CN115656128A - 一种基于上转换内滤效应荧光-比色双模式检测血清中葡萄糖的方法 - Google Patents
一种基于上转换内滤效应荧光-比色双模式检测血清中葡萄糖的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种于上转换内滤效应荧光‑比色双模式检测血清中葡萄糖的方法，该方法用对苯二胺为显色底物，基于其氧化产物吸收带与上转换纳米颗粒(UCNPs)发射带之间的良好重叠，从而通过内滤效应有效地猝灭UCNPs的荧光；同时，检测溶液的紫外吸收强度增强，因此可以通过荧光‑比色双模式对葡萄糖进行定量检测。将该方法用于血清中葡萄糖的测定，并与商用血糖仪检测结果进行对比分析，两者的相对误差不超过4.9％。所述方法不仅克服了荧光供体和荧光受体之间距离的限制，而且快速灵敏、操作简单、抗干扰性好，为复杂体系中葡萄糖的实时监测提供理论依据和技术支持，具有一定的临床应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于生物传感技术领域，具体涉及一种基于上转换内滤效应荧光-比色双模式检测荧光传感器的构建，进而实现对血清中葡萄糖的快速检测新方法。
背景技术
葡萄糖是人类生命活动中的重要物质，它在人体血液中的含量对保障人体的正常工作有着很大的作用。血液中葡萄糖水平可以作为糖尿病或低血糖的诊断参考。因此，发展快速、准确的葡萄糖检测方法在临床诊断中具有重要的意义。
荧光光谱法因其灵敏、快速且操作简单而备受关注。目前，在荧光光谱法中，主要采有机染料和量子点等传统荧光探针材料。其中，有机染料因易受到光漂白的影响稳定性相对较差；量子点大多由高毒性无机材料制备。此外，他们均要求短波长激发，这可能会导致复杂样品中自发的背景荧光干扰。而上转换纳米材料(UCNPs)作为一种可以将近红外光转换成紫外光或可见光的纳米材料，具有低毒、大的反斯托克斯位移、耐光漂白、耐光学化学降解等优良的光学和化学特征，更重要的是该材料有窄的发射带宽、背景荧光几乎为零、大大改善了信噪比，因此被广泛用在在生物成像、生物传感器、光动力疗法等领域。
目前，UCNPs检测葡萄糖主要是基于供体UCNPs与受体之间的荧光共振能量转移(FRET)进行荧光猝灭，而且其猝灭效果依赖于两者之间的距离(通常小于10nm)。与FRET相比，荧光内滤效应(IFE)不依赖于荧光体和吸收体之间的距离，因此更加简单灵活，在分析检测中被广泛应用。但是，IFE仅在猝灭剂的吸收带与荧光团的激发和/或发射带相互重叠时才有效发生，这使得猝灭剂和荧光团的选择非常有限，从而很大程度地限制了基于IFE荧光测定方法的设计。因此，寻找合适的吸收剂-荧光团对于构建基于IFE上转换荧光传感检测葡萄糖仍然是一个挑战。同时，比色法检测葡萄糖常用的显色底物是3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，然而其难溶于水，需要溶解在有机溶剂中。且TMB的氧化产物oxTMB作为IFE的吸收剂，其稳定性较差，实验中发现柠檬酸盐修饰的UCNPs便能使oxTMB褪色。这对在实际人血清中检测葡萄糖的准确性带来严重干扰。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于上转换内滤效应荧光-比色双模式检测血清中葡萄糖的新方法。
本发明的目的通过如下技术方案实现：一种基于上转换内滤效应荧光-比色双模式检测血清中葡萄糖的方法，所述的检测方法包括以下步骤：
(1)采用高温热分解法制备六方相上转换纳米颗粒，再利用柠檬酸钠进行表面配体交换制得水溶性上转换纳米颗粒；
(2)将葡萄糖、水溶性上转换纳米颗粒、葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶和对苯二胺混合，孵育，测定混合液的紫外吸收强度和荧光强度，并计算荧光猝灭效率(F0-F)/F0，其中，F0为葡萄糖浓度为零时，水溶性上转换纳米颗粒的荧光强度，F为水溶性上转换纳米颗粒与葡萄糖同存在时对应的荧光强度；
