CN111748608B - 一种纳米笼探针及其应用和核酸检测方法 - Google Patents

一种纳米笼探针及其应用和核酸检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种纳米笼探针及其应用和核酸检测方法，包括金/银纳米笼颗粒，颗粒的表面修饰有发卡DNA链，发卡DNA链与待测核酸部分互补；并以金/银纳米笼颗粒作为核酸识别反应基底和散射信号指示探针，在探针表面修饰发夹链作为核酸识别单元，利用DNA碱基互补配对和链取代反应规则，实现DNA循环和HCR扩增过程，从而在探针表面形成G‑四链体‑血红素DNA酶，通过酶催化过氧化氢分解产生的活性氧实现对纳米笼中银组分的刻蚀，引起暗场信号的“灭灯”响应。这种具有时间分辨能力的暗场信号改变，显示出对待测核酸浓度的依赖性，并结合统计分析方法，进行定量分析。

Description

一种纳米笼探针及其应用和核酸检测方法
技术领域
本发明涉及探针及其应用和核酸检测方法，特别是涉及一种纳米笼探针及其应用和核酸检测方法。
背景技术
核酸作为生命基础物质之一，携带重要的遗传信息并严格控制着蛋白合成和基因表达，核酸在识别和杂交过程中遵循的碱基互补配对原则确保了核酸检测的强特异性，核酸检测具有重要意义。然而当核酸含量较低时，常规检测手段中大量的样本需求和复杂的预处理操作难以满足核酸检测的灵敏度、精准度。因此，需开发灵敏、精准的核酸检测方法，从而进一步缩短检测窗口期。
发明内容
发明目的：本发明的目的之一是提供一种纳米笼探针，其具有核酸识别功能；本发明的目的之二是提供所述纳米笼探针的应用；本发明的目的之三是提供一种核酸检测方法，可实现低浓度下的超灵敏核酸检测。
技术方案：本发明的纳米笼探针，包括金/银纳米笼颗粒，颗粒的表面修饰有发卡DNA链，发卡DNA链与待测核酸部分互补；所述颗粒为中空结构，外壁为金，内壁为银。
其中，待测核酸的种类为microRNA或DNA。纳米笼探针的制备方法包括银球模板的制备、金/银纳米笼的合成以及纳米笼表面核酸功能化。
优选地，所述金/银纳米笼颗粒利用氯金酸还原银球模板的方法制备得到，颗粒的粒径为40～100nm。可选的，实施例中示出了粒径为52±5nm的颗粒制备过程，合成的粒径在40～100nm范围内均可。
优选地，在纳米笼探针表面形成G-四链体-2红素DNA酶，并将其作为检测的信号传感器和信号放大器。
本发明提供了所述纳米笼探针在制备核酸检测试剂盒或暗场成像监测中的应用。以金纳米笼颗粒作为反应基底和散射信号指示，在其表面构建核酸识别和传感探针，利用纳米笼颗粒对环境中活性氧的灵敏响应，实现散射信号的时间分辨，用于核酸的超灵敏检测。
本发明通过金属纳米粒子局域表面等离子体共振(LSPR)的暗场成像技术实现动态反应过程的实时监测。该方法以修饰有发卡DNA的金/银纳米笼颗粒作为等离子探针，在其表面构建核酸识别单元，利用DNA碱基互补配对和链取代反应规则，实现DNA循环和杂交扩增过程。在血红素(hemin)和K+离子存在下形成G-四链体-血红素DNA酶，通过酶催化过氧化氢分解产生的活性氧(ROS)实现对纳米笼中银组分的刻蚀。刻蚀过程导致银/金纳米笼结构中银的含量随着刻蚀时间的推移而逐渐降低，进而使得单颗粒纳米探针的暗场散射信号突然消失，出现“灭灯”响应。其刻蚀速率与目标microRNA的含量直接相关，表现为基于时间维度的暗场信号变化。结合统计分析方法，可以实现如microRNA-21的浓度测定。所构建的传感器具有较高的灵敏度和选择性，其灵敏的实时响应特性证实了该纳米笼颗粒可以用作表/界面反应的探针以及微环境变化的指示物，显示其在暗场生物传感和生命分析中的应用前景。
本发明还提供了一种非疾病诊断目的的核酸检测方法，包括如下步骤：
(1)将金/银纳米笼颗粒作为核酸识别反应基底和散射信号指示探针，在探针表面修饰发卡DNA链作为核酸识别单元；
(2)利用DNA碱基互补配对和链取代反应规则，实现DNA循环和HCR扩增过程，在探针表面形成G-四链体-血红素DNA酶；
(3)通过酶催化过氧化氢分解产生的活性氧实现对纳米笼颗粒中银组分的刻蚀，引起暗场成像中暗场信号的改变，利用暗场信号的改变时间与待测核酸浓度的关系进行定量检测。
