reagent and sample are mixed to be within the above numerical range. Therefore, the concentration of ATP in the reagent can be determined from the mixing ratio of the reagent and the sample.
  • the lower limit of the concentration of ATP in the reagent is, for example, 0.2 mM or more, preferably 0.4 mM or more, more preferably 1 mM or more
  • the upper limit of the concentration is, for example, 250 mM or less, preferably 50 mM or less, More preferably, it is 25 mM or less.
  • the pH of the reagent is usually 6 or more and 10 or less, preferably 6.5 or more and 9.5 or less, and more preferably 7 or more and 8.5 or less. Even when the reagents are in the form of two reagents, the pH can be appropriately determined from the above range.
  • the above buffer may be added to the reagent to adjust the pH.
  • the optimum pH of butyrate kinase is 8-9, but it shows sufficient activity even at pH 7-7.5. Therefore, when other components accommodated in the reagent together with butyrate kinase are stable at a pH around neutrality, the pH of the reagent may be adjusted to 7 to 7.5.
  • Other components include, for example, components used in the enzymatic determination method of ADP, a coloring reagent, and an electron carrier.
  • the pH of the reagent is preferably 7.5 or less.
  • the reagent of the present embodiment preferably further contains a divalent metal ion.
  • the reagent can contain a divalent metal ion by adding to the reagent a compound that forms a divalent metal ion.
  • the details of the compound that forms a divalent metal ion are as described above.
  • Examples of the divalent metal ion include magnesium ion and zinc ion. Among them, magnesium ion is particularly preferable.
  • the concentration of the divalent metal ion in the reagent may be a concentration that allows the final concentration of the divalent metal ion when the reagent and the sample are mixed to be within the above numerical range.
  • the concentration of the divalent metal ion in the reagent can be determined from the mixing ratio of the reagent and the sample.
  • the lower limit of the concentration of the divalent metal ion in the reagent is, for example, 0.2 mM or more, preferably 1 mM or more, more preferably 2 mM or more
  • the upper limit of the concentration is, for example, 250 mM or less, preferably 100 mM. It is mM or less, more preferably 50 mM or less.
  • the reagent of the present embodiment may further include components used in the enzymatic assay method for ADP.
  • Components used in the enzymatic assay of ADP include enzymes, substrates, coenzymes and the like.
  • the reagent further comprises glucose, ADP-HK, NAD or NADP, and G6PDH.
  • each of the above components may be contained in either the first reagent or the second reagent.
  • the concentration of each component in the reagent is not particularly limited as long as ADP in the reaction mixture can be accurately measured. Such concentration can be appropriately determined by those skilled in the art by referring to, for example, a commercially available reagent for measuring ADP.
  • the concentration of each component in the reagent is 0.1 mM or more and 100 mM or less
  • the concentration of ADP-HK is 0.2 U / mL or more and 20 U / mL or less
  • the concentration of NAD or NADP is 0.1 mM. It is 5 mM or less and the concentration of G6PDH is 0.2 U / mL or more and 20 U / mL or less.
  • the reagent may further contain a coloring reagent and an electron carrier.
  • the coloring reagent and the electron carrier may be included in either the first reagent or the second reagent, respectively. Details of the coloring reagent and the electron carrier are as described above.
  • the respective concentrations of the coloring reagent and the electron carrier in the reagent are not particularly limited as long as ADP in the reaction mixture can be accurately measured. Such a concentration can be appropriately determined by those skilled in the art by referring to, for example, a commercially available reagent for measuring NAD / NADH (or NADP / NADPH).
  • the concentration in the reagent is, for example, 0.05 mM or more and 5 mM or less.
  • concentration in the reagent is, for example, 0.1 U / mL or more and 10 U / mL or less.
  • the reagent may further contain a surfactant.
  • the reagent may further include inorganic salts.
  • the surfactant and the inorganic salt may be included in either the first reagent or the second reagent, respectively.
  • the details of the surfactant and the inorganic salt are as described above.
  • the concentration in the reagent is, for example, 0.01% (W / V) or more and 2% (W / V) or less.
  • the concentration in the reagent is, for example, 1 mM or more and 200 mM or less.
  • the reagent of the present embodiment may be provided as a reagent kit together with the reaction stop solution contained in the container.
  • the details of the reaction stop solution are as described above.
  • the concentration of the modifier in the reaction termination solution can be appropriately determined according to the type of the modifier. When SDS or lithium dodecyl sulfate is included as a modifier, the concentration in the reaction termination solution is, for example, 0.1% (W / V) or more and 10% (W / V) or less.
  • the reagent of this embodiment may be a reagent for periodontal disease diagnosis.
  • the present embodiment also relates to a method for assisting diagnosis of periodontal disease, which comprises a step of measuring a short-chain fatty acid having 3 to 6 carbon atoms in a sample derived from a subject using the reagent.
  • Another embodiment relates to the use of butyrate kinase and ATP for the manufacture of reagents for enzymatic measurement.
  • a further embodiment relates to the use of butyrate kinase and ATP for the manufacture of reagents for periodontal disease diagnosis.
  • Reference Example 1 Preparation of acetoanaerobium sticklandii-derived butyrate kinase (1) Preparation of transformant Acetoanaerobium sticklandii (DSM No.519) chromosomal DNA purchased from DSMZ was used as a template, and a sense primer (SEQ ID NO: 1) and an antisense primer (SEQ ID NO: 2) PCR was performed using KOD FX (product number: KFX-101, Toyobo Co., Ltd.) to amplify the butyrate kinase gene and obtain a PCR product of about 1100 bp. The nucleotide sequence of the obtained PCR product was confirmed by sequencing.
  • the nucleotide sequence of butyrate kinase derived from Acetoanaerobium sticklandii and the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence are shown in SEQ ID NOs: 16 and 17, respectively.
  • the resulting PCR product was digested with EcoRI (Takara Bio Inc.) and HindIII (Takara Bio Inc.), and inserted into the EcoRI-HindIII site of the expression vector pET-21a (+) vector (Novagen), A plasmid for expressing astBK / pET21a (+) was obtained.
  • the astBK / pET21a (+) expression plasmid contained a polynucleotide encoding T7 tag-linker-butyrate kinase-linker-His tag. This expression plasmid was introduced into One shot BL21 (DE3) Chemically Competent E.
  • the mixture was added and cultured in a jar fermenter under the conditions of 30 ° C., pH 6.8 and 650 rpm for about 25 hours.
  • the culture was centrifuged to collect the cells, and the obtained cells were suspended in solution A (10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5), 0.3 M NaCl).
  • solution A 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5), 0.3 M NaCl).
  • the microbial cells in the suspension were sonicated to solubilize and then centrifuged to obtain a supernatant. This supernatant was used as a crude enzyme solution.
  • the active fraction of the obtained recombinant butyrate kinase was concentrated with a pencil type module (UF) (Asahi Kasei Chemicals Co., Ltd.) to 1/10 volume and equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5). It was desalted with a modified PD-10 column (GE Healthcare) to obtain a solution of recombinant butyrate kinase. A part of the obtained solution of butyrate kinase was taken and analyzed by SDS-PAGE. Results are shown in FIG. In the figure, lane 1 shows the enzyme solution, lane 2 shows the molecular weight marker, and the arrow shows the band corresponding to butyrate kinase.
  • BKII the recombinant butyrate kinase derived from acetoanaerobium sticklandii obtained in Reference Example 1 is also referred to as "BKII”.
  • thermosediminibacter oceani-derived butyrate kinase (1) Sense primer (SEQ ID NO: 3) and antisense primer (SEQ ID NO: 4) and KOD FX (product number: KFX-101) using the chromosomal DNA of Thermo Thediminibaca oceani (DSM No. 16646) purchased from DSMZ as a template was used to perform PCR, and the butyrate kinase gene was amplified to obtain a PCR product of about 1100 bp. The nucleotide sequence of the obtained PCR product was confirmed by sequencing.
  • the nucleotide sequence of the butyrate kinase derived from Thermocediminibacter oceanii of Reference Example 2 and the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence are shown in SEQ ID NOs: 18 and 19, respectively.
  • the obtained PCR product was digested with NdeI (Takara Bio Inc.) and HindIII and inserted into the NdeI-HindIII site of the pET-21a (+) vector to obtain a ToBK / pET21a (+) expression plasmid.
  • NdeI Takara Bio Inc.
  • HindIII inserted into the NdeI-HindIII site of the pET-21a (+) vector to obtain a ToBK / pET21a (+) expression plasmid.
  • a nucleotide sequence encoding a vector-derived linker and a His tag was added to the 3'end of the butyrate kinase gene.
  • the ToBK / pET21a (+) expression plasmid contained a polynucleotide encoding a butyrate kinase-linker-His tag.
  • This expression plasmid was introduced into One shot BL21 (DE3) Chemically Competent E. coli, and a transformant ToBK / pET-21a having a recombinant vector containing a polynucleotide encoding butyrate kinase derived from Thermothediminibacter dressi (+) / BL21 (DE3) was obtained.
  • the obtained transformant was cultured in the same manner as in Reference Example 1 to prepare a crude enzyme solution from the cells.
  • the obtained crude enzyme solution was purified in the same manner as in Reference Example 1 to obtain a solution of recombinant butyrate kinase.
  • a part of the obtained solution of butyrate kinase was taken and analyzed by SDS-PAGE. Results are shown in FIG. In the figure, lane 1 shows the enzyme solution, lane 2 shows the molecular weight marker, and the arrow shows the band corresponding to butyrate kinase.
  • Reference Example 3 Preparation of butyrate kinase derived from Thermocediminibacter oceanii (2) Sense primer (SEQ ID NO: 3) and antisense primer (SEQ ID NO: 5) and KOD FX (product number: KFX-101) using the chromosomal DNA of Thermo Thediminibaca Oceani (DSM No. 16646) purchased from DSMZ as a template Was used to perform PCR, and the butyrate kinase gene was amplified to obtain a PCR product of about 1100 bp. The nucleotide sequence of the obtained PCR product was confirmed by sequencing.
  • the base sequence of this butyrate kinase and the amino acid sequence deduced from the base sequence were the same as the sequences represented by SEQ ID NOs: 18 and 19, respectively.
  • the obtained PCR product was digested with NdeI and HindIII and inserted into the NdeI-HindIII site of the pET-21a (+) vector to obtain a ToBKIII / pET21a (+) expression plasmid. No tag was added to the butyrate kinase gene in this expression plasmid.
  • This expression plasmid was introduced into One shot BL21 (DE3) Chemically Competent E.
  • the column was filled with Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) and equilibrated with a 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) solution.
  • the above-mentioned crude enzyme solution was added to the obtained column to adsorb the recombinant butyrate kinase.
  • the recombinant butyrate kinase was eluted with a linear gradient of 10 CV (column volume) using 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) solution and 0.5 mM KCl-containing 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) solution. .
  • the recombinant butyrate kinase was eluted by a 10 CV linear gradient using a 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) solution containing 18% ammonium sulfate and a 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) solution.
  • the active fraction of recombinant butyrate kinase was confirmed and collected.
  • the active fraction of the obtained recombinant butyrate kinase was concentrated with Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit (Millipore) and 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) with PD-10 column (GE Healthcare).
  • lane 1 shows the enzyme solution
  • lane 2 shows the molecular weight marker
  • the arrow shows the band corresponding to butyrate kinase.
  • BKIII the recombinant type butyrate kinase derived from Thermosedi minibacter oceania obtained in Reference Example 3
  • the nucleotide sequence of butyrate kinase derived from Thermocediminibacter oceania obtained in Reference Example 4 and the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence are shown in SEQ ID NOs: 20 and 21, respectively.
  • the obtained PCR product was digested with NdeI and HindIII and inserted into the NdeI-HindIII site of the pET-21a (+) vector to obtain a ToBK2 / pET21a (+) expression plasmid.
  • a nucleotide sequence encoding a vector-derived linker and a His tag was added to the 3'end of the butyrate kinase gene.
  • the ToBK2 / pET21a (+) expression plasmid contained a polynucleotide encoding a butyrate kinase-linker-His tag.
  • a solution of recombinant butyrate kinase derived from Thermosedi minibacter oceani was obtained in the same manner as in Reference Example 2.
  • Reference Example 5 Preparation of butyrate kinase derived from Natranaerovius thermophilus Using a chromosomal DNA of Natranaerovius thermophilus (DSM No.18059) purchased from DSMZ as a template, a sense primer (SEQ ID NO: 8) and an antisense primer PCR was performed using (SEQ ID NO: 9) and KOD FX (product number: KFX-101) to amplify the butyrate kinase gene to obtain a PCR product of about 1100 bp. The nucleotide sequence of the obtained PCR product was confirmed by sequencing.
  • the nucleotide sequences of butyrate kinase derived from Natranaelobius thermophilus and the amino acid sequences deduced from the nucleotide sequences are shown in SEQ ID NOs: 22 and 23, respectively.
  • the obtained PCR product was digested with NdeI and HindIII and inserted into the NdeI-HindIII site of the pET-21a (+) vector to obtain an NtBK / pET21a (+) expression plasmid.
  • a nucleotide sequence encoding a vector-derived linker and a His tag was added to the 3'end of the butyrate kinase gene.
  • the NtBK / pET21a (+) expression plasmid contained a polynucleotide encoding a butyrate kinase-linker-His tag.
  • a solution of recombinant butyrate kinase derived from Natranaelobius thermophilus was obtained in the same manner as in Reference Example 2.
  • Reference Example 6 Preparation of symbiobacterium thermophilum-derived butyrate kinase A sense primer (SEQ ID NO: 10) and an antisense primer were prepared using the chromosomal DNA of symbiobacterium thermophilum (DSM No. 24528) purchased from DSMZ as a template. PCR was performed using (SEQ ID NO: 11) and KOD FX (product number: KFX-101), and the butyrate kinase gene was amplified to obtain a PCR product of about 1100 bp. The nucleotide sequence of the obtained PCR product was confirmed by sequencing.
  • the nucleotide sequence of butyrate kinase derived from Symbiobacterium thermophilum and the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence are shown in SEQ ID NOs: 24 and 25, respectively.
  • the obtained PCR product was digested with NdeI and HindIII and inserted into the NdeI-HindIII site of the pET-21a (+) vector to obtain a StBK / pET21a (+) expression plasmid.
  • a nucleotide sequence encoding a vector-derived linker and a His tag was added to the 3'end of the butyrate kinase gene.
  • the StBK / pET21a (+) expression plasmid contained a polynucleotide encoding a butyrate kinase-linker-His tag.
  • a solution of recombinant butyrate kinase derived from Symbiobacterium thermophilum was obtained in the same manner as in Reference Example 2.
  • Example 1 Activity measurement of recombinant butyrate kinase The enzyme activity of BKII and BKIII against butyrate was measured based on the amount of ADP produced.
  • NADPH is produced by the action of ADP-dependent hexokinase and glucose-6-phosphate dehydrogenase (see FIG. 1), and the increase of NADPH
  • the amount of ADP produced was measured based on the change in absorbance at 340 nm. The measurement was carried out using a 7080 type Hitachi automatic analyzer (Hitachi High Technologies Co., Ltd.).
