CN105445475A - 一种三抗体双通道同时检测人核基质蛋白和癌胚抗原免疫传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种三抗体双通道同时检测人核基质蛋白和癌胚抗原免疫传感器的制备方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105445475A
CN105445475A CN201510793361.0A CN201510793361A CN105445475A CN 105445475 A CN105445475 A CN 105445475A CN 201510793361 A CN201510793361 A CN 201510793361A CN 105445475 A CN105445475 A CN 105445475A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
nuclear matrix
people
matrix protein
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201510793361.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105445475B (zh
Inventor
魏琴
任祥
王�琦
吴丹
庞雪辉
马洪敏
范大伟
孙旭
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Jinan
Original Assignee
University of Jinan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Jinan filed Critical University of Jinan
Priority to CN201510793361.0A priority Critical patent/CN105445475B/zh
Publication of CN105445475A publication Critical patent/CN105445475A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105445475B publication Critical patent/CN105445475B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/48—Systems using polarography, i.e. measuring changes in current under a slowly-varying voltage
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57473—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving carcinoembryonic antigen, i.e. CEA
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7023—(Hyper)proliferation
    • G01N2800/7028—Cancer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及一种三抗体双通道同时检测人核基质蛋白和癌胚抗原免疫传感器的制备方法及应用，属于新型传感器构建技术领域。基于抗原抗体之间良好的特异性，该传感器利用人免疫球蛋白免疫对的夹心结构来增大人核基质蛋白和癌胚抗原的检测范围，显著提高了传感器的灵敏度，降低了传感器的检出限，对膀胱癌的早期诊断具有重要的意义。

Description

一种三抗体双通道同时检测人核基质蛋白和癌胚抗原免疫传感器的制备方法及应用
技术领域
本发明设计了一种三抗体双通道策略电化学免疫传感器，采用金杂化硫化石墨烯Au-S-GS作为连接载体，利用人免疫球蛋白抗体为骨架支撑抗体，来连接人核基质蛋白抗体和癌胚抗原抗体，通过标记层抗体孵化物中甲苯胺蓝和中性红的不同氧化峰电位，实现对人核基质蛋白和癌胚抗原的同时检测，属于新型生物传感技术的发展和新型传感方法构建技术领域。
背景技术
癌症是一大类恶性肿瘤的统称。在正常人体内，肿瘤标志物的含量低于一定的浓度，肿瘤在发生发展过程中，肿瘤细胞异常表达或宿主细胞对肿瘤反应后产生的某些物质，这些肿瘤标志物的含量会急剧上升，可用于临床某些肿瘤的诊断和辅助诊断。但是有时候仅仅一种肿瘤标志物的检出，并不能说明人体内患病状况，而多种标志物的同时检测，则可以确定患者的患病状况。因此，在临床研究上，发展一种快速、简便、灵敏的同时检测多种肿瘤标志物的方法是十分重要的。
