CN113092751A - 检测甲状腺球蛋白的免疫胶体金试纸条及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了检测甲状腺球蛋白的免疫胶体金试纸条在制备术中现场快速检测可疑淋巴结的甲状腺球蛋白值的工具中的应用，涉及免疫测定法技术领域。本发明所述应用中，免疫胶体金试纸条包括依次部分叠接在PVC底板上的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，所述金标垫包被有胶体金标记的一种抗甲状腺球蛋白抗体，所述硝酸纤维素膜上设有分隔的检测线和质控线，检测线包被另一种抗甲状腺球蛋白抗体，质控线上包被羊抗鼠IgG。本发明还提供了所述免疫胶体金试纸条在制备辅助诊断甲状腺乳头状癌的淋巴结转移的工具中的应用，和在制备检测淋巴结细针穿刺抽吸洗脱液中甲状腺球蛋白值的工具中的应用。

Description

检测甲状腺球蛋白的免疫胶体金试纸条及其制备方法
本申请为申请日为2017.04.28、申请号为201710290582.5、申请名称为“检测甲状腺球蛋白的免疫胶体金试纸条及其制备方法”的发明专利申请的分案申请，申请人为天津医科大学总医院。
技术领域
本发明涉及免疫测定法，具体是一种检测甲状腺球蛋白的免疫胶体金试纸条及其制备方法。
背景技术
甲状腺球蛋白(Thyroglobulin，Tg)是甲状腺滤泡上皮分泌的一种分子量约660000的糖蛋白，是合成甲状腺激素的基本原料之一。血Tg水平测定及淋巴结细针穿刺抽吸洗脱液Tg水平(FNA-Tg)在分化型甲状腺癌特别是甲状腺乳头状癌的诊治、随访中应用广泛。术前血Tg水平升高提示术后的血Tg水平可作为较为敏感的肿瘤检测指标。另外，无论是促甲状腺激素抑制还是非促甲状腺激素抑制状态下的术后血清Tg水平，都有助于术后甲状腺乳头状癌的持续状态、甲状腺组织的残留情况的评估，并有助于预测复发可能。血Tg水平还可能是碘缺乏的一个指标。术前及术后随访的淋巴结细针穿刺抽吸洗脱液测Tg水平(FNA-Tg)可辅助用于可疑颈部淋巴结甲状腺乳头状癌转移的诊断，具有较高的灵敏度及特异度。
数十年来，甲状腺癌的发病率全世界范围内逐年升高，其中属分化型甲状腺癌的甲状腺乳头状癌约占总数的70-90％。且近年来甲状腺微小乳头状癌发病率明显升高。而关于甲状腺癌手术患者是否须同时行部分淋巴结清扫的争议也日益凸显。目前治疗性颈淋巴结清扫而非预防性颈淋巴结清扫被强调。但目前术前影像学检查对最容易且最常见转移的区域淋巴结(约为30％-80％)，特别是颈部中央区淋巴结，诊断能力有限(文献报道约占20％-30％)。因此，能否术中诊断淋巴结转移对于避免过度治疗或治疗不足十分重要。术中冰冻常用于术中可疑转移淋巴结的诊断，需取下可疑转移淋巴结送检，但仍有漏诊存在。如能术中快速检测可疑转移淋巴结甲状腺球蛋白辅助颈部淋巴结转移的诊断，则可一定程度上解决上述问题。
目前临床上常用的检测Tg的方法有放射免疫分析法、化学发光免疫分析法与电化学发光免疫分析法。以上方法中放射免疫分析法检测精确度低，检测时间长、有放射性污染、批内变异系数大、不能实现自动化；化学发光免疫分析法及电化学发光免疫分析法检测时间较短、灵敏度高、稳定性好，但设备及配套的试剂费用相对昂贵。由于设备或费用或技术缺陷的原因，上述检测方法不适合现场检测。
发明内容
有鉴于此，本发明为了解决现有的Tg检测方法不适合现场快速检测的问题，所提出的一种检测甲状腺球蛋白的免疫胶体金试纸条及其制备方法。胶体金免疫层析技术是以免疫层析为基础建立的免疫标记技术，其特点是以胶体金为显色标记物与抗原、抗体特异性反应相结合。该检测方法结果判读简单，检测时间短，特异性强，便携、经济实用，适合现场检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种检测甲状腺球蛋白的免疫胶体金试纸条，包括依次部分叠接在PVC底板上的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，所述金标垫包被有胶体金标记的一种抗甲状腺球蛋白抗体，所述硝酸纤维素膜上设有分隔的检测线和质控线，检测线包被另一种抗甲状腺球蛋白抗体，质控线上包被羊抗鼠IgG。
本发明还提供了一种上述检测甲状腺球蛋白的免疫胶体金试纸条的制备方法，包括以下步骤：