(3)以葡萄糖浓度为横坐标，分别以紫外吸收强度和荧光猝灭效率(F0-F)/F0为纵坐标绘制标准曲线；
(4)将待测血清样品加入步骤(2)所述的混合溶液中，并按照步骤(2)所述方法检测待测样品的紫外吸收强度和荧光强度；将所得紫外吸收强度和荧光强度数值带入步骤(3)获得的标准曲线中，再通过计算即得到血清样品中葡萄糖的浓度。
本发明的方法具体包括以下步骤：
(1)OA-UCNPs的制备
将236.6mg YCl3·6H2O、77.5mg YbCl3·6H2O、7.6mg ErCl3·6H2O、6.0mL油酸(OA)和15.0mL 1-十八碳烯混合，在氩气保护下加热至160℃，保持反应30min后冷却至40℃。将包含148.2mg NH4F、100mg NaOH的10mL甲醇混合液加入到上述反应液中成核30min，升温至80℃持续搅拌30min以完全蒸发甲醇，然后继续以15℃/min的速度将温度升至300℃反应60-90min，冷却至室温，用体积比为1:1的环己烷-乙醇在8000rpm转速下离心洗涤3次后，弃去上清液，将得到的固体产物放置在温度为70℃真空干燥，即得OA-UCNPs；取10mg制得的OA-UCNPs，放入3mL环己烷和2mL甲苯的混合溶液中充分溶解后备用。
(2)Cit-UCNPs的制备
将516.14mg柠檬酸钠和15mL的一缩二乙二醇，在氩气保护下，110℃反应30min后缓慢冷却到60℃，与步骤(1)所得的混合液混合，升温到130℃蒸发出环己烷以及甲苯。待蒸发结束以后，继续升高温度到180℃，观察溶液颜色变化，直到变为黄色。将混合液自然冷却到室温，在转速为12000rpm的条件下离心15min，用乙醇洗涤沉淀物三次，获得水溶性的柠檬酸钠修饰上转换纳米粒子(Cit-UCNPs)。
(3)标准曲线的绘制
将葡萄糖、Cit-UCNPs、葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶和对苯二胺混合，孵育，测定混合液的紫外吸收强度和荧光强度，并计算荧光猝灭效率(F0-F)/F0，其中，F0为葡萄糖浓度为零时，亲水性上转换纳米颗粒(即水溶性上转换纳米颗粒)的荧光强度，F为亲水性上转换纳米颗粒与葡萄糖同存在时对应的荧光强度；以葡萄糖浓度为横坐标，分别以紫外吸收强度和荧光猝灭效率(F0-F)/F0为纵坐标绘制标准曲线。
(4)血清中葡萄糖浓度的检测
将待测血清样品加入步骤(3)所述的混合溶液中，并按照步骤(3)所述方法检测待测样品的紫外吸收强度和荧光强度；将所得紫外吸收强度和荧光强度数值带入步骤(3)获得的标准曲线中，再通过计算即得到血清样品中葡萄糖的浓度。
本发明的反应机制是基于内滤效应，其底物为对苯二胺，且浓度为2～16mmol/L；孵育温度为25～60℃；孵育时间为1～10min；pH为4.0～8.0；葡萄糖氧化酶浓度为25～200μg/mL；辣根过氧化物酶浓度为100～500ng/mL。
步骤(3)得到的荧光法标准曲线回归方程为Y＝0.122+0.0029X(5-80μmol/L)，R2＝0.9967；Y＝0.235+0.0016X(80-300μmol/L)，R2＝0.9956，其中，Y为(F0-F)/F0，X为葡萄糖浓度；
得到的比色法标准曲线回归方程为Y＝0.09947+0.00172X(0-500μmol/L)，R2＝0.9998；其中，Y为紫外吸收强度，X为葡萄糖浓度。
本发明建立的一种基于上转换内滤效应荧光-比色双模式检测血清中葡萄糖的方法其原理为：
首先，葡萄糖氧化酶(GOx)催化葡萄糖产生葡萄糖酸和H2O2。产生的H2O2在辣根过氧化酶催化下氧化对苯二胺(PPD)得到其氧化产物(PPDox)。由于PPDox吸收带与上转换纳米颗粒(UCNPs)发射带之间的良好重叠，从而通过内滤效应有效地猝灭UCNPs的荧光；同时，检测溶液的紫外吸收强度增强，因此可以通过荧光-比色双模式对葡萄糖进行定量检测。该方法具有操作简便、灵敏度高等优点，为血清中葡萄糖的检测提供新的方法和思路。
本发明所述方法也可扩展用于与H2O2相关分析物的检测中。
