CN110055053B - 一种特异性识别铜离子的多肽荧光探针及其制备和检测方法 - Google Patents

一种特异性识别铜离子的多肽荧光探针及其制备和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种特异性识别铜离子的多肽荧光探针及其制备和检测方法。其包括：(1)多肽探针的设计：新型的多肽探针，特征包括:①、多肽序列可以靶向结合Cu2+；②、多肽序列的N端修饰发光物质；(2)多肽探针的制备：固相合成特定序列的多肽，再将发光物质修饰到该多肽；(3)体外检测：包括:①、多肽探针的离子选择性；②、多肽探针的铜离子结合比；③、多肽探针的pH响应性；④多肽探针的检测限；(4)细胞成像。本发明设计的一种新型多肽探针，对金属铜离子具有良好的结合能力，选择性好、毒性低、检测限低，而且制备简单、检测方便，为生物和环境样品中的铜离子的快速检测提供了一种高效的方法。

Description

一种特异性识别铜离子的多肽荧光探针及其制备和检测方法
本发明涉及一种特异性识别铜离子的多肽荧光探针及其制备和检测方法，属于分析检测技术领域。
背景技术
铜离子是维持生物体正常活动必不可少的微量元素之一，在人体内的过渡金属的含量中居于第三位，在各种生理过程中扮演着重要角色。当机体内的铜离子浓度超出或者低于细胞所需的浓度范围时，就会导致正常的生命活动受到影响。铜离子浓度的异常会导致神经退行性疾病(如老年痴呆症和威尔逊疾病)、以及肝豆状核变性疾病等疾病。因此开发新的具有高选择性、高灵敏度、水溶性好的识别Cu2+的荧光探针，对解析这些重要疾病的机理机制具有重要意义。
目前，已研发出几种荧光多肽探针用于Cu2+的检测。例如，一种结合Cu2+促使荧光淬灭的传感器NBD-SSH，可用于在纯水中检测Cu2+，但其会受到Hg2+以及Ni2+的干扰，并且检测限较高，最低检测限为724nM，并且没有将其应用于生物成像中。一种检测Cu2+的多肽探针WGGH，其用于检测Cu2+的最适pH为10.0，这不适用于在生物体内成像，并且该探针易受同主族离子的干扰。本发明开发的一种特异性识别铜离子的多肽荧光探针及其制备和检测方法，选择性高、不受其他离子干扰、生物相容性好、制备简单、检测限较低，可用于生物样品的检测，为研究金属离子在人体的生理活动和疾病过程中的作用提供了一种快速灵敏的方法。
发明内容
鉴于此，本发明提供了一种特异性识别铜离子的多肽荧光探针及其制备和检测方法。本方法利用特定多肽序列与Cu2+特异性的结合，建立了一种铜离子的高效检测方法，它特异性好、不受其它金属离子的干扰、毒性低、检测限低，而且制备简单、检测方便。
本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：
(1)多肽探针的设计
新型的多肽探针，特征包括:①、多肽序列可以靶向结合Cu2+；②、多肽序列的N端修饰发光物质；
(2)多肽探针的制备
固相合成特定序列的多肽，再将发光物质修饰到该多肽；
(3)体外检测
包括:①、多肽探针的离子选择性；②、多肽探针的铜离子结合比；③、多肽探针的pH响应性；④多肽探针的检测限；
(4)细胞成像。
包括:①、将该多肽探针用于HeLa细胞中，显微镜观察其成像；②、随后加入Cu2+显微镜下观察其成像。
多肽探针的序列为X-DDGGEE，其中X为发光物质，D为天冬氨酸，G为甘氨酸，E为谷氨酸。
发光物质为荧光素类、罗丹明类、香豆素类、喹啉类、萘酰亚胺、多芳基乙烯类中的一种或几种；所述发光物质连接在探针多肽的N端。
多肽探针固相合成的具体方法为：
a)将80-100mg的树脂加入具有筛板的反应器中，使用2-8mL二氯甲烷溶胀树脂；
b)由15-25％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基，通过显色反应来检测保护基的脱除程度；
c)将N端由Fmoc保护的氨基酸(4eq)与HOBt(4eq)和HBTU(4eq)由DMF溶解，活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，溶液混合均匀后加入到反应器中，反应1-6hrs；
d)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由2-8mL DMF和DCM洗2-4次，显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由15-25％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min，树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；
