CN116037189B - 用于抗坏血酸/葡萄糖检测的Co/Mn双金属位点单原子催化剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于抗坏血酸/葡萄糖检测的Co/Mn双金属位点单原子催化剂，利用g‑C3N4为载体，通过常温碱性条件下的原位刻蚀作用实现单原子催化剂的制备，避免了高温可能带来的危险和氮气氛的苛刻条件。本发明制备的单原子纳米酶既能用于抗坏血酸的检测，又能用于葡萄糖的检测，具有很大的潜在应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物分析检测技术领域，涉及一种用于抗坏血酸/葡萄糖检测的Co/Mn双金属位点单原子催化剂。
背景技术
糖尿病严重威胁人类健康，患有糖尿病的病人需要实时连续监控血糖指标。实时查看血糖水平可以帮助患者在一天中就如何平衡食物、身体活动和服用药物做出更合理的决策参考。常见的血糖监测技术是基于天然葡萄糖氧化酶传感器实现的，利用葡萄糖氧化酶识别葡萄糖并传导出信号，实现检测。对于血糖连续监控，天然酶寿命较短，反复使用后检测灵敏度明显衰减，这极大的缩短了检测仪器的寿命。
自2007年类辣根过氧化酶被报道以来，纳米酶的研究迅速崛起，纳米酶对比天然酶来说价廉易制备，且在极端条件下也能保持较好的催化活性，因此得以在生物医学，环境，食品，工业等领域广泛使用。纳米酶具有类似于天然酶的活性中心，电子转移结构或者二者兼而有之，这是纳米酶催化活性的来源。相较于传统天然酶(主要是蛋白质)更稳定，在极端条件下也能保持较高的催化活性。所以，利用具有类酶催化活性的纳米酶材料来代替天然酶，应用到生物样品检测比如血糖检测当中，可以极大提高检测仪器的寿命。
基于此，开发一款具有模拟天然类过氧化物酶的特性，催化葡萄糖氧化产生的过氧化氢，实现葡萄糖的实时检测，提高葡萄糖氧化酶传感器寿命的单原子葡萄糖氧化纳米酶的制备方法与应用是目前行业内急需的。单原子纳米酶的制备通常需要在管式炉中以氮气氛保护同时作为氮源并持续升温在高温的环境下制备，制备条件较为严苛且具有一定的危险性。因此开发一种简便的能够在常温条件下制备单原子催化剂的方法很有必要。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种用于抗坏血酸/葡萄糖检测的Co/Mn双金属位点单原子催化剂。本发明制备的用于抗坏血酸/葡萄糖检测的Co/Mn双金属位点单原子催化剂在常温下通过利用金属离子在载体表面进行碱性条件下的刻蚀作用制备，同时制备的单原子活性位点和双金属元素使得催化活性有大的增长，具有较大的应用前景。
除特殊说明外，本发明所述份数均为重量份，所述百分比均为质量百分比。
一种用于抗坏血酸/葡萄糖检测的Co/Mn双金属位点单原子催化剂，其特征在于，先在g-C3N4表面覆盖为单原子提供锚定位置的SiO2外壳，再在SiO2外壳上碱性刻蚀双金属单原子，制备得到本发明用于抗坏血酸/葡萄糖检测的Co/Mn双金属位点单原子催化剂；
所述在g-C3N4表面覆盖为单原子提供锚定位置的SiO2外壳的步骤为：
将g-C3N4配置成2-5mg/mL的水溶液，超声10-20min使充分分散；取g-C3N4溶液与甲醇混合均匀，然后加入超纯水形成混合溶液，常温搅拌3-8min，然后用NaOH溶液调节pH至11；所述g-C3N4溶液、甲醇与超纯水的体积比为1：0.8-1.2：6-10；向pH为11的溶液中加入CTAB，搅拌使CTAB充分溶解，再常温搅拌20-40min，接着加入正硅酸四乙酯，常温下搅拌20-40min，以超纯水洗涤除去未反应的物质，得到在g-C3N4表面覆盖为单原子提供锚定位置的SiO2外壳；
所述在SiO2外壳上碱性刻蚀双金属单原子的步骤为：
