JP2000258346A - ラマン分光法による基質の定量分析方法 - Google Patents
ラマン分光法による基質の定量分析方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 基質を更に低濃度領域まで測定できるように
する。 【解決手段】 ＡＬＰＳ、ＰＯＤ、ＧＯＤ、４ＡＡ及び
基質のグルコースを含む反応溶液を調製した。その反応
溶液のグルコース濃度を異ならせてラマン散乱スペクト
ルを測定し、そのシフト波数１６１５ｃｍ-1のピークを
用いて、グルコース濃度とラマン散乱強度との相関関係
を測定した。良好な相関関係が得られ、その測定結果を
検量線としてグルコース濃度を低濃度領域まで定量でき
ることがわかった。
する。 【解決手段】 ＡＬＰＳ、ＰＯＤ、ＧＯＤ、４ＡＡ及び
基質のグルコースを含む反応溶液を調製した。その反応
溶液のグルコース濃度を異ならせてラマン散乱スペクト
ルを測定し、そのシフト波数１６１５ｃｍ-1のピークを
用いて、グルコース濃度とラマン散乱強度との相関関係
を測定した。良好な相関関係が得られ、その測定結果を
検量線としてグルコース濃度を低濃度領域まで定量でき
ることがわかった。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、臨床検査における
指示反応系の１つのオキシダーゼ（酸化酵素）系を用い
た基質の定量方法に関するものであり、具体的には、基
質をオキシダーゼにより酸化して過酸化水素を発生さ
せ、その発生した過酸化水素により、ペルオキシダーゼ
の存在下で発色試薬から色素を生成させて基質を定量す
る方法に関するものである。
指示反応系の１つのオキシダーゼ（酸化酵素）系を用い
た基質の定量方法に関するものであり、具体的には、基
質をオキシダーゼにより酸化して過酸化水素を発生さ
せ、その発生した過酸化水素により、ペルオキシダーゼ
の存在下で発色試薬から色素を生成させて基質を定量す
る方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】オキシダーゼ系でカップリング型発色試
薬を用いて、基質のグルコースを定量測定する方法を説
明する。その反応系は次のように示すことができる。 ここで、ＧＯＤはグルコースオキシダーゼ、ＰＯＤはペ
ルオキシダーゼで、いずれも酵素である。ＡＬＰＳはカ
ップリング型発色試薬の一方であるトリンダー試薬の一
例であり、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリンの
略である。４ＡＡはカップリング型発色試薬の他方であ
るカップラーと呼ばれる試薬であり、４−アミノアンチ
ピリンの略である。Ｄｙｅは生成した色素である。
薬を用いて、基質のグルコースを定量測定する方法を説
明する。その反応系は次のように示すことができる。 ここで、ＧＯＤはグルコースオキシダーゼ、ＰＯＤはペ
ルオキシダーゼで、いずれも酵素である。ＡＬＰＳはカ
ップリング型発色試薬の一方であるトリンダー試薬の一
例であり、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリンの
略である。４ＡＡはカップリング型発色試薬の他方であ
るカップラーと呼ばれる試薬であり、４−アミノアンチ
ピリンの略である。Ｄｙｅは生成した色素である。
【０００３】このオキシダーゼ系の反応で、基質のグル
コース濃度に応じた過酸化水素が発生し、その過酸化水
素によりＰＯＤの存在下でＡＬＰＳと４ＡＡが反応して
カップリング型色素（Ｄｙｅ）が生成する。従来は、こ
のオキシダーゼ系の反応で生成する色素の吸光度を測定
することにより、グルコースの定量を行なっている。基
質と酵素の組合わせはこの例のものに限らず、またカッ
プリング型発色試薬も種々のものが使用されている。
コース濃度に応じた過酸化水素が発生し、その過酸化水
素によりＰＯＤの存在下でＡＬＰＳと４ＡＡが反応して
カップリング型色素（Ｄｙｅ）が生成する。従来は、こ
のオキシダーゼ系の反応で生成する色素の吸光度を測定
することにより、グルコースの定量を行なっている。基
質と酵素の組合わせはこの例のものに限らず、またカッ
プリング型発色試薬も種々のものが使用されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】生成した色素の吸光度
測定により基質を定量する方法は、基質が微量になって
反応溶液中での色素濃度が低濃度になるにつれてＳ／Ｎ
（信号対ノイズ）比が低下し、やがて測定が不能になる
定量限界に至る。そこで、本発明はこのようなオキシダ
ーゼ系で生成する色素を吸光度測定よりも更に低濃度領
域まで測定できるようにして、基質の微量測定を可能に
することを目的とするものである。
測定により基質を定量する方法は、基質が微量になって
反応溶液中での色素濃度が低濃度になるにつれてＳ／Ｎ
（信号対ノイズ）比が低下し、やがて測定が不能になる
定量限界に至る。そこで、本発明はこのようなオキシダ
ーゼ系で生成する色素を吸光度測定よりも更に低濃度領
域まで測定できるようにして、基質の微量測定を可能に
することを目的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、基質をオキシ
ダーゼにより酸化して過酸化水素を発生させ、その発生
した過酸化水素により、ペルオキシダーゼの存在下で発
色試薬から色素を生成させて前記基質を定量する方法に
おいて、生成した色素の吸光度を測定するのではなく、
生成した色素を含む反応溶液に励起光を照射し、その色
素によるラマン散乱光を検出して、そのラマン散乱光強
度により基質を定量する。生成した色素のラマン散乱光
強度を測定することにより、吸光度測定による定量と同
等又はそれよりも低濃度領域まで定量することができる