取不同浓度的目标待测核酸，以上述相同操作后对其进行检测，得到纳米笼探针的灭灯时间(暗场信号的改变时间)与待测核酸浓度之间关系曲线图。
优选地，在有机硅薄膜上打孔，与正电荷玻璃粘贴后作为反应池和检测池；将步骤(1)制得的金/银纳米笼颗粒稀释后加入池中，分散固定于正电荷玻璃表面，形成检测基底。可选的，所述有机硅薄膜为聚二甲基硅氧烷聚合物膜；其中的正电荷玻璃指玻璃表面带有正电荷。
优选地，步骤(2)包括：将制备得到的探针与含有DNA探针H2和待测核酸的样品液混合反应，并用缓冲液清洗基底；后加入发卡探针H3、H4的混合液孵育，进行杂交链反应并使用缓冲液清洗；再加入含有钾离子的hemin溶液，反应后用含有钾离子的缓冲液清洗，得到表面形成G-四链体-血红素DNA酶的纳米笼探针；其中，H2与步骤(1)中的发卡DNA链部分互补，H3与发卡DNA链和H2部分互补，H4与H3部分互补。
优选地，H2的浓度为10nM～30nM，H3和H4浓度为50nM～150nM。
优选地，所述金/银纳米笼颗粒固定后，检测基底使用4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸-3-硫代-N-琥珀酰亚胺酯钠盐溶液孵育以中和玻璃表面的多余正电荷。
优选地，所述暗场信号的改变时间为从加入含H2O2的检测液至颗粒灭灯时的等待时间，所述颗粒灭灯为颗粒的暗场强度前后的灰度值降低50～80％；可以实现可视化的检测过程。
优选地，待测核酸为microRNA或DNA，待测核酸的浓度为1×10-16～1×10-13mol/L；浓度过高会导致信号出现太快，等待时间过短而难以分辨；浓度过低会导致暗场检测时间过长。
进一步地，所述核酸检测方法包括如下步骤：
S1：利用氯金酸还原银球模板的方法，制备得到金/银纳米笼结构；将其与发卡DNA探针(H1)按浓度比1∶200进行混合孵育2个小时，再经过老化、离心、洗涤后获得等离子体探针。
S2：在聚二甲基硅氧烷聚合物膜上打孔，与正电荷玻璃粘贴后作为反应池和检测池。将上述制得的金/银纳米笼颗粒稀释1000倍后，取20μL加入池中，分散并固定在正电荷玻璃表面，获得检测基底。
S3：在池中加入20μL含有10nM的DNA探针(H2)和20fM的目标microRNA或DNA的样品液，反应1小时后用0.1M的磷酸缓冲液(PBS，pH 7.4)清洗基底，再加入含有50nM发卡探针(H3和H4)的混合液20μL孵育1小时，进行杂交链反应并使用0.1M的PBS缓冲液清洗后，加入50μM的hemin溶液(其中含0.1M的K+)，30分钟后用含有0.1M钾离子的PBS清洗。此时在纳米笼探针颗粒表面形成G-四链体-血红素DNA酶。
S4：向反应池中加入20μL浓度为20mM的H2O2的磷酸缓冲液作为暗场检测液，随即在暗场显微镜下观察并进行拍照监测，记录暗场信号随时间变化情况。
S5：对视野中颗粒的成像情况进行分析，获得单个颗粒的暗场信号“灭灯”响应时间。通过统计分析，获得“灭灯”响应时间与待测核酸的浓度之间的标准曲线。
S6：通过与未知浓度的待测核酸孵育后，监测等离子体探针在H2O2检测液中的暗场信号，并进行统计分析，结合标准曲线估算得到待测液中待测核酸的浓度。
其中，步骤S1中，金/银纳米笼粒径为40～100nm，内部中空，内壁成分为银，外壁成分为金；修饰在其表面的发卡DNA的序列与目标物microRNA或DNA序列部分互补。
步骤S2中，反应池的圆孔的内径为3mm，在等离子体探针固定后，使用2mM的SMCC溶液(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸-3-硫代-N-琥珀酰亚胺酯钠盐溶液)孵育30分钟，中和玻璃表面的多余正电荷。
步骤S3中，每一次孵育之后，均需要使用pH为7.4的PBS缓冲液(含0.1M的KCl)进行洗涤。
步骤S5中，暗场成像中，随时间的变化可明显观测到颗粒变暗的“灭灯”过程，根据图像中提取的灰度值信息，颗粒的暗场强度前后的灰度值降低约67％±13％。
步骤S5中，响应时间是指从含H2O2的检测液加入至颗粒“灭灯”时的等待时间，统计至少120个颗粒暗场响应的等待时间，用高斯分布进行拟合，获得平均等待时间的统计结果；绘制不同浓度待测核酸与不同平均等待时间之间的关系图，得到标准曲线。
