CN103627793A

CN103627793A - 用于检测生物材料的系统和方法

Info

Publication number: CN103627793A
Application number: CN201310469534.4A
Authority: CN
Inventors: 陈奕璋; 蔡秀娟
Original assignee: Industrial Technology Research Institute ITRI
Current assignee: Industrial Technology Research Institute ITRI
Priority date: 2012-08-21
Filing date: 2013-08-21
Publication date: 2014-03-12

Abstract

本发明涉及用于检测生物材料的系统和方法。涉及一种通过采用捕获试剂和探针来鉴别目标生物材料的方法。每种捕获试剂对于一种目标是特异性的。每种探针被设计成辨别目标的类型。捕获试剂和探针均被一种或多种可检测的标记物标记。

Description

用于检测生物材料的系统和方法

相关申请的交叉参考

本申请要求享有于2012年8月21曰提交的美国临时申请No.61/691,541的优先权，其全部内容通过参考并入本文。

背景技术

随着生物工程技术的进展，能够通过检测病变细胞、病原体基因或者突变基因的存在来诊断疾病和健康状况。对于一些疾病，检测突变基因的存在不仅对于诊断目的是有用的，而且对于确定治疗方案以及预后同样是颇有价值的。例如，检测细胞色素P450(CYP)基因和维生素K环氧化物还原酶1(VKOR1)基因中的单核苷酸多态性(SNP)能够用于确定患者的华法林(warfarin)剂量。在个性化医学实践中，检测临床相关的突变可用于指导制定靶向治疗方案。

临床上的分子诊断化验经常是耗时的，并且需要复杂的步骤，包括纯化、分离和扩增。因此，需要用于简单、快速且准确地检测核酸分子以及其它生物材料的方法和平台。

发明内容

本发明基于发现了一种简单并且快速的平台，该平台采用数字图像分析来检测并确定生物材料的类型。

因此，本文描述了一种鉴别生物材料的方法。所述方法包括：

提供含有生物材料的样品，其中，生物材料具有种类(kind)和类型(type)；将一种或多种捕获试剂(capture)和一种或多种探针添加到样品中，每种捕获试剂和每种探针被一种或多种可检测的标记物标记，其中，每种捕获试剂对于生物材料的一个种类(a kind ofbiological material)是特异性的，以及每种探针对于生物材料的一个类型(a type ofbiological material)是特异性的，而且一种或多种捕获试剂通过它们的可检测的标记物是可相互辨识(区分)的，并且一种或多种探针通过它们的可检测的标记物是可相互辨识(区分)的，由此可检测的标记物的组合对一种和一类生物材料进行鉴别；

允许一种或多种捕获试剂和一种或多种探针结合至生物材料；并且

测定结合至生物材料的可检测的标记物，由此对生物材料的种类和类型进行鉴别。

待检测的生物材料可以例如是核酸分子、多肽、细胞、脂类、糖脂(glycolipid)、组织或生物体(organism)。感兴趣的生物材料的种类可以是特定的基因、蛋白质、细胞或者生物物种。生物材料的类型可以是基因型、血清型、单核苷酸多态性(SNP)或SNP的组合、突变或突变的组合、核酸序列或者生物物种的类型或亚型。

在下面的附图和描述中阐明了本发明的一个或多个实施方式的细节。通过描述和附图以及权利要求书，本发明的其它特征、目的和优势将会是显而易见的。

附图说明

图1为示例性的核酸捕获试剂和探针的示意图。

图2为示例性的核酸检测的示意图。

图3为一组图像，示出了华法林基因分型检测(warfarin genotyping test)的结果。

图4的显微照片(50倍放大)示出了采用乳液PCR(emulsion PCR)扩增前的血液样品、裂解缓冲液和PCR缓冲液的混合物，其中，油包裹的荧光染料和核酸(oil-encapsulated fluorescent dye and nucleic acid)存在于白色部分，并且凝胶状的材料和背景存在于黑色部分；以及

图5的显微照片(20倍放大)示出了采用乳液PCR扩增的混合物，其中，目标1代表DNA-探针-Cy3，目标2代表采用探针1-Cy5标记的DNA-探针-Cy5。NC(阳性对照)代表采用FAM染料标记的油相，并且

WL代表白光下的状态。

具体实施方式

本文描述了一种用于简单并且快速地检测生物材料的方法。该方法能够用于分析样品的类型、数量、强度以及其它物理的、化学的、生物的特征。例如，该方法能够用于测定生物物种(organism secies)、基因型、血清型以及核酸序列。该方法的应用包括分子学的和免疫学的诊断检测以及核酸测序。