ようになる。グルコースなどの基質に励起光を照射し
て、基質から発生するラマン散乱光を測定して基質濃度
を定量することは原理的に可能ではあるが、感度が低
く、実用的ではない。また、基質から発生するラマン散
乱光を測定する方法では、複数の基質を含む溶液から特
定の基質のラマン散乱光を選択的に検出することはでき
ないが、オキシダーゼ系反応を経て生成する色素は、そ
の基質に特有のものであるので、その色素のラマン散乱
光を測定する本発明の方法は目的とする基質に対する選
択性のある測定方法となる。
ダーゼにより酸化して過酸化水素を発生させ、その発生
した過酸化水素により、ペルオキシダーゼの存在下で発
色試薬から色素を生成させて前記基質を定量する方法に
おいて、生成した色素の吸光度を測定するのではなく、
生成した色素を含む反応溶液に励起光を照射し、その色
素によるラマン散乱光を検出して、そのラマン散乱光強
度により基質を定量する。生成した色素のラマン散乱光
強度を測定することにより、吸光度測定による定量と同
等又はそれよりも低濃度領域まで定量することができる
ようになる。グルコースなどの基質に励起光を照射し
て、基質から発生するラマン散乱光を測定して基質濃度
を定量することは原理的に可能ではあるが、感度が低
く、実用的ではない。また、基質から発生するラマン散
乱光を測定する方法では、複数の基質を含む溶液から特
定の基質のラマン散乱光を選択的に検出することはでき
ないが、オキシダーゼ系反応を経て生成する色素は、そ
の基質に特有のものであるので、その色素のラマン散乱
光を測定する本発明の方法は目的とする基質に対する選
択性のある測定方法となる。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明が対象とする基質は、グル
コースのほか、更に高感度測定が要請されている基質は
ＧＯＴ、ＧＰＴ、尿酸などである。吸光度測定を行なう
カップリング型発色試薬としては、トリンダー試薬とカ
ップラーを組み合わせて色素を生成させている。本発明
でもそのようなカップリング型発色試薬の組合わせによ
り生成した色素のラマン散乱光を測定することができ
る。
コースのほか、更に高感度測定が要請されている基質は
ＧＯＴ、ＧＰＴ、尿酸などである。吸光度測定を行なう
カップリング型発色試薬としては、トリンダー試薬とカ
ップラーを組み合わせて色素を生成させている。本発明
でもそのようなカップリング型発色試薬の組合わせによ
り生成した色素のラマン散乱光を測定することができ
る。
【０００７】しかし、オキシダーゼ系の反応により過酸
化水素が発生すれば、その反応溶液内にトリンダー試薬
のみが存在する場合でも、そのトリンダー試薬がラマン
散乱を生じることがある。そのようなトリンダー試薬
は、カップラーが存在しなくても、過酸化水素と反応す
るか、過酸化水素により変性することによりラマン散乱
光を発生するようになる。そのようなトリンダー試薬
は、カップラーを使用することなく、本発明の試薬とし
て使用することができる。したがって、本発明でラマン
散乱光を測定する色素は、トリンダー試薬とカップラー
が結合したカップリング型色素と、トリンダー試薬が過
酸化水素によりラマン散乱を発生するようになったもの
のいずれをも含んでいる。
化水素が発生すれば、その反応溶液内にトリンダー試薬
のみが存在する場合でも、そのトリンダー試薬がラマン
散乱を生じることがある。そのようなトリンダー試薬
は、カップラーが存在しなくても、過酸化水素と反応す
るか、過酸化水素により変性することによりラマン散乱
光を発生するようになる。そのようなトリンダー試薬
は、カップラーを使用することなく、本発明の試薬とし
て使用することができる。したがって、本発明でラマン
散乱光を測定する色素は、トリンダー試薬とカップラー
が結合したカップリング型色素と、トリンダー試薬が過
酸化水素によりラマン散乱を発生するようになったもの
のいずれをも含んでいる。
【０００８】本発明で用いるトリンダー試薬は、特に限
定されるものではなく、オキシダーゼ系でカップリング
型発色試薬として用いられるものであれば、いずれでも
よい。例えば、次のような試薬を用いることができる。 ＨＤＡＰＳ（Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシ
アニリン）、ＴＯＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロ
キシ−３−スルホプロピル）−３−トルイジン）、ＡＬ
ＰＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン）、Ｄ
ＡＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン）、ＤＡＰ
Ｓ（Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメト
キシアニリン）、ＨＡＬＰＳ（Ｎ−スルホプロピルアニ
リン）、ＡＤＰＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−
３−メトキシアニリン）、ＭＡＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジ
メチルアニリン）、ＭＡＰＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−スルホ
プロピル−３，５−ジメチルアニリン）、ＴＯＰＳ（Ｎ
−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリ
ン）、ＡＤＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−
３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン）、ＡＬ
ＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホ
プロピル）アニリン）、ＨＤＡＯＳ（Ｎ−（２−ヒドロ
キシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニ
リン）。
定されるものではなく、オキシダーゼ系でカップリング
型発色試薬として用いられるものであれば、いずれでも
よい。例えば、次のような試薬を用いることができる。 ＨＤＡＰＳ（Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシ
アニリン）、ＴＯＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロ
キシ−３−スルホプロピル）−３−トルイジン）、ＡＬ
ＰＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン）、Ｄ
ＡＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン）、ＤＡＰ
Ｓ（Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメト
キシアニリン）、ＨＡＬＰＳ（Ｎ−スルホプロピルアニ
リン）、ＡＤＰＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−
３−メトキシアニリン）、ＭＡＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジ
メチルアニリン）、ＭＡＰＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−スルホ
プロピル−３，５−ジメチルアニリン）、ＴＯＰＳ（Ｎ
−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリ
ン）、ＡＤＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−
３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン）、ＡＬ
ＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホ
プロピル）アニリン）、ＨＤＡＯＳ（Ｎ−（２−ヒドロ
キシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニ
リン）。
【０００９】カップラーは、本発明では用いる場合と用
いない場合があるが、用いる場合のカップラーとしては
特に限定されるものではなく、オキシダーゼ系でカップ
リング型発色試薬として用いられるものであればいずれ
でもよい。例えば、先に述べた４ＡＡ（４−アミノアン
チピリン）を用いることができる。
いない場合があるが、用いる場合のカップラーとしては
特に限定されるものではなく、オキシダーゼ系でカップ
リング型発色試薬として用いられるものであればいずれ
でもよい。例えば、先に述べた４ＡＡ（４−アミノアン
チピリン）を用いることができる。
【００１０】カップラーを使用しなくても、トリンダー
試薬のみで過酸化水素によりラマン散乱を発生するよう
になるトリンダー試薬は、実験により容易に確かめるこ
とができるが、例えば、ＡＬＰＳ、ＤＡＯＳ、ＭＡＯＳ
などである。
試薬のみで過酸化水素によりラマン散乱を発生するよう
になるトリンダー試薬は、実験により容易に確かめるこ
とができるが、例えば、ＡＬＰＳ、ＤＡＯＳ、ＭＡＯＳ
などである。
【００１１】ラマン散乱のうち、励起波長によっては共
鳴ラマン散乱を測定することができる。共鳴ラマン散乱
は、励起光の振動数が分子の固有吸収エネルギー帯（分
子の電子遷移のエネルギー）に近づくと、ラマン散乱強
度が著しく増大する現象である。共鳴ラマン散乱では散
乱光強度が増大するので、試料濃度が更に低濃度の領域
まで測定が可能になる。
鳴ラマン散乱を測定することができる。共鳴ラマン散乱
は、励起光の振動数が分子の固有吸収エネルギー帯（分
子の電子遷移のエネルギー）に近づくと、ラマン散乱強
度が著しく増大する現象である。共鳴ラマン散乱では散
乱光強度が増大するので、試料濃度が更に低濃度の領域
まで測定が可能になる。
【００１２】ラマン散乱のうち、共鳴ラマン散乱とは別
のもので、強い散乱光強度を与えるものとして、表面増
強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）が知られている。表面増強ラ
マン散乱は、Ｃ−ＮやＳ−Ｓをもつ分子が銀や金などの
貴金属表面に吸着したとき、そのラマン散乱強度が増大
する現象である。本発明では貴金属コロイドの表面プラ
ズモンと色素間における相互作用により、表面増強ラマ
ン散乱により強いラマン散乱光強度を得る。表面増強ラ
マン散乱を起こす色素は、従来のオキシダーゼ系で用い
られているカップリング型の色素すべてを含むものでは
なく、分子構造に依存して、表面増強ラマン散乱を起こ
すものと起こさないものがある。どの色素が使用できる
かは、実験により容易に確かめることができるが、例え
ば、ＭＡＯＳ、ＡＬＰＳ、ＴＯＯＳ、ＨＤＡＯＳ、ＴＯ
ＰＳなどのトリンダー試薬そのもの、又はそれらのトリ
ンダー試薬とカップラーとの結合により生成する色素
は、表面増強ラマン散乱測定に適する。貴金属コロイド
としては金、銀、銅などのコロイドを利用することがで
きる。そのコロイドの粒径は５〜５０ｎｍが適当であ
る。
のもので、強い散乱光強度を与えるものとして、表面増
強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）が知られている。表面増強ラ