电化学免疫传感器具有灵敏度高、选择性好、操作简便、易于小型化、可连续、快速自动化检测分析等优点，由其是新型的电化学免疫传感器新技术的发展，突破了传统的传感器构建思路，取得良好的实验结果，对于将来的临床应用，具有很好的导向作用，因此本发明构建了一种新型的电化学免疫传感器，利用Au-S-GS交联人免疫球蛋白抗体、人核基质蛋白抗体和癌胚抗原抗体，同时利用NKF-5-3为孵化材料，中性红和甲苯胺蓝的不同氧化峰电位实现了对人核基质蛋白和癌胚抗原的同时检测。
目前已有的肿瘤标志物的临床检测方法很多，如光电化学分析、化学发光免疫分析、酶联免疫分析等。免疫传感器是将免疫学方法与分析化学方法相结合的一种生物传感器，通过抗原与抗体之间的特性性结合，使得它具有高灵敏性、高选择性、分析快速和操作简便等优点。同时，当前对于肿瘤在标志物的同时检测，需要进行多个工作电极的同时实施，而本发明将检测多种标志物集中于一个工作电极上，减少了检测成本，简化了检测步骤。
发明内容
本发明的目的之一是基于GOPANICS-HCl为基底材料，构建一种无酶快速超灵敏的电化学免疫传感器。
本发明的目的之二是首次构建了三抗体双通道电化学免疫传感器，实现了对人核基质蛋白和癌胚抗原的同时检测。
本发明的目的之三是利用Au-S-GS为载体，实现了人免疫球蛋白抗体、人核基质蛋白抗体和癌胚抗原抗体的同时固定，实现了三抗体双通道传感器的构建。
本发明的目的之四是利用NKF-5-3为载体，实现了对抗体和染料的同时孵化，利用中性红和甲苯胺蓝的不同氧化峰电位实现了对人核基质蛋白和癌胚抗原的同时检测，为膀胱癌的早期检测提供了有力保障。
本发明的技术方案如下：
1.一种三抗体双通道同时检测人核基质蛋白和癌胚抗原免疫传感器的制备方法
（1）用Al2O3抛光粉打磨直径为4mm的玻碳电极，超纯水清洗干净；将6μL、1.0~2.0mg/mL氧化石墨烯聚苯胺壳聚糖盐酸盐GOPANICS-HCl分散液滴加到电极表面，室温下晾干成膜；
（2）滴加6μL、质量分数为1%的金纳米溶胶，室温下晾干；
（3）依次滴加6μL、1μg/mL的人免疫球蛋白抗体Ab(I)标准溶液，3μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白BSA溶液，超纯水洗净，4℃冰箱中晾干；
（4）滴加6μL、1μg/mL的人免疫球蛋白抗原Ag(I)标准溶液，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；
（5）滴加6μL的三抗体孵化物Ab(C)Ab(N)Ab(I)Au-S-GS溶液，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；
（6）滴加6μL质量分数为1%的牛血清白蛋白BSA溶液，超纯水洗净，4℃冰箱中晾干；
（7）依次滴加6μL、1μg/mL的癌胚抗原CEA标准溶液，6μL、1μg/mL的人核基质蛋白抗原NMP22标准溶液；
（8）依次滴加6μL、0.5mg/mL的癌胚抗原抗体孵化物NKF-5-3AuTBAb(C)，6μL、0.5mg/mL的人核基质蛋白抗体孵化物NKF-5-3AuNRAb(N)。
2.氧化石墨烯聚苯胺壳聚糖盐酸盐GOPANICS-HCl，的制备
（1）氧化石墨烯聚苯胺GOPANI的制备
在磁力搅拌下，将2.0~3.0mg氧化石墨烯分散在1.0~2.3mL超纯水中，超声30min，继续加入200mg苯胺，超声3h，继续加入1mL、0.2~0.8g/mL的硫酸铵水溶液，4℃下保存24h，用甲醇和超纯水在8000r/min、10min下交替离心洗涤三次，40℃真空干燥，制得GOPANI；
（2）将1mgGOPANI分散于1mL超纯水中，再加入0.1~10mg壳聚糖盐酸盐，超声2h，制得GOPANICS-HCl。
3.三抗体孵化物Ab(C)Ab(N)Ab(I)Au-S-GS的制备
Ab(C)Ab(N)Ab(I)Au-S-GS溶液，其特征在于，制备步骤如下：
将0.1~0.8mg金杂化硫化石墨烯Au-S-GS分散于2mL超纯水中，得到Au-S-GS溶液，将20~30μL、10μg/mL人免疫球蛋白抗体Ab(I)标准溶液，50~100μL、10μg/mL癌胚抗原抗体Ab(C)标准溶液和50~100μL、10μg/mL人核基质蛋白抗体Ab(N)加入到Au-S-GS溶液中，在4℃震荡孵化器中孵化24h，加入10μL、1.0mg/mL的BSA，在4℃震荡孵化器中孵化24h，制得三抗体孵化物Ab(C)Ab(N)Ab(I)Au-S-GS溶液。
4.癌胚抗原抗体孵化物NKF-5-3AuTBAb(C)的制备