普通的方法论

本方法利用了捕获试剂和探针。每种捕获试剂对于目标的一个种类(例如，特定的基因、蛋白质、细胞或者病原体)是特异性的。每种探针被设计成辨别目标的类型(例如，基因型、SNP或血清型)。

捕获试剂和探针各自包含结合至感兴趣的生物材料(例如核酸、多肽、脂类、糖脂、细胞、组织、病原体或生物体)的结合部分(bindmg moiety)。有用的结合部分包括核酸、抗体、抗体片段、抗体样分子(antibody-like molecule)(例如，亲和体分子(affibody molecule)、affilin、affitin、anticalin和高亲和性多聚体(avimer))、类肽物(peptidomimetic)、蛋白质、肽、融合蛋白质、受体、配体、DNA-蛋白质杂交体、DNA-RNA杂交体以及RNA-蛋白质杂交体。通过改变捕获试剂和探针使它们特异性地识别并结合感兴趣的生物材料，所述方法适合于检测任何生物材料。

捕获试剂和探针均被一种或多种可检测的标记物例如发色团(chromophore)和荧光标记物标记。通过唯一的、预定义的颜色代码(unique pre-defined color code)鉴别目标生物材料的种类和类型，颜色代码为与特定的捕获试剂和特定的探针相关的可检测的标记物的组合。

可检测的标记物在本领域是公知的。可检测的标记物的实例包括量子点、同位素标记物(例如，放射性或重金属同位素)、磁性标记物、自旋标记物、电子标记物、热标记物、有色标记物(例如，发色团和荧光标记物)、发光标记物(例如，荧光剂和化学发光试剂)、酶标记物(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、荧光素酶和β-半乳糖苷酶)、抗体标记物以及可化学修饰的标记物(例如，荧光标记物、发光标记物、生物发光标记物、染料和酶）。可检测的标记物包括那些能够通过任何光源例如可见光、荧光、发光、LED、紫外(UV)或激光或者其组合而可视化的物质。荧光标记物的实例包括荧光素、罗丹明、荧光黄、德克萨斯红、Alexa-Fluor染料、Cy3、Cy5、Cy5.5和Cy7。

如果一组捕获试剂包括总共n种不同的颜色，并且一组探针包括总共m种不同的颜色，则捕获试剂组和探针组一起能够用于辨别(2ⁿ-1)x(2^m-1)个类型的生物材料。因此，本文描述的方法能够采用颜色的排列和组合的方式使被辨别(区分)的生物材料种类的数量和生物材料类型的数量最大化。

为了鉴别目标生物材料的种类和类型，将怀疑含有感兴趣的目标的检测样品与对目标(例如，特定的基因)特异的捕获试剂以及对目标一个或多个类型(例如，基因突变或SNP)特异的一种或多种探针混合。通过测定与在检测中使用的捕获试剂和探针有关的可检测的标记物的颜色来鉴别捕获试剂-探针-目标复合物。例如，采用荧光显微镜对捕获试剂-探针-目标复合物进行成像。每种颜色独立地被可视化以获得图像。将这样获得的图像进行数字编辑和分析以鉴别存在的颜色以及颜色信号的强度。由此确定了指示目标的种类和／或类型的颜色代码。在检测中典型地包括阳性和阴性对照。应当将从图像分析中获得的等于或大于阳性对照的信号强度视为阳性信号。

适合的成像系统可从市场上购买。可采用常规的方法或软件例如ImageJ进行图像分析。

在本方法中使用的检测样品可以来自于任何来源，该来源包含或者怀疑包含感兴趣的生物材料。例如，样品可得自有生命的生物体(例如，人、动物、植物、细菌、真菌、原生生物以及病毒)或者环境来源(例如，水或土壤)。样品可以是体液，诸如血浆、血清、唾液、全血、精液或尿液，或者是固态样品(例如，组织、细胞颗粒、活检组织以及排泄物)。感兴趣的生物材料可以首先从样品中分离或从样品中部分分离。生物材料也可以被富集或浓缩，诸如通过分子大小色谱柱(molecular sizing column)、过滤或离心。

