CN101377512A - 一种检测甲状腺球蛋白的化学发光免疫分析测定试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明的试剂盒应用酶催化发光底物,通过检测发光底物产生的光信号代替酶联免疫分析中的显色底物的吸光度,具有与之同等的特异性,而检测光信号的灵敏度要高于检测显色底物的吸光度,可为甲状腺球蛋白的诊断提供更为特异、快速、可靠的依据。本发明提供了一种能够简便、快速、灵敏、稳定地检测甲状腺球蛋白的试剂盒及其制备方法。
Description
技术领域
本发明属于医学免疫检测分析技术领域,具体地提供了一种人甲状腺球蛋白酶促化学发光免疫测定试剂盒,适用于甲状腺球蛋白的酶促化学发光检测分析。
背景技术
甲状腺球蛋白(Tg)是一分子量约为660kD的糖蛋白,在甲状腺主要激素如甲状腺素、三碘甲腺原氨酸的合成中起激素原的作用。在甲状腺瘤、亚急性甲状腺炎、桥本甲状腺炎和葛瑞夫氏病中,Tg的数目会增多;测量Tg的浓度水平有助于婴儿天生甲状腺机能减退症状的治疗。
目前测定Tg的方法有直接竞争固相放射免疫分析(RIA)和双抗体夹心免疫放射分析法(IMRA)或酶联免疫分析法(ELISA),这些方法都会受到机体本身的甲状腺球蛋白自身抗体的干扰,而且放射免疫分析方法存在对操作人员有放射性危害、废弃物处理、产品保质期短、操作时间长等问题;酶联免疫分析法存在灵敏度较低,操作步骤繁琐,操作时间周期长,易造成结果假阳性或假阴性等问题。从而需要人们寻找一种更为安全、灵敏和可靠的免疫检测分析方法,而最近几年使用化学发光为检测技术的测定试剂盒开始初露端倪。
化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay,CLIA)于1977年问世,是把高灵敏的化学发光分析方法和特异性强的免疫分析方法相结合发展起来的一项具有化学发光分析的高灵敏度和免疫分析法的高选择性的新的免疫分析技术。1985年第一代化学发光免疫分析试剂盒研制成功并投放市场。进入九十年代,化学发光免疫分析试剂盒的研制和自动化测量仪的生产取得了突破性进展,从而进入高速发展阶段。化学发光免疫分析是继荧光、放射性同位素和酶免疫分析之后发展起来的一项新的免疫分析技术,根据大量的实验结果及临床应用资料,从实用性、稳定性、准确性及发展前景来看,在非放射性标记分析技术中化学发光免疫分析处于领先地位,代表了当今世界发展的方向和潮流,它不仅具有免疫反应的特异性,而且具有化学发光反应的高灵敏性(检测限可达10-15-10-18mol/L)。化学发光免疫分析技术具有灵敏度高、快速、准确、重复性好、效期长并安全无毒无污染等优点,成为取代放射免疫分析和酶免疫分析技术的首选。
本发明用高活性的酶标记抗体,以1,2-二氧乙烷类衍生物或鲁米诺、异鲁米诺及增强剂为发光底物,检测化学发光信号,其灵敏度远远高于酶联免疫方法中检测显色底物的吸光度的灵敏度。本发明既有效地利用了高特异的免疫方应,又使用了化学发光技术确保了检测的灵敏度,使用本试剂盒可以快速灵敏地检测血清样本中甲状腺球蛋白的含量,为临床诊断提供有价值的参考指标。
发明内容
首先,本发明提供了一种化学发光免疫分析测定甲状腺球蛋白的试剂盒。
本发明的试剂盒包括以下组分:甲状腺球蛋白校准品;甲状腺球蛋白抗体包被的固相载体;酶标记的甲状腺球蛋白抗体;化学发光底物液;以及浓缩洗涤液。
根据本发明的试剂盒,所述固相载体为微孔板、塑料珠或塑料管。
根据本发明的试剂盒,所述酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶,优选的所述酶为辣根过氧化物酶。
根据本发明的试剂盒,所述化学发光底物液的发光剂为1,2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺。
其次,本发明提供了制备上述试剂盒的方法。
其步骤如下:以甲状腺球蛋白纯品配制校准品;以甲状腺球蛋白抗体包被固相载体;制备酶标记的甲状腺球蛋白抗体;配制化学发光底物液;分装上述组分并组装为试剂盒。
根据本发明的方法,所述甲状腺球蛋白抗体包被固相载体的步骤包括以下步骤:采用0.020M pH值为4.2的磷酸缓冲液与适当浓度的甲状腺球蛋白抗体混合制成包被液,并将其负载于固相载体上,使用封闭液封闭。
配制封闭液为,1000mL所述封闭液中包含0.2g NaH2PO4·2H2O、2.9gNaH2PO4·12H2O、10g水解明胶和1mL生物防腐剂,pH值为7.0~7.6,然后将所得封闭液负载于上述固相载体上。
在上述方法中,所述固相载体为微孔板、塑料珠或塑料管,优选的,甲状腺球蛋白抗体包被的微孔板为96孔的微孔板条。
