CN113030217A - 一种检测肌苷酸的酶生物传感器、其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物传感器技术领域，公开了一种检测肌苷酸的自组装ZIF‑67@AgNPs‑鲁米诺双酶电化学发光传感器、其制备方法和应用，其线性检测范围为0.001~25 g/L，检出限为0.0013 g/L。将AgNPs固定在MOF材料ZIF‑67上，采用十二面体结构分散AgNPs粒子，防止纳米AgNPs粒子团聚，同时利用ZIF‑67超大的比表面积和生物相容性，固定化两种水解酶(5'‑核苷酸酶和黄嘌呤氧化酶)对IMP进行水解，通过两步酶解反应得到的H2O2显著放大了鲁米诺‑H2O2体系的ECL信号。本发明酶生物传感器简单、快速、准确，灵敏度高，为维护食品质量安全提供了一个有效的ECL检测平台。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感器技术领域，尤其涉及一种检测肌苷酸的双酶生物传感器、其制备方法和应用，用于食品中肌苷酸（IMP）的检测。
背景技术
肌苷酸（IMP）是一种单核苷酸，是生物体内ATP的代谢中间体，肌苷酸及其盐类能够产生鲜味，是肉品中重要的风味物质之一，它还能够与谷氨酸钠协同作用，使鲜味成倍增加，是一种常用的调味剂，除此之外，肌苷酸也是国际公认的衡量肉类新鲜程度的重要指标，目前，定量检测肌苷酸的方法包括分光光度法、高效液相色谱法等，但这些方法存在着检测成本高、耗费时间长、操作复杂等问题，相较而言，电化学发光酶生物传感器具有较高的敏感性和选择性，能够有效地放大信号，且样品用量较少，响应迅速，操作简单，更加适用于食品中肌苷酸的检测。
由于贵金属纳米粒子对鲁米诺-H2O2发光系统具有良好的催化性能，因此被广泛用于构建电化学发光传感器，然而，纳米材料容易发生聚合，影响传感器的灵敏度和稳定性，本文将AgNPs固定在MOF材料ZIF-67上，采用十二面体结构分散AgNPs颗粒，防止聚合，金属有机框架(Metal organic frameworks, MOFs)是以无机金属为中心和有机配体自组装而成的各种高多孔材料，由于其丰富的孔隙率和较大的内外比表面积，在储气、催化、吸附和ECL检测等领域得到了广泛的应用，ZIF-67超级大的比表面积和生物相容性被用于固定两个水解酶(5'-核苷酸酶和黄嘌呤氧化酶)以水解IMP，过氧化氢通过两步酶法水解反应显著放大鲁米诺-H2O2系统的信号。
发明内容
为了克服现有检测肌苷酸的方法检测成本高、耗费时间长、操作复杂的问题，本发明的首要目的在于提供一种具有良好选择性、灵敏度高和稳定性强的检测肌苷酸的酶生物传感器。
本发明的另一目的在于提供上述酶生物传感器的制备方法，通过合适的纳米材料的载体材料和催化发光方法获得性能稳定的电化学发光酶生物传感器。
本发明的再一目的在于提供上述双酶传感器在肌苷酸定量检测中的应用。
本发明的上述目的通过以下技术方法实现：
第一方面，本发明的检测肌苷酸的双酶传感器，由参比电极、对电极及修饰电极组成，所述修饰电极通过工作电极表面固化对肌苷酸敏感的物质识别膜得到；其中：
所述物质识别膜由复合溶液a、双酶复合溶液b和10 mg/mL的牛血清白蛋白溶液按照体积比为1:1:1组成；其中，所述复合溶液a由20 mg ZIF-67粉末，5 mg AgNPs粉，5 mg鲁米诺粉，9.5 ml超纯水组成，所述双酶复合溶液b由2 mg/mL的5'-核苷酸酶溶液和2 mg/mL的黄嘌呤氧化酶溶液按体积比1:1组成；