优选地，捕获试剂包括小固体颗粒(例如，珠子)以方便从未结合的捕获试剂、探针和目标中分离并且鉴别出捕获试剂-探针-目标复合物。任何类型的小固体颗粒，例如能够结合至生物分子的小的合成颗粒或微球，都能够用在本文的方法中。由各种材料构成的小固体颗粒（例如，塑料、陶瓷、玻璃、聚苯乙烯、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、顺磁性材料、石墨状碳、二氧化钛、乳胶、琼脂糖凝胶、琼脂糖、纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、蛋白质聚合物、尼龙、生物素、链霉亲和素和聚四氟乙烯）在本领域是已知的并且可从市场上购买。适当的颗粒直径范围可以是从约0.2μm至约200μm(例如，1～3μm)。

将生物分子(例如，核酸、蛋白质和抗体)结合至固体颗粒的方法在本领域是已知的。生物分子可以直接地或者经由接头(linker)间接地连接至固体颗粒。

可采用本领域已知的方法例如洗涤和离心来分离捕获试剂-探针-目标复合物。如果使用了生物素珠子或链霉亲和素珠子，则可以使用链霉亲和素或生物素柱或免疫沉淀反应。如果使用了磁珠，则磁性装置可用于分离复合物。双向电泳装置可用于分离具有不同物质和尺寸的磁珠。例如参见Medoro，G；Manaresi，N.；Leonardi，A.；Altomare，L.；Tartagni，M.；Guerrieri，R.A Lab-on-a-Chip for CellDetection and Manipulation.IEEE Sensors Joumal，2003，3，317-325；以及美国专利No.7,682,827。

本文描述的方法能够用于宽泛的多种目的。例如，该方法能够用于诊断基因疾病(或者因此患者的或受试者的风险）、鉴别包含在目标基因内的外源序列(例如，病毒序列)，或者用于检测传染病、传染性生物体或病原体。

术语“受试者”指动物或人，包括但不局限于例如灵长类的哺乳动物、猪、啮齿动物，诸如老鼠和田鼠、兔、豚鼠、仓鼠、牛、马、猫、狗、绵羊和山羊。

本方法能够在现场实施或者在远离现场的装备内实施。采用本方法获得的数据、图像和结果可以在手持式装置例如智能电话、移动装置或者平板电脑上被加载、分析和可视化。

核酸检测

本方法能够用于检测并且鉴别核酸，例如DNA、RNA、mRNA以及cDNA。例如，本方法能够用于检测基因标记物、等位基因、突变或SNP的存在。

在核酸检测中，捕获试剂可以包括核酸分子，例如单链核酸，其具有与目标核酸（例如，基因)内的第一目标序列互补的捕获序列(capture sequence)(例如，30至100个或者30至60个核苷酸)。第一目标序列不包含任何感兴趣的SNP或突变。换句话说，捕获试剂被设计成“捕获”即结合特定的目标核酸，而不是检测目标内的任何特定的基因标记物。捕获试剂被一种或多种可检测的标记物例如有色标记物标记。在同时检测多个目标核酸的检测或者检测样品内是否存在许多目标之一的检测中，采用了各自对目标核酸具有特异性的多种捕获试剂。每种不同的捕获试剂被不同的可检测的标记物或者可检测的标记物的组合所标记。

探针包含核酸分子，其具有与目标核酸内的第二目标序列互补的探针序列(例如，30至100个或者30至60个核苷酸)。第二目标序列包括一种或多种感兴趣的鉴别特征（identifymg feature ofinsterest)，例如SNP、突变、用于疾病的基因标志物或者任何基因改变。探针同样被一种或多种可检测的标记物标记。在设计成检测多个基因改变或特征的检测中或者检测是否存在许多特征之一的检测中，采用了不同的探针，每种探针被不同的可检测的标记物或者可检测的标记物的组合所标记。

例如，如图1所示，多个捕获试剂和探针被设计成同时检测三种不同目标基因中的SNP(箭头指示的位置)。捕获试剂1、捕获试剂2和捕获试剂3中的每一个均与不同的有色珠子(即R、Y或G-有色珠子)结合，并且具有的核酸序列分别与目标1、目标2或目标3的一部分互补。对于每个目标，产生了这样的探针，每个探针均具有与包含特定SNP(例如，SNP1-1或2-1)的部分互补的序列。每种不同的探针被不同的荧光标记物(即a，b)标记。因此，通过专门预定的颜色代码例如Ra、Ya或Gb来表示每个SNP。