将0.5mg氨基化NKF-5-3分散于2~15mL质量分数为1%的金纳米溶胶中，震荡2h，在8000r/min离心5min分离得到NKF-5-3Au，并重新分散到1mL的超纯水中，依次加入10~300μL、10μg/mL癌胚抗原抗体Ab(C)和10~100μL、0.5mg/mL甲苯胺蓝TB溶液，在4℃震荡孵化器中孵化24h，制得癌胚抗原抗体孵化物NKF-5-3AuTBAb(C)。
5.人核基质蛋白抗体孵化物NKF-5-3AuNRAb(N)的制备
将0.5mg氨基化NKF-5-3分散于2~15mL质量分数为1%的金纳米溶胶中，震荡2h，在8000r/min离心5min分离得到NKF-5-3Au，并重新分散到1mL超纯水中，依次加入10~300μL、10μg/mL人核基质蛋白抗体Ab(N)和10~100μL、0.5mg/mL中性红NR溶液，在4℃震荡孵化器中孵化24h，制得人核基质蛋白抗体孵化物NKF-5-3AuNRAb(N)。
6.人核基质蛋白和癌胚抗原的同时检测
（1）使用电化学工作站进行测试，铂电极作为辅助电极，饱和甘汞电极作为参比电极，所制备的免疫传感器为工作电极，在10mL的0.067mol/L磷酸盐缓冲溶液PBS和0.1mmol/L硝酸钾溶液中进行测试；
（2）用方波伏安法对人核基质蛋白和癌胚抗原标准溶液进行检测，其电压测试范围为-0.8V~0.1V；
（3）当背景电流趋于稳定后，记录人核基质蛋白和癌胚抗原加入前后的传感器的峰电流值，绘制工作曲线。
本发明的有益成果
（1）GOPANICS-HCl的使用，增大了电极表面的比表面积，同时能够很好的促进电极表面的电子传递，并且Au的存在能够很好的进行抗体的连接，提高传感器的稳定性。
（2）Au-S-GS的使用，能够很好的连接人免疫球蛋白抗体、人核基质蛋白抗体和癌胚抗原抗体，实现三抗体的同时固定。
（3）基于Au-S-GS为交联材料，构建了一个三抗体双通道的电化学免疫传感器，该方法是首次构建的新型传感器构建方法，实现了对人核基质蛋白和癌胚抗原的同时检测。
（4）该传感器利用NKF-5-3为固定相，通过孵化两种不同的染料中性红和甲苯胺蓝实现对两种肿瘤标志物的同时检测。
（5）本发明两次利用抗原、抗体的免疫反应，提高了检测方法的特异性。
（6）本发明制备的电化学免疫传感器用于人核基质蛋白和癌胚抗原的同时检测，响应时间短，检测限低，线性范围宽，可以实现简单、快速、高灵敏和特异性检测，对人核基质蛋白和癌胚抗原的检出限分别达到12pg/mL和3.6pg/mL，可以实现对膀胱癌的早期预警。
具体实施方式
实施例1一种三抗体双通道同时检测人核基质蛋白和癌胚抗原免疫传感器的制备方法及应用
（1）用Al2O3抛光粉打磨直径为4mm的玻碳电极，超纯水清洗干净；将6μL、1.0mg/mL氧化石墨烯聚苯胺壳聚糖盐酸盐GOPANICS-HCl分散液滴加到电极表面，室温下晾干成膜；
（2）滴加6μL、质量分数为1%的金纳米溶胶，室温下晾干；
（3）依次滴加6μL、1μg/mL的人免疫球蛋白抗体Ab(I)标准溶液，3μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白BSA溶液，超纯水洗净，4℃冰箱中晾干；
（4）滴加6μL、1μg/mL的人免疫球蛋白抗原Ag(I)标准溶液，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；
（5）滴加6μL的三抗体孵化物Ab(C)Ab(N)Ab(I)Au-S-GS溶液，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；
（6）滴加6μL质量分数为1%的牛血清白蛋白BSA溶液，超纯水洗净，4℃冰箱中晾干；
（7）依次滴加6μL、1~10μg/mL的癌胚抗原CEA标准溶液，6μL、1~10μg/mL的人核基质蛋白抗原NMP22标准溶液；
（8）依次滴加6μL、0.5mg/mL的癌胚抗原抗体孵化物NKF-5-3AuTBAb(C)，6μL、0.5mg/mL的人核基质蛋白抗体孵化物NKF-5-3AuNRAb(N)。
实施例2一种三抗体双通道同时检测人核基质蛋白和癌胚抗原免疫传感器的制备方法及应用
（1）用Al2O3抛光粉打磨直径为4mm的玻碳电极，超纯水清洗干净；将6μL、1.5mg/mL氧化石墨烯聚苯胺壳聚糖盐酸盐GOPANICS-HCl分散液滴加到电极表面，室温下晾干成膜；
（2）滴加6μL、质量分数为2%的金纳米溶胶，室温下晾干；
（3）依次滴加6μL、3μg/mL的人免疫球蛋白抗体Ab(I)标准溶液，3μL、质量分数为3%的牛血清白蛋白BSA溶液，超纯水洗净，4℃冰箱中晾干；
（4）滴加6μL、3μg/mL的人免疫球蛋白抗原Ag(I)标准溶液，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；
（5）滴加6μL的三抗体孵化物Ab(C)Ab(N)Ab(I)Au-S-GS溶液，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；
