CN112410018B - 一种用于可视化定量检测乳酸的比率荧光探针及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于可视化定量检测乳酸的比率荧光探针及其应用，制备方法是：制备银纳米粒子包覆掺杂蓝色荧光碳点的bCDs/AgNPs纳米复合物，bCDs的蓝色荧光因聚集和AgNPs掺杂而猝灭；将bCDs/AgNPs纳米复合物与红色荧光发射的量子点结合，形成bCDs/AgNPs‑rQDs比率荧光探针。乳酸在乳酸氧化酶的作用下产生H2O2，H2O2蚀刻AgNPs形成银离子，复合物结构破坏使bCDs的蓝色荧光恢复，形成的银离子会猝灭rQDs的红色荧光，探针荧光强度的比值（I445/I645）随着乳酸浓度的变化而变化，且探针荧光强度的比值的变化会引起荧光颜色发生明显的改变，从而实现可视化检测。用于定量测定血清中生物分子，灵敏度高、检测简便。

Description

一种用于可视化定量检测乳酸的比率荧光探针及其应用
技术领域
本发明属纳米材料、荧光比率技术和生物分析检测领域，具体涉及一种用于可视化检测乳酸的比率荧光探针的制备方法，再具体言之，基于荧光内滤效应和电荷转移作用的比率荧光探针；探针荧光强度的比值(I445/I645)随着乳酸浓度的变化而变化，且探针荧光强度的比值的变化会引起荧光颜色发生明显的改变，从而实现可视化检测。
背景技术
荧光检测方法作为一种简单、灵敏的检测方法，在临床检验中得到广泛应用。比率荧光探针通过两个荧光信号的比值表示待测物的含量，克服单荧光探针易受干扰的缺陷，同时放大检测信号。作为一类新型的荧光纳米材料，CDs(碳点)因其优异的特性(例如出色的光稳定性和低碳性)而引起了极大的关注。由于其出色的物理和化学特性、低毒性、优异的生物相容性和良好的水溶性，CDs已用于构建检测蛋白质、金属离子和其它小分子的新型检测方法。另一方面，AgNPs (银纳米颗粒)具有独特的光学特性，例如高的消光系数、尺寸依赖性的颜色变化和易化学修饰等，引起了人们的广泛关注。更具吸引力的是，AgNPs的结构可以被H2O2破坏，这为传感平台的构建提供了新的视野。基于H2O2蚀刻AgNPs为银离子和通过内滤效应猝灭荧光团荧光的事实，已经构建了许多荧光传感平台，可用于检测H2O2或相关的分子，如葡萄糖、尿酸等，但尚且未用于检测乳酸浓度。
癌症是一个日益严重的医疗问题。其中，H2O2、乳酸和葡萄糖都是目前癌症生物学中的指示性能量代谢物。实验观察显示细胞中的H2O2含量高于一般水平。先前的研究表明，癌症与乳酸代谢异常有关，乳酸酸中毒和葡萄糖缺乏是实体瘤常见的不良微环境。乳酸在实体瘤中的积累是恶性肿瘤发生的关键和早期事件，高水平的乳酸生成是癌症发生的重要生物学特征。在许多癌症类型中，由于肿瘤内乳酸浓度升高与转移发生率增加之间存在相关性，乳酸被认为是恶性肿瘤重要的代谢标志物。由于乳酸和H2O2在肿瘤细胞外液中的水平可以用来暗示肿瘤的恶性程度。因此，选择乳酸和H2O2作为检测靶标对于癌症的诊断和治疗应用是必不可少的，具有重要的理论意义和现实意义。目前，检测乳酸的方法主要是电化学生物传感、比色法、荧光法。但是对于乳酸检测的简单光学策略的实施还没有取得很大的成功。相较于电化学生物传感和比色法，荧光法具有响应快、操作简单、灵敏度高、成本低等优点，引起人们越来越多的研究兴趣。但人们需要一种具有选择性好、抗干扰、稳定、快速的荧光检测法，用于灵敏度和选择性地检测乳酸。
发明内容