在上述方法中,所述酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶,优选的,所述酶为辣根过氧化物酶。
所述化学发光底物液的发光剂为1,2-二氧乙烷类衍生物或鲁米诺、异鲁米诺。
在上述方法中,优选的,所述化学发光底物液包含A液和B液,其中,1000mL所述化学发光底物A液,包括1.7716g鲁米诺、0.051g 4-羟基联苯、0.012g 4-碘苯硼酸、11.4g硼酸、4.9g硼砂,其pH值为8.0~10.0;1000mL所述化学发光底物B液,包括0.329g过氧化脲、1ml Tween20、51.58g Na2HPO4·12H2O、8.74gNaH2PO4·2H2O,其pH值为7.0~7.6。
在上述方法中,所述浓缩洗涤液包括Na2HPO4·12H2O,87g;NaH2PO4·2H2O,3g;NaCl,240g;Tween-20,1.5mL;Proclin 300,1.5mL;双蒸水,定溶至1000mL;调整pH至7.2~7.4。使用时用双蒸水稀释30倍。
上述方法中,所述配制甲状腺球蛋白校准品的原料为标准级,纯度不低于90%。
本发明的试剂盒应用酶催化发光底物,通过检测发光底物产生的光信号代替酶联免疫分析中的显色底物,具有与酶联免疫分析同等的特异性,而检测光信号的灵敏度要比检测显色底物的吸光度要灵敏的多,可为甲状腺球蛋白抗体的诊断提供更为特异、快速、可靠的依据。本发明解决了以往检测方法的缺陷,即去除了放射免疫分析对操作人员的放射性危害,解决的废弃物的处理问题,使产品的保存期更长,大大提高了分析方法的灵敏度,简化了操作步骤并节省了操作时间,提供了一种能够简便、快速、灵敏、稳定地检测甲状腺球蛋白的试剂盒。
附图说明
图1为实施例1所制备的试剂盒校准曲线的线性图。
具体实施方式
实施例1 制备本发明的甲状腺球蛋白化学发光免疫分析测定试剂盒
一、酶标抗体的制备及酶标抗体浓度的选定
1.甲状腺球蛋白抗体用戊二醛氧化法与辣根过氧化物酶偶联,用PBS充分透析,加等量优质丙三醇,-20℃以下保存。具体的:
1)将10mg HRP溶于0.2mL含1.25%戊二醛的0.1mol/L PH 6.8的PBS中,置室温18小时,充分透析除去多余戊二醛;2)加生理盐水至1mL,然后加入5mg纯化的抗体球蛋白及0.1mLPH 9.6的1mol/L碳酸盐缓冲液,混合后于4℃冰箱放置24小时;3)加入0.1mL 0.2mol/L的赖氨酸溶液,室温置2小时;4)用PH 7.2、0.15mol/L PBS充分透析,藉离心除去沉淀,上清即为酶结合物。
2.酶标抗体稀释液的配制:
三羟甲基氨基甲烷 C4H11NO3 12.1g
盐酸 HCl 调pH至7.5
氯化钠 NaCl 8.8g
牛血清白蛋白 BSA 10g
Proclin300 1.0mL
食品红 0.1mL
纯化水 H2O 加至1000mL
3.采用方阵法选择酶标抗体的工作浓度范围为1:500~1:5000。
二、甲状腺球蛋白校准品的制备
用含100%小牛血清稀释甲状腺球蛋白纯品至2、10、40、100、250ng/mL,S0为稀释液,分装成每瓶0.5mL,-20℃保存。
三、固相微孔板制备
(1)包被
采用1000mL的磷酸包被缓冲液,其中包含0.78g NaH2PO4·2H2O,调整pH至4.2,加入适量甲状腺球蛋白抗体混匀,然后加入微孔板各孔中,每孔110μL,4℃过夜。弃去孔中溶液,在吸水纸上拍干。
(2)封闭,该封闭液组分包括:
NaH2PO4·2H2O 0.2g
Na2HPO4·12H2O 2.9g
水解明胶 10g
Proclin 300 1mL
双蒸水 1000mL
将上述试剂称量好放入洁净容器中,加双蒸水定容,溶解混匀,测定pH值为7.2。每孔分别加入封闭液300μL,室温放置3小时。甩掉封闭液,在吸水纸上拍干。室温除湿干燥24小时后进行封袋,置2~8℃保存。
四、化学发光底物液
本实施例所使用的化学发光底物液的配制方法:
1000mL所述化学发光底物A液,包括1.7716g鲁米诺、0.051g 4-羟基联苯、0.012g 4-碘苯硼酸、11.4g硼酸、4.9g硼砂,其pH值为8.0~10.0;
1000mL所述化学发光底物B液,包括0.329g过氧化脲、1mL Tween20、51.58gNa2HPO4·12H2O、8.74g NaH2PO4·2H2O,其pH值为7.0~7.6。
使用前将A液与B液按1:1比例混合后使用。
五、浓缩洗涤液,其组分包括:
Na2HPO4·12H2O 87g
NaH2PO4·2H2O 3g
NaCl 240g
Tween-20 1.5mL
Proclin 300 1.5mL
双蒸水 1000mL
调整pH至7.2~7.4。使用时用双蒸水稀释30倍.