（6）滴加6μL质量分数为2.5%的牛血清白蛋白BSA溶液，超纯水洗净，4℃冰箱中晾干；
（7）依次滴加6μL、1~10μg/mL的癌胚抗原CEA标准溶液，6μL、1~10μg/mL的人核基质蛋白抗原NMP22标准溶液；
（8）依次滴加6μL、1mg/mL的癌胚抗原抗体孵化物NKF-5-3AuTBAb(C)，6μL、1mg/mL的人核基质蛋白抗体孵化物NKF-5-3AuNRAb(N)。
实施例3一种三抗体双通道同时检测人核基质蛋白和癌胚抗原免疫传感器的制备方法及应用
（1）用Al2O3抛光粉打磨直径为4mm的玻碳电极，超纯水清洗干净；将6μL、2.0mg/mL氧化石墨烯聚苯胺壳聚糖盐酸盐GOPANICS-HCl分散液滴加到电极表面，室温下晾干成膜；
（2）滴加6μL、质量分数为5%的金纳米溶胶，室温下晾干；
（3）依次滴加6μL、5μg/mL的人免疫球蛋白抗体Ab(I)标准溶液，3μL、质量分数为5%的牛血清白蛋白BSA溶液，超纯水洗净，4℃冰箱中晾干；
（4）滴加6μL、5μg/mL的人免疫球蛋白抗原Ag(I)标准溶液，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；
（5）滴加6μL的三抗体孵化物Ab(C)Ab(N)Ab(I)Au-S-GS溶液，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；
（6）滴加6μL质量分数为5%的牛血清白蛋白BSA溶液，超纯水洗净，4℃冰箱中晾干；
（7）依次滴加6μL、1~10μg/mL的癌胚抗原CEA标准溶液，6μL、1~10μg/mL的人核基质蛋白抗原NMP22标准溶液；
（8）依次滴加6μL、2mg/mL的癌胚抗原抗体孵化物NKF-5-3AuTBAb(C)，6μL、2mg/mL的人核基质蛋白抗体孵化物NKF-5-3AuNRAb(N)。
实施例4氧化石墨烯聚苯胺壳聚糖盐酸盐GOPANICS-HCl的制备
（1）氧化石墨烯聚苯胺GOPANI的制备
在磁力搅拌下，将2.0mg氧化石墨烯分散在1.0mL超纯水中，超声30min，继续加入200mg苯胺，超声3h，继续加入1mL、0.2g/mL的硫酸铵水溶液，4℃下保存24h，用甲醇和超纯水在8000r/min、10min下交替离心洗涤三次，40℃真空干燥，制得GOPANI；
（2）将1mgGOPANI分散于1mL超纯水中，再加入0.1mg壳聚糖盐酸盐，超声2h，制得GOPANICS-HCl。
实施例5氧化石墨烯聚苯胺壳聚糖盐酸盐GOPANICS-HCl的制备
（1）氧化石墨烯聚苯胺GOPANI的制备
在磁力搅拌下，将2.5mg氧化石墨烯分散在1.3mL超纯水中，超声30min，继续加入200mg苯胺，超声3h，继续加入1mL、0.6g/mL的硫酸铵水溶液，4℃下保存24h，用甲醇和超纯水在8000r/min、10min下交替离心洗涤三次，40℃真空干燥，制得GOPANI；
（2）将1mgGOPANI分散于1mL超纯水中，再加入5mg壳聚糖盐酸盐，超声2h，制得GOPANICS-HCl。
实施例6氧化石墨烯聚苯胺壳聚糖盐酸盐GOPANICS-HCl的制备
（1）氧化石墨烯聚苯胺GOPANI的制备
在磁力搅拌下，将3.0mg氧化石墨烯分散在2.3mL超纯水中，超声30min，继续加入200mg苯胺，超声3h，继续加入1mL、0.8g/mL的硫酸铵水溶液，4℃下保存24h，用甲醇和超纯水在8000r/min、10min下交替离心洗涤三次，40℃真空干燥，制得GOPANI；
（2）将1mgGOPANI分散于1mL超纯水中，再加入10mg壳聚糖盐酸盐，超声2h，制得GOPANICS-HCl。
实施例7三抗体孵化物Ab(C)Ab(N)Ab(I)Au-S-GS的制备
将0.1mg金杂化硫化石墨烯Au-S-GS分散于2mL超纯水中，得到Au-S-GS溶液，将20μL、10μg/mL人免疫球蛋白抗体Ab(I)标准溶液，50μL、10μg/mL癌胚抗原抗体Ab(C)标准溶液和50μL、10μg/mL人核基质蛋白抗体Ab(N)加入到Au-S-GS溶液中，在4℃震荡孵化器中孵化24h，加入10μL、1.0mg/mL的BSA，在4℃震荡孵化器中孵化24h，制得三抗体孵化物Ab(C)Ab(N)Ab(I)Au-S-GS溶液。
实施例8三抗体孵化物Ab(C)Ab(N)Ab(I)Au-S-GS的制备
将0.6mg金杂化硫化石墨烯Au-S-GS分散于2mL超纯水中，得到Au-S-GS溶液，将25μL、10μg/mL人免疫球蛋白抗体Ab(I)标准溶液，80μL、10μg/mL癌胚抗原抗体Ab(C)标准溶液和80μL、10μg/mL人核基质蛋白抗体Ab(N)加入到Au-S-GS溶液中，在4℃震荡孵化器中孵化24h，加入10μL、1.0mg/mL的BSA，在4℃震荡孵化器中孵化24h，制得三抗体孵化物Ab(C)Ab(N)Ab(I)Au-S-GS溶液。