步骤S6中，将含有未知浓度的核酸待测液与等离子体探针孵育，并进行相同的后续处理过程，对100颗以上的颗粒进行等待时间的统计，利用高斯分布进行模拟，获得平均等待时间。对照标准曲线，估算出待测液中待测核酸的浓度。
本发明还提供了上述分析方法在简单溶液中microRNA的检测应用；简单溶液是指含有microRNA的PBS缓冲液，不包含其他干扰物质。
发明原理：基于金属纳米颗粒的暗场成像方法，由于响应速度快，无光漂白和信号闪烁，可实现时/空分辨和活体内长时程观察，而具有独特的应用前景。尤其是金和银纳米颗粒，受入射光电磁场驱动后在颗粒表面产生的局域表面等离子体共振(LSPR)效应，显示出对环境介质极大的敏感特性。因而在颗粒表、界面发生的生物识别或化学反应所引起的纳米颗粒散射信号的改变(波长的位移或强度改变)，可以通过暗场显微镜直接观察到，从而实现对动态反应过程的实时监测。结合DNA链取代或酶辅助的循环策略和信号放大技术，构建高灵敏度和选择性响应的核酸检测体系，可进一步提高信号的分辨率和响应灵敏度，实现低浓度核酸目标物的超灵敏检测，为纳米级生物传感和极低含量的核酸检测提供技术支持。
本发明以金/银纳米笼颗粒作为核酸识别反应基底和散射信号指示探针，在探针表面修饰发夹链作为核酸识别单元，利用DNA碱基互补配对和链取代反应规则，实现DNA循环和HCR扩增过程，从而在探针表面形成G-四链体-血红素DNA酶，通过酶催化过氧化氢分解产生的活性氧实现对纳米笼中银组分的刻蚀，引起暗场信号的“灭灯”响应。这种具有时间分辨能力的暗场信号改变，显示出对待测核酸浓度的依赖性，并结合统计分析方法，进行定量分析。
该方法以金纳米笼颗粒作为反应基底和散射信号指示，在其表面构建核酸识别和传感探针，利用纳米笼颗粒对环境中活性氧的灵敏响应，实现散射信号的时间分辨，用于核酸的超灵敏检测。
在K+存在下，纳米笼表面形成众多的G-四链体-血红素DNA酶，可以催化过氧化氢分解产生活性氧(羟基自由基)，对纳米笼颗粒内壁的银成分进行刻蚀，从而引起单个纳米笼探针散射信号的变化，在暗场成像中显示“灭灯”响应。
本发明基于金属纳米粒子局域表面等离子体共振的暗场成像技术实现动态反应过程的实时监测；以金/银纳米笼颗粒作为等离子体探针，在其表面构建的核酸识别、DNA链扩增、类酶催化等过程最终引发颗粒的暗场“灭灯”信号；信号出现的等待时间与待测核酸的浓度呈现较好的函数关系，在成像过程中可清晰的实现时间维度的分辨，相比于观测散射光谱位移和强度变化更加直观和便于检测；其可实时响应和长时程观察的特点在连续监测中具有突出优势，显示出单颗粒暗场成像技术在生物传感和生命分析中的独特前景。
有益效果：与现有技术相比，
(1)本发明以金/银纳米笼颗粒作为等离子体探针，既是作为核酸识别和传感的基底，也作为活性氧刻蚀过程的指示探针，对环境中的活性氧具有灵敏的响应；
(2)本发明中纳米笼探针表面的DNA杂交和链取代过程具有较高的特异性识别能力，待测microRNA的识别可以引发后续的DNA循环和HCR扩增过程，实现信号放大，为单颗粒表面的超灵敏检测提供有效的放大策略；
(3)本发明中以纳米笼探针的暗场“灭灯”响应作为监测信号，灭灯过程的等待时间，与待测物的浓度呈现较好的函数关系，在成像过程中可清晰的实现时间维度的分辨，相比于观测散射光谱位移和强度变化更加直观和便于检测，其可实时响应和长时程观察的特点在连续监测中显示出突出优势；
(4)结合统计学方法，构建了一种依赖于目标物浓度的时间分辨检测策略，并应用于microRNA-21的超灵敏检测，显示出单颗粒暗场成像技术在生物传感和生命分析中的独特前景；
(5)本发明可以实现目标核酸低浓度下的超灵敏、可视化的快速检测。
附图说明
图1为纳米笼探针表面microRNA的识别触发DNA链取代和类酶结构的形成过程；
图2为金银纳米笼颗粒的电镜表征图及高分辨元素分布图；其中，左上角的图片为SEM图片，右上角的图片为Ag元素的分布图，左下角的图片为Au元素的分布图，右下角的图片为Ag和Au元素分布叠加图；
图3为纳米笼探针与20fM浓度的microRNA-21识别后，在H2O2反应液中的暗场信号变化；