所述5'-核苷酸酶溶液由5'-核苷酸酶溶于pH 6.0、0.01M的PBS溶液得到，所述黄嘌呤氧化酶溶液由黄嘌呤氧化酶溶于pH 6.0、0.01M的PBS溶液得到。
优选的，所述ZIF-67@AgNPs-鲁米诺混合溶液的制备方法为：ZIF-67制备方法：将用分析天平称取249.0 mg Co(NO3)2·6H2O和996.0 mg 2-甲基咪唑，然后溶解在25.0 mL甲醇中，然后将2-甲基咪唑溶液倒入Co(NO3)2·6H2O溶液中制备ZIF-67前驱体溶液，室温静置24小时，最后，用离心机对混合溶液进行离心，得到紫色沉淀，将沉淀用甲醇洗涤多次，80℃真空干燥，得到紫色的ZIF-67样品。
AgNPs制备方法：使用硼氢化钠还原硝酸银制备纳米银，准备100毫升0.01M硝酸银溶液和100毫升0.01M柠檬酸钠溶液，混合，加入470毫升超纯水，同时快速搅拌，添加60毫升0.01M NaBH4于混合溶液中，搅拌30分钟，使用前在4℃冰箱老化2天，将得到的溶液离心，用超纯水洗涤沉淀多次，真空干燥得到纳米银粉末。
ZIF-67@AgNPs-鲁米诺混合溶液的制备方法为：取20 mg ZIF-67粉末，悬浮于9.5ml超纯水中，加入AgNPs粉5 mg，鲁米诺粉5 mg，搅拌后加入ZIF-67，将溶液的pH调至7.4后，搅拌30分钟。
优选的，所述工作电极为铂电极，所述参比电极为Ag/AgCl电极，所述对电极为铂电极。
优选的，所述双酶传感器的线性检测范围为0.001~25 g/L。
优选的，所述双酶传感器的检出限为0.0013 g/L。
第二方面，所述双酶传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）对工作电极进行表面预处理；
（2）将ZIF-67、AgNPs、鲁米诺按配比溶于9.5 ml超纯水中，得复合溶液a，并将其滴加到步骤（1）表面预处理后的工作电极表面，室温晾干；
（3）将5'-核苷酸酶溶液和黄嘌呤氧化酶溶液按配比混合均匀，得双酶复合溶液b，并将其滴加到步骤（2）处理后的电极表面，室温晾干；
（4）将牛血清白蛋白溶液滴加到步骤（3）处理后的电极表面，室温晾干，得修饰电极；
（5）将步骤（4）所得修饰电极与所述参比电极和所述对电极组成三电极体系，即得；
其中，所述复合溶液a、双酶复合溶液b和牛血清白蛋白溶液的滴加量体积比为1:1:1。
优选的，步骤（1）中，所述工作电极表面预处理的步骤为：将工作电极依次使用0.3μm和0.05 μm的氧化铝粉末在抛光布上抛光成镜面，再用超纯水冲洗，然后在超纯水中超声处理1min，然后置于铁氰化钾溶液中进行活化处理，取出，用超纯水冲洗，氮气吹干；所述铁氰化钾溶液为由K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]和KCl按摩尔比为1:1:100组成的混合溶液。
第三方面，上述生物传感器在肌苷酸定量检测中的应用，线性检测范围为0.001~25 g/L，检出限为0.0013 g/L。
本发明选用新型金属有机框架(ZIF-67)，结合AgNPs、鲁米诺并利用纳米银和ZIF-67的催化性，以及ZIF-67的超大比表面积和生物相容性，构建双酶电化学发光传感器的纳米材料载体，AgNPs固定在MOF材料ZIF-67上，采用十二面体结构分散AgNPs颗粒，防止聚合，ZIF-67和AgNPs两种催化材料的结合，双酶两步水解法使ECL信号更明显，检出限更高，滴加由5'-核苷酸酶和黄嘌呤氧化酶组成的双酶复合溶液后用牛血清白蛋白溶液封闭成膜，得到修饰电极，再配合参比电极和对电极组成三电极体系，制得用于检测肌苷酸的酶生物传感器，线性检测范围为0.001~25 g/L，检出限为0.0013 g/L。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