マン散乱は、Ｃ−ＮやＳ−Ｓをもつ分子が銀や金などの
貴金属表面に吸着したとき、そのラマン散乱強度が増大
する現象である。本発明では貴金属コロイドの表面プラ
ズモンと色素間における相互作用により、表面増強ラマ
ン散乱により強いラマン散乱光強度を得る。表面増強ラ
マン散乱を起こす色素は、従来のオキシダーゼ系で用い
られているカップリング型の色素すべてを含むものでは
なく、分子構造に依存して、表面増強ラマン散乱を起こ
すものと起こさないものがある。どの色素が使用できる
かは、実験により容易に確かめることができるが、例え
ば、ＭＡＯＳ、ＡＬＰＳ、ＴＯＯＳ、ＨＤＡＯＳ、ＴＯ
ＰＳなどのトリンダー試薬そのもの、又はそれらのトリ
ンダー試薬とカップラーとの結合により生成する色素
は、表面増強ラマン散乱測定に適する。貴金属コロイド
としては金、銀、銅などのコロイドを利用することがで
きる。そのコロイドの粒径は５〜５０ｎｍが適当であ
る。
【００１３】
【実施例】図１に、本発明が適用されるラマン散乱光測
定装置を示す。励起光源２としてのレーザ装置からの励
起光ビーム４はプリズム４０で光路が曲げられ、バンド
パスフィルタ６及びコリメータレンズ８を経て細いビー
ムとなって試料室１０の試料に照射される。光源のレー
ザ装置としては、連続発振をするＡｒイオンレーザ、Ｋ
ｒイオンレーザ、Ｈｅ−Ｎｅレーザ、又はＨｅ−Ｃｄレ
ーザなどや、Ｎｄ：ＹＡＧレーザなどのパルスレーザな
どを用いることができ、近紫外域から近赤外域に渡る広
い波長範囲のレーザから選択して利用することができ
る。レーザ装置の自然放出線を遮蔽して発振線のみを励
起光として利用するときは、レーザ装置と干渉フィルタ
や分光器を組み合わせて使用すればよい。しかし、自然
放出線も同時に照射してスペクトルの波長校正を行なう
こともある。試料室１０は、後で図２を参照して詳細に
説明されるように、球形状の石英製フローセル４２と、
そのフローセル４２を保持する積分球形のセルホルダー
４４とを備えている。
定装置を示す。励起光源２としてのレーザ装置からの励
起光ビーム４はプリズム４０で光路が曲げられ、バンド
パスフィルタ６及びコリメータレンズ８を経て細いビー
ムとなって試料室１０の試料に照射される。光源のレー
ザ装置としては、連続発振をするＡｒイオンレーザ、Ｋ
ｒイオンレーザ、Ｈｅ−Ｎｅレーザ、又はＨｅ−Ｃｄレ
ーザなどや、Ｎｄ：ＹＡＧレーザなどのパルスレーザな
どを用いることができ、近紫外域から近赤外域に渡る広
い波長範囲のレーザから選択して利用することができ
る。レーザ装置の自然放出線を遮蔽して発振線のみを励
起光として利用するときは、レーザ装置と干渉フィルタ
や分光器を組み合わせて使用すればよい。しかし、自然
放出線も同時に照射してスペクトルの波長校正を行なう
こともある。試料室１０は、後で図２を参照して詳細に
説明されるように、球形状の石英製フローセル４２と、
そのフローセル４２を保持する積分球形のセルホルダー
４４とを備えている。
【００１４】フローセル４２内の試料が励起光により照
射されて発生した散乱光を集光して分光器１８に導く集
光光学系には、試料側から順に、試料からの散乱光を集
光する対物レンズ１２、散乱光から励起光成分を除去す
るための、励起光波長をノッチ領域に含むホログラフィ
ック・ノッチ・フィルタ３４、並びにこの集光光学系及
び後述の補正光学系からの光を収束させて分光器１８に
入射させる集光レンズ１４が配置されている。ホログラ
フィック・ノッチ・フィルタは例えばKAISER OPTICAL S
YSTEMS. INC.（アメリカ）から入手することが出来る。
ホログラフィック・ノッチ・フィルタ３４は、例えばノ
ッチ領域に含まれる波長光を完全に遮蔽し、ノッチ領域
以外の波長領域の光は８０％以上を透過させる特性を持
っている。
射されて発生した散乱光を集光して分光器１８に導く集
光光学系には、試料側から順に、試料からの散乱光を集
光する対物レンズ１２、散乱光から励起光成分を除去す
るための、励起光波長をノッチ領域に含むホログラフィ
ック・ノッチ・フィルタ３４、並びにこの集光光学系及
び後述の補正光学系からの光を収束させて分光器１８に
入射させる集光レンズ１４が配置されている。ホログラ
フィック・ノッチ・フィルタは例えばKAISER OPTICAL S
YSTEMS. INC.（アメリカ）から入手することが出来る。
ホログラフィック・ノッチ・フィルタ３４は、例えばノ
ッチ領域に含まれる波長光を完全に遮蔽し、ノッチ領域
以外の波長領域の光は８０％以上を透過させる特性を持
っている。
【００１５】１８はフィルタ３４を透過した光を分光す
る分光器、２８はその分光器１８で分光された光を検出
する検出器である。分光器１８としては、300Ｇ／ｍ
ｍ、ブレーズ波長が500ｎｍの回折格子２０を用いたシ
ングル分光器を用いた。その分解能は6.8ｃｍ-1（0.18
ｎｍ／ピクセル）である。検出器２８としては、液体窒
素冷却型（ＥＥＶ素子）の256×1024ピクセルのＣＣＤ
撮像素子（米国ＥＧ＆Ｇ社製、200〜1100ｎｍ波長感
度）を用い、分光器１８で分光された多波長を同時に受
光し検出する。この分光器１８と検出器２８によりポリ
クロメータを構成している。検出器２８の検出信号は光
ファイバ３０を通してデータ処理装置としてのパーソナ
ルコンピュータ３２へ転送され、データ処理がなされ
る。
る分光器、２８はその分光器１８で分光された光を検出
する検出器である。分光器１８としては、300Ｇ／ｍ
ｍ、ブレーズ波長が500ｎｍの回折格子２０を用いたシ
ングル分光器を用いた。その分解能は6.8ｃｍ-1（0.18
ｎｍ／ピクセル）である。検出器２８としては、液体窒
素冷却型（ＥＥＶ素子）の256×1024ピクセルのＣＣＤ
撮像素子（米国ＥＧ＆Ｇ社製、200〜1100ｎｍ波長感
度）を用い、分光器１８で分光された多波長を同時に受