本发明的目的在于针对上面所述的问题，提出一种用于可视化定量检测乳酸的比率荧光探针及其应用，具有检测效率高、灵敏度高、检测简便、测定范围广、结果稳定的特点。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种用于定量检测乳酸的比率荧光探针的制备方法，步骤如下：
(1)制备银纳米粒子包覆掺杂蓝色荧光碳点的bCDs/AgNPs纳米复合物，此时，bCDs的蓝色荧光被形成的AgNPs猝灭；
(2)将bCDs/AgNPs纳米复合物与红色荧光发射的量子点rQDs 在室温下结合，形成bCDs/AgNPs-rQDs比率荧光探针；
(3)将不同浓度的H2O2加入到步骤(2)的bCDs/AgNPs-rQDs 比率荧光探针反应体系中，测定bCDs(I445)与rQDs(I645)的荧光比值； H2O2蚀刻AgNPs形成银离子，bCDs的蓝色荧光恢复，而形成的银离子会猝灭rQDs的红色荧光，探针荧光强度的比值(I445/I645)随着 H2O2浓度的变化而变化，且探针荧光强度的比值的变化会引起荧光颜色发生明显的改变，从而实现可视化检测，获得I445/I645比值与乳酸浓度线性关系曲线；
(4)将乳酸与乳酸氧化酶作用，乳酸在乳酸氧化酶的作用下产生H2O2；然后加入到步骤(2)的反应体系中，并测定bCDs(I445)与 rQDs(I645)的荧光比值。
具体步骤如下：
(1)bCDs用一锅水热法合成(“On-off-on_fluorescent system for detectionof Zn2+in biological sample using quantum dots-carbon dots ratiometricnanosensor”，《Journal of Colloid and Interface Science》,516(2018)522-528)。bCDs是以一水合柠檬酸、二乙烯三胺为原料,二者的摩尔比为1:1，以去离子水为溶剂，在 180℃反应4h后获得。CDs具有化学惰性、高溶解度、易改性和高耐光漂白性能，并且CDs由于其优异的生物学特性、如良好的生物相容性和低毒性，使它们在生物传感、生物成像、光催化和药物传递等方面具有潜在的应用价值。
(2)bCDs/AgNPs纳米复合物使用一锅法制备。以bCDs、硝酸银溶液和柠檬酸钠溶液作为反应液，硼氢化钠作为还原剂，室温避光搅拌反应10min，得到棕黄色溶液，将其放置于4℃冰箱内避光老化3天，即得到bCDs/AgNPs纳米复合物。将合成的bCDs/AgNPs溶液浓缩为1mL，备用；
(3)bCDs/AgNPs-rQDs比率荧光探针的合成：取20μL bCDs/AgNPs浓缩液于2mL离心管中，再加入200μL rQDs溶液。随后，在室温下涡旋即得到bCDs/AgNPs-rQDs比率荧光探针。
(4)在步骤(3)的bCDs/AgNPs-rQDs比率荧光探针体系中加入不同浓度的H2O2，随着H2O2浓度的增加，bCDs荧光增强，而rQDs荧光逐渐减弱，形成比率荧光探针，两者荧光强度的比值 I445/I645与待测物浓度呈线性关系，根据两者荧光强度的比值，定量测定H2O2。
(5)将乳酸与乳酸氧化酶反应，然后将其加入步骤(3)的 bCDs/AgNPs-rQDs比率荧光探针体系中，随着乳酸浓度的不断增加，H2O2生成量增加，bCDs与rQDs的荧光强度比值I445/I645与待测物浓度呈线性关系，根据两者荧光强度的比值，定量测定乳酸。