熟练的从业者将意识到以上实例仅为解释说明性的，并且能够针对不同的应用来设计捕获试剂和探针。取决于检测，不同的探针能够共用一些可检测的标记物，只要能够区分不同的目标即可。

图2示出了示例性的核酸检测的概况。在步骤1中，在试管中将血液样品与裂解缓冲液混合以释放细胞内容物。在步骤2中，将捕获试剂、探针、用于扩增目标核酸的引物以及PCR试剂添加到同一试管中。在同一试管中进行PCR。当PCR反应完成时，使捕获试剂、探针和被扩增的目标核酸在同一试管中杂交。在步骤3中，清洗试管。捕获试剂-探针-目标复合物保留在试管内。在步骤4中，对来自试管的样品进行图像分析。

如本文所提到的，与核酸的一部分“互补的”序列指具有能够与核酸杂交并形成稳定的二聚体的充分互补性的序列。不需要捕获试剂序列和探针序列分别与第一目标序列和第二目标序列具有绝对的互补性，尽管这是优选的。本领域技术人员将能够基于预期目标而设计适当的捕获试剂和探针序列。

在适当严格的条件下进行杂交反应。所述严格的条件是公知的，并且将可预测地基于目标、捕获试剂和探针的特定序列而改变。

可采用乳化即采用油包水的液滴进行以上描述的核酸检测。通常，能够产生微乳液，其中水相部分包含目标核酸、捕获试剂、探针和其它成分。PCR、杂交或其它反应能够采用乳液进行。换句话说，乳液中的每个液滴均为微型反应器。用于制作微乳液的方法是本领域已知的。例如参见Williams等人，Nature Methods，3(7)：545-550(2006)以及Dressman等人，PNAS，100(15)8817-8822(2003)。

在当前的方法中，制备了油-表面活性剂混合物(包含Span80、Tween80、TritonX-100、矿物油和染料)以及水溶液相(包含缓冲液、水、DNA模板、引物、DNA聚合酶、PCR试剂、捕获试剂和探针)。可以控制DNA模板、探针和捕获试剂的浓度以产生液滴，该液滴平均每个液滴包含预期数量的分子，例如，单个模板DNA分子，从而使得液滴中的单个模板克隆扩增(clonal expansion)。将水溶液相缓曼地逐滴添加到油-表面活性剂混合物中，同时搅拌混合物。搅拌混合物直到形成乳液。乳液包括油包水的液滴，每个液滴均包含DNA模板、捕获试剂和探针。乳液能够被放置到PCR板的各个孔内，并且能够进行PCR和杂交反应。当反应完成后，等分乳液可以被放置到显微镜的载玻片上，并且进行如上所描述的成像。

可以对乳液中使用的同一DNA模板上进行实时PCR，以验证从乳液的图像分析中获得的数据。此外，在完成乳液的图像分析之后，可以分解具有阳性信号的乳液以分离捕获试剂-探针-目标复合物。参见Dressman等人(2003)，如上。可以对分离出的捕获试剂-探针-目标复合物进一步进行图像分析，以证实从乳液的直接图像分析中获得的结果。

熟练的从业者将意识到采用乳液时存在许多可能的构型和设计。在一个实施方式中，可以制备这样的乳液，其中，每种不同颜色的液滴包含不同的捕获试剂-探针组合。在另外的实施方式中，相同的液滴可以均包含相同的捕获试剂但不同的探针。例如，每个液滴/捕获试剂能够鉴别特定的HCV类型，并且不同的探针用于辨别HCV亚型。熟练的从业者同样将知道包括适当的阳性和阴性对照。

试剂盒

本文包括用于实施上述任何方法的试剂盒。试剂盒可以包括一种或多种捕获试剂以及一种或多种探针。试剂盒也可以包含另外的成分，诸如试剂、PCR引物和说明书。测序试剂盒也可以包括以上描述的固体载体或者测序芯片。

下面的具体实施例被解释为仅是说明性的，并且无论如何绝非用于限制说明书的其余部分。无进一步的详尽细节，相信本领域技术人员能够基于本文的描述将本发明利用到极致。本文引用的所有出版物的全部内容通过参照并入本文。

实施例：华法林灵敏度基因分型(Warfarin Sensitivity Genotyping)