光し検出する。この分光器１８と検出器２８によりポリ
クロメータを構成している。検出器２８の検出信号は光
ファイバ３０を通してデータ処理装置としてのパーソナ
ルコンピュータ３２へ転送され、データ処理がなされ
る。
【００１６】この測定装置では、光源強度を測定して散
乱光強度を補正できるように、補正光学系が設けられて
いる。その補正光学系は、バンドパスフィルタ６とコリ
メータレンズ８の間の光路を横切って光路に斜め方向に
配置され、励起光ビーム４の一部を参照光４０ｒとして
取りだす透明板ガラスのスライドガラス５０と、そのス
ライドガラス５０により取り出された参照光４０ｒの光
路を曲げるスライドガラス５２と、光量を調整する減光
フィルタ５４と、その減光フィルタ５４を透過した参照
光４０ｒを集光レンズ１４を介して分光器１８に入射さ
せるために、ホログラフィック・ノッチフィルタ３４と
集光レンズ１４の間の光路を横切って光路に斜め方向に
配置されたスライドガラス５６とを備えている。参照光
４０ｒは試料からの散乱光とともに集光レンズ１４によ
り集光されて分光器１８に入射し、散乱光とともに分光
されて検出器２８で検出される。散乱光の検出強度が参
照光４０ｒの検出強度で割算されることにより、光源強
度の変動が補正された散乱光出力が得られる。
乱光強度を補正できるように、補正光学系が設けられて
いる。その補正光学系は、バンドパスフィルタ６とコリ
メータレンズ８の間の光路を横切って光路に斜め方向に
配置され、励起光ビーム４の一部を参照光４０ｒとして
取りだす透明板ガラスのスライドガラス５０と、そのス
ライドガラス５０により取り出された参照光４０ｒの光
路を曲げるスライドガラス５２と、光量を調整する減光
フィルタ５４と、その減光フィルタ５４を透過した参照
光４０ｒを集光レンズ１４を介して分光器１８に入射さ
せるために、ホログラフィック・ノッチフィルタ３４と
集光レンズ１４の間の光路を横切って光路に斜め方向に
配置されたスライドガラス５６とを備えている。参照光
４０ｒは試料からの散乱光とともに集光レンズ１４によ
り集光されて分光器１８に入射し、散乱光とともに分光
されて検出器２８で検出される。散乱光の検出強度が参
照光４０ｒの検出強度で割算されることにより、光源強
度の変動が補正された散乱光出力が得られる。
【００１７】図１には、他に光源の駆動装置６０と分光
器の走査制御器６２が示されており、これらはパーソナ
ルコンピュータ３２により制御される。パーソナルコン
ピュータ３２はまた、検出器２８の検出出力を入力し、
そのデータ処理も行ない、データ処理装置としての機能
も果たしている。測定データなどを出力する出力装置６
４や、検出器２８の電源装置６６も示されている。
器の走査制御器６２が示されており、これらはパーソナ
ルコンピュータ３２により制御される。パーソナルコン
ピュータ３２はまた、検出器２８の検出出力を入力し、
そのデータ処理も行ない、データ処理装置としての機能
も果たしている。測定データなどを出力する出力装置６
４や、検出器２８の電源装置６６も示されている。
【００１８】この測定装置で試料室として用いるセル４
２と、そのセル４２を保持するセルホルダー４４を図２
に示す。セル４２は球形状の石英製フローセルであり、
球形状のフローセル本体の両側に筒状の入口部６０ａと
出口部６０ｂが設けられている。セルホルダー４４は積
分球形であり、互いに組み合わされてセル４２を保持す
る２つの部分４４ａ，４４ｂからなり、フローセル４２
の球状部を保持する積分球部分６０と、積分球部分６０
につながりセル４２の入口部６０ａと出口部６０ｂを保
持する保持部６２ａ，６２ｂと、励起光ビームが入射す
る入射孔６４と、セル４２内で発生した散乱光を入射光
方向と９０度の方向に取り出すために外方向に広がった
出射孔６６とを備えている。
２と、そのセル４２を保持するセルホルダー４４を図２
に示す。セル４２は球形状の石英製フローセルであり、
球形状のフローセル本体の両側に筒状の入口部６０ａと
出口部６０ｂが設けられている。セルホルダー４４は積
分球形であり、互いに組み合わされてセル４２を保持す
る２つの部分４４ａ，４４ｂからなり、フローセル４２
の球状部を保持する積分球部分６０と、積分球部分６０
につながりセル４２の入口部６０ａと出口部６０ｂを保
持する保持部６２ａ，６２ｂと、励起光ビームが入射す
る入射孔６４と、セル４２内で発生した散乱光を入射光
方向と９０度の方向に取り出すために外方向に広がった
出射孔６６とを備えている。
【００１９】このような積分球形のセルホルダーを使用
することにより、入射孔６４から入射した励起光ビーム
が積分球部分６０で多重反射して励起効率を高め、かつ
発生した散乱光を集めて１つの出射孔６６から出射させ
るので、散乱光が増強され、高感度な測定が可能にな
る。セル４２には、測定対象の基質を含む試料、オキシ
ダーゼ、ペルオキシダーゼ及びトリンダー試薬が混合さ
れたオキシダーゼ系反応が起こされた反応溶液が流され
る。この反応溶液には、必要に応じてカップラーが添加
され、さらに、表面増強ラマン散乱を測定する場合には
金コロイド等の貴金属コロイドが添加される。図１の測
定装置はラマン測定装置の一例であり、市販されている
フーリエ変換型ラマン測定装置（ＦＴラマン測定装置）
を用いることもできる。
することにより、入射孔６４から入射した励起光ビーム
が積分球部分６０で多重反射して励起効率を高め、かつ
発生した散乱光を集めて１つの出射孔６６から出射させ
るので、散乱光が増強され、高感度な測定が可能にな
る。セル４２には、測定対象の基質を含む試料、オキシ
ダーゼ、ペルオキシダーゼ及びトリンダー試薬が混合さ
れたオキシダーゼ系反応が起こされた反応溶液が流され
る。この反応溶液には、必要に応じてカップラーが添加
され、さらに、表面増強ラマン散乱を測定する場合には
金コロイド等の貴金属コロイドが添加される。図１の測
定装置はラマン測定装置の一例であり、市販されている
フーリエ変換型ラマン測定装置（ＦＴラマン測定装置）
を用いることもできる。
【００２０】（実施例１） トリンダー試薬とカップラーから生成した色素によるラ
マン散乱測定：図１と図２に示したラマン散乱光測定装
置を用い、グルコース濃度を測定した例を説明する。反
応系は、次の通りである。
マン散乱測定：図１と図２に示したラマン散乱光測定装
置を用い、グルコース濃度を測定した例を説明する。反
応系は、次の通りである。
【００２１】反応系は、基本的には、従来技術で説明し
たものと同じであるが、カップラーの４ＡＡを括弧書き
で示しているのは、本発明ではカップラーが不要の場合
があるからである。励起光の光源としてはアルゴンレー
ザを用い、その発振波長が５１４.５ｎｍのものを励起
光として使用した。励起光強度は約５０ｍＷであり、測
定時間は１秒とした。
たものと同じであるが、カップラーの４ＡＡを括弧書き
で示しているのは、本発明ではカップラーが不要の場合
があるからである。励起光の光源としてはアルゴンレー
ザを用い、その発振波長が５１４.５ｎｍのものを励起
光として使用した。励起光強度は約５０ｍＷであり、測
定時間は１秒とした。
【００２２】ラマン散乱光測定用に次の試料及び試薬を
含む反応溶液を調製した。試料の、及びそれらの濃度は
次の通りとした。 ＡＬＰＳ： １ｍＭ ＰＯＤ ： １Ｋｕ／Ｌ ＧＯＤ ： １Ｋｕ／Ｌ ４ＡＡ ： １ｍＭ グルコース（ｍｇ／ｄＬ）：０，０.２，０.４，０.
６，０.８，１.０ グルコース濃度を０にした反応溶液は、バックグラウン
ド測定用の試料ブランク溶液である。図３はその試料ブ
ランク溶液のラマン散乱スペクトルである。
含む反応溶液を調製した。試料の、及びそれらの濃度は
次の通りとした。 ＡＬＰＳ： １ｍＭ ＰＯＤ ： １Ｋｕ／Ｌ ＧＯＤ ： １Ｋｕ／Ｌ ４ＡＡ ： １ｍＭ グルコース（ｍｇ／ｄＬ）：０，０.２，０.４，０.
６，０.８，１.０ グルコース濃度を０にした反応溶液は、バックグラウン
ド測定用の試料ブランク溶液である。図３はその試料ブ
ランク溶液のラマン散乱スペクトルである。
【００２３】一方、図４は上の反応溶液で、グルコース
濃度を０.８ｍｇ／ｄＬとしたときに生成した色素によ
るラマン散乱スペクトルを示したものである。数本のピ
ークが現われており、特に１６１５ｃｍ-1に大きなピー
クが見られる。
濃度を０.８ｍｇ／ｄＬとしたときに生成した色素によ
るラマン散乱スペクトルを示したものである。数本のピ
ークが現われており、特に１６１５ｃｍ-1に大きなピー
クが見られる。
【００２４】図５は、反応溶液からのラマン散乱スペク
トルにおけるシフト波数１６１５ｃｍ-1でのピーク強度
とグルコース濃度の関係を示したものである。ピーク強
度は、図３のスペクトルの１６１５ｃｍ-1でのピーク強
度がゼロになるように、各濃度のピーク高さからバック
グラウンドスペクトルのピーク高さを引き算して示し
た。図５から、グルコース濃度とラマン散乱強度との間
には、重相関係数Ｒ2＝０.９７８８という良好な相関関
係が得られた。この測定結果を検量線としてグルコース
濃度を定量することができる。
トルにおけるシフト波数１６１５ｃｍ-1でのピーク強度
とグルコース濃度の関係を示したものである。ピーク強
度は、図３のスペクトルの１６１５ｃｍ-1でのピーク強
度がゼロになるように、各濃度のピーク高さからバック
グラウンドスペクトルのピーク高さを引き算して示し
た。図５から、グルコース濃度とラマン散乱強度との間
には、重相関係数Ｒ2＝０.９７８８という良好な相関関
係が得られた。この測定結果を検量線としてグルコース
濃度を定量することができる。
【００２５】（実施例２）表面増強ラマン散乱測定：図
６に、ＴＯＯＳ水溶液のラマン散乱スペクトル（ａ）
と、その溶液に金コロイドを添加して表面増強ラマン散
乱を起こさせた場合のラマン散乱スペクトル（ｂ）を示
す。スペクトル（ａ）は、１０-3ＭのＴＯＯＳ水溶液を
試料として、ＦＴラマン測定装置を用いて１０６４ｎｍ
の励起光を試料に照射し、そのラマン散乱を測定したも
のである。一方、スペクトル（ｂ）は表面増強ラマン散
乱を測定するために、そのＴＯＯＳ水溶液に金コロイド
溶液を添加して混合したものを試料として、ＦＴラマン
測定装置で１０６４ｎｍの励起光によりそのラマン散乱
を測定したものである。図６の結果から明らかなよう
に、著しい表面増強ラマン散乱効果が観測される。
６に、ＴＯＯＳ水溶液のラマン散乱スペクトル（ａ）
と、その溶液に金コロイドを添加して表面増強ラマン散
乱を起こさせた場合のラマン散乱スペクトル（ｂ）を示
す。スペクトル（ａ）は、１０-3ＭのＴＯＯＳ水溶液を
試料として、ＦＴラマン測定装置を用いて１０６４ｎｍ
の励起光を試料に照射し、そのラマン散乱を測定したも
のである。一方、スペクトル（ｂ）は表面増強ラマン散
乱を測定するために、そのＴＯＯＳ水溶液に金コロイド
溶液を添加して混合したものを試料として、ＦＴラマン
測定装置で１０６４ｎｍの励起光によりそのラマン散乱
を測定したものである。図６の結果から明らかなよう
に、著しい表面増強ラマン散乱効果が観測される。
【００２６】同様に、銀コロイドによる表面増強ラマン
散乱も測定した。ＴＯＯＳ水溶液に銀コロイドを添加し
た場合は、１０６４ｎｍ励起によっては表面増強ラマン
散乱は観測されず、４８８.０ｎｍ励起によって著しい
表面増強ラマン散乱が観測された。
散乱も測定した。ＴＯＯＳ水溶液に銀コロイドを添加し
た場合は、１０６４ｎｍ励起によっては表面増強ラマン
散乱は観測されず、４８８.０ｎｍ励起によって著しい
表面増強ラマン散乱が観測された。
【００２７】（実施例３） トリンダー試薬のみによるラマン散乱測定：トリンダー
試薬によっては、カップラーを使用しない場合にも反応
溶液中に発生した過酸化水素と反応してラマン散乱を発
生するものがみられた。
試薬によっては、カップラーを使用しない場合にも反応
溶液中に発生した過酸化水素と反応してラマン散乱を発
生するものがみられた。
【００２８】
【発明の効果】本発明では、オキシダーゼ系の反応によ
り生成する色素のラマン散乱光を検出して、そのラマン
散乱光強度により基質濃度を定量するようにしたので、
吸光度測定による定量と同等又はそれよりも低濃度領域
まで定量することができるようになる。
り生成する色素のラマン散乱光を検出して、そのラマン
散乱光強度により基質濃度を定量するようにしたので、
吸光度測定による定量と同等又はそれよりも低濃度領域
まで定量することができるようになる。
【図１】 本発明が適用されるラマン散乱光測定装置の
一例を示すブロック図である。
一例を示すブロック図である。
【図２】 同ラマン散乱光測定装置で使用するセルの一
例を示す分解斜視図である。
例を示す分解斜視図である。
【図３】 試料ブランク溶液のラマン散乱スペクトルを
示す図である。
示す図である。
【図４】 実施例における反応溶液のラマン散乱スペク
トルを示す図である。
トルを示す図である。
【図５】 実施例におけるグルコース濃度とラマン散乱
強度との相関関係を示す図である。
強度との相関関係を示す図である。
【図６】 ＴＯＯＳのラマン散乱スペクトル（ａ）とそ
の表面増強ラマン散乱スペクトル（ｂ）を示す図であ
る。
の表面増強ラマン散乱スペクトル（ｂ）を示す図であ
る。
２ 光源 ４２ セル １８ 分光器 ２８ 検出器
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 米原 聡 京都府京都市南区東九条西明田町57番地 株式会社京都第一科学内 (72)発明者 尾崎 幸洋 兵庫県西宮市神原２番19号 Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA16 DA02 EA03 GA07 GA25 NA11 2G054 AA06 AB07 BA04 BB20 CA28 EA05 FB07 JA06 4B063 QA01 QA19 QQ26 QQ65 QQ68 QQ89 QR02 QR03 QR41 QR66 QS22 QS39 QX02
Claims (5)
- 【請求項１】 基質をオキシダーゼにより酸化して過酸
化水素を発生させ、その発生した過酸化水素により、ペ
ルオキシダーゼの存在下で発色試薬から色素を生成させ
て前記基質を定量する方法において、 生成した色素を含む反応溶液に励起光を照射し、その色
素によるラマン散乱光を検出して、そのラマン散乱光強
度により前記基質を定量することを特徴とする定量分析
方法。 - 【請求項２】 前記ラマン散乱光は共鳴ラマン散乱光で
ある請求項１に記載の定量分析方法。 - 【請求項３】 前記ラマン散乱光は貴金属コロイドを用
いた表面増強ラマン散乱光である請求項１に記載の定量
分析方法。 - 【請求項４】 前記発色試薬はトリンダー試薬とカップ
ラーの組合わせである請求項１から３のいずれかに記載
の定量分析方法。 - 【請求項５】 前記発色試薬はトリンダー試薬のみであ
る請求項１から３のいずれかに記載の定量分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11060740A JP2000258346A (ja) | 1999-03-08 | 1999-03-08 | ラマン分光法による基質の定量分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11060740A JP2000258346A (ja) | 1999-03-08 | 1999-03-08 | ラマン分光法による基質の定量分析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000258346A true JP2000258346A (ja) | 2000-09-22 |
Family
ID=13150970
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11060740A Pending JP2000258346A (ja) | 1999-03-08 | 1999-03-08 | ラマン分光法による基質の定量分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000258346A (ja) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7599057B2 (en) | 2005-10-17 | 2009-10-06 | Sword Diagnostics, Inc. | Method and apparatus for detection of biological organisms using Raman scattering |
| WO2009128978A1 (en) * | 2008-04-16 | 2009-10-22 | Sword Diagnostics, Inc. | Methods for detecting organisms and enzymatic reactions using raman spectroscopy |
| US8213004B2 (en) | 2008-03-26 | 2012-07-03 | Fujifilm Corporation | Method and apparatus for measuring raman signals |
| JP2013007726A (ja) * | 2011-06-27 | 2013-01-10 | Kinki Univ | 反射器およびこれを備えたキャピラリ電気泳動分析装置 |