实施例9三抗体孵化物Ab(C)Ab(N)Ab(I)Au-S-GS的制备
将0.8mg金杂化硫化石墨烯Au-S-GS分散于2mL超纯水中，得到Au-S-GS溶液，将30μL、10μg/mL人免疫球蛋白抗体Ab(I)标准溶液，100μL、10μg/mL癌胚抗原抗体Ab(C)标准溶液和100μL、10μg/mL人核基质蛋白抗体Ab(N)加入到Au-S-GS溶液中，在4℃震荡孵化器孵化24h，加入10μL、1.0mg/mL的BSA，在4℃震荡孵化器中孵化24h，制得三抗体孵化物Ab(C)Ab(N)Ab(I)Au-S-GS溶液。
实施例10癌胚抗原抗体孵化物NKF-5-3AuTBAb(C)的制备
将0.5mg氨基化NKF-5-3分散于2mL质量分数为1%的金纳米溶胶中，震荡2h，在8000r/min离心5min分离得到NKF-5-3Au，并重新分散到1mL的超纯水中，依次加入10μL、10μg/mL癌胚抗原抗体Ab(C)和10μL、0.5mg/mL甲苯胺蓝TB溶液，在4℃震荡孵化器中孵化24h，制得癌胚抗原抗体孵化物NKF-5-3AuTBAb(C)。
实施例11癌胚抗原抗体孵化物NKF-5-3AuTBAb(C)的制备
将0.5mg氨基化NKF-5-3分散于8mL质量分数为1%的金纳米溶胶中，震荡2h，在8000r/min离心5min分离得到NKF-5-3Au，并重新分散到1mL的超纯水中，依次加入100μL、10μg/mL癌胚抗原抗体Ab(C)和80μL、0.5mg/mL甲苯胺蓝TB溶液，在4℃震荡孵化器中孵化24h，制得癌胚抗原抗体孵化物NKF-5-3AuTBAb(C)。
实施例12癌胚抗原抗体孵化物NKF-5-3AuTBAb(C)的制备
将0.5mg氨基化NKF-5-3分散于15mL质量分数为1%的金纳米溶胶中，震荡2h，在8000r/min离心5min分离得到NKF-5-3Au，并重新分散到1mL的超纯水中，依次加入300μL、10μg/mL癌胚抗原抗体Ab(C)和100μL、0.5mg/mL甲苯胺蓝TB溶液，在4℃震荡孵化器中孵化24h，制得癌胚抗原抗体孵化物NKF-5-3AuTBAb(C)。
实施例13人核基质蛋白抗体孵化物NKF-5-3AuNRAb(N)的制备
将0.5mg氨基化NKF-5-3分散于2mL质量分数为1%的金纳米溶胶中，震荡2h，在8000r/min离心5min分离得到NKF-5-3Au，并重新分散到1mL超纯水中，依次加入10μL、10μg/mL人核基质蛋白抗体Ab(N)和10μL、0.5mg/mL中性红NR溶液，在4℃震荡孵化器中孵化24h，制得人核基质蛋白抗体孵化物NKF-5-3AuNRAb(N)。
实施例14人核基质蛋白抗体孵化物NKF-5-3AuNRAb(N)的制备
将0.5mg氨基化NKF-5-3分散于7mL质量分数为1%的金纳米溶胶中，震荡2h，在8000r/min离心5min分离得到NKF-5-3Au，并重新分散到1mL超纯水中，依次加入100μL、10μg/mL人核基质蛋白抗体Ab(N)和500μL、0.5mg/mL中性红NR溶液，在4℃震荡孵化器中孵化24h，制得人核基质蛋白抗体孵化物NKF-5-3AuNRAb(N)。
实施例15人核基质蛋白抗体孵化物NKF-5-3AuNRAb(N)的制备
将0.5mg氨基化NKF-5-3分散于15mL质量分数为1%的金纳米溶胶中，震荡2h，在8000r/min离心5min分离得到NKF-5-3Au，并重新分散到1mL超纯水中，依次加入100μL、10μg/mL人核基质蛋白抗体Ab(N)和100μL、0.5mg/mL中性红NR溶液，在4℃震荡孵化器中孵化24h，制得人核基质蛋白抗体孵化物NKF-5-3AuNRAb(N)。
实施例16人核基质蛋白和癌胚抗原的同时检测
（1）使用电化学工作站进行测试，铂电极作为辅助电极，饱和甘汞电极作为参比电极，所制备的免疫传感器为工作电极，在10mL的0.067mol/L磷酸盐缓冲溶液PBS和0.1mmol/L硝酸钾溶液中进行测试；
（2）用方波伏安法对人核基质蛋白和癌胚抗原标准溶液进行检测，其电压测试范围为-0.8V~0.1V；
（3）当背景电流趋于稳定后，记录人核基质蛋白和癌胚抗原加入前后的传感器的峰电流值，绘制工作曲线。
实施例17人核基质蛋白和癌胚抗原的同时检测
（1）使用电化学工作站进行测试，铂电极作为辅助电极，饱和甘汞电极作为参比电极，所制备的免疫传感器为工作电极，在70mL的0.067mol/L磷酸盐缓冲溶液PBS和0.6mmol/L硝酸钾溶液中进行测试；
（2）用方波伏安法对人核基质蛋白和癌胚抗原标准溶液进行检测，其电压测试范围为-0.8V~0.1V；
（3）当背景电流趋于稳定后，记录人核基质蛋白和癌胚抗原加入前后的传感器的峰电流值，绘制工作曲线。
实施例18人核基质蛋白和癌胚抗原的同时检测
（1）使用电化学工作站进行测试，铂电极作为辅助电极，饱和甘汞电极作为参比电极，所制备的免疫传感器为工作电极，在100mL的0.067mol/L磷酸盐缓冲溶液PBS和1.0mmol/L硝酸钾溶液中进行测试；