  • Reagents and devices [Composition of the first reagent] 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) (Sigma) 2 mM ATP (pH 7.5) (Oriental Yeast Co., Ltd.) 2 mM MgCl 2 (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 20 mM glucose (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM sodium butyrate (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 1 mM NADP (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 5 U / mL G6PDH II (Glucose-6-phosphate dehydrogenase: T-51, Asahi Kasei Pharma Corporation) 5 U / mL ADP-HK II (ADP-dependent hexokinase: T-92, Asahi Kasei Pharma Corporation) 0.1% TN-100 (ADEKA Corporation)
  • composition of BKIII diluted solution 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) (Sigma) 0.1% TN-100 (ADEKA Corporation)
  • the activity value of BKII was about 340 U / mL
  • the activity value of BKIII was about 1800 U / mL.
  • Specific activity is an activity value per 1 mg of enzyme.
  • the protein (enzyme) concentrations of the BKII solution obtained in Reference Example 1 and the BKIII solution obtained in Reference Example 3 were quantified by the Bradford method, and the specific activities of BKII and BKIII with respect to butyric acid under the measurement conditions of Example 1 were calculated. .
  • the specific activity of BKII was about 337 U / mg
  • the specific activity of BKIII was about 513 U / mg.
  • Substrate specificity The substrate specificity of BKII and BKIII was examined using the following first and second reagents. Various fatty acids shown in Table 1 were used as substrates. The measurement was performed using a 7180 type Hitachi automatic analyzer (Hitachi High-Technologies Corporation).
  • composition of the second reagent Substrate 100 mM Tris-HCl (pH 7.5) 100 mM various fatty acid sodium salts
  • variable fatty acid sodium salts means sodium octanoate, sodium caproate, sodium valerate, sodium isovalerate, sodium butyrate, sodium isobutyrate, sodium propionate, sodium acetate, sodium lactate and Refers to any one of sodium succinate.
  • pH stability of BKII was investigated based on the residual activity after incubation of about 2.4 ⁇ g / mL BKII in 10 mM buffer containing 100 mM KCl at 37 ° C for 30 minutes. It was The pH stability of BKIII was also examined based on the residual activity after about 1 U / mL BKIII was incubated at 37 ° C. for 5 hours in 50 mM of the following buffer containing 0.1% TN-100. The residual activity was measured in the same manner as in Example 1.
  • the buffer used was Acetate-NaOH (pH 5-6), MES-NaOH (pH 6-7), PIPES-NaOH (pH 7-7.5), Tris-HCl (pH 7-9), CHES-NaOH (pH 9-10). And CAPS-NaOH (pH 10-11).
  • the measurement results are shown in FIGS. From FIGS. 10 and 11, the pH stability of BKII was in the range of pH 8 to 11 (37 ° C. for 30 minutes), and the pH stability of BKIII was in the range of pH 5 to 11 (37 ° C. for 5 hours).
  • thermostability of BKII about 0.3 mg / mL BKII was incubated in 100 mM KCl-containing 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) for 30 minutes at each temperature of 4 to 50 ° C. It was examined based on the residual activity afterwards.
  • thermal stability of BKIII about 1 mg / mL BKIII was incubated for 30 minutes at each temperature of 4 to 80 ° C. in 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7) containing 0.1% TN-100 (ADEKA Corporation). It was examined based on the residual activity afterwards. The residual activity was measured in the same manner as in Example 1. The measurement results are shown in FIGS. From FIGS.
  • the thermal stability of BKII is 50% or more after treatment at 37 ° C. for 30 minutes, and the thermal stability of BKIII (residual activity) after treatment at 70 ° C. for 30 minutes. It was 85% or more.
  • thermosediminibacter-oceani-derived butyrate kinase ToBK2
  • NtBK Natranaerovius thermophilus-derived butyrate kinase
  • StBK thermophilum-derived butyrate kinase
  • each butyrate kinase was added to 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7) containing 0.1% TN-100 to a concentration of about 1 mg / mL, and the residual activity after incubation at 65 ° C for 30 minutes was measured. It was measured. The residual activity was measured in the same manner as in Example 1.
  • the residual activities of BKIII, ToBK2, NtBK and StBK were 81.6%, 60.5%, 14.7% and 48.7%, respectively.
  • Example 2 Linearity test In order to confirm the accuracy of quantification of butyrate measurement using butyrate kinase, the linearity of the calibration curve was confirmed. The measurement was performed using a 7180 type Hitachi automatic analyzer (Hitachi High-Technologies Corporation).
  • Samples, reagents and devices [sample] Sodium butyrate (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in physiological saline to prepare a 10 mM sodium butyrate aqueous solution. This was serially diluted with physiological saline to prepare a dilution series containing sodium butyrate at concentrations of 0.156, 0.313, 0.625, 1.25, 2.5 and 5.0 mM. Saline was used as a control sample without butyric acid.
  • composition of the first reagent 100 mM Tris-HCl (pH 7.5) (Sigma) 2 mM ATP (pH 7.5) (Oriental Yeast Co., Ltd.) 2 mM MgCl 2 (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 20 mM glucose (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 1 mM NADP (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 5 U / mL G6PDH II (T-51, Asahi Kasei Pharma Corporation) 5 U / mL ADP-HK II (T-92, Asahi Kasei Pharma Corporation) 0.1% Triton (registered trademark) X-100 (Nacalai Tesque, Inc.)
  • composition of the second reagent 100 mM Tris-HCl (pH 7.5) (Sigma) 10 mM KCl (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 40 U / mL BKII
  • the linearity up to a butyric acid concentration of 10 mM could be confirmed. Therefore, it was shown that the enzymatic measurement method of the present embodiment is capable of quantitative analysis of butyric acid.
  • the optimum pH of BKII is 8 to 9 according to Reference Example 7, there was no problem in measurement even if the pH of the second reagent containing BKII was adjusted to 7.5.
  • Example 3 Measurement of butyric acid in human saliva Porphyromonas gingivalis and other bacteria causing periodontal disease are known to release short-chain fatty acids having 3 to 6 carbon atoms, especially butyric acid, in the oral cavity. ing. Further, it is known that about 3 to 4 mM butyric acid is also detected in the gingival crevicular fluid of a healthy person. Therefore, it was examined whether or not the short-chain fatty acid having 3 to 6 carbon atoms in human saliva can be measured by the enzymatic measurement method of the present embodiment. The measurement was carried out by a method using a model 7180 Hitachi automatic analyzer (Hitachi High-Technologies Corporation) or a 96-well microplate. For comparison, short-chain fatty acids were also measured by GC-MS.
  • composition of the second reagent 1% lithium dodecyl sulfate (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 1% Triton (registered trademark) X-100 (Nacalai Tesque, Inc.)
  • short-chain fatty acids other than acetic acid that is, propionic acid, butyric acid, isobutyric acid, valeric acid, isovaleric acid, and caproic acid were prepared with individual calibration curves for individual concentrations ( (mM) was measured, and the sum was used as the concentration of short-chain fatty acids having 3 to 6 carbon atoms.
  • Table 3 shows the results of measurement by the automatic analyzer, manual method and GC-MS.
  • the numerical values in the table are the concentrations (mM) of short chain fatty acids obtained from the calibration curve.
  • the correlation with the measurement by the automatic analyzer, the method used, and the measurement by GC-MS was confirmed.
  • the results are shown in Figures 15A-C.
  • Comparative Example 1 Measurement Using Acetate Kinase and Propionate Kinase It was examined whether it is possible to measure butyrate using acetate acetate (AK) or propionate kinase (PK) instead of butyrate kinase. For comparison, measurement using BKIII was also performed.
  • AK acetate acetate
  • PK propionate kinase
  • Samples, reagents and devices [sample] Neutralized 100 mM acetic acid, butyric acid and isobutyric acid were prepared in physiological saline to prepare 5 mM acetic acid, 5 mM butyric acid and 5 mM isobutyric acid aqueous solutions, respectively.
  • composition of the first reagent was the same as that of the first reagent used in the examination of the substrate specificity of Reference Example 7.
  • AK Sigma-Aldrich, E. coli derived
  • PK MyBioSource, recombinant protein
  • BKIII BKIII
  • Comparative Example 2 Measurement using acetate-CoA transferase Acetate-CoA transferase (EC 2.8.3.8) has been reported to catalyze the reaction represented by the following formula (9) (ExPASy-SIB Bioinformatics Resource EC 2.8.3.8 of Enzyme nomenclature database at Portal).
  • formula (9) ExPASy-SIB Bioinformatics Resource EC 2.8.3.8 of Enzyme nomenclature database at Portal.
  • acetate-CoA transferase instead of butyrate kinase, it was examined whether or not it is possible to measure butyric acid by the reaction of formula (10) which is the reverse reaction of formula (9).
  • Acetic acid produced by the formula (10) by acetate-CoA transferase was confirmed by the reaction with AK in Comparative Example 1.
  • the measurement was performed using a 7180 type Hitachi automatic analyzer (Hitachi High-Technologies Corporation).
  • composition of the first reagent 100 mM Tris-HCl (pH 7.5) (Sigma) 2 mM MgCl 2 (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 2 mM ATP (pH 7.5) (Oriental Yeast Co., Ltd.) 20 mM glucose (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 1 mM NADP (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 5 U / mL G6PDH II (Glucose-6-phosphate dehydrogenase: T-51, Asahi Kasei Pharma Corporation) 5 U / mL ADP-HK II (ADP-dependent hexokinase: T-92, Asahi Kasei Pharma Corporation) 1.25 mM Acetyl-CoA (Sigma-Aldrich) 20 U / mL AK (Sigma-Aldrich)
  • the produced acetoacetic acid was confirmed by a decrease reaction of ⁇ -NADH by 3-hydroxybutyrate dehydrogenase represented by the formula (13).
  • the measurement was performed using a 7180 type Hitachi automatic analyzer (Hitachi High-Technologies Corporation).
  • Samples, reagents and devices [sample] The 5 mM acetic acid, 5 mM butyric acid, and 5 mM isobutyric acid aqueous solutions used in Comparative Example 1 were used.
  • composition of the first reagent 100 mM Tris-HCl (pH 7.5) (Sigma) 0.35mM Acetoacetyl-CoA (Sigma-Aldrich) 2 mM MgCl 2 (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.25 mM ⁇ -NADH (Oriental Yeast Co., Ltd.) 5 U / mL 3-Hydroxybutyrate dehydrogenase (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • Example 2 Measurement As in Example 2, acetic acid, butyric acid and isobutyric acid in the sample were measured by an automatic analyzer. The reaction recovery rate (%) was calculated by dividing the measured value by the theoretical absorbance value of Comparative Example 1. However, since the product of the reaction of Comparative Example 3 was produced twice, it was divided by 2.
  • the resulting PCR product was digested with NdeI (Takara Bio Inc.) and HindIII (Takara Bio Inc.), and inserted into the NdeI-HindIII site of pET-21a (+) vector (Novagen), MsER / pET21a ( +) An expression plasmid was obtained.
  • a base sequence encoding a vector-derived linker and a His tag was added to the 3'end of the 2-enoate reductase gene. That is, the MsER / pET21a (+) expression plasmid contained a polynucleotide encoding a 2-enoate reductase-linker-His tag.
  • This expression plasmid was introduced into One shot BL21 (DE3) Chemically Competent E. coli (Invitrogen), and a transformant MsER having a recombinant vector containing a polynucleotide encoding Meiothermus sylvanus-derived 2-enoate reductase was introduced. / pET-21a (+) / BL21 (DE3) was obtained. The obtained transformant was cultured in the same manner as in Reference Example 1 to prepare a crude enzyme solution from the cells. The obtained crude enzyme solution was purified in the same manner as in Reference Example 1 to obtain a solution of recombinant 2-enoate reductase.
  • the obtained PCR product was digested with NdeI (Takara Bio Inc.) and XhoI (Takara Bio Inc.), and inserted into the NdeI-XhoI site of the pET-21a (+) vector (Novagen), KlER / pET21a ( +) An expression plasmid was obtained.
  • this expression plasmid a base sequence encoding a vector-derived linker and a His tag was added to the 3'end of the 2-enoate reductase gene. That is, the KlER / pET21a (+) expression plasmid contained a polynucleotide encoding a 2-enoate reductase-linker-His tag.
  • This expression plasmid was introduced into One shot BL21 (DE3) Chemically Competent E. coli (Invitrogen), and a transformant KlER having a recombinant vector containing a polynucleotide encoding Kleberomyces lactis-derived 2-enoate reductase was introduced. / pET-21a (+) / BL21 (DE3) was obtained.
  • the obtained transformant was cultured in the same manner as in Reference Example 1 to prepare a crude enzyme solution from the cells.
  • the obtained crude enzyme solution was purified in the same manner as in Reference Example 1 to obtain a solution of recombinant 2-enoate reductase.
  • lane 1 shows the enzyme solution
  • lane 2 shows the molecular weight marker
  • the arrow shows the band corresponding to 2-enoate reductase.
  • Example 4 Measurement of butyric acid in porcine stool It is known that butyric acid produced mainly by enterobacteria belonging to the order Clostridia promotes differentiation into regulatory T cells (Treg) that control immune tolerance. Therefore, it was examined whether butyric acid in pig stool can be measured by the enzymatic measurement method of the present embodiment. The measurement was carried out using a Hitachi 7180 automatic analyzer (Hitachi High-Technologies Corporation). For comparison, measurement of short-chain fatty acids by GC-MS was performed under the same conditions as in Example 3.
  • the first reagent used in the examination of the substrate specificity of Reference Example 7 contained a myokinase inhibitor.
  • Ap5A was added at 50 ⁇ M, and Triton (trademark) X-100 was added at a concentration of 0.1% to remove turbidity.
  • the obtained reagent was used as the first reagent in Example 4.
  • the second reagent of Example 3 was used as the second reagent. The measurement was carried out in the same manner as in Example 3 with the measurement parameters being the same as in Example 3 using a Hitachi 7180 automatic analyzer.

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Abstract

本発明は、酵素的測定方法及び酵素的測定用試薬に関する。酵素的測定方法は、試料中の炭素数３～６の短鎖脂肪酸と、アデノシン三リン酸と、酪酸キナーゼとを接触してアデノシン二リン酸を生成し、生成したADPを測定する工程を含む。酵素的測定用試薬は、酪酸キナーゼと、アデノシン三リン酸とを含む。

Description

酵素的測定方法及び酵素的測定用試薬
　本発明は、酵素的測定方法及び酵素的測定用試薬に関する。
　酪酸は、天然にはバターなどの乳脂中にグリセリンエステルの形態で存在する。また、酪酸菌による糖類の酪酸発酵によっても酪酸は生成される。近年、生体における酪酸の役割が着目されている。例えば、腸内細菌により生成された酪酸は、ムチン層で適当に希釈されてＴ細胞の制御性Ｔ細胞への分化を誘導する物質として注目されている。酪酸は、腸管粘膜上皮に吸収されてエネルギー源となり、粘膜上皮の増殖を促進するなど、適度な低い濃度では腸内環境に有益な作用を有する。酪酸の有益な作用は、生体内の細菌によって生成された酪酸だけでなく、酪酸の経口投与でも得られることから、食品中の酪酸も注目されている。酪酸は唾液中にも存在するが、口腔内にはムチン層がないために酪酸が高濃度になり細胞に障害を与える有害な事象が報告されている。一方、同じ短鎖脂肪酸でも細胞障害性に関しては酪酸＞吉草酸＞プロピオン酸の順であり、酢酸に関しては高濃度まで細胞障害性を示さないことが知られている(Xiaolan Yu, et al; Short-chain fatty acids from periodontal pathogens suppress histone deacetylases, EZH2, and SUV39H1 to promote Kaposi’s sarcoma associated herpesvirus replication. 2014, Vol.88, No.9, 4466-4479.)