图4为统计133颗纳米笼探针在暗场下灭灯时间分布及其高斯拟合曲线；
图5为纳米笼探针的灭灯时间与microRNA-21浓度之间函数关系图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步地详细描述。
以下实施例中使用的材料和试剂均为市售；其中，microRNA-21、microRNA-141序列购自上海吉玛制药技术有限公司，其他DNA序列购自生工生物工程(上海)股份有限公司；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、氯金酸(HAuCl4·3H2O)、过氧化氢(H2O2，30％)、氢氧化钠(NaOH)、氯化钾(KCl)、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠购自国药集团化学试剂有限公司；AgNO3、抗坏血酸(AA)和氯化血红素(hemin)购自阿拉丁试剂公司。三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)、(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯钠盐(磺基-SMCC)购自Sigma-Aldrich有限公司。实验中使用的超纯水电阻率为18.2MΩcm，由Milli-Q超纯水器净化得到。PBS缓冲液由磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配制至所需浓度和pH值。
实施例1：
本实施例提供一种具有核酸识别功能的纳米笼探针的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、银球模板的制备：将85mg的聚乙烯吡络烷酮(PVP)溶于20mL的超纯水中，置于圆底烧瓶中搅拌并加入85mg的AgNO3使其完全溶解。然后加入200μL的氯化钠溶液(5M)，在黑暗条件下继续搅拌15分钟后获得AgCl胶体。在另一个干净的烧瓶中将2.5mL 0.5MNaOH溶液和20mL 50mM的抗坏血酸溶液混合，然后滴入2.5mL新鲜制备的AgCl胶体。混合物在黑暗中搅拌2小时，通过离心洗涤收集得到银球。
步骤2、金/银纳米笼的合成：将按照步骤1制备好的银纳米球稀释到100ml水中，加入200mg PVP，加热至沸腾10分钟。然后滴加1.5mL的HAuCl4溶液(0.2mM)，煮沸10分钟。当混合物冷却到室温时，离心并用饱和的NaCl溶液洗涤，然后离心并用水洗几次得到金/银纳米笼(记为Au/Ag NCs)。
本实施例中制备得到的金/银纳米笼颗粒为中空结构，粒径为52±5nm，外壁为金，内壁为银。
步骤3、纳米笼表面核酸功能化：0.1mM硫醇修饰的DNA序列(H1)在室温下用10mMTCEP活化1h。然后将H1与Au/AgNCs以200∶1的摩尔比在PBS缓冲液中室温孵育12小时。在随后的24h内分多次加入NaCl溶液进行老化，使其浓度逐渐升高至0.15M，之后离心洗涤3次，再分散于1mLPBS缓冲液中(含0.1MNaCl)。从而得到了H1修饰的Au/Ag NCs等离子体探针。其中，H1的序列见下表1所示。
实施例2：
本实施例是对纳米笼颗粒表面的修饰及其在暗场成像监测中的应用。本实施例以microRNA-21为例。
步骤1、按照实施例1制备具有核酸识别功能的纳米笼探针，将等离子体探针分散并固定在正电荷玻璃表面的检测池内，从而获得检测基底。向池中加入20μL含有microRNA-21和H2的溶液孵育1h。之后再用含有H3和H4的PBS溶液孵育。反应1h后，用含有血红素(50μM)和K-(0.1M)的PBS溶液孵育。其中，在每一步孵育后，用PBS缓冲液冲洗反应池；最终形成G-四链体-血红素DNA酶。如图1所示，待测目标链与发卡DNA杂交结合后，发卡结构打开形成直链，此时溶液中H2识别直链中单链部分，并与之杂交发生链取代反应，释放目标链进入下一个循环过程，从而形成多个杂交的直链。再与溶液中H3和H4发生HCR过程，双链延伸。当加入K-和hemin时，H3和H4两端的特定序列与hemin结合形成G-四链体-血红素DNA酶。
