CN108866037A - 一种以多孔纳米金为载体固定脂肪酶的制备方法和应用 - Google Patents

一种以多孔纳米金为载体固定脂肪酶的制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种以多孔纳米金为载体固定脂肪酶的制备方法和应用，所述制备方法采用去合金化法制备多孔纳米金材料，首先用α‑硫辛酸修饰，形成羧基化的纳米金材料；再用偶联剂对其修饰，形成以N‑羟基硫代琥珀酰亚胺为终端的纳米金复合物，将猪胰脂肪酶固定在纳米金复合物上形成固定化酶。本发明所得到的固定化酶具有良好的催化活性、pH稳定性、热稳性、储存稳定性相比游离酶具有明显提高，且载体经过简单处理后可循环利用，从而降低成本。

Description

一种以多孔纳米金为载体固定脂肪酶的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种以多孔纳米金为载体固定脂肪酶的制备方法和应用，属于生物材料制备技术领域。
背景技术
脂肪酶因其在油脂水解、酯交换、脂反应等催化反应中表现出来较高的选择性，在食品加工、医药、传感器等领域有着广泛的应用。然而，游离酶因其稳定性差、与产物难以分离、无法循环使用等缺点阻碍了其在工业生产中的进一步应用。将游离酶通过物理或化学的方法固定在特殊的载体上，在保持其天然活性的基础上还可以提高其热稳定性、储存稳定性等基本性质，此外，与特殊功能载体的结合还可以满足其在生物等领域特殊功能化的需要。
随着固定化技术研究的不断发展，从最初的天然高分子材料到合成高分子材料、无机材料以及现在的复合材料等多种载体已被成功用于酶的固定化。近年来，多孔纳米材料作为一种新的固定化酶载体引起了国内外学者的广泛关注。
发明内容
本发明旨在提供一种以多孔纳米金为载体固定脂肪酶的制备方法，确定了脂肪酶固定化的条件，通过本方法，使脂肪酶的pH值稳定性、热稳定性、操作稳定性、储存稳定性均比自由酶明显提高，固定化脂肪酶载体经硝酸简单处理可实现重复利用，操作简便从而使成本降低。
本发明还提供了上述以多孔纳米金为载体的固定化酶的应用，对比了固定化酶和游离酶的酶学特性。
本发明提供了一种以多孔纳米金为载体固定脂肪酶的制备方法，采用去合金化法制备多孔纳米金材料，首先用α-硫辛酸修饰，形成羧基化的纳米金材料；再用偶联剂对其修饰，形成以N-羟基硫代琥珀酰亚胺为终端的纳米金复合物，将猪胰脂肪酶固定在纳米金复合物上形成固定化酶。
本发明采用去合金化法制备多孔纳米金，并用硫辛酸修饰，再用碳化二亚胺与N-羟基硫代琥珀酰亚胺修饰，然后将脂肪酶固定在载体上形成固定化酶。
上述制备方法具体包括以下步骤：
（1）多孔纳米金材料的制备
将金银合金材料放置于68-85%浓硝酸中腐蚀15-24 h，超纯水清洗试样，洗至中性，真空冷冻干燥机干燥；200-400℃退火2-3 h，得到孔径为25-100 nm的纳米金材料（NPG）；
（2）α-硫辛酸修饰多孔纳米金材料表面
将α-硫辛酸固体溶于乙醇溶液，充分搅拌混合成混合液，然后加入步骤（1）制备的多孔纳米金材料，常温混合反应15-24 h；用缓冲液冲洗3-6遍，干燥得到表面修饰羧基化的纳米金材料；
（3）偶联剂修饰羧基化的纳米金材料
取步骤（2）中制备的羧基化的纳米金材料与碳化二亚胺（EDC）和 N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）溶液常温混合反应4-12 h，继续使用缓冲液冲洗，冷冻干燥后得到以NHS为终端的纳米金复合物；
（4）纳米金载体共价固定脂肪酶
将步骤（3）中制得的纳米金复合物与脂肪酶溶液混合反应，将得到的固定酶洗涤，干燥，得到脂肪酶纳米金复合物（lipase-NPG）。
步骤（1）中金银合金原子质量比为48:52或50:50，浓硝酸浓度为68%-85%，腐蚀时间为15-24 h，200-400℃退火2-3小时，多孔纳米金的孔径为25-100 nm。
步骤（2）~（4）中所用缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH为7.2-8.5。