　脂肪酸の酵素的測定法としては、アシルCoAシンテターゼ(ACS：EC6.2.1.)を用いる方法がよく知られている。アシルCoAシンテターゼ(EC6.2.1.3)と、アシルCoAオキシダーゼ及びペルオキシダーゼ(POD)とを組み合わせて、血清中の脂肪酸を可視部測定できる試薬が市販されている。しかし、EC6.2.1.3は中鎖脂肪酸以上の脂肪酸に反応し、酪酸、プロピオン酸及び酢酸には反応しないことが報告されている(Kohei Hosaka, et al., A New Colorimetric method for the determination of free fatty acids with acyl-CoA synthetase and acyl-CoA oxidase. J Biochem. 1981, 89, 1799-1803)。一方、EC6.2.1.2は短鎖脂肪酸にしか働かないが、酢酸及びプロピオン酸への反応性が高く、酪酸には反応しないことが報告されている(Catherine AR. et al. Regulation of volatile fattyacid uptake by mitochondrial Acyl CoA Synthetase of Bovine Heart. J Dairy Sci. 1981, 64:2336-2343.)。このように、生体試料及び食品に含まれる酪酸を測定する需要が高まっているが、現在、酪酸の測定は、ガスクロマトグラフィ-質量分析計(GC-MS)又は高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により行われている。例えば、特許文献１には、糞便中の酪酸などの短鎖脂肪酸をHPLCで測定したことが開示されている。また、GC-MSの利点としては、機能の異なる酢酸と酪酸とを分別できることにある。
特開2009-229456号公報
　しかし、GC-MS及びHPLCによる測定には高価な装置が必要であり、また操作も煩雑である。よって、酢酸の影響を受けることなく、酪酸を含む短鎖脂肪酸を簡便に測定することを可能にする技術が求められている。
　本発明者らは、酪酸キナーゼの作用により、試料中の酪酸及びアデノシン三リン酸(ATP)からアデノシン二リン酸(ADP)を生成し、生成したADPを測定することにより、試料中の酪酸を酢酸の影響を受けることなく測定できることを見出した。すなわち、本発明者らは、試料中の酪酸を測定可能な新規な酵素的測定法を確立して、本発明を完成した。
　よって、本発明は、試料中の酪酸と、ATPと、酪酸キナーゼとを接触してADPを生成し、生成したADPを測定する工程を含む、酵素的測定方法を提供する。また、本発明は、試料中の炭素数３～６の短鎖脂肪酸と、ATPと、酪酸キナーゼとを接触してADPを生成し、生成したADPを測定する工程を含む、酵素的測定方法を提供する。さらに、本発明は、酪酸キナーゼと、ATPとを含む酵素的測定用試薬を提供する。
　本発明は、試料中の酪酸を簡便に測定することを可能にする。また、本発明は、歯周病の診断の補助に有用である。
酪酸キナーゼ、ADP依存性ヘキソキナーゼ(ADP-HK)及びグルコース-6-リン酸脱水素酵素(G6PDH)のそれぞれが触媒する反応を同じ反応系で行った場合の経路を示す図である。 酪酸キナーゼ、ADP-HK、G6PDH及びジアホラーゼのそれぞれが触媒する反応を同じ反応系で行った場合の経路を示す図である。 一試薬の形態にある試薬の一例を示す模式図である。 二試薬の形態にある試薬の一例を示す模式図である。 アセトアナエロビウム・スティックランディイ由来の組換え型酪酸キナーゼの溶液をSDS-PAGEで分析した結果を示す図である。 サーモセディミニバクター・オセアニ由来の組換え型酪酸キナーゼの溶液をSDS-PAGEで分析した結果を示す図である。 サーモセディミニバクター・オセアニ由来の組換え型酪酸キナーゼの溶液をSDS-PAGEで分析した結果を示す図である。 アセトアナエロビウム・スティックランディイ由来の組換え型酪酸キナーゼの至適pHを示すグラフである。 サーモセディミニバクター・オセアニ由来の組換え型酪酸キナーゼの至適pHを示すグラフである。 アセトアナエロビウム・スティックランディイ由来の組換え型酪酸キナーゼのpH安定性を示すグラフである。 サーモセディミニバクター・オセアニ由来の組換え型酪酸キナーゼのpH安定性を示すグラフである。 アセトアナエロビウム・スティックランディイ由来の組換え型酪酸キナーゼの熱安定性を示すグラフである。 サーモセディミニバクター・オセアニ由来の組換え型酪酸キナーゼの熱安定性を示すグラフである。 本実施形態の酪酸を測定する方法による酪酸定量の直線性を示すグラフである。 自動分析装置による測定結果と用手法による測定結果との相関を示すグラフである。 GS-MS法による測定結果と自動分析装置による測定結果との相関を示すグラフである。 GS-MS法による測定結果と用手法による測定結果との相関を示すグラフである。 メイオサーマス・シルバヌス由来の組換え型2-エノエート・レダクターゼの溶液をSDS-PAGEで分析した結果を示す図である。 クリベロマイセス・ラクティス由来の組換え型2-エノエート・レダクターゼの溶液をSDS-PAGEで分析した結果を示す図である。 GS-MS法による測定結果と自動分析装置による測定結果との相関を示すグラフである。
　本明細書において「測定する」とは、対象物質の量又は濃度の値を決定すること、及び、対象物質の量又は濃度を反映する測定結果を取得することを含む。測定結果は、定性的情報、定量的情報及び半定量的情報のいずれであってもよい。定性的情報は、対象物質の有無を示す情報をいう。定量的情報は、測定機器によって得られた測定値などの数値をいう。定量的情報に基づいて、対象物質の量又は濃度の値を決定できる。半定量的情報は、対象物質の量又は濃度を、語句、数字、色などにより段階的に示す情報をいう。例えば、半定量的情報として、「検出限界以下」、「少ない」、「中程度」、「多い」などの語句を用いてもよい。ここで、「対象物質の量又は濃度を反映する測定結果」とは、対象物質の量又は濃度に応じて変化する指標を意味する。この指標は、視認可能又は機械的に測定可能な光学的変化であることが好ましい。具体的には、反応液の吸光度、濁度、発色などが例示される。
[１．酪酸の酵素的測定方法]
　本実施形態の酵素的測定方法(以下、単に「方法」ともいう)では、まず、試料中の酪酸と、ATPと、酪酸キナーゼとを接触してADPを生成する。本明細書において、「酪酸」との用語には、酪酸だけでなく、酪酸の異性体であるイソ酪酸も含まれる。試料中の酪酸は、塩又はイオンの状態であってもよい。酪酸塩としては、例えばアルカリ金属塩、カルシウム塩などが挙げられる。具体的には、酪酸ナトリウム、酪酸リチウム、イソ酪酸ナトリウムなどが挙げられる。
　試料は、酪酸、酪酸塩又は酪酸イオンを含む可能性がある限り、特に限定されない。試料は、例えば生体試料、飲食品などが挙げられる。生体試料としては、例えば唾液、歯肉溝滲出液、血液、血漿、血清、乳汁、尿、糞便などが挙げられる。飲食品としては、例えば牛乳などの乳製品が挙げられる。試料は、適切な溶媒で希釈してもよい。酪酸を生成する微生物の培養上清を試料として用いてもよい。
　酪酸キナーゼによる反応は通常、液体中で行われるので、試料は液状であることが好ましい。液状の試料は、溶液に限られず、細胞などの微細な固形物が懸濁した懸濁液、ゾルなども含む。例えば、試料が固形である場合、該試料を破砕して適切な溶媒中に溶解又は懸濁した後、遠心分離又はろ過により固形物を除いて、液状の試料を調製してもよい。唾液などの液状の試料が不溶性の不純物を含む場合、該試料を遠心分離又はろ過して、不溶性の不純物を除いてもよい。
　溶媒は、生化学分野において一般に用いられる水性溶媒から適宜選択できる。そのような溶媒としては、例えば水、生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。緩衝液のpHは、６以上10以下であることが好ましい。緩衝液としては、例えばMES、PIPES、BES、TES、HEPES、CHESなどのグッド緩衝液、トリス塩酸緩衝液(Tris-HCl)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、イミダゾール塩酸緩衝液などが挙げられる。酪酸キナーゼは酢酸に対してほとんど反応しないが、大量の酢酸は経時的に試薬のブランク上昇を引き起こして試薬の安定性に影響を与える。よって、酢酸又は酢酸塩を含む緩衝液を用いないことが好ましい。
　酪酸キナーゼ(ATP：ブタノエート1-ホスホトランスフェラーゼ又はEC 2.7.2.7とも呼ばれる)は、下記の式(１)で表される反応を触媒する酵素である。酪酸キナーゼ自体は公知であり、例えばアセトン・ブタノール発酵に関与するクロストリジウム(Clostridium)属細菌の代謝酵素の一つとして知られる。また、酪酸キナーゼのアミノ酸配列及び酪酸キナーゼをコードする遺伝子の塩基配列は、公知のデータベースから取得できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　酪酸キナーゼは、天然由来であってもよいし、遺伝子組み換え技術などにより人工的に得られた酵素であってもよい。本実施形態では、酪酸キナーゼは、上記の反応を触媒する作用を有する限り、天然由来の酪酸キナーゼのアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されてもよい。
　酪酸キナーゼの由来は特に限定されない。酪酸キナーゼをコードする遺伝子は、例えばアセトアナエロビウム・スティックランディイ(Acetoanaerobium sticklandii)(クロストリジウム・スティックランディイ(Clostridium sticklandii)とも呼ばれる)、サーモセディミニバクター・オセアニ(Thermosediminibacter oceani)、ナトラナエロビウス・サーモフィルス(Natranaerobius thermophilus)、シンビオバクテリウム・サーモフィラム(Symbiobacterium thermophilum)などの微生物からクローニングできる。これらの微生物及びその染色体DNAは一般に入手可能であり、例えばDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)社より購入できる。本実施形態では、アセトアナエロビウム・スティックランディイ又はサーモセディミニバクター・オセアニに由来する酪酸キナーゼを用いることが好ましい。より好ましくは好熱性細菌、例えばサーモセディミニバクター・オセアニに由来する酪酸キナーゼを用いる。アセトアナエロビウム・スティックランディイに由来する酪酸キナーゼは、例えば配列番号17で表されるアミノ酸配列を含む。また、サーモセディミニバクター・オセアニに由来する酪酸キナーゼは、例えば配列番号19で表されるアミノ酸配列を含む。
　試料と酪酸キナーゼとATPとの混合液(以下、「反応混合液」ともいう)における酪酸キナーゼの終濃度は、特に限定されない。反応混合液における酪酸キナーゼの終濃度の下限は、例えば0.01 U/mL以上、好ましくは0.1U/mL以上、更に好ましくは0.5 U/mL以上であり、該終濃度の上限は、例えば150 U/mL以下、好ましくは50 U/mL以下、更に好ましくは20 U/mL以下であればよい。なお、これらの値は、試薬組成、温度、測定波長、副波長などの測定条件で異なる場合がある。酪酸キナーゼの終濃度は、経済的な観点などからは低い方が好ましく、試薬の有効期間などの観点からは高い方が好ましい。「U/mL」は、酵素の活性値の単位である。１Uの酪酸キナーゼは、１分間に１μmolの酪酸をリン酸化する酵素量と定義される。酵素の活性値を測定する方法自体は公知であり、当業者であればルーチンの実験により容易に活性値を測定できる。
　上記の式(１)で表される酵素反応は可逆反応であるが、本実施形態では、十分量のATPを添加することにより、酵素反応は、ブチリルリン酸及びADPが生成される方へ進行する。ATPの添加量は、特に限定されない。本実施形態では、酵素反応の開始時の反応混合液におけるATPの終濃度の下限は、例えば0.1mM以上、好ましくは0.2 mM以上、更に好ましくは0.5mM以上であり、該終濃度の上限は、例えば50 mM以下、好ましくは10 mM以下、更に好ましくは５mM以下であればよい。
　本実施形態では、酪酸キナーゼによる酵素反応をより効率よく行う観点から、試料と、ATPと、酪酸キナーゼとを二価の金属イオンの存在下で接触することが好ましい。二価の金属イオンとしては、例えばマグネシウムイオン、亜鉛イオンなどが挙げられる。それらの中でも、マグネシウムイオンが特に好ましい。二価の金属イオンは、二価の金属イオンを形成する化合物又はその水溶液を、試料とATPと酪酸キナーゼとの混合液に添加することにより供給できる。二価の金属イオンの添加量は、特に限定されない。酵素反応の開始時の反応混合液における二価の金属イオンの終濃度の下限は、例えば0.1 mM以上、好ましくは0.5 mM以上、更に好ましくは１mM以上であり、該終濃度の上限は、例えば50 mM以下、好ましくは20 mM以下、更に好ましくは10mM以下であればよい。上記の条件下で使用する二価の金属イオンの量は、例えばマグネシウムイオンの場合、下限がATPの濃度に対して0.1当量以上、好ましくは0.5当量以上、更に好ましくは１当量以上であり、上限が10当量以下、好ましくは５当量以下、更に好ましくは３当量以下である。最も好ましい濃度はATPの１当量である。
　二価の金属イオンを形成する化合物は、適当な溶媒中で二価の金属イオンを生じ、かつ該化合物から生じるアニオンが酵素反応を阻害しない限り、特に限定されない。そのような化合物としては、二価の金属と無機酸との塩が好ましく、例えば塩酸、硫酸、硝酸などの酸と二価の金属との塩が挙げられる。より好ましい二価の金属塩としては、マグネシウム、亜鉛などから選択される少なくとも１つの金属の塩が挙げられる。二価の金属イオンを形成する化合物は、無水物であってもよいし、水和物であってもよい。
　必要に応じて、試料とATPと酪酸キナーゼとを界面活性剤の存在下で接触してもよい。界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤及び両性界面活性剤から適宜選択できる。それらの中でも、非イオン性界面活性剤が好ましく、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエ-テル系又はポチオキシエチレンアルキルエーテル系の非イオン性界面活性剤が特に好ましい。そのような非イオン性界面活性剤としては、例えばTriton(登録商標) X-100、TN-100 (株式会社ADEKA)、エマルゲン1150s-60 (花王株式会社)、ニューコール710 (日本乳化剤株式会社)などが挙げられる。
　本実施形態の方法では、酪酸キナーゼが触媒する反応により生成したADPを測定する。式(１)から分かるように、ADPの生成量は、酪酸キナーゼの基質である酪酸の量に比例する。よって、生成したADPを測定することにより、試料中の酪酸を測定できる。すなわち、本実施形態の方法は、試料と、ATPと、酪酸キナーゼとを接触させることにより生成されるADPの測定結果に基づき、試料中の酪酸を測定する方法とも言える。本実施形態では、生成したADPの量又は濃度を反映する測定値(以下、「ADPの測定値」ともいう)に基づいて、試料中の酪酸の量又は濃度を決定できる。例えば、濃度既知の酪酸水溶液を、試料と同様に測定することにより、ADPの測定値と酪酸濃度との関係を示す検量線を作成する。得られた検量線を用いて、反応混合液のADPの測定値から、試料中の酪酸濃度の値を決定できる。濃度既知の酪酸水溶液はキャリブレーション試薬として使用でき、キャリブレーション試薬中の酪酸濃度、成分の種類や濃度等の条件等は、当業者であれば適宜決定できる。