（1）本发明的生物传感器具有良好的发光信号，ZIF-67和AgNPs两种催化材料的结合，双酶两步水解法使ECL信号更明显，检出限更高。
（2）本发明的生物传感器具有良好的选择性，可对肌苷酸进行准确检测，抗干扰能力强，对半胱氨酸、蛋氨酸、肌苷二磷酸和肌苷三磷酸等干扰物无电流响应。
（3）本发明的生物传感器具有良好的稳定性和重现性，在含0.1 g·L-1IMP的PBS(pH=7.4)缓冲溶液中对所制备的传感器进行了稳定性测试，显示出1.5%的相对标准偏差，在4℃存放7天后可以保留高达95%的初始ECL响应信号。
（4）本发明的生物传感器可用于食品中肌苷酸的检测，制备工艺简单、安全，可在室温环境检测条件下检测，具有较宽的检测范围，较低的检测限，应用前景好。
附图说明
图1是本发明中酶生物传感器的整体结构示意图。
图2是本发明中酶生物传感器工作电极的制备流程图。
图3是实施例2中裸电极，改性材料ZIF-67以及ZIF-67@AgNPs在含有0.1M KCl和5mM [Fe(CN)6]3-/4-的溶液中的阻抗谱图；其中，黑线表示ZIF-67@AgNPs-鲁米诺的阻抗曲线表明电极表面的电阻减小，电导率增大，绿色表示ZIF-67的阻抗曲线，改性后导电性基本不变，红色表示裸电极的阻抗曲线。
图4是实施例2中不同的修饰材料在含有0.1M KCl和5 mM [Fe(CN)6]3-/4-的溶液中的差分脉冲伏安曲线图；其中，黑线表示ZIF-67@AgNPs修饰电极在溶液中的DPV曲线，导电性最好，红线表示ZIF-67修饰电极的DPV曲线，电流变化不大，蓝线表示裸电极的DPV曲线。
图5是实施例3中双酶传感器在存在3 μmol/L肌苷酸和不存在肌苷酸的PBS缓冲溶液（0.01M、pH=7.4）中的ECL曲线图；曲线a显示缓冲液几乎没有发光信号，表示缓冲溶液中不含IMP，曲线b显示缓冲液有很强的发光信号，表示缓冲溶液中含有IMP。
图6是实施例4中双酶传感器对不同浓度肌苷酸的ECL图像；其中a~f分别代表IMP浓度梯度为1 mgL-1，5 mgL-1，10 mgL-1，15 mgL-1，20 mgL-1，25 mgL-1的ECL曲线。
图7是实施例4中双酶传感器对不同浓度肌苷酸的响应电流的标准曲线。
图8是实施例5中双酶传感器对不同的干扰物质与肌苷酸的ECL响应强度柱状图；其中1~5分别代表三磷酸肌苷、半胱氨酸、二磷酸肌苷、蛋氨酸和肌苷的柱状图谱。
图9是实施例5中双酶传感器在含0.1 gL-1 IMP的PBS(pH=7.4)缓冲溶液中对所制备的传感器进行了稳定性测试；表明所构建的双酶电化学发光传感器具有良好的稳定性，可以保留高达95%的初始ECL响应信号。
具体实施方式
下面结合实例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明实施例ZIF-67材料可以是市售产品或采用以下方法制备得到：用分析天平称取249.0 mg Co(NO3)2·6H2O和996.0 mg 2-甲基咪唑，然后将其分别溶解在25.0 mL甲醇中，然后将2-甲基咪唑溶液倒入Co(NO3)2·6H2O溶液中制备ZIF-67前驱体溶液，室温静置24小时，最后，用离心机对混合溶液进行离心，得到紫色沉淀，将沉淀用甲醇洗涤多次，80℃真空干燥，得到紫色的ZIF-67样品。
实施例1：