e)之后重复步骤c)和d)，直到合成目标序列的多肽后，向反应器中加入发光物质(4eq)，显色反应检测反应完全后，树脂分别由3-8mL DMF和DCM洗2-4次；
f)树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤2-4次，然后将树脂抽干，加入切割液，切割液的组分为TFA:TIS:水的质量比为95:2.5:2.5，反应1-6hrs；
g)向反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀，然后通过离心收集沉淀，用TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2-4次后干燥，得到粗肽，粗肽由反相液相色谱纯化得纯肽；
h)然后将经液相色谱纯化得到的溶液冻干得到探针。
多肽探针的离子选择性评价的具体方法为：比较该探针对于16种常见金属离子(Ag+,Al3+,Ca2+,Cd2+,Co2+,Cr3+,Cu2+,Fe3+,Hg2+,K+,Mg2+,Mn2+,Na+,Ni2+,Pb2+,Zn2+)的选择性，再加入响应离子后研究该探针在对响应离子Cu2+识别过程中的竞争能力。
多肽探针的铜离子结合比测定的具体方法为：在荧光比色皿中加入2m L、p H＝7.4的HEPES缓冲溶液和20μL、10-3mol/L的多肽探针；然后，依次加入0-40μL、10-3mol/L的Cu2 +，进行测量，取数据作图。
多肽探针的pH响应性评价的具体方法为：在荧光比色皿中加入2m L、p H＝7.4的HEPES缓冲溶液和20μL、10-3mol/L的多肽探针，测量其荧光；然后，依次加入0-40μL、10- 3mol/L的Cu2+，进行测量，取数据作图。
多肽探针的检测限测定的具体方法为：通过Cu2+的荧光滴定数据，我们可以计算出Cu2+的检测限；首先，通过10次重复性实验测出仅有多肽探针时的荧光数据来确定空白条件下的标准偏差(R)；其次，通过逐次递增Cu2+浓度，在发射波长为515nm处测得系列荧光数据，作图可观察到，最后，利用检测限LOD＝3σ/k公式计算，其中σ是空白条件下标准偏差、k是曲线斜率，便可以计算出Cu2+的最低检测限。
多肽探针用于细胞成像的具体方法为：HeLa细胞被培养在DMEM介质中，在37℃下，向该细胞中加入10μM的多肽探针孵育2h，洗涤3次后，通过正置荧光显微镜(ex＝330nm，em＝545nm)进行观察，暗场成像；然后向上述细胞中加入10μM的Cu2+孵育2h，洗涤3次后，通过正置荧光显微镜进行观察，暗场成像。
本发明的有益效果：
1.因多肽是生物分子，该探针以多肽为主要结构单元，因而具有生物相容性好、毒性低的优点；
2.根据计算机模拟，该多肽的序列DDGGEE可以很好的螯合Cu离子；荧光实验的结果进一步证实，该多肽探针对Hg2+、Ni2+等Cu2+以外的离子没有响应，充分表明基于DDGGEE这一特征序列的新型多肽探针对Cu离子特异性好，不受其它金属离子干扰；
3.该多肽探针可以通过固相法直接合成，制备简单；该探针对Cu离子通过常规荧光方法测定，检测方便。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。
图1是本发明荧光多肽探针的结构图；
图2是本发明多肽探针的阳离子荧光选择性识别光谱图；
图3是本发明多肽探针的阳离子荧光选择性识别柱状图；
图4是本发明Cu2+的荧光滴定光谱图及趋势图；
图5是本发明多肽探针L、L-Cu在不同pH范围内的荧光强度响应图；
图6是本发明Cu2+的最低检测限图；
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。如图1-图6所示，一种特异性识别铜离子的多肽荧光探针及其制备和检测方法，包括如下步骤：
(1)多肽探针的设计
新型的多肽探针，特征包括:①、多肽序列可以靶向结合Cu2+；②、多肽序列的N端修饰发光物质；
(2)多肽探针的制备
固相合成特定序列的多肽，再将发光物质修饰到该多肽；
(3)体外检测
包括:①、多肽探针的离子选择性；②、多肽探针的铜离子结合比；③、多肽探针的pH响应性；④多肽探针的检测限；
(4)细胞成像。
包括:①、将该多肽探针用于HeLa细胞中，显微镜观察其成像；②、随后加入Cu2+显微镜下观察其成像。
所述步骤(1)中多肽探针的序列为X-DDGGEE，其中X为发光物质，D为天冬氨酸，G为甘氨酸，E为谷氨酸。
所述步骤(1)中发光物质为荧光素类、罗丹明类、香豆素类、喹啉类、萘酰亚胺、多芳基乙烯类中的一种或几种；所述发光物质连接在探针多肽的N端。
所述步骤(2)中多肽探针固相合成的具体方法为：
a)将80-100mg的树脂加入具有筛板的反应器中，使用2-8mL二氯甲烷溶胀树脂；
b)由15-25％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基，通过显色反应来检测保护基的脱除程度；
c)将N端由Fmoc保护的氨基酸(4eq)与HOBt(4eq)和HBTU(4eq)由DMF溶解，活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，溶液混合均匀后加入到反应器中，反应1-6hrs；
d)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由2-8mL DMF和DCM洗2-4次，显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由15-25％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min，树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；
e)之后重复步骤c)和d)，直到合成目标序列的多肽后，向反应器中加入发光物质(4eq)，显色反应检测反应完全后，树脂分别由3-8mL DMF和DCM洗2-4次；
f)树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤2-4次，然后将树脂抽干，加入切割液，切割液的组分为TFA:TIS:水的质量比为95:2.5:2.5，反应1-6hrs；
g)向反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀，然后通过离心收集沉淀，用TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2-4次后干燥，得到粗肽，粗肽由反相液相色谱纯化得纯肽；
h)然后将经液相色谱纯化得到的溶液冻干得到探针。
所述步骤(3)中多肽探针的离子选择性评价的具体方法为：比较该探针对于16种常见金属离子(Ag+,Al3+,Ca2+,Cd2+,Co2+,Cr3+,Cu2+,Fe3+,Hg2+,K+,Mg2+,Mn2+,Na+,Ni2+,Pb2+,Zn2+)的选择性,再加入响应离子后研究该探针在对响应离子Cu2+识别过程中的竞争能力。
所述步骤(3)中多肽探针的铜离子结合比测定的具体方法为：在荧光比色皿中加入2mL、pH 7.4的HEPES缓冲溶液和20μL、10-3mol/L的多肽探针，测量其荧光；然后，依次加入0-40μL、10-3mol/L的Cu2+，进行测量，取数据作图。
所述步骤(3)中多肽探针的pH响应性评价的具体方法为：在荧光比色皿中加入2mL、pH＝7.4的HEPES缓冲溶液和20μL、10-3mol/L的多肽探针；然后，依次加入0-40μL、10- 3mol/L的Cu2+，进行测量，取数据作图。
所述步骤(3)中多肽探针的检测限测定的具体方法为：通过Cu2+的荧光滴定数据，我们可以计算出Cu2+的检测限；首先，通过10次重复性实验测出仅有多肽探针时的荧光数据来确定空白条件下的标准偏差(R)；其次，通过逐次递增Cu2+浓度，在发射波长为515nm处测得系列荧光数据，作图可观察到；最后，利用检测限LOD＝3σ/k公式计算，其中σ是空白条件下标准偏差、k是曲线斜率，便可以计算出Cu2+的最低检测限。
所述步骤(4)中多肽探针用于细胞成像的具体方法为：HeLa细胞被培养在DMEM介质中，在37℃下，向该细胞中加入10μM的多肽探针孵育2h，洗涤3次后，通过正置荧光显微镜(ex＝330nm，em＝545nm)进行观察，暗场成像；然后向上述细胞中加入10μM的Cu2+孵育2h，洗涤3次后，通过正置荧光显微镜进行观察，暗场成像。
实施例1
(1)多肽探针的设计
设计的荧光多肽探针的序列为Dansyl-DDGGEE，其中Dansyl为丹磺酰氯，该探针单独以及与Cu离子结合的结构如图1所示；
(2)多肽探针的制备
1.将100mg Rink氨树脂加入具有筛板的反应器中，使用5mL二氯甲烷溶胀树脂；
2.由20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基，显色反应检测保护基脱除完全；
3.将N端由Fmoc保护的氨基酸(4eq)与HOBt(4eq)和HBTU(4eq)由DMF溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，溶液混合后加入到反应器中，反应3hrs。
4.反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次。显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由20％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min。树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；
5.重复步骤3、4，直到合成目标序列的多肽DDGGEE。将Dansyl(4eq)与HOBt(4eq)和HBTU(4eq)由DMF溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，溶液混合后加入到反应器中，反应6hrs。
6.反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次。显色反应检测Dansyl缩合完全，树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤3次。将树脂抽干，加入切割液(TFA:TIS:水＝95:2.5:2.5)，反应3hrs。
7.反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀。离心收集沉淀，用少量TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2次后风干，得到粗肽。粗肽由反相液相色谱纯化得纯肽。
(3)体外检测
1.多肽探针的离子选择性评价
HEPES缓冲(10mM,pH7.4)，向其中分别加入10-5mol/L的探针以及10-5mol/L的金属阳离子(Ag+,Al3+,Ca2+,Cd2+,Co2+,Cr3+,Cu2+,Fe3+,Hg2+,K+,Mg2+,Mn2+,Na+,Ni2+,Pb2+,Zn2+)，检测溶液的荧光发射光谱变化，如图2所示；只有加入Cu2+时才引起荧光强度的显著变化，而其他的金属阳离子都不会引起荧光强度的变化，包括Hg2+；与文献中报道的检测Cu2+的多肽相比，该探针的选择性更好。
HEPES缓冲(10mM,pH7.4)，向其中加入10-5mol/L的探针以及10-5mol/L的金属阳离子(Ag+,Al3+,Ca2+,Cd2+,Co2+,Cr3+,Cu2+,Fe3+,Hg2+,K+,Mg2+,Mn2+,Na+,Ni2+,Pb2+,Zn2+)，检测溶液的荧光发射光谱变化，然后再向以上含有金属离子的溶液中分别加入10-5mol/L的Cu2+，检测溶液的荧光发射光谱，取最大发射波长所对应的值作图，如图3所示；尽管存在其他金属离子，Cu2+仍然能够导致荧光多肽探针的猝灭，说明该荧光多肽探针对Cu2+的检测不受其他阳离子干扰。
2.多肽探针的铜离子结合比
HEPES缓冲(10mM,pH7.4)，向其中加入10-5mol/L的探针，再向其中加入不同浓度的Cu2+(0.001,0.05,0.1,0.15,0.2,0.25,0.3,0.35,0.4,0.45，0.5,0.55,0.6,0.65,0.7,0.75,0.8,0.85,0.9,0.95,1.0,…2.0eq)，检测溶液的荧光发射光谱变化；再取发射波长为540nm处所对应的值作出荧光滴定趋势图，如图4所示；随着Cu2+浓度的增大，在540nm处的荧光强度不断降低，当加入的1当量的Cu2+后，540nm处的荧光强度不再发生变化，说明所加的Cu2+已经达到饱和，该荧光多肽探针与Cu2+以1:1的化学计量比结合。
3.多肽探针的pH响应性
在不同pH的HEPES缓冲溶液中，检测荧光多肽探针自己以及其与Cu2+共同存在时的荧光发射光谱，取荧光强度最大值做图，得到图5；可以看出，该体系的pH适用范围很广。
4.多肽探针的检测限
利用Cu2+滴定数据，取540nm处的荧光强度做成点图，线性拟合得到一条线性相关系数为0.99的直线，如图6；计算得出Cu2+的检测限为74nM。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (13)

1.一种靶向结合Cu2+的多肽序列，其特征在于，所述多肽序列为DDGGEE。
2.一种特异性识别Cu2+的多肽荧光探针，其特征在于，所述多肽荧光探针的序列为Dansyl-DDGGEE，其中，所述Dansyl为荧光发光物质丹磺酰氯，所述Dansyl修饰在所述多肽序列DDGGEE的N端。
3.如权利要求2所述的多肽荧光探针的制备方法，其特征在于，所述方法为：固相合成多肽序列DDGGEE，再将荧光发光物质Dansyl修饰到该多肽序列上。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将80-100mg的树脂加入具有筛板的反应器中，使用2-8mL二氯甲烷溶胀树脂；
(2)由15-25％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除N端Fmoc保护基，通过显色反应来检测保护基的脱除程度；
(3)将N端由Fmoc保护的氨基酸4eq与HOBt 4eq和HBTU 4eq由DMF溶解，活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA 6eq，溶液混合均匀后加入到反应器中，反应1-6hrs；
(4)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由2-8mLDMF和DCM洗2-4次，显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由15-25％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min，树脂分别由5mLDMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；
(5)之后重复步骤(3)和(4)，直到合成目标序列的多肽后，向反应器中加入荧光发光物质Dansyl4eq，显色反应检测反应完全后，树脂分别由3-8mLDMF和DCM洗2-4次；
(6)树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤2-4次，然后将树脂抽干，加入切割液，切割液的组分为TFA：TIS：水的质量比为95：2.5：2.5，反应1-6hrs；
(7)向反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀，然后通过离心收集沉淀，用TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2-4次后干燥，得到粗肽，粗肽由反相液相色谱纯化得纯肽；
(8)然后将经液相色谱纯化得到的溶液冻干得到探针。
5.一种如权利要求2所述的多肽荧光探针在体外检测Cu2+中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述体外检测Cu2+含量的方法包括：①、多肽探针的离子选择性；②、多肽探针的铜离子结合比；③、多肽探针的pH响应性；④多肽探针的检测限。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述多肽探针的离子选择性的方法为：比较该探针对于Ag+、Al3+、Ca2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Cu2+、Fe3+、Hg2+、K+、Mg2+、Mn2+、Na+、Ni2+、Pb2+、Zn2+的选择性，再加入响应离子后研究该探针在对响应离子Cu2+识别过程中的竞争能力。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述多肽探针的铜离子结合比的测定方法为：在荧光比色皿中加入2mL、pH7.4的HEPES缓冲溶液和20μL、10-3mol/L的多肽探针，测量其荧光；然后，依次加入0-40μL、103mol/L的Cu2+，测其荧光，取数据作图。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述多肽探针的pH响应性的检测方法为：荧光比色皿中分别加入20μL、10-3mol/L的多肽探针和2mL、pH＝2-12的系列缓冲溶液测出数据；然后，在上述荧光比色皿中分别加入2.0μL、10-2mol/L的Cu2+，测出数据，作图。
10.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述多肽探针的检测限的测定方法为：通过Cu2+的荧光滴定数据，计算出Cu2+的检测限；首先，通过10次重复性实验测出仅有多肽探针时的荧光数据来确定空白条件下的标准偏差R；其次，通过逐次递增Cu2+浓度，在发射波长为515nm处测得系列荧光数据，作图可观察到，最后，利用检测限LOD＝3σ/k公式计算，其中σ是空白条件下标准偏差、k是曲线斜率，计算出Cu2+的最低检测限。
11.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述多肽探针的铜离子结合比为1:1。
12.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述Cu2+的最低检测限为74nM。
13.如权利要求2所述的多肽荧光探针在制备细胞成像试剂中的应用。
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