Ⅰ.胶体金的制备：向沸腾的超纯水中加入1％氯金酸溶液，再加入1％柠檬酸三钠溶液，加热至溶液呈酒红色透亮，冷却，定容，即为胶体金溶液；
Ⅱ.胶体金标记甲状腺球蛋白抗体的制备及纯化：取步骤Ⅰ中制得的胶体金溶液，以0.1M K2CO3溶液调节pH值至9，加入抗甲状腺球蛋白抗体，静置后加入2％BSA溶液，静置，制得金标抗体溶液；
所述金标抗体溶液在3-5℃、1000-1500rpm、10-20min条件下离心，去沉淀；再在3-5℃、10000-12000rpm、30-40min的条件下离心，去上清；以pH910mM Tris液复溶，加入0.5％PEG20000；5-10min后在3-5℃、10000-12000rpm、30-40min条件下再次离心，去上清；以胶体金复溶液复溶；
Ⅲ.金标垫与样品垫预处理：金标垫以金标垫处理液浸泡，室温干燥；样品垫以样品垫处理液浸泡，室温干燥；
Ⅳ.试纸条的组装：
将包被有另一种抗甲状腺球蛋白抗体和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜和吸水垫次第粘贴在PVC底板上，二者部分重合，吸水垫在上；
将步骤Ⅱ中制得的金标抗体溶液涂布于步骤Ⅲ中预处理过的金标垫，室温干燥；将金标垫粘贴在PVC底板上，与硝酸纤维素膜的未重叠侧部分重叠，金标垫在上；
将步骤Ⅲ中预处理过的样品垫粘贴在PVC底板上，与金标垫的未重叠侧部分重叠，样品垫在上。
所述胶体金复溶液及金标垫预处理液为5％蔗糖、1％BSA、0.1％Tween 20、0.01％NaN3的PBS液，pH 8.5；所述样品垫预处理液为0.1％Tween20、pH8.5 Tris-HCl液；所述T线划线稀释液、C线划线稀释液为0.01M pH 7.2PBS液。
所述硝酸纤维素膜上抗甲状腺球蛋白抗体浓度均为2-3mg/ml，羊抗鼠IgG抗体浓度均为3-5mg/ml。
将步骤Ⅳ制得的试纸板切成宽约3-4mm的试纸条。
本发明获得了如下的有益效果。
本发明试纸条可术中现场快速检测可疑淋巴结的甲状腺球蛋白(Tg)值，辅助诊断甲状腺乳头状癌的淋巴结转移；本发明试纸条还可用于术前、术后随访的淋巴结细针穿刺抽吸洗脱液测Tg值(FNA-Tg)，辅助可疑颈部淋巴结甲状腺乳头状癌转移的明确诊断。本发明试纸条制备方法简单、使用简便、检测速度快、特异性强、可定性和半定量检测甲状腺球蛋白，充分满足了临床的需要，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明免疫胶体金试纸条结构示意图；
图2是本发明Tg冻干粉不同浓度稀释液的试纸条检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明进行进一步说明。
1.主要材料：
Human thyroglobulin full length protein(Tg冻干粉ab96518)、Anti-Thyroglobulin antibody(5F9)(抗甲状腺球蛋白抗体，ab1984)、Anti-Thyroglobulinantibody(5E6)(抗甲状腺球蛋白抗体，ab1982)：abcam公司；
羊抗鼠IgG、胶体金试纸条实验耗材包：上海金标生物科技有限公司；
BSA：北京索莱宝生物科技有限公司；
柠檬酸钠、氯金酸：天津赢达稀贵化学试剂厂；
临床样本：共3份，血清样本2个(Tg值1541ng/ml、20ng/ml)、颈部淋巴结穿刺洗脱液样本1个(稀释1000倍时Tg值46ng/ml)。
2.制备方法：
(1)胶体金的制备：于烧瓶中加入超纯水99ml，加热至沸腾状态后，沸腾时的实际温度为100℃，向烧杯中快速加入1ml 1％氯金酸溶液，1分钟后快速加入0.8ml 1％柠檬酸三钠溶液，烧杯中的溶液变为红色后再加热10分钟，直至溶液透亮，冷却至室温后定容，即制得胶体金溶液(胶体金直径30-40mm)，于4℃密封避光保存。
(2)胶体金标记甲状腺球蛋白抗体的制备及纯化
取上述所制备的胶体金溶液1ml于离心管，以0.1M K2CO3溶液调节pH值至9(以精密pH试纸测定)，加入5μg抗甲状腺球蛋白抗体(ab1982)，混匀后静置30分钟。后加入500μl2％BSA溶液，静置30min，制得金标抗体溶液。