步骤（2）中所使用混合液中α-硫辛酸的浓度为0.8-1.3 mmol/L。
步骤（3）中所使用偶联剂 N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)的浓度为10-20mmol/L，碳化二亚胺（EDC）的浓度为 N-羟基硫代琥珀酰亚胺的5-10倍。
步骤（4）中所使用酶液浓度为0.8-2.0 mg/ml；反应条件：0-8℃，静置反应时间18-24 h。
步骤（1）~（4）中的干燥使用真空冷冻干燥机干燥，干燥时间为20-40分钟，干燥温度-10℃～-50℃，真空1.5-20帕斯卡。
本发明所采用的原料纯度等级为分析纯。
多孔纳米金是一种具有三维双连续海绵结构的材料，其具有较大的比表面积，且有较好的生物相容性。使用去合金化方法制备多孔纳米金材料，方法简单且其孔径大小可通过后期热处理调节。在浓硝酸中制备，其纳米结构表面非常干净，能够很容易的进行功能化。将脂肪酶固定在纳米金载体上，不仅可以提高脂肪酶的稳定性，而且还可以实现在酶传感器上的应用。此外，纳米金载体通过浓硝酸的简单处理，可以实现载体的循环利用，从而达到降低生产成本，减少污染的目的。
本发明的有益效果：
（1）本发明首次将脂肪酶通过共价连接的方法固定在多孔纳米金的载体上，得到稳定性好的、重复利用效率高的固定化酶。
（2）首先，我们通过比较该化学连接方法与物理吸附方法下的酶载量，发现通过该方法所结合的酶量为物理吸附的2-4倍。
（3）环境对酶的使用效率具有很大的影响，因此我们分别检测了在不同pH以及不同温度下脂肪酶的活性及其适用范围。
附图说明
图1 为实施例1中多孔纳米金材料的SEM图。
图2为多孔纳米金固定脂肪酶的反应过程示意图。
具体实施方式
下面通过实施例来进一步说明本发明，但不局限于以下实施例。
实施例1：
以多孔纳米金为载体固定脂肪酶的制备方法，包括以下步骤：
1、制备多孔纳米金材料
（1）将金银原子比为48:52的金银合金材料剪成1cm×1cm的方片试样，称重为5 mg。将试样放置于质量浓度为68%浓硝酸，室温下腐蚀24小时。超纯水清洗试样五遍，洗至中性，放入真空冷冻干燥机干燥试样。
（2）将上述试样放入退火炉，设置温度为200℃，温度上升到预设温度后开始计时两小时。关闭退火炉，自然冷却后得到多孔纳米金（NPG）材料。
在上述工艺条件下，可制得三维连续状结构的纳米多孔材料。如图1所示。
2、纳米金材料共价连接脂肪酶
（1）将α-硫辛酸固体溶于无水乙醇溶液中，配制成1.0 mM α-硫辛酸乙醇溶液10 ml。充分搅拌混合成混合液，然后加入纳米金，常温混合反应24 h。
（2）配制Tris-HCl缓冲液，pH为8.0。用Tris-HCl缓冲液缓慢冲洗纳米金材料五遍，真空冷冻干燥机干燥30 min后，干燥温度-20℃，真空度10帕斯卡。得到表面修饰羧基化的纳米金。
（3）称量偶联剂 N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS），快速称量碳化二亚胺（EDC）于反应容器中，加入Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液，配制成最终浓度分别为15 mM 的Sulfo-NHS溶液和75 mM EDC溶液。
（4）将羧基化纳米金放入EDC和 Sulfo-NHS溶液中，常温混合反应12 h，使用Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液冲洗五遍。得以NHS为终端的纳米金复合物（NPG-NHS）。
（5）称量猪胰脂肪酶10 mg，使用Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液配制10 ml浓度为1 mg/ml的猪胰脂肪酶溶液。将NPG-NHS与脂肪酶溶液4℃混合，静置，反应24 h。