六、组装试剂盒
将上述组分分装,随机抽取三份,经过各项方法学指标检定合格后,组装成甲状腺球蛋白测定试剂盒(附使用说明书)。
实施例2 制备本发明的甲状腺球蛋白化学发光免疫分析测定试剂盒
除以塑料珠作为载体外,其余均以与实施例1相同的方法制备甲状腺球蛋白化学发光免疫分析测定试剂盒。
实施例3 制备本发明的甲状腺球蛋白化学发光免疫分析测定试剂盒
除以塑料管作为载体外,其余均以与实施例1相同的方法制备甲状腺球蛋白化学发光免疫分析测定试剂盒。
实施例4 制备本发明的甲状腺球蛋白化学发光免疫分析测定试剂盒
1、改良的戊二醛交联法标记碱性磷酸酶(ALP)
1)取ALP 2.0mg和抗体4.0mg,分别溶于生理盐水中,混合,最终体积控制在0.50ml;2)加入0.50ml 1%的戊二醛,室温磁力搅拌15min后,避光反应4h;3)加入1.0mol/L的乙醇胺0.10ml,室温温育2h;4)4℃条件下用PBS加磁力搅拌过夜透析,更换透析液三至四次;5)将透析产物移入试剂瓶加入等体积甘油,混匀,加入1% BSA,密闭冷冻保存备用。
2、本实施例所使用的碱性磷酸酶(ALP)的化学发光底物液的配制方法:
1000mL所述化学发光底物液,包括24g Tris、160g NaCl、4g KCl、15mlHCl、1ml Proclin 300、200ml AMPPD、1000ml双蒸水。
除使用碱性磷酸酶标记抗体,及所使用的化学发光底物液不同外,本实施例其余均以与实施例1相同的方法制备甲状腺球蛋白化学发光免疫分析测定试剂盒。
实施例5 本发明的试剂盒的使用方法
以上实施例1制备的甲状腺球蛋白化学发光免疫分析测定试剂盒的具体使用方法如下:
1)将包被好的固相载体(微孔板条)、校准品/待测样品、化学发光底物液、酶标记抗体从4℃冰箱中取出,平衡至室温;
2)配制洗涤缓冲液:将试剂盒提供的洗涤液缓冲液加双蒸水30倍稀释;
3)在板架上固定已包被好的微孔板条;
4)反应孔中分别加待测样品和各浓度校准品每孔加0、2、10、40、100、250ng/mL各25μL,室温反应60min;
5)用洗涤缓冲液在自动洗板机上或者手工洗板5次,在吸水纸上拍干;
6)各孔加入酶标抗体工作液100μl,于微量振荡器上振荡30秒混匀,放室温反应60min,洗板5次,在吸水纸上拍干;
7)每孔加化学发光底物100μL,振荡混匀,室温(20~28℃)反应10分钟;
8)在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU),测量时间1秒/孔;
9)分别对校准品浓度和对应RLU取对数,在双对数坐标图上建立标准曲线,以校准品浓度为横坐标,RLU值为纵坐标绘出标准曲线,见附图1,以各待测血清RLU值在标准曲线上查出该血清的甲状腺球蛋白的浓度;
10)打印检测结果报告。
实施例6 本发明的试剂盒的方法学检定
方法的精密性
1)分析内精密度 用两份正常人血清配制成低、高质控血清,在同一批实验中测定它们的化学发光强度值,每个质控血清平行做10孔,本试剂盒的分析内精密度:CV<15.0%。
表1 分析内精密度实验结果
2)分析间精密度 用两份正常人血清配制成低、高质控血清,分别于不同实验日测定它们的浓度值,共做十次,计算它们的分析间精密度,本试剂盒的分析间精密度:CV<20.0%。
表2 分析间精密度实验结果
方法的灵敏度
以S0校准品进行10次重复测定,其平均值加上两倍标准差求出所对应的浓度值,分别用不同批次的试剂和校准曲线进行三次试验,求出平均浓度值作为本试剂盒的灵敏度。经三次实验其平均灵敏度为0.4ng/mL。
方法的准确性
向1mL正常人血清(测定值为20.0ng/mL)中分别加入已知浓度为1000ng/mL的标准原料8μL,30μL,60μL,150μL,然后用同一批号的药盒,分别进行新生产的试剂盒和37℃已经存放10天试剂盒的重复检测。结果表明理论浓度值与实测浓度值的偏倚不超过±10%,在不同剂量水平所做样品的回收率均符合检测要求(100±10%),其结果见表3.