本发明定量检测乳酸的原理是：当乳酸在乳酸氧化酶的作用下产生H2O2时，H2O2蚀刻AgNPs形成银离子，bCDs的蓝色荧光恢复，而形成的银离子会猝灭rQDs的红色荧光，探针荧光强度的比值(I445/I645)随着乳酸浓度的变化而变化，且探针荧光强度的比值的变化会引起荧光颜色发生明显的改变，从而实现可视化检测。
有益效果：
(1)本发明以两种荧光发射的荧光纳米材料bCDs(发射蓝色荧光的碳点)和红色荧光发射的量子点(rQDs)作为信号来源，将 bCDs/AgNPs纳米复合物与rQDs结合，形成bCDs/AgNPs-rQDs比率荧光探针。bCDs/AgNPs纳米复合物中bCDs的荧光因聚集和AgNPs 吸收而猝灭，H2O2存在时，H2O2蚀刻AgNPs形成银离子，bCDs的荧光强度随H2O2分子浓度增大而增强，而rQDs的红色荧光随之被银离子淬灭，两者荧光变化均仅与体系中H2O2的浓度相关，因此用两者的荧光比值(I445/I645)定量可产生H2O2的生物分子。H2O2在该体系中的作用层层响应，最终形成比率荧光探针，具有提升测定选择性和灵敏度的的效果。该发明可用于高灵敏的测定乳酸和H2O2。
(2)检测过程灵敏度高，检测操作过程简便。且材料低毒，良好的水溶性和生物相容性使整个检测过程环保、安全、方便。
(3)当乳酸浓度在1-100μM时，比率荧光探针的荧光强度比值的变化与乳酸浓度呈良好的线性关系，可用于定量检测乳酸的浓度。
附图说明
图1是实施例1制备得到的bCDs(图A)、AgNPs(图B)和 bCDs/AgNPs纳米复合物(图C)的透射电镜图；如图1A所示，合成的bCDs为近球形，粒径低于10nm且具有较强的蓝色荧光(图1A 的插图，左为透明，右为蓝色)。如图1B所示，合成的AgNPs为球形颗粒，平均粒径为33.6nm。如图1C所示，合成的bCDs/AgNPs 纳米复合物具有bCDs和AgNPs的共同特征，bCD与AgNPs掺杂形成复合物。
图2是实施例1制备得到的bCDs/AgNPs纳米复合物与不同浓度的H2O2作用后，得到的紫外吸收和荧光发射图；图2A是紫外吸收图，如图所示bCDs/AgNPs纳米复合物在408nm处具有典型的表面等离子体共振吸收峰，当H2O2存在时，由于蚀刻银壳结构， bCDs/AgNPs纳米复合物的表面等离子体共振吸收峰下降和蓝移，且随着H2O2浓度的增加，bCDs/AgNPs纳米复合物在408nm处的表面等离子体共振吸收峰逐渐下降和蓝移。图2B是荧光发射图，如图所示，Blank表示空白样品(bCDs)的荧光强度，当形成bCDs/AgNPs 纳米复合物时，荧光强度降到最低值，且当H2O2浓度逐渐增加时，碳点的荧光强度逐渐增强。图2C是bCDs/AgNPs纳米复合物加入不同浓度的H2O2后，在日光下观察的颜色变化，随着H2O2浓度的增加，颜色由棕黄色变为无色(如图2C所示，依次从左到右观察)。图2D是bCDs/AgNPs纳米复合物加入不同浓度的H2O2后，在紫外灯下观察的颜色变化，随着H2O2浓度的增加，颜色由浅蓝色变为亮蓝色(如图2D所示，依次从左到右观察)。
图3是对实验的可行性进行分析得到的结果图；如图3A所示， bCDs和rQDs之间荧光不相互影响。如图3B所示，不同浓度银离子对bCDs的蓝色荧光几乎无影响。如图3C所示，不同浓度H2O2对 rQDs的红色荧光几乎无影响。如图3D所示，随着银离子浓度的增加， rQDs的荧光强度逐渐降低。