本发明的显著优点在于：
(1)本发明采用对苯二胺为显色底物，基于上转换内滤效应构建了一种荧光-比色双模式检测血清中葡萄糖的新方法。
(2)本发明所述的荧光内滤不依赖于荧光体和吸收体之间的距离，因此操作更加简单灵活；
(3)本发明使用980nm近红外激发光可以有效地消除背景的自发荧光干扰，灵敏度更高；
(4)本发明所述方法用于血清中葡萄糖的测定，并与商用血糖仪检测结果进行对比分析，两者的相对误差不超过4.9％。
(5)本发明所述方法不仅克服了荧光供体和荧光受体之间距离的限制，而且快速灵敏、操作简单、抗干扰性好，为复杂体系中葡萄糖的实时监测提供理论依据和技术支持，具有一定的临床应用潜力。
(6)不同的合成方法对UCNPs的尺寸、形貌、结构和上转换发光性能有较大影响。相较于现有报道水热法合成的UCNPs用来检测葡萄糖，本发明用溶剂热法合成粒子，该方法具有多重优势，如反应时间短、毒副产物少、合成的粒子尺寸均匀、单分散性高且尺寸可控范围广。最重要的是本发明采用溶剂热法合成的均匀六方β相的UCNPs要比现有报道中立方α相的具有更高的发光强度及热稳定性。
(7)比色法检测葡萄糖常用的显色底物是3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，然而其难溶于水，需要溶解在有机溶剂中。且TMB的氧化产物oxTMB作为IFE的吸收剂，其稳定性较差，实验中发现柠檬酸盐修饰的UCNPs便能使oxTMB褪色。这对在实际人血清中检测葡萄糖的准确性带来严重干扰。而本发明选用水溶性较好的对苯二胺(PPD)，其氧化产物PPDox的稳定性极好，受其他基质影响较小，更适用于在复杂人血清中准确的检测葡萄糖。另一方面，本发明提出的H2O2/HRP/PPD系统适用的pH范围较广，与人正常血液的pH(7.35-7.45)相近的条件下，也具有较高的反应活性。与现有报道中类芬顿反应必须具有较低的pH相比，本发明的系统更加适用于在不改变正常人血清pH的条件下高效准确的检测葡萄糖。
附图说明
图1为本发明实施例1中Cit-UCNPs的透射电镜图。
图2为本发明实施例1中Cit-UCNPs的X射线衍射图。
图3为本发明实施例2中荧光法检测葡萄糖。
图4为本发明实施例2中比色法检测葡萄糖。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
实施例1
Cit-UCNPs的制备
(1)将236.6mg YCl3·6H2O、77.5mg YbCl3·6H2O、7.6mg ErCl3·6H2O、6.0mL油酸(OA)和15.0mL 1-十八碳烯混合，在氩气保护下加热至160℃，保持反应30min后冷却至40℃。将包含148.2mg NH4F、100mg NaOH的10mL甲醇混合液加入到上述反应液中成核30min，升温至80℃持续搅拌30min以完全蒸发甲醇，然后继续以15℃/min的速度将温度升至300℃反应60-90min，冷却至室温，用体积比为1:1的环己烷-乙醇在8000rpm转速下离心洗涤3次后，弃去上清液，将得到的固体产物放置在温度为70℃真空干燥，即得OA-UCNPs；取10mg制得的OA-UCNPs，放入3mL环己烷和2mL甲苯的混合溶液中充分溶解后，得含有OA-UCNPs的混合液，备用。
(2)将516.14mg柠檬酸钠和15mL的一缩二乙二醇，在氩气保护下，110℃反应30min后缓慢冷却到60℃，与步骤(1)所得的混合液混合，升温到130℃蒸发出环己烷以及甲苯。待蒸发结束以后，继续升高温度到180℃，观察溶液颜色变化，直到变为黄色，反应时间为60-90min。将反应液自然冷却到室温，在转速为12000rpm的条件下离心15min，用乙醇洗涤沉淀物三次，获得水溶性的柠檬酸修饰上转换纳米粒子(Cit-UCNPs)。
其中，Cit-UCNPs的TEM和XRD表征如图1和图2所示。图1表明合成的Cit-UCNPs纳米粒子分散性良好，粒径约为30nm。图2的XRD数据表明与六方相的NaYF4的谱图完全吻合，说明合成的Cit-UCNPs为六方相，具有较好的荧光性能。