| CN103411949A (zh) * | 2013-06-24 | 2013-11-27 | 吉林大学 | 利用sers技术间接检测血清中葡萄糖含量的方法 |
| KR101639527B1 (ko) * | 2015-06-25 | 2016-07-14 | 중앙대학교 산학협력단 | 처리 용액 내 오염물 농도의 분석 장치, 분석 방법, 이를 위한 데이터 모델링 방법 및 처리 용액 내 오염물 농도의 분석 시스템 |
| KR101841369B1 (ko) | 2016-12-09 | 2018-03-22 | 성균관대학교산학협력단 | 이미지 기반 물질 정량 분석방법 |
| US10155973B2 (en) | 2005-10-17 | 2018-12-18 | Sword Diagnostics, Inc. | Methods for detecting organisms and enzymatic reactions using raman spectroscopy and aromatic compounds comprising phosphate |
| KR20200065504A (ko) * | 2018-11-30 | 2020-06-09 | 서강대학교산학협력단 | 수용액 상의 물질 종류와 물질 농도 예측 장치 및 그 예측 방법 |
-
1999
- 1999-03-08 JP JP11060740A patent/JP2000258346A/ja active Pending
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10155973B2 (en) | 2005-10-17 | 2018-12-18 | Sword Diagnostics, Inc. | Methods for detecting organisms and enzymatic reactions using raman spectroscopy and aromatic compounds comprising phosphate |
| US7947437B2 (en) | 2005-10-17 | 2011-05-24 | Sword Diagnostics, Inc. | Methods for detecting organisms and enzymatic reactions using raman spectroscopy |
| US8243267B2 (en) | 2005-10-17 | 2012-08-14 | Neal Arthur Siegel | Method and apparatus for detection of biological organisms using raman scattering |
| US7599057B2 (en) | 2005-10-17 | 2009-10-06 | Sword Diagnostics, Inc. | Method and apparatus for detection of biological organisms using Raman scattering |
| US9260742B2 (en) | 2005-10-17 | 2016-02-16 | Sword Diagnostics, Inc. | Methods for detecting organisms and enzymatic reactions using raman spectroscopy |
| US8213004B2 (en) | 2008-03-26 | 2012-07-03 | Fujifilm Corporation | Method and apparatus for measuring raman signals |
| WO2009128978A1 (en) * | 2008-04-16 | 2009-10-22 | Sword Diagnostics, Inc. | Methods for detecting organisms and enzymatic reactions using raman spectroscopy |
| JP2013007726A (ja) * | 2011-06-27 | 2013-01-10 | Kinki Univ | 反射器およびこれを備えたキャピラリ電気泳動分析装置 |
| CN103411949A (zh) * | 2013-06-24 | 2013-11-27 | 吉林大学 | 利用sers技术间接检测血清中葡萄糖含量的方法 |
| KR101639527B1 (ko) * | 2015-06-25 | 2016-07-14 | 중앙대학교 산학협력단 | 처리 용액 내 오염물 농도의 분석 장치, 분석 방법, 이를 위한 데이터 모델링 방법 및 처리 용액 내 오염물 농도의 분석 시스템 |
| KR101841369B1 (ko) | 2016-12-09 | 2018-03-22 | 성균관대학교산학협력단 | 이미지 기반 물질 정량 분석방법 |
| WO2018106066A1 (ko) * | 2016-12-09 | 2018-06-14 | 성균관대학교산학협력단 | 이미지 기반 물질 정량 분석방법 |
| KR20200065504A (ko) * | 2018-11-30 | 2020-06-09 | 서강대학교산학협력단 | 수용액 상의 물질 종류와 물질 농도 예측 장치 및 그 예측 방법 |
| KR102234340B1 (ko) | 2018-11-30 | 2021-03-31 | 서강대학교산학협력단 | 수용액 상의 물질 종류와 물질 농도 예측 장치 및 그 예측 방법 |
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