图4是实施例2制备得到的；在bCDs/AgNPs-rQDs比率荧光探针中，当rQDs的荧光远大于bCDs/AgNPs体系的荧光时，有利于检测系统的建立。如图4A所示，当bCDs/AgNPs与rQDs的加入比例为1:1时，bCDs/AgNPs的荧光强度与rQDs的荧光强度几乎相等。随着rQDs浓度的增加，rQDs的荧光相对于bCDs/AgNPs的荧光逐渐变强。如图4D所示，当bCDs/AgNPs与rQDs的加入比例为1:10时， rQDs的荧光远大于bCDs/AgNPs的荧光，适合建立灵敏的检测系统。我们也发现当rQDs的浓度继续增大时，rQDs的荧光强度保持相对稳定。因此，本实验中选择1:10的反应物比例进行合成 bCDs/AgNPs-rQDs比率荧光探针。
图5是实施例2制备得到的；如图所示，随着H2O2浓度的增加， bCDs的荧光逐渐增强，rQDs的荧光逐渐降低。如图5B所示，当H2O2浓度在0.1-2μM时，比率荧光探针的荧光强度比值的变化与H2O2浓度呈良好的线性关系，线性方程为I＝0.08726c+0.19755，r＝0.99904。图5C所示的是加入不同浓度的H2O2后的比率荧光探针在紫外光下的图片，可以看出随着H2O2浓度的增加，bCDs的荧光逐渐增强，rQDs 的荧光逐渐降低，颜色逐渐由玫红色变为蓝色。
图6是实施例3制备得到的比率荧光探针在测定不同浓度乳酸的荧光强度曲线图；如图所示，在1-100μM范围内，I445/I645比值与乳酸浓度成线性相关，其线性方程是为I＝0.00223c+0.18969，r＝0.99726。
具体实施方式
以下将结合具体实施例说明本发明的技术方案：
以下实施例所采用试剂的说明：一水合柠檬酸、二乙烯三胺、丙酮均从国药集团化学试剂有限公司购得；3-巯基丙酸、H2O2、硝酸银和硼氢化钠从上海阿拉丁生化科技股份有限公司购得；柠檬酸钠和乳酸从上海麦克林生化科技有限公司购买；水合氯化镉是从上海展云化工有限公司购买；乳酸氧化酶从上海源叶生物科技有限公司购得。
实施例1制备bCDs/AgNPs纳米复合物，步骤如下：
bCDs/AgNPs纳米复合物的制备：此纳米复合物使用一锅法制备。首先用5ml去离子水将1mg bCDs溶解，浓度为0.2mg mL-1。将该溶液转移至25mL圆底烧瓶内，然后加入10mL(1.2mM)硝酸银溶液和2mL(30mM)柠檬酸钠溶液。随后，逐滴滴加380μL (10mM)硼氢化钠溶液，室温避光搅拌反应10min，得到棕黄色溶液，将其放置于4℃冰箱内避光老化3天，即得到bCDs/AgNPs纳米复合物。
AgNPs的制备(Liu,S.G.；Mo,S.；Han,L.,et al.,Oxidation etching induceddual-signal response of carbon dots/silver nanoparticles system forratiometric optical sensing of H2O2 and H2O2-related bioanalysis. Anal ChimActa 2019,1055:81-89.)：5ml去离子水、10mL(1.2mM) 硝酸银溶液和2mL(30mM)柠檬酸钠溶液。随后，逐滴滴加380μL (10mM)硼氢化钠溶液，室温避光搅拌反应10min，得到棕黄色溶液，将其放置于4℃冰箱内避光老化3天，即得到AgNPs。
实施例2制备bCDs/AgNPs-rQDs比率荧光探针，步骤如下：