（6）将得到的固定酶使用Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液洗涤，真空冷冻干燥机干燥40 min，干燥温度-20℃，真空度9帕斯卡，得到脂肪酶纳米金复合物（lipase-NPG），保存于4℃冰箱中。
纳米金共价固定脂肪酶流程如反应示意图2所示。
通过比较该化学连接方法与物理吸附方法下的酶载量，发现通过该方法所结合的酶量为物理吸附的2-4倍。具体实验方法为：使用等量（5 mg）、且孔径相同的NPG（25 nm）放置入等浓度的脂肪酶（1mg/ml）溶液中，静置24 h进行物理吸附，之后使用缓冲液Tris–HCl（50 mM, pH 8.0）冲洗5次，洗去连接较弱的脂肪酶。最后通过添加脂肪酶与清洗缓冲液中脂肪酶的差值来计算酶载量。将其与本专利所保护的化学连接方法进行对比，发现该方法中脂肪酶连接力比较强，起酶载量为物理吸附方法的2-4倍。
环境对酶的使用效率具有很大的影响，因此我们分别检测了在不同pH以及不同温度下脂肪酶的活性及其适用范围。具体实验方法为：将等浓度的自由脂肪酶以及上述方法所制备的固定脂肪酶（1 mg/ml），40℃预热10 min后，使用对硝基苯酚棕榈酸酯来检测其酶活性。反应10 min后使用碳酸钠（5 ml, 50 mM）溶液终止反应。将最终反应物摇匀并静置5min后使用UV-1800检测其在410 nm处的吸光度。1单位的脂肪酶活性单位定义为在上述实验条件下催化硝基苯酚棕榈酸酯生成1 μm产物所使用的脂肪酶的量。通过上述方法我们分别改变pH范围6.5-8.5以及温度范围30-70℃，并检测其活性，得到Lipas-NPG最适pH为8.0，最适反应温度为60℃，Lipas-NPG在pH值范围内（6.5-8.5）均保持着较高的活性，相比较游离酶，其相对活力保持在70%以上；而且其最适温度比游离酶的最适反应温度提高了10℃。
实施例2：
以多孔纳米金为载体固定脂肪酶的制备方法，包括以下步骤：
1、制备多孔纳米金材料
（1）将金银原子比为48:52的金银合金材料剪成1cm×1cm的方片试样，称重为5mg。将试样放置于质量浓度为70%浓硝酸，室温下腐蚀24小时。超纯水清洗试样6遍，洗至中性，放入真空冷冻干燥机干燥试样。
（2）将上述试样放入退火炉，设置温度为250℃，温度上升到预设温度后开始计时两小时。关闭退火炉，自然冷却后得到多孔纳米金（NPG）材料。
2、纳米金材料共价连接脂肪酶
（1）将α-硫辛酸固体溶于无水乙醇溶液中，配制成1.3mM α-硫辛酸乙醇溶液10ml。充分搅拌混合成混合液，然后加入纳米金，常温混合反应24 h。
（2）配制Tris-HCl缓冲液，pH为8.5。用Tris-HCl缓冲液缓慢冲洗纳米金材料五遍，真空冷冻干燥机干燥30min后，干燥温度-20℃，真空度10帕斯卡得到表面修饰羧基化的纳米金。
（3）称量偶联剂 N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)，快速称量碳化二亚胺（EDC）于反应容器中，加入Tris-HCl（pH 8.3）缓冲液，配制成最终浓度分别为15mM 的Sulfo-NHS溶液和80mM EDC溶液。
（4）将羧基化纳米金放入EDC和 Sulfo-NHS溶液中，常温混合反应12h，使用Tris-HCl（pH 8.3）缓冲液冲洗五遍。得以NHS为终端的纳米金复合物（NPG-NHS）。
（5）称量猪胰脂肪酶1.2mg，使用Tris-HCl（pH 8.3）缓冲液配制10ml浓度为1.2mg/ml的猪胰脂肪酶溶液。将NPG-NHS与脂肪酶溶液4℃混合，静置，反应24 h。
（6）将得到的固定酶使用Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液洗涤，真空冷冻干燥机干燥40 min，干燥温度-20℃，真空度10帕斯卡，得到脂肪酶纳米金复合物（lipase-NPG），保存于4℃冰箱中。
实施例3：
以多孔纳米金为载体固定脂肪酶的制备方法，包括以下步骤：
1、制备多孔纳米金材料