将在g-C3N4表面覆盖为单原子提供锚定位置的SiO2外壳用超纯水溶解，然后与双金属氨水溶液混合均匀，搅拌过夜得到在SiO2外壳上碱性刻蚀双金属单原子催化剂；所述双金属氨水溶液的制备方法为：CoCl2·6H2O和MnSO4·4H2O用超纯水溶解得到双金属水溶液，向双金属水溶液中加入NH4Cl和浓氨水，得到双金属氨水溶液。
本发明用于抗坏血酸/葡萄糖检测的Co/Mn双金属位点单原子催化剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在g-C3N4表面覆盖为单原子提供锚定位置的SiO2外壳：
称取3mg g-C3N4配置成3mg/mL的水溶液，超声15min使充分分散；取1mL g-C3N4溶液加入0.925mL甲醇，涡旋并混合均匀后加入7.325mL超纯水，常温搅拌5min；以1M的NaOH溶液调节上述溶液的pH为11；向g-C3N4溶液中加入CTAB 9.25mg，低速搅拌使CTAB充分溶解，常温搅拌30min，加入46.25μL正硅酸四乙酯，常温下搅拌30min；以超纯水洗涤三遍除去未反应的物质；
(2)在SiO2外壳上碱性刻蚀双金属单原子：
上述步骤中洗涤过后的包覆了二氧化硅外壳的g-C3N4全部溶解于0.5mL超纯水备用；称取8.806mg CoCl2·6H2O和8.255mg MnSO4·4H2O溶解于0.5mL超纯水，向双金属水溶液中加入14.84mg NH4Cl和37μL的浓氨水，然后与包覆了二氧化硅外壳的g-C3N4的溶液混合，搅拌过夜；以超纯水清洗沉淀三次，冻干收集。
本发明用于抗坏血酸/葡萄糖检测的Co/Mn双金属位点单原子催化剂检测抗坏血酸的方法为：向500μL HAc-NaAc缓冲液里加入100μL TMB的醇溶液，加入100μL抗坏血酸溶液和10μL 1mg/mL的CoMn SACs溶液，涡旋使充分混合，等待10min后在紫外分光光度计中测量652nm处的吸收值；所有操作在避光条件下进行；将吸收值代入建立的吸收值-浓度曲线得到抗坏血酸的浓度。
CoMn SACs能够催化水中的溶解氧产生自由基，自由基将无色的TMB氧化为蓝色TMBox，而蓝色TMBox会被抗坏血酸还原成无色的TMB，即抗坏血酸的浓度越高，吸收值越小。
本发明用于抗坏血酸/葡萄糖检测的Co/Mn双金属位点单原子催化剂检测葡萄糖的方法为：将葡萄糖溶液200μL和50μL 1mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液混合，在37℃下孵育30min，使葡萄糖被充分分解产生H2O2，而过氧化氢在类过氧化物酶存在的条件下被催化分解，产生羟基自由基氧化无色的TMB为蓝色TMBox；500μL的HAc-NaAc缓冲液里加入100μLTMB的醇溶液，加入100μL葡萄糖与葡萄糖氧化酶混合溶液和10μL 1mg/mL的CoMn SACs溶液，涡旋使充分混合，等待10min后在紫外分光光度计中测量652nm处的吸收值。上述所有操作在避光条件下进行。理论上葡萄糖浓度越高，吸收值越高。
与现有技术相比，本发明所制备的以g-C3N4为载体的Co Mn双金属位点单原子纳米酶，其突出的特点是：
(1)本发明首次利用g-C3N4为载体，而不是作为氮原子提供来源，通过常温碱性条件下的原位刻蚀作用实现单原子催化剂的制备，避免了高温可能带来的危险和氮气氛的苛刻条件。
(2)本发明制备的单原子纳米酶既能用于抗坏血酸的检测，又能用于葡萄糖的检测，具有很大的潜在应用前景。
附图说明
图1为CoMn SACs的氧化酶活性和过氧化物酶活性验证结果图。
图2为CoMn SACs比色检测抗坏血酸的吸光度值随浓度变化图：图A吸光度随浓度变化图；图B为抗坏血酸检测的标准曲线图。
图3为CoMn SACs比色检测葡萄糖的吸光度值随浓度变化图：图A吸光度随浓度变化图；图B为葡萄糖检测的标准曲线图。
具体实施方式