表3 准确性实验结果
方法的稳定性
将建立的免疫分析各组分组合成试剂盒,37℃放置3、7、10天,然后检测S0和Smax校准品、灵敏度以及Tg质控品精密度(n=10),结果见表4。
表4 37℃放置3天、7天和10天后的试剂盒的各项指标
特异性
将80ng/mL的Tg 4mL分成4份各1mL,每份各加入1mL 250ng/mL的T4、7.5ng/mL的T3 1mL、3.2ng/mL的rT3 1mL和1mL的Tg零标准(对照),同时进行检测,结果见表5。
表5 T3、T4、rT3对Tg检测的干扰情况
以上结果表明“甲状腺球蛋白化学发光免疫分析测定试剂盒”的精密性、准确性、灵敏度、稳定性和特异性是完全符合要求的。
实施例7 使用本发明的试剂盒与DRG公司的Tg酶联免疫试剂盒的比较
为验证本发明试剂盒的应用实际性,特与DRG公司酶联试剂盒进行了对比,对比结果如表6所示。
表6 本发明试剂盒与DRG酶联免疫试剂盒的比较
上述结果表明,本发明试剂盒的灵敏度和精密度优于酶联试剂盒。
Claims (10)
1、一种甲状腺球蛋白化学发光免疫分析测定试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:甲状腺球蛋白校准品;甲状腺球蛋白抗体包被的固相载体;酶标记的甲状腺球蛋白抗体;化学发光底物液;以及浓缩洗涤液。
2、如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述甲状腺球蛋白包被的固相载体是微孔板、塑料珠或塑料管。
3、如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒使用的固相载体材料为透明聚苯乙烯、聚乙烯或者聚丙烯。
4、一种制备权利要求1所述试剂盒的方法,其特征在于,包括以下步骤:以甲状腺球蛋白纯品配制校准品;以甲状腺球蛋白抗体包被固相载体;制备酶标记的甲状腺球蛋白抗体;配制化学发光底物液;配制浓缩洗涤液;分装上述组分并组装为试剂盒。
5、如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
6、如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述化学发光底物液的发光剂为1,2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺。
7、如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述1,2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1,2-二氧乙烷、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧乙烷(AMPPD)、CSPD或CDP-Star。
8、如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述发光剂为鲁米诺或异鲁米诺,化学发光底物液包括A液和B液:其中,基于1000mL所述化学发光底物A液,包括1.7716g鲁米诺、0.051g 4-羟基联苯、0.012g 4-碘苯硼酸、11.4g硼酸、4.9g硼砂,其pH值为8.0~10.0;基于1000mL所述化学发光底物B液,包括0.329g过氧化脲、1mL Tween20、51.58g Na2HPO4·12H2O、8.74g NaH2PO4·2H2O,其pH值为7.0~7.6。
9、如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述甲状腺球蛋白抗体包被固相载体的步骤,采用以下方法:用0.020M pH值为4.2的磷酸缓冲液与适当浓度的甲状腺球蛋白抗体混合制成包被液,并将其负载于固相载体上,用封闭液封闭后,干燥封板。
10、如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述浓缩洗涤液组分包括Na2HPO4·12H2O,87g;NaH2PO4·2H2O,3g;NaCl,240g;Tween-20,1.5mL;Proclin300,1.5mL;双蒸水,定溶至1000mL;调整pH至7.2~7.4。使用时用双蒸水稀释30倍。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20090304 |