（2）用方波伏安法对人核基质蛋白和癌胚抗原标准溶液进行检测，其电压测试范围为-0.8V~0.1V；
（3）当背景电流趋于稳定后，记录人核基质蛋白和癌胚抗原加入前后的传感器的峰电流值，绘制工作曲线。

Claims (6)

1.一种三抗体双通道同时检测人核基质蛋白和癌胚抗原免疫传感器的制备方法及应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）用Al2O3抛光粉打磨直径为4mm的玻碳电极，超纯水清洗干净；将6μL、1.0~2.0mg/mL氧化石墨烯聚苯胺壳聚糖盐酸盐GOPANICS-HCl分散液滴加到电极表面，室温下晾干成膜；
（2）滴加6μL、质量分数为1~5%的金纳米溶胶，室温下晾干；
（3）依次滴加6μL、1~5μg/mL的人免疫球蛋白抗体Ab(I)标准溶液，3μL、质量分数为1~5%的牛血清白蛋白BSA溶液，超纯水洗净，4℃冰箱中晾干；
（4）滴加6μL、1~5μg/mL的人免疫球蛋白抗原Ag(I)标准溶液，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；
（5）滴加6μL的三抗体孵化物Ab(C)Ab(N)Ab(I)Au-S-GS溶液，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；
（6）滴加6μL质量分数为1~5%的牛血清白蛋白BSA溶液，超纯水洗净，4℃冰箱中晾干；
（7）依次滴加6μL、1~10μg/mL的癌胚抗原CEA标准溶液，6μL、1~10μg/mL的人核基质蛋白抗原NMP22标准溶液；
（8）依次滴加6μL、0.5~2mg/mL的癌胚抗原抗体孵化物NKF-5-3AuTBAb(C)，6μL、0.5~2mg/mL的人核基质蛋白抗体孵化物NKF-5-3AuNRAb(N)。
2.如权利要求1所述的一种三抗体双通道同时检测人核基质蛋白和癌胚抗原免疫传感器的制备方法及应用，所述的氧化石墨烯聚苯胺壳聚糖盐酸盐GOPANICS-HCl，其特征在于，制备步骤如下：
（1）氧化石墨烯聚苯胺GOPANI的制备
在磁力搅拌下，将2.0~3.0mg氧化石墨烯分散在1.0~2.3mL超纯水中，超声30min，继续加入200mg苯胺，超声3h，继续加入1mL、0.2~0.8g/mL的硫酸铵水溶液，4℃下保存24h，用甲醇和超纯水在8000r/min、10min下交替离心洗涤三次，40℃真空干燥，制得GOPANI；
（2）将1mgGOPANI分散于1mL超纯水中，再加入0.1~10mg壳聚糖盐酸盐，超声2h，制得GOPANICS-HCl。
3.如权利要求1所述的一种三抗体双通道同时检测人核基质蛋白和癌胚抗原免疫传感器的制备方法及应用，所述的三抗体孵化物Ab(C)Ab(N)Ab(I)Au-S-GS溶液，其特征在于，制备步骤如下：
将0.1~0.8mg金杂化硫化石墨烯Au-S-GS分散于2mL超纯水中，得到Au-S-GS溶液，将20~30μL、10μg/mL人免疫球蛋白抗体Ab(I)标准溶液，50~100μL、10μg/mL癌胚抗原抗体Ab(C)标准溶液和50~100μL、10μg/mL人核基质蛋白抗体Ab(N)加入到Au-S-GS溶液中，在4℃震荡孵化器中孵化24h，加入10μL、1.0mg/mL的BSA，在4℃震荡孵化器中孵化24h，制得三抗体孵化物Ab(C)Ab(N)Ab(I)Au-S-GS溶液。
4.如权利要求1所述的一种三抗体双通道同时检测人核基质蛋白和癌胚抗原免疫传感器的制备方法及应用，所述的癌胚抗原抗体孵化物NKF-5-3AuTBAb(C)，其特征在于，制备步骤如下：
将0.5mg氨基化NKF-5-3分散于2~15mL质量分数为1%的金纳米溶胶中，震荡2h，在8000r/min离心5min分离得到NKF-5-3Au，并重新分散到1mL的超纯水中，依次加入10~300μL、10μg/mL癌胚抗原抗体Ab(C)和10~100μL、0.5mg/mL甲苯胺蓝TB溶液，在4℃震荡孵化器中孵化24h，制得癌胚抗原抗体孵化物NKF-5-3AuTBAb(C)。
5.如权利要求1所述的一种三抗体双通道同时检测人核基质蛋白和癌胚抗原免疫传感器的制备方法及应用，所述的人核基质蛋白抗体孵化物NKF-5-3AuNRAb(N)，其特征在于，制备步骤如下：
将0.5mg氨基化NKF-5-3分散于2~15mL质量分数为1%的金纳米溶胶中，震荡2h，在8000r/min离心5min分离得到NKF-5-3Au，并重新分散到1mL超纯水中，依次加入10~300μL、10μg/mL人核基质蛋白抗体Ab(N)和10~100μL、0.5mg/mL中性红NR溶液，在4℃震荡孵化器中孵化24h，制得人核基质蛋白抗体孵化物NKF-5-3AuNRAb(N)。