　ADPを測定する方法は特に限定されないが、酵素的測定法が簡便で好ましい。ADPの酵素的測定法は種々知られており、ADP測定用試薬も市販されている。本実施形態では、いずれの酵素的測定法を用いてもよい。例えば、ピルビン酸キナーゼ(PyK)及び乳酸脱水素酵素(LDH)を用いる方法が挙げられる。この方法では、まず、以下の式(２)で表されるように、ADPとホスホエノールピルビン酸(PEP)とPyKとを接触して、ピルビン酸を生成する。次いで、以下の式(３)で表されるように、生成したピルビン酸とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型(NADH)とLDHとを接触して、乳酸及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型(NAD+)(NADとも表記する)を生成する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　ここで、NADHの吸収スペクトルは340 nm付近に吸収ピークを有するが、NADの吸収スペクトルには340 nm付近に吸収ピークはないことが知られている。式(２)及び(３)から分かるように、ADPの量に応じてNADHが減少する。よって、NADHの減少による340 nm付近の吸光度の変化は、反応混合液中のADPの量又は濃度を反映する。PYK及びLDHを用いるADPの測定方法では、340 nm付近の吸光度に基づいて、ADPを測定する。NADHは自家蛍光を有するので、NADHの減少による590～600 nmに生じる蛍光強度(励起波長530～570 nm)の変化に基づいて、ADPを測定してもよい。
　また、PyK及びピルビン酸オキシダーゼを用いる方法も知られている。この方法では、まず、式(２)で表されるように、ADPとPEPとPyKとを接触して、ピルビン酸を生成する。次いで、以下の式(４)で表されるように、生成したピルビン酸とピルビン酸オキシダーゼとを、リン酸(Pi)及び酸素の存在下で接触する。この酵素反応により、アセチルリン酸、二酸化炭素及び過酸化水素が生成する。式(２)及び(４)から分かるように、過酸化水素の生成量は、反応混合液中のADPの量に比例する。このADPの測定方法では、生成した過酸化水素を、ペルオキシダーゼを用いる呈色反応により測定することにより、ADPを測定する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　本実施形態では、ADPの酵素的測定法の中でも、ADP依存性ヘキソキナーゼ(ADP-HK)及びグルコース-6-リン酸脱水素酵素(G6PDH)を用いる方法が好ましい。この方法では、まず、以下の式(５)で表されるように、ADPとグルコースとADP-HKとを接触して、グルコース-6-リン酸 (G6P)を生成する。この反応は、二価の金属イオンの存在下で行うことが好ましい。次いで、以下の式(６)で表されるように、生成したG6PとNAD+とG6PDHとを接触して、6-ホスホグルコノ-δ-ラクトン及びNADHを生成する。式(５)及び(６)から分かるように、NADHの生成量は、反応混合液中のADPの量に比例する。このADPの測定方法では、生成したNADHを測定することにより、ADPを測定する。式(６)で表される酵素反応では、NAD+に替えて、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型(NADP+)(NADPとも表記する)を用いてもよい。この場合、生成したニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型(NADPH)を測定することにより、ADPを測定する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　NADH又はNADPHの測定は、生成したNADH又はNADPHを含む反応混合液の吸光度を測定することにより行うことができる。NADH又はNADPHの増加により、反応混合液の340 nm付近の吸光度が上昇する。この吸光度の変化に基づいて、ADPを測定できる。また、NADH及びNADPHは自家蛍光を有するので、励起波長530～570 nmで590～600 nmに生じる蛍光強度を測定することで更に高感度の測定が可能となる。あるいは、生成したNADH又はNADPHと、発色試薬と、電子キャリアとを接触させて色素を生成し、生成した色素を含む反応混合液の吸光度を測定することにより、NADH又はNADPHを測定してもよい。発色試薬及び電子キャリアは、NAD/NADH(又はNADP/NADPH)測定用試薬として市販されている。
　電子キャリアは、NADH又はNADPHから電子を受容して、発色試薬に電子を供与できる物質であれば、特に限定されない。そのような電子キャリアとしては、例えばジアホラーゼ、フェナジンメトサルフェート、メトキシフェナジンメトサルフェート、ジメチルアミノベンゾフェノキサジニウムクロライド(メルドラブルー)などが挙げられる。それらの中でもジアホラーゼが特に好ましい。
　発色試薬は、電子キャリアから電子を供与されることにより還元されて、色素を生成する物質であれば、特に限定されない。そのような物質としては、例えばテトラゾリウム化合物などが挙げられる。以下の式(７)に示されるように、電子キャリアの作用によりテトラゾリウム化合物が還元されると、種々の色を呈するホルマザン色素に変換される。式(７)で表される反応では、NADHに替えて、NADPHを用いてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　テトラゾリウム化合物は、テトラゾール環を有する化合物又はその塩であれば、特に限定されない。テトラゾリウム化合物は、発色試薬として種々の化合物が市販されている。例えば、WST-1(2-(4-ヨードフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム一ナトリウム塩)、WST-8(2-(2-メトキシ-4-ニトロフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム)、NBT(ニトロブルーテトラゾリウム)、MTT(3-(4,5-ジメチル-2-チアゾリル)-2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウムブロミド)、XTT(2,3-ビス-(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム-5-カルボキシアニリド)、INT(2-(4-ヨードフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-フェニル-2H-テトラゾリウムクロリド)などが挙げられる。それらの中でも、水溶性ホルマザン色素を生成するWST-1などが好ましい。
　生体試料、特に赤血球を含む生体試料には、内因性のアデニレートキナーゼ(ミオキナーゼとも呼ばれる)が含まれる場合がある。アデニレートキナーゼは、式(８)で表される反応を触媒することにより、ADPを繰り返して反応させるので、本実施形態の方法は正の干渉を受ける。アデニレートキナーゼによる内因性干渉を避けるため、アデニレートキナーゼの阻害剤であるP1,P5-ジ(アデノシン-5'-)ペンタリン酸(Ap5A)を試料又は反応混合液に添加してもよい。Ap5Aの添加量は、酵素反応の開始時の反応混合液におけるAp5Aの終濃度で表して、例えば１μM以上200μM以下、さらに好ましくは5μM以上50μM以下である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　本実施形態では、上記の酪酸キナーゼによる反応と、ADPの酵素的測定法とを同じ反応系で行うことが好ましい。反応系とは、酵素反応に必要な成分が存在し、該反応が起こる限定された環境を意味する。例えば、試料と、ATPと、酪酸キナーゼと、ADPの酵素的測定法に用いられる成分とを接触させることにより、酪酸キナーゼによる反応と、ADPの酵素的測定法とを同じ反応系で行うことができる。このような反応系では、酪酸キナーゼによる酵素反応により生成したADPは、すぐにADPの酵素的測定法で消費される。よって、上記の式(１)で示される酵素反応は、ブチリルリン酸及びADPが生成される方へより促進される。
　図１を参照して、上記の式(１)、(５)及び(６)で表される反応を同じ反応系で行った場合の経路について説明する。この反応系は、試料、ATP、酪酸キナーゼ(BK)、グルコース、NAD又はNADP、ADP-HK及びG6PDHを含む。好ましい実施形態では、反応系は、二価の金属イオンをさらに含む。まず、試料とATPとBKとが接触することにより、ブチリルリン酸及びADPが生成される。次いで、生成したADPとグルコースとADP-HKとが接触することにより、G6P及びアデノシン一リン酸(AMP)が生成される。そして、生成したG6PとNAD(又はNADP)とG6PDHとが接触することにより、6-ホスホグルコノ-δ-ラクトン及びNADH(又はNADPH)が生成する。本実施形態では、NADH又はNADPHの増加による340 nm付近の吸光度の変化に基づいて、ADPを測定する。あるいは、NADH又はNADPHの増加による590～600 nmに生じる蛍光強度(励起波長530～570 nm)の変化に基づいて、ADPを測定する。また、図２に、上記の式(１)及び(５)～(７)で表される反応を同じ反応系で行った場合の経路を示す。図２では、G6PDHの作用により生成したNADH(又はNADPH)とテトラゾリウム化合物とジアホラーゼとを接触させることにより、ホルマザン色素及びNAD(又はNADP)が生成する。本実施形態では、ホルマザン色素の増加による吸光度の変化に基づいて、ADPを測定する。
　吸光度の変化に基づくADPの測定は、レートアッセイにより行ってもよいし、エンドポイントアッセイにより行ってもよい。レートアッセイでは、反応開始後の単位時間当たりの吸光度変化の量に基づいて、反応混合液中のADPを測定する。エンドポイントアッセイでは、反応開始前の吸光度と反応終了後の吸光度との差に基づいて、反応混合液中のADPを測定する。
　本実施形態において、反応温度は、用いる酵素が作用する室温や常温などの温度範囲であればよく、通常10℃以上60℃以下であり、好ましくは15℃以上50℃以下であり、より好ましくは20℃以上40℃以下である。汎用の自動分析機を使用する場合は、37℃が好ましい。反応時間は、試料中の酪酸を正確に測定することができれば特に限定されないが、30秒以上60分以下であり、好ましくは１分以上30分以下である。汎用の自動分析機を使用する場合は10分が特に好ましい。反応混合液におけるpHは、用いる酵素が作用するpH範囲であればよく、通常６以上10以下であり、好ましくは6.5以上9.5以下であり、より好ましくは７以上8.5以下である。テトラゾリウム塩を用いた発色系は、pH８以上では内因性還元物質の影響を受けるので、pH８以下で反応させた方が良い。酪酸キナーゼによる反応と、ADPの酵素的測定法とを同じ反応系で行う場合も、反応温度、反応時間及びpHは、上記の範囲から適宜選択できる。pHを調整するために、上記の緩衝液を試料又は反応混合液に添加してもよい。
　本実施形態では、反応停止液を添加することにより、酵素反応を停止してからADPの測定を行ってもよい。反応停止液は、変性剤を含む溶液であれば特に限定されない。変性剤としては、例えば塩酸、硫酸、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ドデシル硫酸リチウムなどが挙げられる。
[２．炭素数３～６の短鎖脂肪酸の酵素的測定方法]
　さらなる実施形態では、試料中の炭素数３～６の短鎖脂肪酸と、ATPと、酪酸キナーゼとを接触してADPを生成し、生成したADPを測定する工程を含む、酵素的測定方法が提供される。唾液や糞便などのように、微生物が存在する環境から得た生体試料には、該微生物により生成された種々の短鎖脂肪酸が含まれることが知られている。そのような生体試料中の短鎖脂肪酸としては、酢酸、プロピオン酸、酪酸などが挙げられるが、一般に、酢酸が他の脂肪酸よりも多く含まれる傾向にある。一方、歯周病やクローン病などの炎症性疾患では、口腔内及び腸内の細菌により産生された酪酸やプロピオン酸など、酢酸以外の短鎖脂肪酸の作用が注目されている。ここで、酪酸キナーゼは、後述の参考例７に示されるように、酪酸を含め、炭素数３～６の短鎖脂肪酸を基質として反応する。しかし、酪酸キナーゼは、酢酸を実質的に基質としない。すなわち、試料中に酢酸と炭素数３～６の短鎖脂肪酸とが混在する場合、酪酸キナーゼを用いる酵素的測定法は、酢酸を測定することなく、炭素数３～６の短鎖脂肪酸を測定することが可能となる。
　酪酸キナーゼは、上記の式(１)で表される反応を触媒する酵素であるが、酪酸以外の炭素数３～６の短鎖脂肪酸に対しても同様のリン酸化反応を触媒する。すなわち、酪酸キナーゼの存在下で、炭素数３～６の短鎖脂肪酸とATPとが接触すると、ATPのリン酸基が該脂肪酸に転位して、リン酸化された脂肪酸とADPが生成する。酪酸キナーゼの詳細は上記のとおりである。
　本明細書において、「短鎖脂肪酸」とは、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、イソ吉草酸及びカプロン酸を含む。乳酸とコハク酸は、その性質がかなり異なるため、「短鎖脂肪酸」には含めない(坂田隆、市川宏文、「短鎖脂肪酸の生理活性」日本油化学会誌 Vol.46 (1997) No.10, PP.1205-1212)。炭素数３～６の短鎖脂肪酸は、直鎖状でもよいし、分岐鎖状でもよい。炭素数３～６の短鎖脂肪酸としては、例えばプロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、イソ吉草酸、カプロン酸などが挙げられる。試料中の炭素数３～６の短鎖脂肪酸は、塩又はイオンの状態であってもよい。脂肪酸の塩としては、例えばアルカリ金属塩、カルシウム塩などが挙げられる。脂肪酸のアルカリ金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩などが挙げられる。
　試料は、炭素数３～６の短鎖脂肪酸、それらの塩又はイオンを含む可能性がある限り、特に限定されない。試料に含まれる炭素数３～６の短鎖脂肪酸は１種でもよいし、２種以上でもよい。そのような試料としては、上記の生体試料、飲食品などが挙げられる。また、試料として、炭素数３～６の短鎖脂肪酸を生成する微生物の培養上清を用いてもよい。試料は、適切な溶媒で希釈してもよい。溶媒の詳細は上記のとおりである。本実施形態では、試料は液状であることが好ましい。液状の試料及びその調製の詳細は、上記のとおりである。
　試料中の炭素数３～６の短鎖脂肪酸と、ATPと、酪酸キナーゼとを接触してADPを生成する工程は、上記の本実施形態の方法のADPを生成する工程と同様にして行うことができる。反応混合液における酪酸キナーゼ及びATPの終濃度は、上記のとおりである。また、本実施形態の酵素的測定方法では、二価の金属イオン及び／又は界面活性剤の存在下で、試料とATPと酪酸キナーゼとを接触してもよい。二価の金属イオン及びそれを形成する化合物、並びに界面活性剤の詳細は、上記のとおりである。
　本実施形態の酵素的測定方法では、酪酸キナーゼが触媒する反応により生成したADPを測定する。ADPの測定方法の詳細は、上記の本実施形態の方法について述べたことと同じである。ADPの生成量は、酪酸キナーゼの基質である炭素数３～６の短鎖脂肪酸の量に比例する。よって、生成したADPを測定することにより、試料中の炭素数３～６の短鎖脂肪酸を測定できる。すなわち、生成したADPの測定値は、試料中の炭素数３～６の短鎖脂肪酸の総量、又は単位体積当たりの炭素数３～６の短鎖脂肪酸の総量を示す。本実施形態の酵素的測定方法は、試料と、ATPと、酪酸キナーゼとを接触させることにより生成されるADPの測定結果に基づき、試料中の炭素数３～６の短鎖脂肪酸を測定する方法とも言える。
　本実施形態では、検量線を用いて、ADPの測定値から、試料中の炭素数３～６の短鎖脂肪酸の総量の値、又は単位体積当たりの炭素数３～６の短鎖脂肪酸の総量の値を決定してもよい。一方で、具体的にどの短鎖脂肪酸が試料中に含まれるかは不明である場合が多いので、検量線作成のための標準液を厳密に調製することは難しい。そこで、試料中の炭素数３～６の短鎖脂肪酸が１種であると仮定して、検量線作成のための標準液を調製してもよい。例えば、炭素数３～６の短鎖脂肪酸から選択されるいずれか１種を所定の濃度で含む水溶液を調製する。炭素数３～６の短鎖脂肪酸のうち、いずれを選択するかは特に限定されないが、例えば、測定対象の試料中に最も多く含まれると考えられる短鎖脂肪酸を選択してもよい。好ましい実施形態では、濃度既知の酪酸水溶液を検量線作成のための標準液として用いる。標準液を試料と同様に測定することにより、ADPの測定値と短鎖脂肪酸の濃度との関係を示す検量線を作成できる。