使用捕获试剂和探针进行华法林灵敏度基因分型。

下面的表1示出了生物素标记的捕获试剂、Texas Red或FAM标记的对照以及Cy3或Cy5标记的等位基因特异性探针的序列。

表1

生物素标记的捕获试剂结合至包被有链霉亲和素的珠子。将3.0μl结合了珠子的捕获试剂添加到10.0μl的结合缓冲液，并且在室温下温育一小时。溶液被清洗三次并且重新悬浮在10μl的结合缓冲液中，以便在杂交试验中使用。

在试管内将10μl血液样品和20μl裂解缓冲液混合。将50μl双蒸水添加到试管。接着将10μlλ核酸外切酶(New England Biolabs)添加到试管，随后在干燥箱中于37℃下温育30分钟。在冰箱内冷冻前，95℃加热半分钟使残留的酶失活。

将1.0μl结合了珠子的捕获试剂、0.5μl未结合的捕获试剂、0.5μl的每种对照、0.5μl的每种探针(100ng)一起在200μlEppendorf管内混合好。将79.5μlλ核酸外切酶预处理过的样品、10μl杂交缓冲液以及7μl双蒸水添加到试管内。将内容物混合好并且在温控室内于65℃下温育10分钟，之后以每分钟温度改变一度的速度在从65℃至45℃的下降温度梯度下温育。随后采用包含1mMEDTA、1％SDS和10mM NaCl的清洗液于42℃下将试管中的内容物冲洗三次。将内容物接着进行图像分析。与牛DNA序列互补的寡核苷酸被用作阴性对照。

等位基因特异性的探针序列被设计成每种在目标基因内包含与SNP核苷酸互补的碱基。捕获试剂被设计成杂交到目标基因中的不包含感兴趣的SNP的序列。如果目标基因不包含SNP，则探针将不结合并因此将观察不到与该探针相关的颜色。参见图3的画面2d、3d和3c。相反地，如果目标基因真的包含SNP，将观察到与用于该SNP的探针相关的颜色。参见图3的画面1d、1c和2c。Texas Red标记的对照序列显示出阳性反应。参见图3的画面1b、2b和3b。如预期的，牛DNA阴性对照未产生任何信号。参见图3的画面1a、2a和3a。

作为实施例，下面示出了来自一个杂合对照(heterozygous control)和一个纯合对照(homozygous contr0l)以及8个临床样品的检测结果。而且，以常规方法进行检测获得的那些结果证实了该结果。

实施例：乳液PCR扩增灵敏度基因分型

将10μl裂解缓冲液(1μl全氟己烷(FluorinertTM)、8μl聚四亚甲基乙二醇和1μlTriton X100)和PCR缓冲液添加到20μl全血中并且维持不变约3分钟，以使颜色变为绿色。裂解缓冲液和PCR缓冲液可以分开添加或者在加入前预先混合。将20μl油（油-表面活性剂和PCR组分，下面列出了制备过程)添加到处理过的样品中并且在室温下混合3分钟。图4示出了显微照片(50倍放大)，其中，在进行乳液PCR反应之前PCR试剂被包裹在油内。图4中的白色部分显示出荧光染料和被包裹的核酸，而黑色部分显示出背景和凝胶状物质。

随后采用乳液PCR在如下条件下扩增乳液，在一次循环中于95℃进行5分钟，94℃进行45秒，65℃进行45秒，55℃进行45秒，72℃进行60秒，并且重复40次循环。随后将溶液于72℃下保持5分钟，并且于4℃下储存以进行光学分析。

以下组分在50ml离心管内于25℃下充分混合以制备油-表面活性剂混合物。

将400μl油-表面活性剂混合物转移到CryoTube安瓿，并且加入3×8mm磁性搅拌棒。采用搅拌棒以1,000rpm将混合物混合均匀。

将以下组分混合以形成乳液的水相：

第一步骤可以在第二、第三或第四步骤后随机进行。在图5中显示出放大20倍的结果。在图5中，目标1代表DNA-探针-Cy3，其中，探针1-Cy3被标记。目标2代表DNA-探针-Cy5，其中，探针2-Cy5被标记。NC(阳性对照)代表被FAM染料标记的油相。WL代表在白光下的情形。结果表明采用本文公开的一个实施例的组成(composition)处理过的生物样品当采用乳液PCR扩增后产生完全的油球形状，这对于接下来的光学分析是有利的。

其它实施方式

在本文的说明书中公开的所有特征能够被组合在任意组合中。在本文的说明书中公开的每个特征可以被用于相同的、等同的或者相似目的的供选特征替代。因此，除非另外专门指明，公开的每个特征仅为一个普通系列的等同或相似特征的一个实施例。