只有当待测microRNA存在时，才会使纳米笼表面修饰的H1序列的发卡环打开，并引发H2进行链取代反应，进而释放microRNA-21进入下一个循环，且H3和H4的链杂交扩增过程为目标检测实现了二次信号放大。
步骤2、单个等离子体纳米笼探针的形貌及成分表征如图2所示，纳米笼颗粒为镂空结构，粒径在52±5nm，从元素分布图上可以看出，元素金主要分布在纳米笼外壁，内壁为银。在上述步骤1实施后的检测池中加入含有20mM H2O2的PBS缓冲液作为暗场检测液，随即在暗场显微镜下观察并进行拍照监测，记录暗场信号随时间变化情况。从拍摄照片中提取颗粒的灰度值(散射强度)随时间变化的曲线，获得灭灯时间。如图3所示，以时间为横坐标，以不同时间点拍摄的图像中颗粒的灰度值作为纵坐标，记录颗粒散射强度随时间的变化，其中散射强度突然降低达到平台时对应的时间，即为等待时间。分析至少120个颗粒的暗场信号变化，统计每个颗粒的等待时间，并采用高斯拟合获得平均等待时间。
其中，H2与发卡DNA链部分互补，H3与发卡DNA链和H2部分互补，H4与H3部分互补，它们都是一部分互补；H2浓度为10nM～30nM，H3和H4浓度为50nM～150nM。
具体序列信息见下表1所示，表1中的待测核酸序列以microRNA-21为例示出。若更换其他待测核酸种类，改变待测核酸序列，则下划线的序列段需要进行对应修改；其中，H1和H2序列中的未划线部分需要保持互补。
表1
Figure BDA0002505866920000071
本实施例以金/银纳米笼颗粒作为核酸识别反应基底和散射信号指示探针，在探针表面修饰发夹链作为核酸识别单元，利用DNA碱基互补配对和链取代反应规则，实现DNA循环和HCR扩增过程，从而在探针表面形成G-四链体-血红素DNA酶，通过酶催化过氧化氢分解产生的活性氧实现对纳米笼中银组分的刻蚀，引起暗场信号的“灭灯”响应。
实施例3：
本实施例为对microRNA-21的定量检测及分析过程的应用。按照实施例2进行microRNA的检测和暗场信号获取，其中步骤1中加入的microRNA-21的浓度为20fM，其他实验操作和信号记录过程相同，分析这一microRNA-21浓度下，133个颗粒的灭灯信号响应，统计每个颗粒的等待时间，并采用高斯拟合获得平均等待时间约为41s，如图4所示。重复上述步骤，使用不同浓度的microRNA-21进行实验，绘制不同microRNA-21浓度与平均等待时间之间的曲线，拟合得到两者之间的线性关系，如图5所示。从图5可以看出，microRNA-21的最佳检测浓度在1×10-16～1×10-13mol/L范围内；“灭灯”信号的等待时间与microRNA-21浓度之间存在依赖关系，整体表现为浓度越高，等待时间越短，通过数据拟合得到两者之间线性关系。
这种具有时间分辨能力的暗场信号改变，显示出对microRNA-21浓度的依赖性，并结合统计分析方法，进行定量分析。对于含有未知浓度的microRNA-21待测液，按照本实施例进行，通过对暗场信号的统计和分析获得平均等待时间，利用标准曲线计算待测液中microRNA-21的浓度。
实施例4：
本实施例以microRNA-141为例，检测过程包括如下步骤：
(1)利用氯金酸还原银球模板的方法，制备得到金/银纳米笼结构；将其与发卡DNA探针(H1)按浓度比1∶200进行混合孵育2个小时，再经过老化、离心、洗涤后获得等离子体探针；制备方法同实施例1。
(2)在聚二甲基硅氧烷聚合物膜上打孔，与正电荷玻璃粘贴后作为反应池和检测池。将上述制得的金/银纳米笼颗粒稀释1000倍后，取20μL加入池中，分散并固定在正电荷玻璃表面，获得检测基底。
(3)在池中加入20μL含有10nM的DNA探针(H2)和20fM的目标microRNA-141的样品液，反应1小时后用0.1M的磷酸缓冲液(PBS，pH 7.4)清洗基底，再加入含有50nM发卡探针(H3和H4)的混合液20μL孵育1小时，进行杂交链反应并使用0.1M的PBS缓冲液清洗后，加入50μM的hemin溶液(其中含0.1M的K+)，30分钟后用含有0.1M钾离子的PBS清洗。此时在纳米笼探针颗粒表面形成G-四链体-血红素DNA酶。