将实施例1合成的bCDs/AgNPs溶液浓缩为1mL。取20μL bCDs/AgNPs浓缩液于2mL离心管中，再加入200μL rQDs溶液。随后，在室温下涡旋即得到bCDs/AgNPs-rQDs比率荧光探针。然后，取50μL不同浓度的H2O2与探针共同孵育，测定荧光强度比 (I445/I645)。结果见图4、5所示。
实施例3制备可视化检测乳酸的比率荧光探针，步骤如下：
步骤如下：取50μL不同浓度的乳酸(0、1、2、5、10、 20、50、100μM)，各加入2U的乳酸氧化酶，反应体系是在37℃孵育90min。然后加入到实施例2所制备的比率荧光探针反应体系中，充分震荡混合。每个浓度平行操作三份，测定荧光强度比(I445/I645)。结果见图6所示。
实施例4以血清为例，说明本发明的检测方法：
步骤如下：使用标准加入法检测人血清中的乳酸含量。取 5μL不同浓度的乳酸溶液加入到50μL血清样本中，使乳酸加入终浓度分别为200、400、600μM，其它步骤按照“实施例3”操作，测定血清中乳酸的含量。结果见表1所示。
表1健康人血清样本中乳酸含量的测定(n＝3)
Figure RE-GDA0002815568190000101
如表所示，健康人血清样本高于LOD，乳酸的回收率在94.1- 104.4％，且RSD小于5.4％，符合生物样品检测要求。
以上结果证实了本发明所合成的探针可应用于临床血清样本的检测。

Claims (3)

1.一种用于可视化定量检测乳酸的比率荧光探针，其特征在于，所述比率荧光探针的制备方法如下：
（1）制备银纳米粒子包覆掺杂蓝色荧光碳点的bCDs/AgNPs纳米复合物，此时，bCDs的蓝色荧光因聚集和AgNPs掺杂猝灭；
所述的bCDs是以一水合柠檬酸、二乙烯三胺为原料，二者的摩尔比为1:1，以去离子水为溶剂，在180℃反应4 h后获得；为近球形，粒径低于10 nm且具有蓝色荧光；
bCDs/AgNPs纳米复合物是以bCDs、硝酸银、柠檬酸钠、硼氢化钠为原料，室温避光搅拌反应10 min；bCDs与AgNPs掺杂形成复合球；
（2）将bCDs/AgNPs纳米复合物与红色荧光发射的量子点rQDs按1：1-1：50加入比例在室温下结合，形成bCDs/AgNPs-rQDs比率荧光探针。
2.根据权利要求1所述的用于可视化定量检测乳酸的比率荧光探针，其特征在于，bCDs/AgNPs与rQDs的加入比例为1：10。
3.权利要求1所述的用于可视化定量检测乳酸的比率荧光探针的不以诊断为目的的用于可视化定量检测乳酸的应用，其特征在于，
（1）将不同浓度的H2O2加入到步骤（2）的bCDs/AgNPs-rQDs比率荧光探针反应体系中，测定bCDs I445与rQDs I645的荧光比值；
H2O2蚀刻AgNPs形成银离子，bCDs的蓝色荧光恢复，而形成的银离子会猝灭rQDs的红色荧光，探针荧光强度的比值随着H2O2浓度的变化而变化，且探针荧光强度的比值的变化会引起荧光颜色发生明显的改变，从而实现可视化检测，获得荧光强度比值与H2O2浓度线性关系曲线；
（2）将乳酸与乳酸氧化酶作用，乳酸在乳酸氧化酶的作用下产生H2O2；然后加入到bCDs/AgNPs-rQDs比率荧光探针反应体系中，并测定bCDs I445与rQDs I645的荧光比值，当乳酸浓度在1-100 μM时，比率荧光探针的荧光强度比值的变化与乳酸浓度呈良好的线性关系，线性方程为I=0.00223c+0.18969，r=0.99726，根据线性方程获得生物样品中的乳酸浓度。
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