检测肌苷酸的酶生物传感器，其整体结构如图1所示，由参比电极2、对电极3及修饰电极1组成，修饰电极1由工作电极1-1及固化在工作电极表面的物质识别膜1-2组成，其中，对肌苷酸敏感的物质识别膜1-2由ZIF-67@AgNPs-鲁米诺混合溶液、5'-核苷酸酶溶液、黄嘌呤氧化酶溶液以及牛血清白蛋白溶液制备而成，将上述酶生物传感器放入待测液4中，可检测待测液4中肌苷酸的含量。
修饰电极1的制备流程如图2所示，具体制备方法步骤为：
（1）工作电极预处理，将工作电极依次使用直径为0.3 μm与0.05 μm的氧化铝粉末在抛光布上抛光成镜面，再用超纯水冲洗，然后在超纯水中超声处理1min，晾干后，再将玻碳电极置于铁氰化钾溶液（由K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]和KCl按摩尔比为1:1:100组成的混合溶液）中，在-0.2~0.6 V下采用循环伏安法扫描4圈进行电极活化，取出用超纯水冲洗，氮气吹干后得到预处理的玻碳电极。
（2）滴加复合溶液a，在预处理后的电极表面滴加5μL a溶液；a溶液为ZIF-67@AgNPs-鲁米诺混合溶液，取20 mg ZIF-67粉末，悬浮于9.5 ml超纯水中，加入AgNPs粉末5mg，鲁米诺粉末5 mg，同时搅拌，将溶液的pH调至7.4后，搅拌30分钟配制而成；
（3）滴加双酶复合溶液b，待电极表面滴加的a溶液干燥后，滴加5 μLb溶液；b溶液为5'-核苷酸酶溶液、黄嘌呤氧化酶溶液的混合溶液，其中5'-核苷酸酶溶液的浓度为2 mg/mL，黄嘌呤氧化酶溶液的浓度为2 mg/mL，5'-核苷酸酶溶液、黄嘌呤氧化酶溶液的体积比为1:1；
（4）滴加牛血清白蛋白溶液，待电极表面滴加的b溶液干燥后，滴加5 μL牛血清白蛋白溶液，干燥后即制得修饰电极1。
将上述修饰电极1，与参比电极2和对电极3组成三电极体系，即得到检测肌苷酸的酶生物传感器。
实施例2：
用于检测肌苷酸的酶生物传感器，其制备步骤如下：
（1）将直径为3 mm的玻碳电极依次使用直径为0.3 μm与0.05 μm的氧化铝粉末在抛光布上抛光成镜面，再用超纯水冲洗，然后在超纯水中超声处理1min，晾干后，再将玻碳电极置于铁氰化钾溶液（由K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]和KCl按摩尔比为1:1:100组成的混合溶液）中，在-0.2~0.6 V下采用循环伏安法扫描4圈进行电极活化，取出用超纯水冲洗，氮气吹干后得到预处理的玻碳电极。
（2）滴加复合溶液a，在预处理后的电极表面滴加5 μL a溶液；a溶液为ZIF-67@AgNPs-鲁米诺混合溶液，取20 mg ZIF-67粉末，悬浮于9.5 ml超纯水中，加入AgNPs粉末5mg，鲁米诺粉末5 mg，同时搅拌，将溶液的pH调至7.4后，搅拌30分钟配制而成。
（3）将5'-核苷酸酶溶液及黄嘌呤氧化酶溶液按照1：1的体积比混合均匀，得到双酶复合溶液b，取5 μL双酶复合溶液b滴加到步骤（3）中玻碳电极表面，室温晾干。
（4）取5 μL牛血清白蛋白溶液滴加到步骤（4）中玻碳电极表面，室温晾干，得到修饰电极。
（5）将修饰电极与作为参比电极的Ag/AgCl电极（KCl浓度为3 mol/L）和作为对电极的铂丝组合成三电极体系，得到检测肌苷酸的酶生物传感器。
采用阻抗法(EIS)对实施例2制备的酶生物传感器进行测试，具体步骤为：室温下，将检测肌苷酸的酶生物传感器浸入含有0.1M KCl和5 mM [Fe(CN)6]3-/4-的铁氰化钾溶液，采用阻抗法进行电化学测试，交流阻抗谱图像为100 mV/S。
图3是检测肌苷酸的酶生物传感器工作电极在含有0.1M KCl和5 mM [Fe(CN)6]3-/4-中的阻抗曲线图，改性材料GCE/ZIF-67/ZIF-67@AgNPs-鲁米诺在含有0.1M KCl和5 mM [Fe(CN)6]3-/4-检测阻抗谱的溶液中，图中显示，裸电极的电阻高达3.5 kW左右，ZIF-67改性后导电性基本不变，复合MOF材料的导电性普遍较差，AgNPs-鲁米诺修饰后，半圆直径减小到2.8 kW左右，表明电极表面的电阻减小，电导率增大，纳米银的修饰提高了电极表面的电子转移效率，表明5'-肌苷酸酶/黄嘌呤酶和工作电极之间的电子转移可以在物质识别膜上快速进行。
采用差分脉冲伏安法对实施例2制备的酶生物传感器进行测试，具体步骤为：室温下，将裸电极、修饰ZIF-67的电极、修饰ZIF-67@AgNPs-鲁米诺的电极依次浸入pH6.0、0.01M的PBS缓冲溶液，采用差分脉冲伏安法进行电化学测试，扫描电位范围为-0.2~0.6 V。
图4是检测肌苷酸的酶生物传感器工作电极在pH6.0、0.01M的PBS溶液中的差分脉冲伏安曲线图，其中，a表示裸电极，b表示修饰ZIF-67的电极，c表示修饰ZIF-67@AgNPs-鲁米诺的电极，差分脉冲伏安法对电极施加阶梯电势，与循环伏安法相比，灵敏度和分辨率更高，有很好的检测能力，不同的修饰材料在0.17 V处表现出不同的电流值，裸电极的峰值电流为-0.15e-5，ZIF-67修饰后的电流变化不大，为-0.17e-5，当对AgNPs-鲁米诺进行修饰时，电流显著增加到-3e-5，基于以上结果，电极表面的AgNPs-鲁米诺修饰的ZIF-67在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中具有良好的导电性，可以作为纳米电极来促进电极表面的电子转移。
实施例3：
用于检测肌苷酸的酶生物传感器，其制备步骤如下：
（1）将直径为3 mm的玻碳电极依次使用直径为0.3 μm与0.05 μm的氧化铝粉末在抛光布上抛光成镜面，再用超纯水冲洗，然后在超纯水中超声处理1min，晾干后，再将玻碳电极置于铁氰化钾溶液（由K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]和KCl按摩尔比为1:1:100组成的混合溶液）中，在-0.2~0.6 V下采用循环伏安法扫描4圈进行电极活化，取出用超纯水冲洗，氮气吹干后得到预处理的玻碳电极。
（2）滴加复合溶液a，在预处理后的电极表面滴加5 μL a溶液；a溶液为ZIF-67@AgNPs-鲁米诺混合溶液，取20 mg ZIF-67粉末，悬浮于9.5 ml超纯水中，加入AgNPs粉末5mg，鲁米诺粉末5 mg，同时搅拌，将溶液的pH调至7.4后，搅拌30分钟配制而成；
（3）将5'-核苷酸酶溶液及黄嘌呤氧化酶溶液按照1:1的体积比混合均匀，得到双酶复合溶液b，取5 μL双酶复合溶液b滴加到步骤（3）中玻碳电极表面，室温晾干。
（4）取5μL牛血清白蛋白溶液滴加到步骤（4）中玻碳电极表面，室温晾干，得到修饰电极。
（5）将修饰电极与作为参比电极的Ag/AgCl电极（KCl浓度为3 mol/L）和作为对电极的铂丝组合成三电极体系，得到检测肌苷酸的酶生物传感器。
采用电化学发光法对实施例3制备的酶生物传感器进行测试，具体步骤为：使用ZIF-67@AgNPs-鲁米诺复合膜电极，滴加5'-核苷酸酶和黄嘌呤氧化酶混合物，用牛血清白蛋白封闭，制成双酶生物传感器，在两种酶的催化下，IMP(3 g/L)逐步水解生成副产物H2O2。
图5是检测肌苷酸的酶生物传感器工作电极在pH 7.4、0.01M的PBS溶液中的循环伏安曲线图，其中，曲线a显示不含被分析物的缓冲液几乎没有发光信号，曲线b显示含有IMP的缓冲液有很强的发光信号，证明所构建的电化学发光双酶传感器可以用于IMP的检测。
实施例4：
用于检测肌苷酸的酶生物传感器，其制备步骤如下：
（1）将直径为3 mm的玻碳电极依次使用直径为0.3 μm与0.05 μm的氧化铝粉末在抛光布上抛光成镜面，再用超纯水冲洗，然后在超纯水中超声处理1min，晾干后，再将玻碳电极置于铁氰化钾溶液（由K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]和KCl按摩尔比为1:1:100组成的混合溶液）中，在-0.2~0.6 V下采用循环伏安法扫描4圈进行电极活化，取出用超纯水冲洗，氮气吹干后得到预处理的玻碳电极。
（2）滴加复合溶液a，在预处理后的电极表面滴加5 μL a溶液；a溶液为ZIF-67@AgNPs-鲁米诺混合溶液，取20 mg ZIF-67粉末，悬浮于9.5 ml超纯水中，加入AgNPs粉末5mg，鲁米诺粉末5 mg，同时搅拌，将溶液的pH调至7.4后，搅拌30分钟配制而成；
（3）将5'-核苷酸酶溶液及黄嘌呤氧化酶溶液按照1:1的体积比混合均匀，得到双酶复合溶液b，取5 μL双酶复合溶液b滴加到步骤（3）中玻碳电极表面，室温晾干。
（4）取5 μL牛血清白蛋白溶液滴加到步骤（4）中玻碳电极表面，室温晾干，得到修饰电极。
（5）将修饰电极与作为参比电极的Ag/AgCl电极（KCl浓度为3 mol/L）和作为对电极的铂丝组合成三电极体系，得到检测肌苷酸的酶生物传感器。
采用电化学发光法对实施例4制备的酶生物传感器进行测试，具体步骤为：使用ZIF-67@AgNPs-鲁米诺复合膜电极，滴加5'-核苷酸酶和黄嘌呤氧化酶混合物，用牛血清白蛋白封闭，制成双酶生物传感器，在两种酶的催化下，IMP逐步水解生成副产物H2O2。
图6是实施例4中制备的酶生物传感器在-0.15 V的固定电位、100mV/s的扫描速率下对不同浓度肌苷酸响应的电化学发光曲线，ECL强度随着IMP浓度的增加而逐渐增加，表明电极表面的物质识别膜在所测肌苷酸浓度范围内保持着较好的生物催化活性。
图7所示的是实施例4中检测肌苷酸的酶生物传感器对不同浓度肌苷酸的响应电流的标准曲线；可以看出，随着IMP浓度从1 mgL-1增加到25 gL-1，ECL强度逐渐增加，线性回归方程为I=227CIMP+427，相关系数为0.993，检出限为0.0013 g/L(S/N=3)，因此，本发明酶生物传感器可用于肌苷酸的定量检测。
对实际样本的检测
选用4种不同的肉样品（鸡肉、猪肉、牛肉、羊肉），各取5 g，在5 g肉样品中加入20mL 5%高氯酸，使用匀浆机在10000 rpm均化3min，然后用5%高氯酸稀释至25 mL，将匀浆在4℃条件下以15000 rpm离心10分钟，收集上清液，用KOH调节pH=5.5，再在4℃以15000 rpm离心10分钟，收集上清液，用于肌苷酸含量的分析检测，将实施例4中制备的酶生物传感器的检测结果与液相色谱的检测结果进行对比，结果显示，实施例4中制备的酶生物传感器与液相色谱的检测结果相比，部分误差数据基本一致，误差来源于相同的样品时间差，误差在合理范围内，表明构建的生物传感器可以有效地应用于实际样品。
实施例5：
用于检测肌苷酸的酶生物传感器，其制备步骤如下：
（1）将直径为3 mm的玻碳电极依次使用直径为0.3 μm与0.05 μm的氧化铝粉末在抛光布上抛光成镜面，再用超纯水冲洗，然后在超纯水中超声处理1min，晾干后，再将玻碳电极置于铁氰化钾溶液（由K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]和KCl按摩尔比为1:1:100组成的混合溶液）中，在-0.2~0.6 V下采用循环伏安法扫描4圈进行电极活化，取出用超纯水冲洗，氮气吹干后得到预处理的玻碳电极。
（2）滴加复合溶液a，在预处理后的电极表面滴加5 μL a溶液；a溶液为ZIF-67@AgNPs-鲁米诺混合溶液，取20 mg ZIF-67粉末，悬浮于9.5 ml超纯水中，加入AgNPs粉末5mg，鲁米诺粉末5 mg，同时搅拌，将溶液的pH调至7.4后，搅拌30分钟配制而成。
（3）将5'-核苷酸酶溶液及黄嘌呤氧化酶溶液按照1:1的体积比混合均匀，得到双酶复合溶液b，取5 μL双酶复合溶液b滴加到步骤（3）中玻碳电极表面，室温晾干。
（4）取5 μL牛血清白蛋白溶液滴加到步骤（4）中玻碳电极表面，室温晾干，得到修饰电极。
（5）将修饰电极与作为参比电极的Ag/AgCl电极（KCl浓度为3 mol/L）和作为对电极的铂丝组合成三电极体系，得到检测肌苷酸的酶生物传感器。
采用电化学发光法对实施例4制备的酶生物传感器进行测试，具体步骤为：使用ZIF-67@AgNPs-鲁米诺复合膜电极，滴加5'-核苷酸酶和黄嘌呤氧化酶混合物，用牛血清白蛋白封闭，制成双酶生物传感器，选用三磷酸肌苷、半胱氨酸、二磷酸肌苷、蛋氨酸和肌苷作为IMP的干扰物质，利用肉品中共存的类似物进行检测。
图8是实施例5中制备的酶生物传感器在-0.15 V的固定电位、100 mV/s的扫描速率下对不同干扰物质及肌苷酸响应的ECL强度柱状图，与IMP信号相比，去除背景信号干扰不会产生ECL信号，而IMP的加入会产生较强的ECL信号，此外，混合了IMP和其他干扰的样品的ECL信号与纯IMP的强度大致相同，表明所构建的电化学发光酶生物传感器对IMP具有良好的特异性。
图9是实施例5中制备的酶生物传感器在-0.15 V的固定电位、100 mV/s的扫描速率下对不同干扰物质及肌苷酸响应的ECL强度曲线，在含0.1 gL-1 IMP的PBS(pH=7.4)缓冲溶液中对所制备的传感器进行了稳定性测试，相对标准偏差(RSD)为1.5%，表明所构建的双酶电化学发光传感器具有良好的稳定性。
此外，在含0.1 gL-1 IMP的PBS(pH=7.4)缓冲溶液中对所制备的传感器进行了稳定性测试，相对标准偏差(RSD)为1.5%，表明所构建的双酶电化学发光传感器具有良好的稳定性，此外，使用过的ECL传感器在4℃保存7天后，可以保留高达95%的初始ECL响应信号，这表明所开发的ECL传感器具有理想的长期存储稳定性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.检测肌苷酸的自组装ZIF-67@AgNPs-鲁米诺双酶电化学发光传感器，其特征在于，其线性检测范围为0.001~25 g/L，由参比电极、对电极和修饰电极组成，将AgNPs固定在MOF材料ZIF-67上，采用十二面体结构分散AgNPs粒子，防止纳米AgNPs粒子团聚，同时利用ZIF-67超大的比表面积和生物相容性，固定化两种水解酶(5'-核苷酸酶和黄嘌呤氧化酶)对IMP进行水解，通过两步酶解反应得到的H2O2显著放大了鲁米诺-H2O2体系的ECL信号，ZIF-67和AgNPs两种催化材料的结合，双酶两步水解法的应用使ECL信号更明显，检出限更高。
2.如权利要求1所述的检测肌苷酸的双酶传感器，其特征在于，所述5'-核苷酸酶溶液由5'-核苷酸酶溶于pH 7.4、0.01M的PBS溶液得到；所述黄嘌呤氧化酶溶液由黄嘌呤氧化酶溶于pH 7.4、0.01M的PBS溶液得到。
3.如权利要求1所述的检测肌苷酸的双酶传感器，其特征在于，所述ZIF-67制备方法：将用分析天平称取249.0 mg Co(NO3)2·6H2O和996.0 mg 2-甲基咪唑，然后溶解在25.0 mL甲醇中，然后将2-甲基咪唑溶液倒入Co(NO3)2·6H2O溶液中制备ZIF-67前驱体溶液，室温静置24小时，最后，用离心机对混合溶液进行离心，得到紫色沉淀，将沉淀用甲醇洗涤多次，80℃真空干燥，得到紫色的ZIF-67样品：
AgNPs制备方法：使用硼氢化钠还原硝酸银制备纳米银，准备100毫升0.01M硝酸银溶液和100毫升0.01M柠檬酸钠溶液，混合，加入470毫升超纯水，同时快速搅拌，添加60毫升0.01M NaBH4于混合溶液中，搅拌30分钟，使用前在4℃冰箱老化2天，将得到的溶液离心，用超纯水洗涤沉淀多次，真空干燥得到纳米银粉末；
ZIF-67@AgNPs-鲁米诺混合溶液的制备方法为：取20 mg ZIF-67粉末，悬浮于9.5 ml超纯水中，加入AgNPs粉5 mg，鲁米诺粉5 mg，搅拌后加入ZIF-67，将溶液的pH调至7.4后，搅拌30分钟。
4.如权利要求1所述的检测肌苷酸的双酶传感器，其特征在于，所述工作电极为铂电极，所述参比电极为Ag/AgCl电极，所述对电极为铂电极。
5.如权利要求1所述的检测肌苷酸的双酶传感器，其特征在于，所述双酶电化学发光传感器为0.0013g/L。
6.权利要求1~5任一项所述双酶传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对工作电极进行表面预处理；
（2）将所述复合溶液a滴加到步骤（1）表面预处理后的工作电极表面，室温晾干；
（3）将双酶复合溶液b混合物滴加到步骤（2）处理后的电极表面，室温晾干；
（4）将所述牛血清白蛋白溶液滴加到步骤（3）处理后的电极表面，室温晾干，得到修饰电极；
（5）将步骤（4）所得修饰电极与所述参比电极和所述对电极组成三电极体系，即得；其中：所述复合溶液a、双酶复合溶液b和牛血清白蛋白溶液的滴加量体积比为1:1:1。
7.如权利要求6所述双酶电化学发光传感器的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述工作电极表面预处理的步骤为：将工作电极依次使用0.3 μm和0.05 μm的氧化铝粉末在抛光布上抛光成镜面，再用超纯水冲洗，然后在超纯水中超声处理1min，然后置于铁氰化钾溶液中活化处理，取出，用超纯水冲洗，氮气吹干；其中，所述铁氰化钾溶液为由K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]和KCl按摩尔比为1:1:100组成的混合溶液。
8.权利要求1~5任一项所述双酶电化学发光传感器在肌苷酸定量检测中的应用，其特征在于，所述肌苷酸的线性检测范围为0.001~25 g/L。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肌苷酸的检出限为0.0013 g/L。
10.如权利要求6所述双酶电化学发光传感器的制备方法，其特征在于，所制备的传感器具备良好的稳定性，相对标准偏差(RSD)为1.5%。
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| CN110501400A (zh) * | 2019-09-05 | 2019-11-26 | 上海交通大学 | 一种检测肌苷酸的酶生物传感器、其制备方法和应用 |
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