[３．酵素的測定用試薬]
　本実施形態の酵素的測定用試薬(以下、単に「試薬」ともいう)は、酪酸キナーゼと、ATPとを含む。本実施形態の試薬は、上記の本実施形態の酵素的測定方法に用いられる。本実施形態の試薬は、酪酸キナーゼ及びATPの両方を１つの試薬中に含む一試薬の形態であってもよい。あるいは、本実施形態の試薬は、ATPを含む第１試薬と、酪酸キナーゼを含む第２試薬とを含む二試薬の形態であってもよい。
　本実施形態では、試薬を収容した容器を箱に梱包して、ユーザに提供してもよい。箱には、試薬の使用方法などを記載した添付文書を同梱していてもよい。図３及び４に、本実施形態の試薬の例を示す。図３を参照して、１０は、一試薬の形態の試薬を示し、１１は、試薬を収容した第１容器を示し、１２は、梱包箱を示し、１３は、添付文書を示す。図４を参照して、２０は、二試薬の形態の試薬を示し、２１は、第１試薬を収容した第１容器を示し、２２は、第２試薬を収容した第２容器を示し、２３は、梱包箱を示し、２４は、添付文書を示す。
　本実施形態の試薬は、酪酸キナーゼ及びATPを固体(粉末、結晶、凍結乾燥品など)の状態で含んでもよい。あるいは、本実施形態の試薬は、酪酸キナーゼ及びATPが適切な溶媒に溶解された溶液の状態で含んでもよい。試薬が二試薬の形態である場合は、第１試薬及び第２試薬のいずれか一方が固体の状態であり、残りの一方が溶液の状態であってもよい。好ましくは、第１試薬及び第２試薬の両方が溶液の状態である。溶媒としては、例えば水、生理食塩水、緩衝液などの水性溶媒が挙げられる。緩衝液の詳細は、上記のとおりである。
　試薬が溶液の状態である場合、試薬中の酪酸キナーゼの濃度は、試薬と試料とを混合したときの酪酸キナーゼの終濃度を上述の数値範囲にできる濃度であればよい。したがって、試薬における酪酸キナーゼの濃度は、試薬と試料との混合比から決定できる。本実施形態では、試薬における酪酸キナーゼの濃度の下限は、例えば0.02 U/mL以上、好ましくは0.2 U/mL以上、更に好ましくは１U/mL以上であり、該濃度の上限は、例えば750 U/mL以下、好ましくは250 U/mL以下、更に好ましくは100 U/mL以下である。
　試薬が溶液の状態である場合、試薬中のATPの濃度は、試薬と試料とを混合したときのATPの終濃度を上述の数値範囲にできる濃度であればよい。したがって、試薬におけるATPの濃度は、試薬と試料との混合比から決定できる。本実施形態では、試薬におけるATPの濃度の下限は、例えば0.2 mM以上、好ましくは0.4 mM以上、更に好ましくは１mM以上であり、該濃度の上限は、例えば250 mM以下、好ましくは50 mM以下、更に好ましくは25 mM以下である。
　試薬が溶液の状態である場合、試薬のpHは、通常６以上10以下であり、好ましくは6.5以上9.5以下であり、より好ましくは７以上8.5以下である。試薬が二試薬の形態である場合も、上記の範囲からpHを適宜決定できる。pHの調整のため、上記の緩衝液を試薬に添加してもよい。酪酸キナーゼの至適pHは８～９であるが、pH７～7.5でも十分に活性を示す。よって、酪酸キナーゼと共に試薬中に収容される他の成分が中性付近のpHで安定である場合は、試薬のpHを７～7.5に調整してもよい。他の成分としては、例えばADPの酵素的測定法に用いられる成分、発色試薬、電子キャリアなどが挙げられる。特に、試薬がテトラゾリウム化合物を含む場合、試薬のpHは7.5以下であることが望ましい。
　本実施形態の試薬は、二価の金属イオンをさらに含むことが好ましい。二価の金属イオンを形成する化合物を試薬に添加することにより、試薬は二価の金属イオンを含有できる。二価の金属イオンを形成する化合物の詳細は、上記のとおりである。二価の金属イオンとしては、マグネシウムイオン、亜鉛イオンなどが挙げられる。それらの中でも、マグネシウムイオンが特に好ましい。試薬中の二価の金属イオンの濃度は、試薬と試料とを混合したときの二価の金属イオンの終濃度を上述の数値範囲にできる濃度であればよい。したがって、試薬における二価の金属イオンの濃度は、試薬と試料との混合比から決定できる。本実施形態では、試薬における二価の金属イオンの濃度の下限は、例えば0.2 mM以上、好ましくは１mM以上、更に好ましくは２mM以上であり、該濃度の上限は、例えば250 mM以下、好ましくは100 mM以下、更に好ましくは50 mM以下である。
　本実施形態の試薬は、ADPの酵素的測定法に用いられる成分をさらに含んでもよい。ADPの酵素的測定法に用いられる成分としては、酵素、基質、補酵素などが挙げられる。好ましい実施形態では、試薬は、グルコース、ADP-HK、NAD又はNADP、及びG6PDHをさらに含む。試薬が二試薬の形態である場合、上記の成分はそれぞれ、第１試薬及び第２試薬のいずれに含まれてもよい。試薬中の各成分の濃度は、反応混合液中のADPを正確に測定できれば特に限定されない。そのような濃度は、例えば市販のADP測定用試薬を参照するなどして当業者が適宜決定できる。試薬中の各成分の濃度の一例として、グルコースの濃度は0.1 mM以上100mM以下であり、ADP-HKの濃度は0.2 U/mL以上20 U/mL以下であり、NAD又はNADPの濃度は0.1 mM以上５mM以下であり、G6PDHの濃度は0.2 U/mL以上20 U/mL以下である。
　試薬が、グルコース、ADP-HK、NAD又はNADP、及びG6PDHを含む場合、試薬は、発色試薬及び電子キャリアをさらに含んでもよい。試薬が二試薬の形態である場合、発色試薬及び電子キャリアはそれぞれ、第１試薬及び第２試薬のいずれに含まれてもよい。発色試薬及び電子キャリアの詳細は、上記のとおりである。試薬中の発色試薬及び電子キャリアのそれぞれの濃度は、反応混合液中のADPを正確に測定できれば特に限定されない。そのような濃度は、例えば市販のNAD/NADH(又はNADP/NADPH)測定用試薬を参照するなどして当業者が適宜決定できる。発色試薬としてテトラゾリウム化合物を含む場合、試薬中の濃度は、例えば0.05 mM以上５mM以下である。電子キャリアとしてジアホラーゼを含む場合、試薬中の濃度は、例えば0.1 U/mL以上10 U/mL以下である。
　必要に応じて、試薬は、界面活性剤をさらに含んでもよい。また、試薬は、無機塩類をさらに含んでもよい。試薬が二試薬の形態である場合、界面活性剤及び無機塩類はそれぞれ、第１試薬及び第２試薬のいずれに含まれてもよい。界面活性剤及び無機塩類の詳細は、上記のとおりである。試薬が非イオン性界面活性剤を含む場合、試薬中の濃度は、例えば0.01%(W/V)以上２%(W/V)以下である。試薬がカリウム塩を含む場合、試薬中の濃度は、例えば１mM以上200mM以下である。
　本実施形態の試薬は、容器に収容された反応停止液と共に、試薬キットとして提供されてもよい。反応停止液の詳細は、上記のとおりである。反応停止液中の変性剤の濃度は、変性剤の種類に応じて適宜決定できる。変性剤としてSDS又はドデシル硫酸リチウムを含む場合、反応停止液中の濃度は、例えば0.1%(W/V)以上10%(W/V)以下である。
　本実施形態の試薬は、歯周病診断用試薬であってもよい。また、本実施形態は、前記試薬を用いて、被検体由来の試料中の炭素数３～６の短鎖脂肪酸を測定する工程を含む、歯周病の診断を補助する方法に関する。別の実施形態は、酵素的測定用試薬の製造のための酪酸キナーゼ及びATPの使用に関する。さらなる実施形態は、歯周病診断用試薬の製造のための酪酸キナーゼ及びATPの使用に関する。
　以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　参考例１～６では、種々の微生物の染色体DNAから酪酸キナーゼをコードする遺伝子をクローニングし、大腸菌発現系を用いて組換え型酪酸キナーゼを取得した。
参考例１：アセトアナエロビウム・スティックランディイ由来酪酸キナーゼの調製
(１) 形質転換体の作製
　DSMZ社から購入したアセトアナエロビウム・スティックランディイ(DSM No.519)の染色体DNAを鋳型として、センスプライマー(配列番号１)及びアンチセンスプライマー(配列番号２)並びにKOD FX (品番：KFX-101、東洋紡株式会社)を用いてPCRを行い、酪酸キナーゼ遺伝子を増幅して約1100 bpのPCR産物を得た。得られたPCR産物の塩基配列をシーケンシングにより確認した。アセトアナエロビウム・スティックランディイ由来の酪酸キナーゼの塩基配列及びその塩基配列から推定されるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号16及び17に示した。得られたPCR産物をEcoRI(タカラバイオ株式会社)及びHindIII(タカラバイオ株式会社)で消化し、発現ベクターであるpET-21a(+)ベクター(Novagen社)のEcoRI-HindIII部位に挿入して、astBK/pET21a(+)発現用プラスミドを得た。この発現用プラスミドでは、酪酸キナーゼ遺伝子の5’末端にベクター由来のT7タグ及びリンカーをコードする塩基配列が付加された。また、酪酸キナーゼ遺伝子の3’末端に、ベクター由来のリンカー及びHisタグをコードする塩基配列が付加された。すなわち、astBK/pET21a(+)発現用プラスミドは、T7タグ－リンカー－酪酸キナーゼ－リンカー－Hisタグをコードするポリヌクレオチドを含んでいた。この発現用プラスミドをOne shot BL21(DE3) Chemically Competent E.coli (Invitrogen社)に導入して、アセトアナエロビウム・スティックランディイ由来酪酸キナーゼをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを有する形質転換体astBK/pET-21a(+)/BL21(DE3)を得た。
(２) 組換え型酪酸キナーゼの調製
(2.1) 形質転換体における酪酸キナーゼの誘導及び粗酵素液の調製
　上記の形質転換体を１コロニー取り、これを50μg/mLアンピシリン含有LB液体培地(５mL)に植菌して、試験管にて約25℃で約16時間培養した。培養物(1.6 mL)を、50μg/mLアンピシリン含有液体培地(１％グリセロール含有Overnight Express(商標) Instant TB Medium(メルク社)、0.1％アデカノールLG-109(ADEKA社製))(1.6 L)に添加して、ジャーファーメンターにて30℃、pH 6.8、650 rpmの条件で約25時間培養した。培養物を遠心分離して集菌し、得られた菌体を溶液Ａ(10 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.5)、0.3 M NaCl)で懸濁した。懸濁液中の菌体を超音波で破砕して可溶化した後、遠心分離して上清を得た。この上清を粗酵素液として用いた。
(2.2) 組換え型酪酸キナーゼの精製
　Chelating Sepharose Fast Flow (GEヘルスケア社)をカラムに充填してNi2+を固定化した後、溶液Ａで平衡化した。得られたカラムに上記の粗酵素液を添加して、組換え型酪酸キナーゼを吸着させた。カラムを溶液Ａで洗浄した後、溶液Ａ及び0.4 Mイミダゾール含有溶液Ａを用いた10 CV(カラムボリューム)のリニアグラジエントにより、組換え型酪酸キナーゼを溶出した。得られた組換え型酪酸キナーゼの活性画分を、ペンシル型モジュール(UF)(旭化成ケミカルズ株式会社)で1/10量となるまで濃縮し、10 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.5)で平衡化したPD-10カラム(GEヘルスケア社)で脱塩して、組換え型酪酸キナーゼの溶液を得た。得られた酪酸キナーゼの溶液を一部取り、SDS-PAGEで分析した。結果を図５に示す。図中、レーン１は酵素溶液を示し、レーン２は分子量マーカーを示し、矢印は酪酸キナーゼに相当するバンドを示す。以下、参考例１で得られたアセトアナエロビウム・スティックランディイ由来組換え型酪酸キナーゼを「BKII」とも呼ぶ。
参考例２：サーモセディミニバクター・オセアニ由来酪酸キナーゼの調製(１)
　DSMZ社から購入したサーモセディミニバクター・オセアニ(DSM No.16646)の染色体DNAを鋳型として、センスプライマー(配列番号３)及びアンチセンスプライマー(配列番号４)並びにKOD FX (品番：KFX-101)を用いてPCRを行い、酪酸キナーゼ遺伝子を増幅して約1100 bpのPCR産物を得た。得られたPCR産物の塩基配列をシーケンシングにより確認した。参考例２のサーモセディミニバクター・オセアニ由来の酪酸キナーゼの塩基配列及びその塩基配列から推定されるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号18及び19に示した。得られたPCR産物をNdeI(タカラバイオ株式会社)及びHindIIIで消化し、pET-21a(+)ベクターのNdeI-HindIII部位に挿入して、ToBK/pET21a(+)発現用プラスミドを得た。この発現用プラスミドでは、酪酸キナーゼ遺伝子の3’末端に、ベクター由来のリンカー及びHisタグをコードする塩基配列が付加された。すなわち、ToBK/pET21a(+)発現用プラスミドは、酪酸キナーゼ－リンカー－Hisタグをコードするポリヌクレオチドを含んでいた。この発現用プラスミドをOne shot BL21(DE3) Chemically Competent E.coliに導入して、サーモセディミニバクター・オセアニ由来酪酸キナーゼをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを有する形質転換体ToBK/pET-21a(+)/BL21(DE3)を得た。得られた形質転換体を参考例１と同様にして培養し、菌体から粗酵素液を調製した。得られた粗酵素液を参考例１と同様にして精製し、組換え型酪酸キナーゼの溶液を得た。得られた酪酸キナーゼの溶液を一部取り、SDS-PAGEで分析した。結果を図６に示す。図中、レーン１は酵素溶液を示し、レーン２は分子量マーカーを示し、矢印は酪酸キナーゼに相当するバンドを示す。
参考例３：サーモセディミニバクター・オセアニ由来酪酸キナーゼの調製(２)
　DSMZ社から購入したサーモセディミニバクター・オセアニ(DSM No.16646)の染色体DNAを鋳型として、センスプライマー(配列番号３)及びアンチセンスプライマー(配列番号５)並びにKOD FX (品番：KFX-101)を用いてPCRを行い、酪酸キナーゼ遺伝子を増幅して約1100 bpのPCR産物を得た。得られたPCR産物の塩基配列をシーケンシングにより確認した。この酪酸キナーゼの塩基配列及びその塩基配列から推定されるアミノ酸配列はそれぞれ配列番号18及び19で表される配列と同じであった。得られたPCR産物をNdeI及びHindIIIで消化し、pET-21a(+)ベクターのNdeI-HindIII部位に挿入して、ToBKIII/pET21a(+)発現用プラスミドを得た。この発現用プラスミドでは、酪酸キナーゼ遺伝子にタグは付加されなかった。この発現用プラスミドをOne shot BL21(DE3) Chemically Competent E.coliに導入して、サーモセディミニバクター・オセアニ由来酪酸キナーゼをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを有する形質転換体ToBKIII/pET-21a(+)/BL21(DE3)を得た。得られた形質転換体を参考例１と同様にして培養した。培養物を遠心分離して集菌し、得られた菌体を20 mM Tris-HCl(pH 7.5)で懸濁した。懸濁液中の菌体を超音波で破砕して可溶化した後、遠心分離して上清を得た。この上清を粗酵素液として用いた。