6.如权利要求1所述的一种三抗体双通道同时检测人核基质蛋白和癌胚抗原免疫传感器，用于人核基质蛋白和癌胚抗原的同时检测，其特征在于：
（1）使用电化学工作站进行测试，铂电极作为辅助电极，饱和甘汞电极作为参比电极，所制备的免疫传感器为工作电极，在10~100mL的0.067mol/L磷酸盐缓冲溶液PBS和0.1~1.0mmol/L硝酸钾溶液中进行测试；
（2）用方波伏安法对人核基质蛋白和癌胚抗原标准溶液进行检测，其电压测试范围为-0.8V~0.1V；
（3）当背景电流趋于稳定后，记录人核基质蛋白和癌胚抗原加入前后的传感器的峰电流值，绘制工作曲线。
CN201510793361.0A 2015-11-18 2015-11-18 一种三抗体双通道同时检测人核基质蛋白和癌胚抗原免疫传感器的制备方法及应用 Active CN105445475B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510793361.0A CN105445475B (zh) 2015-11-18 2015-11-18 一种三抗体双通道同时检测人核基质蛋白和癌胚抗原免疫传感器的制备方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510793361.0A CN105445475B (zh) 2015-11-18 2015-11-18 一种三抗体双通道同时检测人核基质蛋白和癌胚抗原免疫传感器的制备方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105445475A true CN105445475A (zh) 2016-03-30
CN105445475B CN105445475B (zh) 2017-04-19

Family

ID=55555911

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510793361.0A Active CN105445475B (zh) 2015-11-18 2015-11-18 一种三抗体双通道同时检测人核基质蛋白和癌胚抗原免疫传感器的制备方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105445475B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107328930A (zh) * 2017-05-09 2017-11-07 济南大学 一种基于双信号响应比率型丝网印刷电极免疫传感器的制备及应用
CN112378974A (zh) * 2020-10-30 2021-02-19 哈尔滨烯芯科技有限公司 一种基于蛋白质特异性的石墨烯薄膜传感器及其制备方法
CN113759115A (zh) * 2021-06-30 2021-12-07 杭州卓亨生物科技有限公司 用于膀胱癌检测的标志物及检测试剂盒

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102148267A (zh) * 2010-12-31 2011-08-10 南昌大学 一种氧化钨半导体电池及其制备方法
CN103198932A (zh) * 2013-02-27 2013-07-10 国家纳米科学中心 一种碳基复合纤维电极材料、制备方法及其用途
CN104297478A (zh) * 2014-09-09 2015-01-21 济南大学 一种基于酸中心复合物的免疫传感器的制备方法及应用
CN104880459A (zh) * 2015-05-15 2015-09-02 哈尔滨飞机工业集团有限责任公司 一种飞机铝合金蒙皮表面划伤检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102148267A (zh) * 2010-12-31 2011-08-10 南昌大学 一种氧化钨半导体电池及其制备方法
CN103198932A (zh) * 2013-02-27 2013-07-10 国家纳米科学中心 一种碳基复合纤维电极材料、制备方法及其用途
CN104297478A (zh) * 2014-09-09 2015-01-21 济南大学 一种基于酸中心复合物的免疫传感器的制备方法及应用
CN104880459A (zh) * 2015-05-15 2015-09-02 哈尔滨飞机工业集团有限责任公司 一种飞机铝合金蒙皮表面划伤检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XIANG REN,ET AL.: "An ultrasensitive squamous cell carcinoma antigen biosensing plat- form utilizing double- antibody single- channel amplification strategy", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》 *