实施例2
荧光-比色双模式检测葡萄糖
将50μL 50μg/mL葡萄糖氧化酶GOx加入200μL含不同浓度葡萄糖的磷酸盐缓冲溶液中，于37℃下反应30min用以产生H2O2。之后加入30μL 1mg/mL Cit-UCNPs、50μL 250ng/mLHRP和50μL 4mmol/L PPD，并用10mmol/L，pH＝6.5的磷酸盐缓冲液将所得溶液稀释到550μL，于45℃下孵育10min。随后收集其上转换荧光和比色光谱，实验结果如图3和图4所示。由图3可知，随着葡萄糖浓度的增加，Cit-UCNPs的荧光强度逐渐减弱，并且猝灭效率和葡萄糖浓度在5～80μmol/L(R2＝0.9967)和80-300μmol/L(R2＝0.9956)之间有很好的线性关系，计算的葡萄糖的检测限为0.83μmol/L(S/N＝3)，与已经报道的葡萄糖荧光检测方法进行比较，该方法的检测限低于报道的相关方法(如文献[1]至文献[6]所报道的方法)，比较结果见表1，表1为本发明所述本方法的检测限与文献报道的相关方法进行比较的结果。
表1
其中，文献[1]至文献[6]为：
[1]J.J.Guo,Y.Y.Liu,M.Zhao,S.Wu,J.Y.Wang,Y.Yue,M.Zhao,W.Yan*.Label-free fluorescence detection of hydrogen peroxide and glucose based on the Ni-MOF nanozyme-induced self-ligand emission.Microchim Acta,2022,189:219-229.
[2]C.L.Yang,N.Gao,Y.Z.Liu,H.Z.Zhao,J.Jing,X.L.Zhang*.A siliconnanoparticle-based nanoprobe for ratiometric fluorescence and visualdetection of glucose.New J.Chem,2021,45:19515-19520.
[3]J.L.Ma,B.C.Yin*,X.Wu,B.C.Ye.Simple and Cost-Effective GlucoseDetection Based on Carbon Nanodots Supported on SilverNanoparticles.Anal.Chem,2017,89:1323-1328.
[4]D.Zhu,S.J.Zhuo*,C.Q.Zhu*,P.Zhang,W.L.Shen.Synthesis ofcatalytically active peroxidase-like Fe-doped carbon dots and application forratiometric fluorescence detection of hydrogen peroxide andglucose.Anal.Methods,2019,11:2663-2668.
[5]J.Yuan,C.Yao,X.J.Kong,S.Wu,C.L.W.Liu,R.Q.Yu,X.Chu*.MnO2-Nanosheet-Modified Upconversion Nanosystem for Sensitive Turn-On Fluorescence Detectionof H2O2 and Glucose in Blood.ACS Appl.Mater.Interfaces,2015,7:10548-10555.
[6]H.Y.Chen,A.J.Fang,H.Li,Y.Y.Zhang*,S.Z.Yao.Sensitive fluorescentdetection of H2O2 and glucose in human serum based on inner filter effect ofsquaric acid-iron(III)on the fluorescence of upconversionnanoparticle.Talanta,2017,164:580-587.
实施例3
为了评估本方法的适用性，分别通过本方法和商用血糖仪对血清样品中葡萄糖进行检测，结果表明本方法的检测结果与商用血糖仪测试结果一致。此外，还进行了标准加入实验，结果表明葡萄糖的回收率在99.5％～109.0％之间，相对标准偏差(RSD，n＝3)小于4.9％。以上结果表明，本发明建立的方法能够有效地检测血清中葡萄糖。
以上所述为本发明的典型实施例，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。
Claims (5)
1.一种基于上转换内滤效应荧光-比色双模式检测血清中葡萄糖的方法，其特征在于：所述的检测方法包括以下步骤：
(1)采用高温热分解法制备六方相上转换纳米颗粒，再利用柠檬酸钠进行表面配体交换制得水溶性上转换纳米颗粒；
(2)将葡萄糖、水溶性上转换纳米颗粒、葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶和对苯二胺混合，孵育，测定混合液的紫外吸收强度和荧光强度，并计算荧光猝灭效率(F0-F)/F0，其中，F0为葡萄糖浓度为零时，水溶性上转换纳米颗粒的荧光强度，F为水溶性上转换纳米颗粒与葡萄糖同存在时对应的荧光强度；
(3)以葡萄糖浓度为横坐标，分别以紫外吸收强度和荧光猝灭效率(F0-F)/F0为纵坐标绘制对应的标准曲线；
(4)将待测血清样品加入步骤(2)所述的混合溶液中，并按照步骤(2)所述方法检测待测样品的紫外吸收强度和荧光强度；将所得紫外吸收强度和荧光强度数值带入步骤(3)获得的标准曲线中，再通过计算即得到血清样品中葡萄糖的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述水溶性上转换纳米颗粒为柠檬酸钠修饰的上转换纳米粒子(Cit-UCNPs)，其制备方法包括以下步骤：
步骤Ⅰ将236.6mg YCl3·6H2O、77.5mg YbCl3·6H2O、7.6mg ErCl3·6H2O、6.0mL油酸(OA)和15.0mL 1-十八碳烯混合，在氩气保护下加热至160℃，保持反应30min后冷却至40℃；将包含148.2mg NH4F、100mg NaOH的10mL甲醇混合液加入到上述反应液中成核30min，升温至80℃持续搅拌30min以完全蒸发甲醇，然后继续以15℃/min的速度将温度升至300℃反应60-90min，冷却至室温，用体积比为1:1的环己烷-乙醇在8000rpm转速下离心洗涤3次后，弃去上清液，将得到的固体产物放置在温度为70℃真空干燥，即得OA-UCNPs；
步骤Ⅱ将516.14mg柠檬酸钠和15mL的一缩二乙二醇，110℃反应30min后缓慢冷却到60℃；
步骤Ⅲ取步骤Ⅰ制得的OA-UCNPs 10mg，放入3mL环己烷和2mL甲苯的混合液中充分溶解；随后，将此混合物加入到步骤Ⅱ的混合物中，升温到130℃蒸发出环己烷以及甲苯；待蒸发结束以后，继续升高温度到180℃，观察溶液颜色变化，直到变为黄色；将混合液自然冷却到室温，在转速为12000rpm的条件下离心15min，用乙醇洗涤沉淀物三次，获得水溶性的柠檬酸钠修饰上转换纳米粒子(Cit-UCNPs)。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)的反应机制是基于内滤效应，且其底物为对苯二胺，对苯二胺的浓度为2～16mmol/L；孵育温度为25～60℃；孵育时间为1～10min；pH为4.0～8.0；葡萄糖氧化酶浓度为25～200μg/mL；辣根过氧化物酶浓度为100～500ng/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)所得的荧光法标准曲线回归方程为Y＝0.122+0.0029X(5-80μmol/L)，R2＝0.9967；Y＝0.235+0.0016X(80-300μmol/L)，R2＝0.9956，其中，Y为(F0-F)/F0，X为葡萄糖浓度。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)所得的比色法标准曲线回归方程为Y＝0.09947+0.00172X(0-500μmol/L)，R2＝0.9998；其中，Y为紫外吸收强度，X为葡萄糖浓度。
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|---|---|---|---|---|
| CN116908154A (zh) * | 2023-06-26 | 2023-10-20 | 江苏大学 | 一种基于酶联上转换荧光与草酸钛钾酸体系的肉制品中环丙沙星快速检测方法 |
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2022
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