　Q Sepharose Fast Flow (GEヘルスケア社)をカラムに充填し、10 mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液で平衡化した。得られたカラムに上記の粗酵素液を添加して組換え型酪酸キナーゼを吸着させた。その後、10 mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液及び0.5 M KCl含有10 mM Tris-HCl(pH8.0)溶液を用いた10 CV(カラムボリューム)のリニアグラジエントにより、組換え型酪酸キナーゼを溶出した。組換え型酪酸キナーゼの活性画分を確認し、18%になるように硫酸アンモニウムを添加した。Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(high sub)(GEヘルスケア社)をカラムに充填し、18%硫酸アンモニウム含有10 mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液で平衡化して、上記の18%硫酸アンモニウムを含む活性画分を吸着させた。その後、18%硫酸アンモニウム含有10 mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液及び10 mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液を用いた10 CVのリニアグラジエントにより、組換え型酪酸キナーゼを溶出した。組換え型酪酸キナーゼの活性画分を確認して回収した。得られた組換え型酪酸キナーゼの活性画分を、Amicon Ultra-15遠心式フィルターユニット(ミリポア社)で濃縮し、PD-10カラム(GEヘルスケア社)で10 mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液にBuffer交換して、組換え型酪酸キナーゼの溶液を得た。得られた酪酸キナーゼの一部をSDS-PAGEで分析した。結果を図７に示す。図中、レーン１は酵素溶液を示し、レーン２は分子量マーカーを示し、矢印は酪酸キナーゼに相当するバンドを示す。以下、参考例３で得られたサーモセディミニバクター・オセアニ由来組換え型酪酸キナーゼを「BKIII」とも呼ぶ。
参考例４：サーモセディミニバクター・オセアニ由来酪酸キナーゼの調製(３)
　DSMZ社から購入したサーモセディミニバクター・オセアニ(DSM No.16646)の染色体DNAを鋳型として、センスプライマー(配列番号６)及びアンチセンスプライマー(配列番号７)並びにKOD FX (品番：KFX-101)を用いてPCRを行い、酪酸キナーゼ遺伝子を増幅して約1100 bpのPCR産物を得た。得られたPCR産物の塩基配列をシーケンシングにより確認した。参考例４で得たサーモセディミニバクター・オセアニ由来の酪酸キナーゼの塩基配列及びその塩基配列から推定されるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号20及び21に示した。得られたPCR産物をNdeI及びHindIIIで消化し、pET-21a(+)ベクターのNdeI-HindIII部位に挿入して、ToBK2/pET21a(+)発現用プラスミドを得た。この発現用プラスミドでは、酪酸キナーゼ遺伝子の3’末端に、ベクター由来のリンカー及びHisタグをコードする塩基配列が付加された。すなわち、ToBK2/pET21a(+)発現用プラスミドは、酪酸キナーゼ－リンカー－Hisタグをコードするポリヌクレオチドを含んでいた。ToBK2/pET21a(+)発現用プラスミドを用いて、参考例２と同様にしてサーモセディミニバクター・オセアニ由来組換え型酪酸キナーゼの溶液を得た。
参考例５：ナトラナエロビウス・サーモフィルス由来酪酸キナーゼの調製
　DSMZ社から購入したナトラナエロビウス・サーモフィルス(DSM No.18059)の染色体DNAを鋳型として、センスプライマー(配列番号８)及びアンチセンスプライマー(配列番号９)並びにKOD FX (品番：KFX-101)を用いてPCRを行い、酪酸キナーゼ遺伝子を増幅して約1100 bpのPCR産物を得た。得られたPCR産物の塩基配列をシーケンシングにより確認した。ナトラナエロビウス・サーモフィルス由来の酪酸キナーゼの塩基配列及びその塩基配列から推定されるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号22及び23に示した。得られたPCR産物をNdeI及びHindIIIで消化し、pET-21a(+)ベクターのNdeI-HindIII部位に挿入して、NtBK/pET21a(+)発現用プラスミドを得た。この発現用プラスミドでは、酪酸キナーゼ遺伝子の3’末端に、ベクター由来のリンカー及びHisタグをコードする塩基配列が付加された。すなわち、NtBK/pET21a(+)発現用プラスミドは、酪酸キナーゼ－リンカー－Hisタグをコードするポリヌクレオチドを含んでいた。NtBK/pET21a(+)発現用プラスミドを用いて、参考例２と同様にしてナトラナエロビウス・サーモフィルス由来組換え型酪酸キナーゼの溶液を得た。
参考例６：シンビオバクテリウム・サーモフィラム由来酪酸キナーゼの調製
　DSMZ社から購入したシンビオバクテリウム・サーモフィラム(DSM No.24528)の染色体DNAを鋳型として、センスプライマー(配列番号10)及びアンチセンスプライマー(配列番号11)並びにKOD FX (品番：KFX-101)を用いてPCRを行い、酪酸キナーゼ遺伝子を増幅して約1100 bpのPCR産物を得た。得られたPCR産物の塩基配列をシーケンシングにより確認した。シンビオバクテリウム・サーモフィラム由来の酪酸キナーゼの塩基配列及びその塩基配列から推定されるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号24及び25に示した。得られたPCR産物をNdeI及びHindIIIで消化し、pET-21a(+)ベクターのNdeI-HindIII部位に挿入して、StBK/pET21a(+)発現用プラスミドを得た。この発現用プラスミドでは、酪酸キナーゼ遺伝子の3’末端に、ベクター由来のリンカー及びHisタグをコードする塩基配列が付加された。すなわち、StBK/pET21a(+)発現用プラスミドは、酪酸キナーゼ－リンカー－Hisタグをコードするポリヌクレオチドを含んでいた。StBK/pET21a(+)発現用プラスミドを用いて、参考例２と同様にしてシンビオバクテリウム・サーモフィラム由来組換え型酪酸キナーゼの溶液を得た。
実施例１：組換え型酪酸キナーゼの活性測定
　BKII及びBKIIIの酪酸に対する酵素活性を、ADPの生成量に基づいて測定した。この実施例１では、酪酸キナーゼの作用により生成したADPを利用して、ADP依存性ヘキソキナーゼ及びグルコース-6-リン酸脱水素酵素の作用によりNADPHを生成し(図１参照)、NADPHの増加による340 nmにおける吸光度の変化に基づいて、ADPの生成量を測定した。測定は、7080形日立自動分析装置(株式会社日立ハイテクノロジーズ)を用いて行った。
(１) 試薬及び装置
[第１試薬の組成]
50 mM Tris-HCl(pH 7.5) (シグマ社)
2 mM ATP(pH 7.5) (オリエンタル酵母株式会社)
2 mM MgCl2 (富士フイルム和光純薬株式会社)
20 mM グルコース (富士フイルム和光純薬株式会社)
100 mM 酪酸ナトリウム (富士フイルム和光純薬株式会社)
1 mM NADP (富士フイルム和光純薬株式会社)
5 U/mL G6PDH II (グルコース-6-リン酸脱水素酵素：T-51、旭化成ファーマ株式会社)
5 U/mL ADP-HK II (ADP依存性ヘキソキナーゼ：T-92、旭化成ファーマ株式会社)
0.1% TN-100 (株式会社ADEKA)
[BKII希釈液の組成]
50 mM Tris-HCl(pH 7.5) (シグマ社)
10 mM KCl (富士フイルム和光純薬株式会社)
[BKIII希釈液の組成]
50 mM リン酸カリウム緩衝液(pH 7.0) (シグマ社)
0.1% TN-100 (株式会社ADEKA)
[自動分析装置の測定パラメータ]
分析方法 Rate-A
測定波長(副/主) 700 nm/340 nm
反応時間 5分
測光ポイント 11-16
試料量 3μL
第１試薬量 150μL
(２) 試料の調製
　参考例１で得たBKII溶液をBKII希釈液で200倍希釈して、BKIIを含む試料を調製した。参考例３で得たBKIII溶液をBKIII希釈液で40000倍希釈して、BKIIIを含む試料を調製した。
(３) 酵素活性の測定
　キュベットに試料を分注し、次いで第１試薬を添加して撹拌した。試料と第１試薬との混合液を37℃で５分間インキュベートした。キュベットに光を照射して、第１試薬の添加後約200秒から約296秒の間の340 nmにおける吸光変化を測定した。これらの操作は自動分析装置により行われた。酪酸キナーゼの活性値(U/mL)は、１分間に１μmolの酪酸をリン酸化する酵素量を１Uと定義して、測光ポイントにおける吸光度より算出された１分間当たりの吸光度変化の値(ΔmAbs/min)及びNADHの340 nmにおけるミリモル吸光係数(ε＝6.3)を用いて、下記の式から算出した。その結果、BKIIの活性値は約340 U/mLであり、BKIIIの活性値は約1800 U/mLであった。
酪酸キナーゼ活性値(U/mL)
＝[(ΔmAbs/min)/(NADHの340 nmにおけるミリモル分子吸光係数)]×[(試料量＋第１試薬量)/(試料量)]×(酵素の希釈倍数)
＝[(ΔmAbs/min)/6.3]×[(3＋150)/3]×(酵素の希釈倍数)
参考例７：組換え型酪酸キナーゼの各種パラメータの測定
(１) 比活性
　比活性(U/mg)は、酵素１mgあたりの活性値である。参考例１で得たBKII溶液及び参考例３で得たBKIII溶液のタンパク質(酵素)濃度をBradford法により定量して、実施例１の測定条件下における酪酸に対するBKII及びBKIIIの比活性を算出した。その結果、BKIIの比活性は約337 U/mgであり、BKIIIの比活性は約513 U/mgであった。
(２) ミカエリス・メンテン定数及び最大速度
　実施例１の測定条件下における酪酸に対するBKII及びBKIIIのKm及びVmaxを、ラインウィーバー・バークプロットにより求めた。その結果、BKIIのKmは4.2 mMであり、BKIIIのKmは1.9 mMであった。また、BKIIのVmaxは1100 U/mgであり、BKIIIのVmaxは450 U/mgであった。
(３) 基質特異性
　下記の第１試薬及び第２試薬を用いて、BKII及びBKIIIの基質特異性を調べた。基質として、表１に示す各種脂肪酸を用いた。測定は、7180形日立自動分析装置(株式会社日立ハイテクノロジーズ)を用いて行った。
(3.1) 試薬、試料及び装置
[第１試薬の組成]
100 mM Tris-HCl(pH 7.5) (シグマ社)
2 mM ATP(pH 7.5) (オリエンタル酵母株式会社)
2 mM MgCl2 (富士フイルム和光純薬株式会社)
20 mM グルコース (富士フイルム和光純薬株式会社)
1 mM NADP (富士フイルム和光純薬株式会社)
5 U/mL G6PDH II (グルコース-6-リン酸脱水素酵素：T-51、旭化成ファーマ株式会社)
5 U/mL ADP-HK II (ADP依存性ヘキソキナーゼ：T-92、旭化成ファーマ株式会社)
[第２試薬の組成]
基質
100 mM Tris-HCl(pH7.5)
100 mM 各種脂肪酸ナトリウム塩
　第２試薬の組成中、「各種脂肪酸ナトリウム塩」とは、オクタン酸ナトリウム、カプロン酸ナトリウム、吉草酸ナトリウム、イソ吉草酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、イソ酪酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム及びコハク酸ナトリウムのいずれか１種をいう。市販脂肪酸でナトリウム塩として販売されていないイソ酪酸、吉草酸、イソ吉草酸、カプロン酸、オクタン酸については水酸化ナトリウムでpH7.5に調製した。
[試料の組成]
1U/mL BKII（BKII希釈液に溶解）またはBKIII（BKIII希釈液に溶解）
[自動分析装置の測定パラメータ]
分析方法 Rate-A
測定波長(副/主) 700 nm/340 nm
反応時間 10分
測光ポイント 20-23
試料量 3.5μL
第１試薬量 140μL
第２試薬量 35μL
(3.2) 結果
　結果を表１に示す。表中、基質特異性は、酪酸に対する活性値を100とした場合の相対値(%)で示した。表１に示されるとおり、酪酸キナーゼは、オクタン酸、酢酸、乳酸及びコハク酸とほとんど反応せず、カプロン酸、吉草酸、イソ吉草酸、酪酸、イソ酪酸及びプロピオン酸と反応した。酪酸キナーゼは、炭素数３～６の短鎖脂肪酸を基質とすることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
(４) 等電点
　BKII及びBKIIIの等電点をGENETYX Ver.10 (GENETYX CORPORATION)を使用して算出した結果、BKIIの等電点は6.31であり、BKIIIの等電点は4.99であった。
(５) 至適pH
　実施例１で用いた第１試薬中のTris-HCl(pH 7.5)緩衝液を下記の緩衝液に替えたこと以外は同様にして、BKII及びBKIIIの活性値を測定した。用いた緩衝液は、Acetate-NaOH(pH5-6)、MES-NaOH(pH6-7)、PIPES-NaOH(pH7-7.5)、Tris-HCl(pH7-9)及びCHES-NaOH(pH9-10)、CAPS-NaOH(pH10-11)であった。測定結果を図８及び９に示す。図中、活性値を相対値で示した。図８及び９より、BKIIの至適pHは８～９であり、BKIIIの至適pHは８～9.3であった。
(６) 分子量
　BKII及びBKIIIの分子量をSDS-PAGE法により求めた。その結果、BKIIの分子量は約41,000であり、BKIIIの分子量は約39,000であった。また、BKII及びBKIIIの分子量をそれぞれのアミノ酸配列から算出すると、BKIIの分子量は約42,339であり、BKIIIの分子量は約39,088であった。
(７) pH安定性
　BKIIのpH安定性を、100 mM KClを含有する10 mMの下記の緩衝液中で約2.4μg/mL BKIIを37℃で30分間インキュベートした後の残存活性に基づいて調べた。また、BKIIIのpH安定性を、0.1% TN-100を含有する50 mMの下記の緩衝液中で約１U/mL BKIIIを37℃で５時間インキュベートした後の残存活性に基づいて調べた。残存活性は、実施例１と同様にして測定した。用いた緩衝液は、Acetate-NaOH(pH5-6)、MES-NaOH(pH6-7)、PIPES-NaOH(pH7-7.5)、Tris-HCl(pH7-9)、CHES-NaOH(pH9-10)及びCAPS-NaOH(pH10-11)であった。測定結果を図10及び11に示す。図10及び11より、BKIIのpH安定性はpH８～11(37℃で30分間)の範囲であり、BKIIIのpH安定性はpH５～11(37℃で５時間)の範囲であった。
(８) 熱安定性
　BKIIの熱安定性を、100 mM KCl含有10 mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5)中で約0.3 mg/mL BKIIを４～50℃の各温度で30分間インキュベートした後の残存活性に基づいて調べた。また、BKIIIの熱安定性を、0.1% TN-100(株式会社ADEKA)含有50 mMリン酸カリウム緩衝液(pH７)中で約１mg/mL BKIIIを４～80℃の各温度で30分間インキュベートした後の残存活性に基づいて調べた。残存活性は、実施例１と同様にして測定した。測定結果を図12及び13に示す。図12及び13より、BKIIの熱安定性(残存活性)は、37℃で30分間の処理で50%以上であり、BKIIIの熱安定性(残存活性)は、70℃で30分間の処理で85%以上であった。
　BKIII、参考例４で調製したサーモセディミニバクター・オセアニ由来酪酸キナーゼ(ToBK2)、参考例５で調製したナトラナエロビウス・サーモフィルス由来酪酸キナーゼ(NtBK)及び参考例６で調製したシンビオバクテリウム・サーモフィラム由来酪酸キナーゼ(StBK)の熱安定性を比較した。具体的には、0.1% TN-100含有50 mMリン酸カリウム緩衝液(pH７)に各酪酸キナーゼを約１mg/mLの濃度となるよう添加し、65℃で30分間インキュベートした後の残存活性を測定した。残存活性は、実施例１と同様にして測定した。BKIII、ToBK2、NtBK及びStBKの残存活性は、それぞれ81.6%、60.5%、14.7%及び48.7%であった。
実施例２：直線性試験
　酪酸キナーゼを用いる酪酸測定の定量の正確さを確認するため、検量線の直線性を確認した。測定は、7180形日立自動分析装置(株式会社日立ハイテクノロジーズ)を用いて行った。
(１) 試料、試薬及び装置
[試料]
　酪酸ナトリウム(富士フイルム和光純薬株式会社)を生理食塩水に溶解して、10 mM 酪酸ナトリウム水溶液を調製した。これを生理食塩水で順次希釈して、酪酸ナトリウムを0.156、0.313、0.625、1.25、2.5及び5.0 mMの濃度で含む希釈系列を調製した。酪酸を含まない対照試料として、生理食塩水を用いた。
[第１試薬の組成]
100 mM Tris-HCl(pH 7.5) (シグマ社)
2 mM ATP(pH 7.5) (オリエンタル酵母株式会社)
2 mM MgCl2 (富士フイルム和光純薬株式会社)
20 mM グルコース (和光純薬工業株式会社)
1 mM NADP (富士フイルム和光純薬株式会社)
5 U/mL G6PDH II (T-51、旭化成ファーマ株式会社)
5 U/mL ADP-HK II (T-92、旭化成ファーマ株式会社)
0.1% Triton(登録商標) X-100 (ナカライテスク株式会社)
[第２試薬の組成]
100 mM Tris-HCl(pH 7.5) (シグマ社)
10 mM KCl (富士フイルム和光純薬株式会社)
40 U/mL BKII
[自動分析装置の測定パラメータ]
分析方法 2ポイント
測定波長(副/主) 700 nm/340 nm
反応時間 5分
測光ポイント 16-34
試料量 3.5μL
第１試薬量 140μL
第２試薬量 35μL
(３) 酪酸の測定
　キュベットに第１試薬を分注し、次いで試料を添加して撹拌した。そして、キュベットに第２試薬を添加して撹拌した。試料と第１試薬と第２試薬との混合液を37℃で５分間インキュベートした。第２試薬の添加後、キュベットに光を照射して、340 nmにおける５分間の吸光度変化を測定した。これらの操作は自動分析装置により行われた。結果を表２及び図14に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　図14から分かるように、酪酸濃度10 mMまでの直線性を確認できた。よって、本実施形態の酵素的測定方法は、酪酸の定量分析が可能であることが示された。なお、参考例７よりBKIIの至適pHは８～９であるが、BKIIを含む第２試薬のpHを7.5に調整しても、測定に問題はなかった。
実施例３：ヒト唾液中の酪酸の測定
　ポルフィロモナス・ジンジバリスなどの歯周病の原因となる細菌は、口腔内で炭素数３～６の短鎖脂肪酸、特に酪酸を放出することが知られている。また、健常者の歯肉溝滲出液からも約３～４mMの酪酸が検出されることが知られている。そこで、本実施形態の酵素的測定方法により、ヒト唾液中の炭素数３～６の短鎖脂肪酸を測定できるかを検討した。測定は、7180形日立自動分析装置(株式会社日立ハイテクノロジーズ)又は96穴マイクロプレートを用いる用手法で行った。比較のため、GC-MSによる短鎖脂肪酸の測定も行った。
　GC-MSによる短鎖脂肪酸の測定では、富士フイルム和光純薬株式会社の酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、吉草酸及びイソ吉草酸ナトリウム、ナカライテスク株式会社のイソ酪酸ナトリウム、並びにシグマ社のカプロン酸ナトリウムを標準液に使用した。アイソト－プ内部標準物質混合溶液として、Cambridge Isotope Lab.のC13同位体酢酸ナトリウムを使用し、シグマ社のプロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、カプロン酸、吉草酸は重水素置換を使用した。測定前に、各脂肪酸に内部標準液を添加して、塩酸酸性下にジエチルエ－テルを加えて攪拌した後、遠心分離した。上清のエ－テル層を採取し、tert－ブチルジメチルクロロシラン(東京化成工業株式会社)を加え、60℃で30分間加温してGC-MS測定試料を調製した。分析にはGCMS-QP2010 Ultra(島津製作所)を用いた。
(１) 試料
　７名の健常者から、歯周病唾液検査用唾液採取セット(製品コードTZ1000、栄研化学株式会社)を用いて唾液を採取した。採取した唾液を10,000 rpmで10分間遠心分離して、上清を試料として用いた。唾液中には種々の短鎖脂肪酸が含まれるが、具体的にどの短鎖脂肪酸が含まれるかは不明である。そこで、検量線作成のための標準液には、炭素数３～６の短鎖脂肪酸の代表として酪酸を含む溶液(酪酸標準液と呼ぶ)を用いた。酪酸標準液として、5.0 mMの酪酸ナトリウム水溶液を調製した。炭素数３～６の短鎖脂肪酸を含まない対照試料として、生理食塩水を用いた。
(２) 自動分析装置による紫外部測定
(2.1) 試薬及び装置
　第１試薬の組成は、参考例７の基質特異性の検討に用いた第１試薬と同じであった。
[第２試薬の組成]
100 mM Tris-HCl(pH 7.5) (シグマ社)
40 U/mL BKIII
[自動分析装置の測定パラメータ]
分析方法 2ポイント
測定波長(副/主) 700 nm/340nm
反応時間 5分
測光ポイント 16-34
試料量 3.5μL
第１試薬量 140μL
第２試薬量 35μL
(2.2) 炭素数３～６の短鎖脂肪酸の測定
　キュベットに第１試薬を分注し、次いで試料を添加して37℃で５分間インキュベートして吸光度を測定した。第２試薬の添加後、５分間インキュベートして吸光度を測定し、２つの吸光度差を求めた。これらの操作は自動分析装置により行われた。5 mM酪酸標準液の測定結果から、唾液における、単位体積当たりの炭素数３～６の短鎖脂肪酸の総量を決定した。得られた値を、唾液中の炭素数３～６の短鎖脂肪酸の濃度とした。
(３) 96穴マイクロプレートを用いた用手法による可視部測定
(3.1) 試薬
[第１試薬の組成]
100 mM Tris-HCl(pH 7.5) (シグマ社)
2 mM KCl (富士フイルム和光純薬株式会社)
2 mM ATP(pH 7.5) (オリエンタル酵母株式会社)
2 mM MgCl2 (富士フイルム和光純薬株式会社)
20 mM グルコース (富士フイルム和光純薬株式会社)
1 mM NADP (オリエンタル酵母株式会社)
5 U/mL G6PDH II (T-51、旭化成ファーマ株式会社)
5 U/mL ADP-HK II (T-92、旭化成ファーマ株式会社)
8 U/mL BKIII
0.4 mM WST-1 (同仁化学株式会社)
1.6 U/mL ジアホラーゼ (T-06又はT-10、旭化成ファーマ株式会社)
[第２試薬の組成]
1% ドデシル硫酸リチウム (富士フイルム和光純薬株式会社)
1% Triton(登録商標) X-100 (ナカライテスク株式会社)
(3.2) 炭素数３～６の短鎖脂肪酸の測定
　ELISA用96穴マイクロプレ-ト(Nunk社)の各ウェルに試料(５μL)を添加し、次いで第１試薬(170μL)を添加して、室温(約20℃)で5分間反応させた。そして、各ウェルに第２試薬(20μL)を添加して反応を停止した。マイクロプレートをプレートリーダーInfinite 200(テカン社)にセットし、各ウェル中の反応混合液の450 nmにおける吸光度を測定した。酪酸ナトリウム水溶液の測定結果から検量線を作成して、唾液中の炭素数３～６の短鎖脂肪酸の濃度を決定した。また、同じ試料をGC-MSにて測定し、酢酸以外の短鎖脂肪酸、すなわちプロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、イソ吉草酸及びカプロン酸について各々検量線を作成して個別の濃度(mM)を測定し、その総和を、炭素数３～６の短鎖脂肪酸の濃度とした。
(４) 結果
　自動分析装置、用手法及びGC-MSでの測定結果を表３に示す。表中の数値は、検量線から求めた短鎖脂肪酸の濃度(mM)である。また、これらの測定結果をプロットして、自動分析装置による測定、用手法及びGC-MSによる測定との相関性を確認した。結果を図15Ａ～Ｃに示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　酵素法による自動分析法と用手法との相関係数Rは0.990、回帰式はy＝1.0959ｘ+108.88であった(図15Ａ参照)。よって、自動分析装置による測定と用手法による測定との相関は良好であった。このように、本実施形態の酵素的測定方法は、自動分析装置及び用手法のいずれで行っても、ほぼ同じ測定値が得られることが示された。次に、GC-MS法と自動分析装置との相関係数Rは0.928、回帰式はy＝0.5412ｘ+0.161であった(図15Ｂ参照)。GC-MS法と用手法との相関係数Rは0.947、回帰式はy＝0.5084ｘ+0.0584であった(図15Ｃ参照)。GC-MSと酵素法との相関は良好であった。
比較例１：酢酸キナーゼ及びプロピオン酸キナーゼを用いた測定
　酪酸キナーゼに替えて、酢酸キナーゼ(AK)又はプロピオン酸キナーゼ(PK)を用いて酪酸の測定が可能であるかを検討した。比較のため、BKIIIを用いた測定も行った。
(１) 試料、試薬及び装置
[試料]
　中和した100 mM酢酸、酪酸及びイソ酪酸をそれぞれ生理食塩水にて5 mM 酢酸、5 mM酪酸及び5 mMイソ酪酸水溶液を調製した。
　第１試薬の組成は、参考例７の基質特異性の検討に用いた第１試薬と同じであった。
[第２試薬]
　AK(Sigma-Aldrich社、E.coli由来)、PK(MyBioSource社、リコンビナント蛋白)及びBKIIIをそれぞれ100 mM Tris-HCl(pH 7.5)(シグマ社)に添加して、各酵素を1.25～40 U/mLの濃度で含む酵素溶液を調製した。
[自動分析装置]
　測定は、7180形日立自動分析装置(株式会社日立ハイテクノロジーズ)を用いて行った。自動分析装置の測定パラメータは、実施例２と同じであった。
(２) 測定
　実施例２と同様に、自動分析装置により試料中の酪酸及びイソ酪酸を測定した。測定値を理論吸光度の値で割ることにより、反応回収率(%)を算出した。理論吸光度は、試料中の全ての基質(酪酸又はイソ酪酸)がNADPHに変換された場合の吸光度であり、下記の式により算出される。各測定値より算出した反応回収率(%)を表４に示す。
(理論吸光度)
＝ (試料中の基質濃度)×[(試料量)/(試料量＋第１試薬量＋第２試薬量)]×(NADPHの340 nmにおけるミリモル分子吸光係数)
＝ 5×[3.5/(3.5＋140＋35)]×6.3
＝ 0.617
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表４に示されるように、酢酸キナーゼは、酢酸に反応するが、酪酸及びイソ酪酸に対して反応しないことが示された。また、プロピオン酸キナーゼは、酢酸に反応して酪酸に対してほとんど反応せず、イソ酪酸に対して反応しないことが示された。よって、酢酸キナーゼ及びプロピオン酸キナーゼを用いて、酪酸及びイソ酪酸を測定することはできないことが示された。一方、酪酸キナーゼを用いた測定では、酢酸に反応せず、酪酸キナーゼの濃度に依存して、酪酸とイソ酪酸の反応回収率が増大した。
比較例２：アセテート-CoAトランスフェラーゼを用いた測定
　アセテート-CoAトランスフェラーゼ(EC 2.8.3.8)は、下記の式(９)で表される反応を触媒することが報告されている(ExPASy-SIB Bioinformatics Resource PortalにあるEnzyme nomenclature databaseのEC2.8.3.8)。酪酸キナーゼに替えてアセテート-CoAトランスフェラーゼを用いて、式(９)の逆反応である式(10)の反応による酪酸の測定が可能であるかを検討した。アセテート-CoAトランスフェラーゼにより式(10)で生成した酢酸を、比較例１のAKによる反応で確認した。測定は、7180形日立自動分析装置(株式会社日立ハイテクノロジーズ)を用いて行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
(１) 試料、試薬及び装置
[試料]
　比較例１で使用した5 mM酪酸及び5 mMイソ酪酸水溶液を使用した。
[第１試薬の組成]
100 mM Tris-HCl(pH 7.5) (シグマ社)
2 mM MgCl2 (富士フイルム和光純薬株式会社)
2 mM ATP(pH 7.5) (オリエンタル酵母株式会社)
20 mM グルコース (富士フイルム和光純薬株式会社)
1 mM NADP (富士フイルム和光純薬株式会社)
5 U/mL G6PDH II (グルコース-6-リン酸脱水素酵素：T-51、旭化成ファーマ株式会社)
5 U/mL ADP-HK II (ADP依存性ヘキソキナーゼ：T-92、旭化成ファーマ株式会社)
1.25 mM Acetyl-CoA(シグマ-アルドリッチ)
20 U/mL AK(シグマ-アルドリッチ)
[第２試薬]
30μg/mLアセテート-CoAトランスフェラーゼ(MyBioSource社、E.coli由来)100 mM Tris-HCl(pH 7.5)(シグマ社)
[自動分析装置]
　測定は、7180形日立自動分析装置(株式会社日立ハイテクノロジーズ)を用いて行った。自動分析装置の測定パラメータは、実施例２と同じであった。
(２) 測定
　実施例２と同様に、自動分析装置により試料中の酪酸及びイソ酪酸を測定した。測定値を比較例1の理論吸光度の値で割ることにより、反応回収率(%)を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表５に示されるように、アセテート-CoAトランスフェラーゼは酪酸及びイソ酪酸に対してほとんど反応しないことが示された。正反応に対して逆反応は反応性が低いと考えられた。
比較例３：ブチレート-アセトアセテート-CoAトランスフェラーゼを用いた測定
　ブチレート-アセトアセテート-CoAトランスフェラーゼ (EC 2.8.3.9)は、下記の式(11)で表される反応を触媒する(ExPASy-SIB Bioinformatics Resource PortalにあるEnzyme nomenclature databaseのEC2.8.3.9)。酪酸キナーゼに替えてブチレート-アセトアセテート-CoAトランスフェラーゼを用いて、式(11)の逆反応である式(12)の反応による酢酸及び酪酸の測定が可能であるかを検討した。式(12)に表されるように、ブチレート-アセトアセテート-CoAトランスフェラーゼによりアセト酢酸が生成する。生成したアセト酢酸を、式(13)で表される3-ヒドロキシ酪酸脱水素酵素によるβ-NADHの減少反応により確認した。測定は、7180形日立自動分析装置(株式会社日立ハイテクノロジーズ)を用いて行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
(１) 試料、試薬及び装置
[試料]
　比較例１で使用した5 mM 酢酸、5 mM酪酸及び5 mMイソ酪酸水溶液を使用した。
[第１試薬の組成]
100 mM Tris-HCl(pH 7.5) (シグマ社)
0.35mM　Acetoacetyl-CoA(シグマ-アルドリッチ)
2 mM MgCl2 (富士フイルム和光純薬株式会社)
0.25 mM β-NADH (オリエンタル酵母工業)
5 U/mL 3-ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（富士フイルム和光純薬株式会社)
[第２試薬]
60μg/mL ブチレート-アセトアセテート-CoAトランスフェラーゼ(MyBioSource社、E.Coli由来)
100 mM Tris-HCl(pH 7.5)(シグマ社)
[自動分析装置]
　測定は、7180形日立自動分析装置(株式会社日立ハイテクノロジーズ)を用いて行った。自動分析装置の測定パラメータは、実施例２と同じであった。
(２) 測定
　実施例２と同様に、自動分析装置により試料中の酢酸、酪酸及びイソ酪酸を測定した。測定値を比較例１の理論吸光度の値で割ることにより、反応回収率(%)を算出した。但し、比較例３の反応では生成物が２倍産生されることから、２で除算した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　表６に示されるように、ブチレート-アセトアセテート-CoAトランスフェラーゼは酪酸及びイソ酪酸に対してほとんど反応しないことが示された。正反応に対して逆反応は反応性が低いことが考えられる。ExPASy-SIB Bioinformatics Resource PortalにあるEnzyme nomenclature databaseのEC2.8.3.9においても、炭素数２～６(C2-C6)の短鎖脂肪酸に対してゆっくり反応することを報告している。
比較例４：2-エノエート・レダクターゼを用いた測定
　2-エノエート・レダクターゼ(EC 1.3.1.31)は、下記の式(14)で表される反応を触媒する(ExPASy-SIB Bioinformatics Resource PortalにあるEnzyme nomenclature databaseのEC1.3.1.31)。酪酸キナーゼに替えて2-エノエート・レダクターゼを用いて、酪酸の測定が可能であるかを検討するため、2-エノエート・レダクターゼにより式(15)で表される反応が生じるかを確認した。測定は、7080形日立自動分析装置(株式会社日立ハイテクノロジーズ)を用いて行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
(１) メイオサーマス・シルバヌス由来2-エノエート・レダクターゼの調製
　メイオサーマス・シルバヌス(DSM No.9946、DSMZ社)から、常法により染色体DNAを調製した。得られた染色体DNAを鋳型として、センスプライマー(配列番号12)及びアンチセンスプライマー(配列番号13)並びにKOD FX (品番：KFX-101、東洋紡株式会社)を用いてPCRを行い、2-エノエート・レダクターゼ遺伝子を増幅して約1100 bpのPCR産物を得た。得られたPCR産物をNdeI(タカラバイオ株式会社)及びHindIII(タカラバイオ株式会社)で消化し、pET-21a(+)ベクター(Novagen社)のNdeI-HindIII部位に挿入して、MsER/pET21a(+)発現用プラスミドを得た。この発現用プラスミドでは、2-エノエート・レダクターゼ遺伝子の3’末端に、ベクター由来のリンカー及びHisタグをコードする塩基配列が付加された。すなわち、MsER /pET21a(+)発現用プラスミドは、2-エノエート・レダクターゼ－リンカー－Hisタグをコードするポリヌクレオチドを含んでいた。この発現用プラスミドをOne shot BL21(DE3) Chemically Competent E.coli (Invitrogen社)を導入して、メイオサーマス・シルバヌス由来2-エノエート・レダクターゼをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを有する形質転換体MsER /pET-21a(+)/BL21(DE3)を得た。得られた形質転換体を参考例１と同様にして培養し、菌体から粗酵素液を調製した。得られた粗酵素液を参考例１と同様にして精製し、組換え型2-エノエート・レダクターゼの溶液を得た。得られた酪酸キナーゼの溶液を一部取り、SDS-PAGEで分析した。結果を図16に示す。図中、レーン１は酵素溶液を示し、レーン２は分子量マーカーを示し、矢印は2-エノエート・レダクターゼに相当するバンドを示す。
(２) クリベロマイセス・ラクティス由来2-エノエート・レダクターゼの調製
　クリベロマイセス・ラクティス(DSM No.70799、DSMZ社)から、常法により染色体DNAを調製した。得られた染色体DNAを鋳型として、センスプライマー(配列番号14)及びアンチセンスプライマー(配列番号15)並びにKOD FX (品番：KFX-101、東洋紡株式会社)を用いてPCRを行い、2-エノエート・レダクターゼ遺伝子を増幅して約1200 bpのPCR産物を得た。得られたPCR産物をNdeI(タカラバイオ株式会社)及びXhoI(タカラバイオ株式会社)で消化し、pET-21a(+)ベクター(Novagen社)のNdeI-XhoI部位に挿入して、KlER/pET21a(+)発現用プラスミドを得た。この発現用プラスミドでは、2-エノエート・レダクターゼ遺伝子の3’末端に、ベクター由来のリンカー及びHisタグをコードする塩基配列が付加された。すなわち、KlER /pET21a(+)発現用プラスミドは、2-エノエート・レダクターゼ－リンカー－Hisタグをコードするポリヌクレオチドを含んでいた。この発現用プラスミドをOne shot BL21(DE3) Chemically Competent E.coli (Invitrogen社)を導入して、クリベロマイセス・ラクティス由来2-エノエート・レダクターゼをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを有する形質転換体KlER /pET-21a(+)/BL21(DE3)を得た。得られた形質転換体を参考例１と同様にして培養し、菌体から粗酵素液を調製した。得られた粗酵素液を参考例１と同様にして精製し、組換え型2-エノエート・レダクターゼの溶液を得た。得られた酪酸キナーゼの溶液を一部取り、SDS-PAGEで分析した。結果を図17に示す。図中、レーン１は酵素溶液を示し、レーン２は分子量マーカーを示し、矢印は2-エノエート・レダクターゼに相当するバンドを示す。
(３) NADH又はNADPHによる吸光度変化に基づく測定
(3.1) 試薬及び装置
[第１試薬の組成]
100 mM Tris-HCl (シグマ社)
3 mM NAD又はNADP (富士フイルム和光純薬株式会社)
150 mM 酪酸 (富士フイルム和光純薬株式会社)
　第１試薬のpHは、５N塩酸を用いて7.5、８、8.5又は９に調整した。
[自動分析装置の測定パラメータ]
分析方法 Rate-A
測定波長(副/主) なし/340 nm
反応時間 5分
測光ポイント 10-15
試料量 3μL
第１試薬量 150μL
(3.2) 酵素活性の測定
　メイオサーマス・シルバヌス及びクリベロマイセス・ラクティス由来の組換え型2-エノエート・レダクターゼの溶液を、試料として用いた。キュベットに第１試薬を分注し、次いで試料を添加して撹拌した。試料と第１試薬との混合液を37℃で５分間インキュベートした。試料の添加後、キュベットに光を照射して、340 nmにおける吸光度を測定した。これらの操作は自動分析装置により行われた。測定の結果、340 nm における吸光度は増加しなかった。これは、NADH又はNADPHが生成されなかったことを示す。よって、式(15)で表される反応は確認できなかった。
(４) ホルマザン色素の生成に基づく測定
(4.1) 試薬及び装置
[第１試薬の組成]
100 mM Tris-HCl (シグマ社)
0.1% ウシ血清アルブミン (品番：10416-59-8、東京化成工業株式会社)
0.03% ニトロブルーテトラゾリウム (品番298-83-9：東京化成工業株式会社)
3 mM NAD又はNADP (富士フイルム和光純薬株式会社)
50 mM 酪酸 (富士フイルム和光純薬株式会社)
10 U/mL ジアホラーゼ (T-06又はT-10、旭化成ファーマ株式会社)
　第１試薬のpHは、５N塩酸を用いて7.5、８、8.5又は９に調整した。
[自動分析装置の測定パラメータ]
分析方法 Rate-A
測定波長(副/主) なし/546 nm
反応時間 5分
測光ポイント 10-15
試料量 3μL
第１試薬量 150μL
(4.2) 酵素活性の測定
　メイオサーマス・シルバヌス及びクリベロマイセス・ラクティス由来の組換え型2-エノエート・レダクターゼの溶液を、試料として用いた。キュベットに第１試薬を分注し、次いで試料を添加して撹拌した。試料と第１試薬との混合液を37℃で５分間インキュベートした。試料の添加後、キュベットに光を照射して、546 nmにおける吸光度を測定した。これらの操作は自動分析装置により行われた。測定の結果、546 nmにおける吸光度は増加しなかった。これは、ニトロブルーテトラゾリウムがホルマザン色素に変換されなかったことを示す。よって、式(15)で表される反応は確認できなかった。
　上記の測定結果より、メイオサーマス・シルバヌス及びクリベロマイセス・ラクティス由来の組換え型2-エノエート・レダクターゼは、式(15)で表される反応を触媒しないことが示された。よって、2-エノエート・レダクターゼを用いて酪酸を測定することはできないことが示された。
実施例４：ブタ便中の酪酸の測定
　主としてクロストリジウム目に属する腸内細菌が作り出す酪酸が、免疫寛容をつかさどる制御性Ｔ細胞(Treg)への分化を促すことが知られている。そこで、本実施形態の酵素的測定方法により、ブタ便中の酪酸を測定できるかを検討した。測定は、7180形日立自動分析装置(株式会社日立ハイテクノロジーズ)で行った。比較のため、GC-MSによる短鎖脂肪酸の測定を実施例３と同様の条件で実施した。
(１) 試料
　６個体のブタの便(各1 g)にPBS緩衝液を4 mLずつ加え、ミキサ－で分散攪拌した。便の分散液を5,000 Gで20分間遠心して上清3 mLを採取した。得られた上清を0.8μmフィルターでろ過して、試料を調製した。また、酪酸標準液として、5.0 mMの酪酸ナトリウム水溶液を調製した。酪酸を含まない対照試料として、生理食塩水を用いた。
(２) 自動分析装置による紫外部測定
　便中はミオキナ－ゼ活性が高く、また試料に濁りがあることから、参考例７の基質特異性の検討に用いた第１試薬に、ミオキナーゼ阻害剤のAp5Aを50μMとなるように添加し、濁り除去のためトリトン(商標)X-100を0.1%の濃度となるように添加した。得られた試薬を実施例４の第１試薬として用いた。第２試薬として、実施例３の第２試薬を用いた。7180形日立自動分析装置による測定は、測定パラメータを実施例３と同じにして、実施例３と同様に行った。
(３) 結果
　図18に、7180形日立自動分析装置による酵素的測定及びGC-MS測定の結果を示す。回帰式はｙ＝0.8634ｘ+0.1553であり、相関係数は0.924であったことから、GC-MSと酵素的測定との良好な相関が得られた。
１０、２０：　試薬
１１、２１：　第１容器
１２、２３：　梱包箱
１３、２４：　添付文書
２２：　第２容器

Claims (23)

  1. 　試料中の酪酸と、アデノシン三リン酸(ATP)と、酪酸キナーゼとを接触してアデノシン二リン酸(ADP)を生成し、生成したADPを測定する工程を含む、酵素的測定方法。
  2. 　試料中の炭素数３～６の短鎖脂肪酸と、アデノシン三リン酸(ATP)と、酪酸キナーゼとを接触してアデノシン二リン酸(ADP)を生成し、生成したADPを測定する工程を含む、酵素的測定方法。
  3. 　前記炭素数３～６の短鎖脂肪酸が、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、イソ吉草酸及びカプロン酸からなる群より選択される少なくとも１種を含む請求項２に記載の方法。
  4. 　生成したADPの測定値が、前記試料中の炭素数３～６の短鎖脂肪酸の総量、又は単位体積当たりの炭素数３～６の短鎖脂肪酸の総量を示す請求項２又は３に記載の方法。
  5. 　ADPを測定する工程が、生成したADPと、グルコースと、ADP依存性ヘキソキナーゼとを二価の金属イオンの存在下で接触して、グルコース-6-リン酸及びアデノシン一リン酸を生成する工程を含む請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　ADPを測定する工程が、
    　生成したグルコース-6-リン酸と、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型(NAD)又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型(NADP)と、グルコース-6-リン酸脱水素酵素とを接触して、6-ホスホグルコノ-δ-ラクトン、及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型(NADH)又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型(NADPH)を生成する工程と、
    　生成したNADH又はNADPHを測定する工程と
    をさらに含む、請求項５に記載の方法。
  7. 　NADH又はNADPHを測定する工程が、生成したNADH又はNADPHを含む反応混合液の吸光度又は蛍光強度を測定することにより行われる請求項６に記載の方法。
  8. 　NADH又はNADPHを測定する工程が、生成したNADH又はNADPHと、発色試薬と、電子キャリアとを接触させて色素を生成し、生成した色素を含む反応混合液の吸光度を測定することにより行われる請求項６に記載の方法。
  9. 　ADPを生成する工程が、試料と、ATPと、酪酸キナーゼとを二価の金属イオンの存在下で接触することにより行われる請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　二価の金属イオンが、マグネシウムイオン及び亜鉛イオンから選択される少なくとも１種である請求項９に記載の方法。
  11. 　試料が、生体試料又は飲食品である請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　前記酪酸キナーゼが、酢酸を実質的に基質としない請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　前記酪酸キナーゼが、アセトアナエロビウム・スティックランディイ又はサーモセディミニバクター・オセアニに由来する請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　前記酪酸キナーゼが、配列番号17又は19で表されるアミノ酸配列を含む請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　酪酸キナーゼと、アデノシン三リン酸(ATP)とを含む、酵素的測定用試薬。
  16. 　ATPを含む第１試薬と、酪酸キナーゼを含む第２試薬とを含む請求項１５に記載の試薬。
  17. 　二価の金属イオンをさらに含む請求項１５又は１６に記載の試薬。
  18. 　グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型(NAD)又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型(NADP)、及びグルコース-6-リン酸脱水素酵素をさらに含む請求項１５～１７のいずれか１項に記載の試薬。
  19. 　発色試薬及び電子キャリアをさらに含む請求項１８に記載の試薬。
  20. 　前記酪酸キナーゼが、炭素数３～６の短鎖脂肪酸を基質とする請求項１５～１９のいずれか１項に記載の試薬。
  21. 　前記酪酸キナーゼが、酢酸を実質的に基質としない請求項１５～２０のいずれか１項に記載の試薬。
  22. 　請求項１５～２１のいずれか１項に記載の試薬を用いて、被検体由来の試料中の炭素数３～６の短鎖脂肪酸を測定する工程を含む、歯周病の診断を補助する方法。
  23. 　歯周病診断用試薬である、請求項１５～２１のいずれか１項に記載の試薬。
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