最佳的抗甲状腺球蛋白抗体量的确定：取4管1ml的胶体金溶液，加入2.5μg、5μg、7.5μg、10μg甲状腺球蛋白抗体，其他条件相同的情况下分别制成试纸条，并在同条件下检测：加入5μg、7.5μg、10μg甲状腺球蛋白抗体者试纸条显色无明显差异，加入2.5μg甲状腺球蛋白抗体者试纸条显色较其他三组颜色浅。综合考虑，5μg的抗甲状腺球蛋白抗体量最佳。
最佳金标抗体液pH的确定：取4管1ml的胶体金溶液，加入0.1M K2CO3分别至pH为8、8.5、9、9.5，其他条件相同的情况下分别制成试纸条，并在同条件下检测：pH为8.5及9者试纸条显色较其他两组颜色深。综合考虑，最佳金标抗体液pH为8.5-9。
上述制得的金标抗体溶液在4℃、1500rpm、10min条件下离心，去沉淀；后再在4℃、12000rpm、30min的条件下离心，留沉淀、去上清；以10mM Tris液、pH9复溶至1ml，加入0.5％PEG20000100μl；于5-10min后在4℃、12000rpm、30min条件下再次离心，留沉淀、去上清；以胶体金复溶液复溶至100μl，4℃保存备用。
(3)金标垫与样品垫预处理
金标垫以金标垫处理液浸泡30min后取出，室温干燥至少8小时，后保持干燥备用。
样品垫以样品垫处理液浸泡30min后取出，室温干燥至少8小时，后保持干燥备用。
(4)试纸条的组装
将硝酸纤维素膜和吸水垫次第粘贴在PVC底板上，二者间2mm重合、吸水垫在上。
以上述制得的金标抗体溶液均匀涂布于上述预处理过的金标垫，室温干燥至少8小时后，保持干燥，备用。
将金标垫粘贴在PVC底板上，与硝酸纤维素膜的未重叠侧重叠约2mm、金标垫在上。
将上述预处理过的样品垫粘贴在PVC底板上，与金标垫的未重叠侧重叠约2mm、样品垫在上。
在金标垫与吸水垫之间的硝酸纤维素膜上依次包被抗甲状腺球蛋白抗体(ab1984)(检测线，即T线，靠近样品垫)和羊抗鼠IgG(控制线，即C线，靠近吸水垫)。抗甲状腺球蛋白抗体(ab1984)以T线稀释液稀释，羊抗鼠IgG以C线稀释液稀释。在硝酸纤维素膜上进行点样：每个试纸条T线、C线划线量约0.5μl。T线抗体浓度均为2mg/ml，C线抗体浓度均为4mg/ml。C线、T线间距3.5-5mm。室温干燥至少8小时。
将上述制得的试纸板切成宽约4mm的试纸条若干。
(5)制成的试纸条构造及示意图：
检测甲状腺球蛋白(Tg)的免疫胶体金试纸条包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫及PVC底板，样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜及吸水垫从右至左依次部分叠接在PVC底板上。金标垫包被有胶体金标记的抗甲状腺球蛋白抗体(ab1982)，硝酸纤维素膜上设有分隔的检测线和质控线，检测线包被抗甲状腺球蛋白抗体(ab1984)，质控线上包被羊抗鼠IgG。(见图1)
制备方法中胶体金复溶液及金标垫预处理液为5％蔗糖、1％BSA、0.1％Tween 20、0.01％NaN3的PBS液，pH 8.5。样品垫预处理液为0.1％Tween20、pH8.5 Tris-HCl液。T线划线稀释液、C线划线稀释液为0.01M pH 7.2PBS液。
3.试纸条的检测性能
3.1灵敏度
用0.01M pH7.2的PBS液将Tg冻干粉稀释成不同浓度的样品溶液：100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0(PBS)，并用试纸条检测，10-15分钟观察结果(结果见表1及图2)。
表1 Tg冻干粉不同浓度稀释液的试纸条检测结果
浓度μg/ml 100 10 1 0(PBS)
结果 + + - -
3.2特异度
取0.01M pH7.2的PBS液、血清Tg、生理盐水、淋巴结穿刺洗脱液FNA-Tg做特异性检测，结果见表2。
表2试纸条特异度的检测结果
Figure BDA0003008023460000061