（1）将金银原子比为50:50的金银合金材料剪成1cm×1cm的方片试样，称重为5mg。将试样放置于质量浓度为75%浓硝酸，室温下腐蚀16小时。超纯水清洗试样五遍，洗至中性，放入真空冷冻干燥机干燥试样。
（2）将上述试样放入退火炉，设置温度为300℃，温度上升到预设温度后开始计时1.5小时。关闭退火炉，自然冷却后得到多孔纳米金（NPG）材料。
在上述工艺条件下，可制得三维连续状结构的纳米多孔材料。如图1所示。
2、纳米金材料共价连接脂肪酶
（1）将α-硫辛酸固体溶于无水乙醇溶液中，配制成1.0mM α-硫辛酸乙醇溶液10ml。充分搅拌混合成混合液，然后加入纳米金，常温混合反应24 h。
（2）配制Tris-HCl缓冲液，pH为8.0。用Tris-HCl缓冲液缓慢冲洗纳米金材料五遍，真空冷冻干燥机干燥30min后，得到表面修饰羧基化的纳米金。
（3）称量偶联剂 N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)，快速称量碳化二亚胺（EDC）于反应容器中，加入Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液，配制成最终浓度分别为20mM 的Sulfo-NHS溶液和130mM EDC溶液。
（4）将羧基化纳米金放入EDC和 Sulfo-NHS溶液中，常温混合反应12 h，使用Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液冲洗五遍。得以NHS为终端的纳米金复合物（NPG-NHS）。
（5）称量猪胰脂肪酶10mg，使用Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液配制10ml浓度为1mg/ml的猪胰脂肪酶溶液。将NPG-NHS与脂肪酶溶液4℃混合，静置，反应24 h。
（6）将得到的固定酶使用Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液洗涤，真空冷冻干燥机干燥40 min，干燥温度-20℃，真空度9帕斯卡，得到脂肪酶纳米金复合物（lipase-NPG），保存于4℃冰箱中。
实施例4：
以多孔纳米金为载体固定脂肪酶的制备方法，包括以下步骤：
1、制备多孔纳米金材料
（1）将金银原子比为48:52的金银合金材料剪成1cm×1cm的方片试样，称重为5mg。将试样放置于质量浓度为68%浓硝酸，室温下腐蚀24小时。超纯水清洗试样五遍，洗至中性，放入真空冷冻干燥机干燥试样。
（2）将上述试样放入退火炉，设置温度为400℃，温度上升到预设温度后开始计时1小时。关闭退火炉，自然冷却后得到多孔纳米金（NPG）材料。
2、纳米金材料共价连接脂肪酶
（1）将α-硫辛酸固体溶于无水乙醇溶液中，配制成1.0 mM α-硫辛酸乙醇溶液10ml。充分搅拌混合成混合液，然后加入纳米金，常温混合反应24 h。
（2）配制Tris-HCl缓冲液，pH为8.0。用Tris-HCl缓冲液缓慢冲洗纳米金材料五遍，真空冷冻干燥机干燥50 min后，得到表面修饰羧基化的纳米金。
（3）称量偶联剂 N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)，快速称量碳化二亚胺（EDC）于反应容器中，加入Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液，配制成最终浓度分别为15 mM 的Sulfo-NHS溶液和100 mM EDC溶液。
（4）将羧基化纳米金放入EDC和 Sulfo-NHS溶液中，常温混合反应6 h，使用Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液冲洗五遍。得以NHS为终端的纳米金复合物（NPG-NHS）。
（5）称量猪胰脂肪酶10mg，使用Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液配制10ml浓度为1mg/ml的猪胰脂肪酶溶液。将NPG-NHS与脂肪酶溶液4℃混合，静置，反应20 h。
（6）将得到的固定酶使用Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液洗涤，真空冷冻干燥机干燥40 min，干燥温度-20℃，真空度10帕斯卡，得到脂肪酶纳米金复合物（lipase-NPG），保存于4℃冰箱中。

Claims (10)

1.一种以多孔纳米金为载体固定脂肪酶的制备方法，其特征在于：采用去合金化法制备多孔纳米金材料，首先用α-硫辛酸修饰，形成羧基化的纳米金材料；再用偶联剂对其修饰，形成以N-羟基硫代琥珀酰亚胺为终端的纳米金复合物，将猪胰脂肪酶固定在纳米金复合物上形成固定化酶。
2.根据权利要求1所述的以多孔纳米金为载体固定脂肪酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）多孔纳米金材料的制备
将金银合金材料放置于68%-85%浓硝酸中腐蚀15-24小时，超纯水清洗试样，洗至中性，实用真空冷冻干燥机干燥；200-400℃退火2-3小时，得到多孔纳米金材料；
（2）α-硫辛酸修饰多孔纳米金材料表面
将α-硫辛酸固体溶于乙醇溶液，充分搅拌混合成混合液，然后加入步骤（1）制备的多孔纳米金材料，常温混合反应15-24 h；用缓冲液冲洗3-6遍，干燥得到表面修饰羧基化的纳米金材料；
（3）偶联剂修饰羧基化的纳米金材料
取步骤（2）中制备的羧基化的纳米金材料与碳化二亚胺和 N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液常温混合反应4-12 h，继续使用缓冲液冲洗，冷冻干燥后得到以N-羟基硫代琥珀酰亚胺为终端的纳米金复合物；
（4）纳米金载体共价固定脂肪酶
将步骤（3）中制得的纳米金复合物与脂肪酶溶液混合反应，将得到的固定酶洗涤，干燥，得到脂肪酶纳米金复合物。
3.根据权利要求2所述的以多孔纳米金为载体固定脂肪酶的制备方法，其特征在于：步骤（1）中金银合金原子质量比为48:52或50:50，浓硝酸浓度为68-85%，腐蚀时间为15-24 h，200-400℃退火2-3小时，多孔纳米金的孔径为25-100 nm。
4.根据权利要求2所述的以多孔纳米金为载体固定脂肪酶的制备方法，其特征在于：步骤（2）所使用混合液α-硫辛酸的浓度为0.8-1.3 mmol/L。
5.根据权利要求2所述的以多孔纳米金为载体固定脂肪酶的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所使用偶联剂 N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)的浓度为10-20 mmol/L，碳化二亚胺（EDC）的浓度为 N-羟基硫代琥珀酰亚胺的5-10倍。
6.根据权利要求2所述的以多孔纳米金为载体固定脂肪酶的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所使用酶液浓度为0.8-2.0 mg/ml；反应条件：0-8℃，静置反应时间18-24h。
7.根据权利要求2所述的以多孔纳米金为载体固定脂肪酶的制备方法，其特征在于：步骤（1）~（4）中的干燥使用真空冷冻干燥机干燥，干燥时间为20-40分钟；干燥温度-10℃～-50℃，真空1.5-20帕斯卡；
步骤（2）~（4）中所用缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH为7.2-8.5。
8.一种采用权利要求1~7所述的以多孔纳米金为载体固定脂肪酶的制备方法制备得到的脂肪酶纳米金复合物。
9.一种权利要求8所述的脂肪酶纳米金复合物在酶固定化中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：脂肪酶纳米金复合物反复使用了10次后，酶活仍保持在80%-93%。
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