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。下面结合具体实施例对本发明进行进一步阐述，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明实施例中CoMn SACs即用于抗坏血酸/葡萄糖检测的Co/Mn双金属位点单原子催化剂。
本发明实施例中用到的主要化学试剂来源：g-C3N4购自先丰纳米(中国)。NaOH，CTAB，CoCl2·6H2O，MnSO4·4H2O，NH4Cl均购自于阿拉丁有限公司(上海，中国),正硅酸四乙酯购自麦克林生化科技有限公司(上海,中国)。
实施例1
制备CoMn SACs，按如下步骤操作：
(1)在g-C3N4表面覆盖为单原子提供锚定位置的SiO2外壳：
称取3mg g-C3N4配置成3mg/mL的水溶液，超声15min使充分分散。取1mL g-C3N4溶液加入0.925mL甲醇，涡旋并混合均匀后加入7.325mL超纯水，常温搅拌5min。以1M的NaOH溶液调节上述溶液的pH为11。向g-C3N4溶液中加入CTAB 9.25mg，低速搅拌使CTAB充分溶解，常温搅拌30min，加入46.25μL正硅酸四乙酯，常温下搅拌30min。以超纯水洗涤三遍除去未反应的物质。
(2)在SiO2外壳上碱性刻蚀双金属单原子：
上述步骤中洗涤过后的包覆了二氧化硅外壳的g-C3N4全部溶解于0.5mL超纯水备用。称取8.806mg CoCl2·6H2O和8.255mg MnSO4·4H2O溶解于0.5mL超纯水，向双金属水溶液中加入14.84mg NH4Cl和37μL的浓氨水，然后迅速混合双金属水溶液和包覆了二氧化硅外壳的g-C3N4的溶液，搅拌过夜。以超纯水清洗沉淀三次，冻干收集。
实施例2.
利用制备的CoMn SACs的氧化酶活性检测抗坏血酸：
向500μLHAc-NaAc缓冲液里加入100μL TMB的醇溶液，加入100μL抗坏血酸溶液和10μL 1mg/mL的CoMn SACs溶液，涡旋使充分混合，等待10min后在紫外分光光度计中测量652nm处的吸收值。上述所有操作在避光条件下进行。将吸收值代入建立的吸收值-浓度曲线可以得到抗坏血酸的浓度。CoMn SACs能够催化水中的溶解氧产生自由基，自由基将无色的TMB氧化为蓝色TMBox，而蓝色TMBox会被具有还原性物质如抗坏血酸还原成无色的TMB，即抗坏血酸的浓度越高，吸收值越小。
CoMn SACs的氧化酶活性和过氧化物酶活性验证结果见图1。构建检测抗坏血酸检测标准曲线选择的抗坏血酸浓度分别为(单位均为μM)1，10，20，50，80，100，120。结果详见图2，可以观察到随着加入的抗坏血酸浓度的增加，紫外分光光度计检测到的吸光度值就越低，表明两者在浓度范围内呈良好的线性关系，线性相关系数为0.9897。
实施例3
利用制备的CoMn SACs的过氧化酶活性检测葡萄糖。
将葡萄糖溶液200μL和50μL 1mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液混合，在37℃下孵育30min，使葡萄糖被充分分解产生H2O2，而过氧化氢在类过氧化物酶存在的条件下被催化分解，产生羟基自由基氧化无色的TMB为蓝色TMBox。500μLHAc-NaAc缓冲液里加入100μL TMB的醇溶液，加入100μL葡萄糖与葡萄糖氧化酶混合溶液和10μL 1mg/mL的CoMn SACs溶液，涡旋使充分混合，等待10min后在紫外分光光度计中测量652nm处的吸收值。上述所有操作在避光条件下进行。理论上葡萄糖浓度越高，吸收值越高。构建检测抗坏血酸检测标准曲线选择的葡萄糖浓度分别为(单位均为mM)0.5，0.6，0.8，1，5，10，20。结果详见图3，可以观察到随着加入的葡萄糖的增加，紫外分光光度计检测到的吸光度值就越高，表明两者在浓度范围内呈良好的线性关系，线性相关系数为0.9893。
Claims (4)
1.一种用于抗坏血酸/葡萄糖检测的Co/Mn双金属位点单原子催化剂，其特征在于，先在g-C3N4表面覆盖为单原子提供锚定位置的SiO2外壳，再在SiO2外壳上碱性刻蚀双金属单原子，制备得到用于抗坏血酸/葡萄糖检测的Co/Mn双金属位点单原子催化剂CoMn SACs；
所述在g-C3N4表面覆盖为单原子提供锚定位置的SiO2外壳的步骤为：
将g-C3N4 配置成2-5 mg / mL 的水溶液，超声10-20 min 使充分分散；取g-C3N4溶液与甲醇混合均匀，然后加入超纯水形成混合溶液，常温搅拌3-8 min，然后用NaOH溶液调节pH至11；所述g-C3N4溶液、甲醇与超纯水的体积比为1：0.8-1.2：6-10；向pH为11的溶液中加入CTAB，搅拌使CTAB充分溶解，再常温搅拌20-40 min，接着加入正硅酸四乙酯，常温下搅拌20-40min，以超纯水洗涤除去未反应的物质，得到在g-C3N4表面覆盖为单原子提供锚定位置的SiO2外壳；
所述在SiO2外壳上碱性刻蚀双金属单原子的步骤为：
将在g-C3N4表面覆盖为单原子提供锚定位置的SiO2外壳用超纯水溶解，然后与双金属氨水溶液混合均匀，搅拌过夜得到在SiO2外壳上碱性刻蚀双金属单原子催化剂；所述双金属氨水溶液的制备方法为：CoCl2·6H2O和MnSO4·4H2O用超纯水溶解得到双金属水溶液，向双金属水溶液中加入NH4Cl和浓氨水，得到双金属氨水溶液。
2.如权利要求1所述的用于抗坏血酸/葡萄糖检测的Co/Mn双金属位点单原子催化剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）在g-C3N4表面覆盖为单原子提供锚定位置的SiO2外壳：
称取3mg g-C3N4 配置成3 mg / mL 的水溶液，超声15 min 使充分分散；取1mL g-C3N4溶液加入0.925 mL 甲醇，涡旋并混合均匀后加入7.325 mL 超纯水，常温搅拌5 min；以1 M的NaOH溶液调节上述溶液的pH为11；向g-C3N4溶液中加入CTAB 9.25 mg，低速搅拌使CTAB充分溶解，常温搅拌30 min，加入46.25 μL 正硅酸四乙酯，常温下搅拌30min；以超纯水洗涤三遍除去未反应的物质；
（2）在SiO2外壳上碱性刻蚀双金属单原子：
上述步骤中洗涤过后的包覆了二氧化硅外壳的g-C3N4 全部溶解于0.5 mL 超纯水备用；称取8.806 mg CoCl2·6H2O和8.255 mg MnSO4·4H2O溶解于0.5 mL 超纯水，向双金属水溶液中加入14.84 mg NH4Cl和37μL的浓氨水，然后与包覆了二氧化硅外壳的g-C3N4的溶液混合，搅拌过夜；以超纯水清洗沉淀三次，冻干收集。
3.利用权利要求1所述双金属位点单原子催化剂检测抗坏血酸的方法，其特征在于：向500μL HAc-NaAc缓冲液里加入100μL TMB的醇溶液，加入100μL 抗坏血酸溶液和10μL 1mg/mL 的CoMn SACs溶液，涡旋使充分混合，等待10 min 后在紫外分光光度计中测量652nm 处的吸收值；所有操作在避光条件下进行；将吸收值代入建立的吸收值-浓度曲线得到抗坏血酸的浓度。
4.利用权利要求1所述双金属位点单原子催化剂检测葡萄糖的方法，其特征在于：将葡萄糖溶液200 μL和50μL 1mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液混合，在37℃下孵育30min，使葡萄糖被充分分解产生H2O2，向500μL 的HAc-NaAc缓冲液里加入100 μL TMB的醇溶液，加入100 μL葡萄糖与葡萄糖氧化酶混合溶液和10 μL 1mg/mL 的CoMn SACs溶液，涡旋使充分混合，过氧化氢在类过氧化物酶存在的条件下被催化分解，产生羟基自由基氧化无色的TMB为蓝色TMBox；等待10 min 后在紫外分光光度计中测量652nm 处的吸收值。
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