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.检测甲状腺球蛋白的免疫胶体金试纸条在制备术中现场快速检测可疑淋巴结的甲状腺球蛋白值的工具中的应用，其特征在于，所述检测甲状腺球蛋白的免疫胶体金试纸条，包括依次部分叠接在PVC底板上的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，其特征在于：所述金标垫包被有胶体金标记的一种抗甲状腺球蛋白抗体，所述硝酸纤维素膜上设有分隔的检测线和质控线，检测线包被另一种抗甲状腺球蛋白抗体，质控线上包被羊抗鼠IgG。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述检测甲状腺球蛋白的免疫胶体金试纸条的制备方法，包括以下步骤：
Ⅰ.胶体金的制备：向沸腾的超纯水中加入1％氯金酸溶液，再加入1％柠檬酸三钠溶液，加热至溶液呈酒红色透亮，冷却，定容，即为胶体金溶液；
Ⅱ.胶体金标记甲状腺球蛋白抗体的制备及纯化：取步骤Ⅰ中制得的胶体金溶液，以0.1M K2CO3溶液调节pH值至8.5-9，加入抗甲状腺球蛋白抗体，静置后加入2％BSA溶液，静置，制得金标抗体溶液；
所述金标抗体溶液在3-5℃、1000-1500rpm、10-20min条件下离心，去沉淀；再在3-5℃、10000-12000rpm、30-40min的条件下离心，去上清；以pH910mM Tris液复溶，加入0.5％PEG20000；5-10min后在3-5℃、10000-12000rpm、30-40min条件下再次离心，去上清；以胶体金复溶液复溶；
Ⅲ.金标垫与样品垫预处理：金标垫以金标垫处理液浸泡，室温干燥；样品垫以样品垫处理液浸泡，室温干燥；
Ⅳ.试纸条的组装：
将包被有另一种抗甲状腺球蛋白抗体和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜和吸水垫次第粘贴在PVC底板上，二者部分重合，吸水垫在上；
将步骤Ⅱ中制得的金标抗体溶液涂布于步骤Ⅲ中预处理过的金标垫，室温干燥；将金标垫粘贴在PVC底板上，与硝酸纤维素膜的未重叠侧部分重叠，金标垫在上；
将步骤Ⅲ中预处理过的样品垫粘贴在PVC底板上，与金标垫的未重叠侧部分重叠，样品垫在上。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于：所述胶体金复溶液及金标垫预处理液为5％蔗糖、1％BSA、0.1％Tween20、0.01％NaN3的PBS液，pH8.5；所述样品垫预处理液为0.1％Tween20、pH 8.5Tris-HCl液；所述T线划线稀释液、C线划线稀释液为0.01M pH 7.2PBS液。
4.根据权利要求2所述应用，其特征在于：所述硝酸纤维素膜上抗甲状腺球蛋白抗体浓度均为2-3mg/ml，羊抗鼠IgG抗体浓度均为3-5mg/ml。
5.根据权利要求2所述应用，其特征在于：将步骤Ⅳ制得的试纸板切成宽约3-4mm的试纸条。
6.根据权利要求2所述应用，其特征在于：步骤Ⅱ中抗甲状腺球蛋白抗体加入量为5μg。
7.根据权利要求2所述应用，其特征在于：步骤Ⅱ中0.1M K2CO3溶液调节pH值至9。
8.检测甲状腺球蛋白的免疫胶体金试纸条在制备辅助诊断甲状腺乳头状癌的淋巴结转移的工具中的应用，其特征在于，所述检测甲状腺球蛋白的免疫胶体金试纸条，包括依次部分叠接在PVC底板上的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，其特征在于：所述金标垫包被有胶体金标记的一种抗甲状腺球蛋白抗体，所述硝酸纤维素膜上设有分隔的检测线和质控线，检测线包被另一种抗甲状腺球蛋白抗体，质控线上包被羊抗鼠IgG。
9.检测甲状腺球蛋白的免疫胶体金试纸条在制备检测淋巴结细针穿刺抽吸洗脱液中甲状腺球蛋白值的工具中的应用，其特征在于，所述检测甲状腺球蛋白的免疫胶体金试纸条，包括依次部分叠接在PVC底板上的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，其特征在于：所述金标垫包被有胶体金标记的一种抗甲状腺球蛋白抗体，所述硝酸纤维素膜上设有分隔的检测线和质控线，检测线包被另一种抗甲状腺球蛋白抗体，质控线上包被羊抗鼠IgG。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述检测的时期包括术前和术后。
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