(4)向反应池中加入20μL浓度为20mM的H2O2的磷酸缓冲液作为暗场检测液，随即在暗场显微镜下观察并进行拍照监测，记录暗场信号随时间变化情况。
(5)对视野中颗粒的成像情况进行分析，获得单个颗粒的暗场信号“灭灯”响应时间。通过统计分析，获得“灭灯”响应时间与microRNA-141的浓度之间的标准曲线。
(6)通过与待测浓度的microRNA-141孵育后，监测等离子体探针在H2O2检测液中的暗场信号，并进行统计分析，结合标准曲线估算得到待测液中microRNA-141的浓度。
本实施例中的检测结果同实施例2、3相符；其中，本实施例中的具体序列信息见下表2所示。
表2
Figure BDA0002505866920000091
实施例5：
本实施例以DNA为例，检测过程同实施例4基本相同，不同之处在于待测核酸为DNA，以microRNA-21对应的DNA序列作为待测核酸。
本实施例中的检测结果同实施例2、3相符；其中，本实施例中的具体序列信息见下表3所示。
表3
Figure BDA0002505866920000092

Claims (9)

1.一种纳米笼探针，其特征在于：包括金/银纳米笼颗粒，颗粒的表面修饰有发卡DNA链，发卡DNA链与待测核酸部分互补；所述颗粒为中空结构，外壁为金，内壁为银；
所述金/银纳米笼颗粒利用氯金酸还原银球模板的方法制备得到，颗粒的粒径为40～100nm。
2.一种权利要求1所述的纳米笼探针在制备核酸检测试剂盒或非疾病诊断目的的暗场成像监测中的应用。
3.一种非疾病诊断目的的核酸检测方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将金银纳米笼颗粒作为核酸识别反应基底和散射信号指示探针，在探针表面修饰发卡DNA链作为核酸识别单元；
(2)利用DNA碱基互补配对和链取代反应规则，实现DNA循环和HCR扩增过程，在探针表面形成G-四链体-血红素DNA酶；
(3)通过酶催化过氧化氢分解产生的活性氧实现对纳米笼颗粒中银组分的刻蚀，引起暗场成像中暗场信号的改变，利用暗场信号的改变时间与待测核酸浓度的关系进行定量检测。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：在有机硅薄膜上打孔，与正电荷玻璃粘贴后作为反应池和检测池；将步骤(1)制得的金/银纳米笼颗粒稀释后加入池中，分散固定于正电荷玻璃表面，形成检测基底。
5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于步骤(2)包括：将制备得到的探针与含有DNA探针H2和待测核酸的样品液混合反应，用缓冲液清洗基底；后加入发卡探针H3、H4的混合液孵育，进行杂交链反应并使用缓冲液清洗；再加入含有钾离子的hemin溶液，反应后用含有钾离子的缓冲液清洗，得到表面形成G-四链体-血红素DNA酶的纳米笼探针；其中，H2与步骤(1)中的发卡DNA链部分互补，H3与发卡DNA链和H2部分互补，H4与H3部分互补。
6.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述暗场信号的改变时间为从加入含过氧化氢的检测液至颗粒灭灯时的等待时间，所述颗粒灭灯为颗粒的暗场强度前后的灰度值降低50～80％。
7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述金/银纳米笼颗粒固定后，检测基底使用4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸-3-硫代-N-琥珀酰亚胺酯钠盐溶液孵育以中和玻璃表面的多余正电荷。
8.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：待测核酸为microRNA或DNA，待测核酸的浓度为1×10-16 ～1×10-13 mol/L。
9.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：H2的浓度为10nM～30nM，H3和H4浓度为50nM～150nM。
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