本领域技术人员从以上描述中能够轻易地确定本发明的本质特征，并且不偏离其精神和范围，能够对本发明进行各种改变和修改，以使之适合于各种用途和情形。因此，其它的实施方式同样处于权利要求书的保护范围内。

Claims

1.一种鉴别生物材料的方法，该方法包括：

提供含有生物材料的样品，其中生物材料具有种类和类型；

将一种或多种捕获试剂和一种或多种探针添加到样品中，每种捕获试剂和每种探针被一种或多种可检测的标记物标记，其中，每种捕获试剂对于生物材料的一个种类是特异性的，并且每种探针对于生物材料的一个类型是特异性的，且一种或多种捕获试剂通过它们的可检测的标记物是可相互区别的，且一种或多种探针通过它们的可检测的标记物是可相互区别的，由此可检测的标记物的组合对生物材料的种类和类型进行鉴别；

使一种或多种捕获试剂和一种或多种探针结合至生物材料；以及

测定结合至生物材料的可检测的标记物，由此鉴别生物材料的种类和类型。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，可检测的标记物为有色标记物。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，一种或多种捕获试剂包括总共n种不同的有色标记物，以及一种或多种探针包括总共m种不同的有色标记物，n和m均为等于或大于1的整数。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，样品为血液样品、血清样品、血浆样品、尿液样品、唾液样品、组织样品、细胞样品、含有被扩增过的核酸的样品或者含有经纯化或经部分纯化的生物材料的样品。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，生物材料为核酸分子、组织或生物体。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，种类是特定的基因或生物物种。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，类型为基因型、单核苷酸多态性(SNP)或SNP的组合、突变或突变的组合、核酸序列或者生物物种的类型或亚型。

8.根据权利要求2所述的方法，其中，有色标记物中的每一种可采用可见光、荧光、发光、LED光、紫外光、激光或者它们的组合来检测。

9.根据权利要求3所述的方法，其中，一种或多种捕获试剂和所述一种或多种探针共用x种有色标记物，其中，x为等于或大于0并且小于n+m的整数。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，通过对每个有色标记物单独成像以获得n+m-x个独立图像而进行测定步骤。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，每种捕获试剂包含经一种或多种可检测的标记物标记的小固体颗粒。

12.一种鉴别一种或多种目标核酸的方法，该方法包括：

提供包含核酸分子的样品；

将一种或多种捕获试剂和一种或多种探针添加到所述样品中，其中，

(i)每种捕获试剂被一种或多种可检测的标记物标记，从而使之可通过其可检测的标记物而与其它捕获试剂区分，并且包含与目标核酸中的第一目标序列互补的捕获核酸序列，以及

(ii)每种探针被一种或多种可检测的标记物标记，从而使之可通过其可检测的标记物而与其它探针区分，并且包含与目标核酸中的第二目标序列互补的探针序列，第二目标序列包括SNP、突变或野生型序列，并且每种探针对于SNP、突变或野生型序列是特异性的，由此可检测的标记物的组合对目标核酸分子及其类型进行鉴定，该类型为SNP、突变或野生型序列，或者它们的组合；

使一种或多种捕获试剂和一种或多种探针与核酸分子杂交；

分离各自含有目标核酸、捕获试剂和探针的复合物；并且

测定结合至被分离出的复合物的可检测的标记物，由此对一种或多种目标核酸及其类型进行鉴别。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，可检测的标记物为有色标记物。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，一种或多种捕获试剂包括总共n种不同的颜色，并且一种或多种探针包括总共m种不同的颜色，n和m均为等于或大于1的整数。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，一种或多种捕获试剂和一种或多种探针共用x种有色标记物，其中，x为等于或大于0并且小于n+m的整数。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，通过单独地对每种有色标记物进行成像以获得n+m-x个独立图像而进行测定步骤。

17.根据权利要求13所述的方法，其中，有色标记物中的每一种可采用可见光、荧光、发光、LED光、紫外光、激光或者它们的组合来检测。

18.根据权利要求11所述的方法，其中，目标核酸包括维生素K环氧化物还原酶基因或其片段和细胞色素p450基因或其片段，以及SNP包括与华法林灵敏度相关的SNP。

19.根据权利要求11所述的方法，其中，每种捕获试剂包含经一种或多种可检测的标记物标记的小固体颗粒。

20.根据权利要求11所述的方法，其中，在乳液中进行杂交步骤。