余晟，等。: "石墨烯修饰离子液体电极制备癌胚抗原免疫传感器", 《信阳师范学院学报：自然科学版》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107328930A (zh) * 2017-05-09 2017-11-07 济南大学 一种基于双信号响应比率型丝网印刷电极免疫传感器的制备及应用
CN112378974A (zh) * 2020-10-30 2021-02-19 哈尔滨烯芯科技有限公司 一种基于蛋白质特异性的石墨烯薄膜传感器及其制备方法
CN113759115A (zh) * 2021-06-30 2021-12-07 杭州卓亨生物科技有限公司 用于膀胱癌检测的标志物及检测试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
CN105445475B (zh) 2017-04-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103116023B (zh) 用于检测肿瘤标志物的电化学发光免疫传感器及其制备方法和应用
CN102967706B (zh) 检测肿瘤标志物流动注射化学发光免疫传感器的制备及应用
CN104880456B (zh) 一种基于GO/MWCNTs-COOH/Au@CeO2构建的电化学发光免疫传感器的制备方法及应用
CN104569427B (zh) 一种基于二氧化锰负载银纳米粒子多壁碳纳米管构建的免疫传感器的制备方法及应用
CN104391117B (zh) 一种基于PPy-NH2GO-Ag2Se@CdSe的胃癌抗原电致化学发光传感器的制备方法及应用
CN105675697A (zh) 一种基于纳米探针c60的癌胚抗原的电化学免疫传感器的构建方法
CN105158479A (zh) 一种基于AuNPs-PDDA-GR复合材料的癌胚抗原电化学免疫传感器的制备方法及应用
Ren et al. An ultrasensitive squamous cell carcinoma antigen biosensing platform utilizing double-antibody single-channel amplification strategy
CN105115961A (zh) 一种纳米复合材料的电化学发光传感器的制备方法
CN105445475A (zh) 一种三抗体双通道同时检测人核基质蛋白和癌胚抗原免疫传感器的制备方法及应用
CN106066324A (zh) 一种电致化学发光生物传感器标记物的制备方法及应用
Yang et al. Bead‐Based Extracellular Vesicle Analysis Using Flow Cytometry
CN109115855A (zh) 一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学免疫传感器的制备方法及应用
CN104297478B (zh) 一种基于酸中心复合物的免疫传感器的制备方法及应用
CN102226807A (zh) 基于Au-PB-SiO2复合纳米颗粒的电化学免疫检测方法
CN102998449B (zh) 基于氨基化钠基蒙脱石的肿瘤标志物传感器的制备及应用
CN109613244A (zh) 一种Ag@Pt-CuS标记的免疫传感器的制备方法及应用
CN104849458B (zh) 一种基于KNbO3-Au NPs@Bi2S3构建的电化学发光免疫传感器的制备方法及应用
CN104133059B (zh) 一种合金负载分子筛电化学免疫传感器的制备方法及应用
CN105158469B (zh) 一种基于生物素化氨基化Fe3O4与链霉亲和素的免疫传感器的制备方法及应用
CN104198563B (zh) 铅离子负载金磁性多壁碳纳米管传感器的制备方法及应用
CN104407152B (zh) 一种双抗体单通道乙脑抗原免疫传感器的制备方法及应用
CN103207218B (zh) 电化学免疫传感器制备方法及其用于猪链球菌的检测方法
JP6669731B2 (ja) がん患者由来のヒト血清のエクソソーム画分からのアスパルチル（アスパラギニル）ベータヒドロキシラーゼ（ｈａａｈ）の回収
CN107271519A (zh) 一种基于负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管的免疫传感器的制备方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant