CN101473227A - 目标核酸的检测方法及该检测方法中所使用的容器 - Google Patents

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Abstract

本发明提供目标核酸的检测方法及该检测方法中所使用的容器。本发明的目的在于提供不使用杂交法即可简便且高精度地检测目标核酸的方法以及该检测方法中所使用的容器。在本发明的目标核酸的检测方法中，所述目标核酸在检测对象的核酸上结合有种类不同的第一配体(31)和第二配体(32)，其特征在于具有以下工序：制备结合有多个与第一配体(31)特异性结合的第一受体(331)的第一微粒(33)和结合有多个与第二配体(32)特异性结合的第二受体(341)的第二微粒(34)的工序；在底面具有沉降物捕获部的容器内混合可能含有目标核酸(30)的试样、第一微粒(33)和第二微粒(34)的工序；和在混合工序后，观测由连接的目标核酸(30)与第一微粒(33)和第二微粒(34)构成的凝集物以及/或第一微粒(33)和第二微粒(33)的沉降物在容器底面的捕获分布的工序。

Description

目标核酸的检测方法及该检测方法中所使用的容器
技术领域
本发明涉及对检测对象有无核酸或核酸浓度进行检测的方法及该检测方法中所使用的容器。
背景技术
作为检测试样中存在的特定目标核酸的代表性技术，已知有利用杂交法的技术(参照专利文献1)。该方法是能够利用探针从含有多种核酸的试样中检测仅存在非常少量的DNA或RNA的目标核酸的技术。
另一方面，还已知通过使试样中存在的特定的目标分子凝集来进行检测的方法。作为该方法中检测进行凝集反应而获得的凝集物的容器，至今已提出了各种容器。例如提出了可以通过目测来判定凝集物的凝集模式的容器(参照专利文献2)。
专利文献1：日本特开平7-51099号公报
专利文献2：日本特公昭63-60854号公报
但是，核酸本质上具有有时非特异性地进行杂交的问题。例如在目标核酸具有与非目标核酸相类似的碱基序列时，往往难以选择性地从试样中仅检测目标核酸。因此，在专利文献1所记载的方法中，具有未必能够以高精度检测目标核酸的问题。
另外，专利文献2所记载的容器用于红细胞的检测。由于核酸与红细胞的分子大小及结构大大不同，因此具有无法将该容器直接用于目标核酸的检测的问题。
发明内容
本发明是鉴于上述情况而完成的发明，其目的在于提供不使用杂交法即可简便且高精度地检测目标核酸的方法及该检测方法中所使用的容器。
为了解决上述课题，本发明为如下构成。
(1)一种目标核酸的检测方法，所述目标核酸在检测对象的核酸上结合有种类不同的第一配体和第二配体，所述检测方法的特征在于，具有以下工序：
制备结合有多个与上述第一配体特异性结合的第一受体的第一微粒和结合有多个与上述第二配体特异性结合的第二受体的第二微粒的工序；
在底面具有沉降物捕获部的容器内混合可能含有上述目标核酸的试样、上述第一微粒和第二微粒的工序；和，
在上述混合工序后，观测由借助于第一配体与第一受体的结合和第二配体与第二受体的结合而分别连接的上述目标核酸与上述第一微粒和第二微粒构成的凝集物以及/或上述第一微粒和第二微粒的沉降物在上述容器底面的捕获分布的工序。
(2)一种目标核酸的检测方法，所述目标核酸在检测对象的核酸上结合有种类不同的第一配体和第二配体，所述检测方法的特征在于，具有以下工序：
制备在底面上结合有多个与上述第一配体特异性结合的第一受体的容器的工序；
制备结合有多个与上述第二配体特异性结合的第二受体的磁性微粒的工序；
向上述容器内添加可能含有上述目标核酸的试样和上述磁性微粒的工序；和，
在该添加工序后，从上述容器外侧向上述磁性微粒施加磁力并观测该容器底面的磁性微粒的分布的工序。
(3)一种目标核酸的检测方法，其特征在于，上述(1)所述的检测方法和上述(2)所述的检测方法均进行。
(4)一种目标核酸的检测方法，其特征在于，在上述(1)～(3)任一项所述的目标核酸的检测方法中，将使用含有浓度已知的目标核酸的试样(1)时的观测结果、使用不含该目标核酸的试样(2)时的观测结果和使用可能含有该目标核酸的试样(3)时的观测结果进行比较，确认上述试样(3)中目标核酸的有无或浓度。
(5)一种目标核酸的检测方法，其特征在于，在上述(1)～(3)任一项所述的目标核酸的检测方法中，将使用含有已知的不同浓度的目标核酸的试样时的观测结果和使用可能含有该目标核酸的试样(4)时的观测结果进行比较，确认上述试样(4)中目标核酸的有无或浓度。
(6)如上述(1)～(5)任一项所述的目标核酸的检测方法，其特征在于，上述配体选自亲水性有机化合物、地高辛配基、荧光素、Alexa、异硫氰酸荧光素(FITC)、2，4-二硝基苯酚(DNP)、四甲基罗丹明(TAMRA)、氨基酸残基数为6以上的多肽、2个以上单糖结合而成的糖链、生物素、蛋白质、聚组氨酸、HA、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、由序列号1表示氨基酸序列构成的肽(Flag)以及它们的衍生物。
(7)如上述(1)～(6)任一项所述的目标核酸的检测方法，其特征在于，上述目标核酸为使用结合有第一配体的第一引物和结合有第二配体的第二引物并通过聚合酶链反应法而制备的。
(8)如上述(1)～(6)任一项所述的目标核酸的检测方法，其特征在于，上述目标核酸为使用第一引物引入至少1个结合有第一配体的核苷酸，同时使用第二引物引入至少1个结合有第二配体的核苷酸并同时通过聚合酶链反应法而制备的。
(9)如上述(1)～(8)任一项所述的目标核酸的检测方法，其特征在于，上述目标核酸为多个不同的种类，这些目标核酸中的第一和第二配体中的至少一方在每种目标核酸中都不同。
(10)如上述(1)～(9)任一项所述的目标核酸的检测方法，其特征在于，上述目标核酸为生物体来源。
(11)如上述(1)和(3)～(10)任一项所述的目标核酸的检测方法，其特征在于，上述第一和第二微粒的粒径为0.1～10μm，且光学上能够相互区分。
(12)如上述(1)～(11)任一项所述的目标核酸的检测方法，其特征在于，多个上述容器设置在同一板上，且各容器的容量为0.1～0.5ml。
(13)如上述(1)和(3)～(12)任一项所述的目标核酸的检测方法，其特征在于，上述容器的沉降物捕获部在形成研钵状的底面上以同心圆状配置有径向截面为锯齿状的多个凹凸，从中心向外侧由峰连接到谷的第一倾斜面的长度(h)为0.2～20μm，从中心向外侧由谷连接到峰的第二倾斜面的长度(1)为0.5～50μm，连接峰和中心的直线与水平面所成的角度(θ1)为15～45°。
(14)如上述(1)和(3)～(12)任一项所述的目标核酸的检测方法，其特征在于，上述容器的沉降物捕获部在形成研钵状的底面上独立地设置有多个凹部，且底面与水平面所成的角度(θ2)为15～45°。
(15)如上述(14)所述的目标核酸的检测方法，其特征在于，上述凹部的开口部直径(L)为0.05～100μm、深度(d)为0.03～60μm。
(16)一种目标核酸的检测方法，其特征在于，上述(13)所述的检测方法和上述(14)或(15)所述的检测方法均进行。
(17)如上述(2)～(10)和(12)任一项所述的目标核酸的检测方法，其特征在于，上述磁性微粒的粒径为0.1～20μm。
(18)如上述(2)～(10)、(12)和(17)任一项所述的目标核酸的检测方法，其特征在于，上述容器的底面为大致半球面状或大致圆锥面状，底面与水平面所成的角度(θ3)为15～45°。
(19)一种目标核酸的检测用容器，其用于上述(1)和(3)～(12)任一项所述的目标核酸的检测方法中，其特征在于，在形成研钵状的底面上以同心圆状配置有径向截面为锯齿状的多个凹凸，从中心向外侧由峰连接到谷的第一倾斜面的长度(h)为0.2～20μm，从中心向外侧由谷连接到峰的第二倾斜面的长度(1)为0.5～50μm，且连接峰和中心的直线与水平面所成的角度(θ1)为15～45°。
(20)一种目标核酸的检测用容器，其用于上述(1)和(3)～(12)任一项所述的目标核酸的检测方法中，其特征在于，在形成研钵状的底面上独立地设置有多个凹部，且底面与水平面所成的角度(θ2)为15～45°。
(21)如上述20所述的目标核酸的检测用容器，其特征在于，上述凹部的开口部直径(L)为0.05～100μm、深度(d)为0.03～60μm。
(22)一种目标核酸的检测用容器，其用于上述(2)～(10)、(12)和(17)任一项所述的目标核酸的检测方法中，其特征在于，底面为大致半球面状或大致圆锥面状，且底面与水平面所成的角度(θ3)为15～45°。
(23)一种目标核酸的检测用容器，其特征在于，多个上述(19)～(22)任一项所述的容器设置于同一板上。
根据本发明，通过在视觉上观测容器底面的沉降物的捕获分布，能够简便且高精度地检测目标核酸的有无或浓度。
附图说明
图1A是表示获得目标核酸的方法的概念图。
图1B是表示获得目标核酸的方法的概念图。
图1C是表示获得目标核酸的方法的概念图。
图1D是表示获得目标核酸的方法的概念图。
图2A是表示结合有受体的微粒的图。
图2B是表示结合有受体的微粒的图。
图3是表示与目标核酸连接而发生凝集时的微粒的概念图。
图4是表示本发明容器的一个例子的截面图。
图5是表示本发明容器的另一例子的截面图。
图6表示使用图4所示的容器时的沉降物捕获分布的一个例子的图。
图7表示使用图5所示的容器时的沉降物捕获分布的一个例子的图。
图8为表示本发明容器的另一例子的截面图。
图9为表示结合有受体的磁性微粒的图。
图10A为表示借助于目标核酸连接图8所示的容器和图9所示的磁性微粒的状态的概念图。
图10B为表示借助于目标核酸连接图8所示的容器和图9所示的磁性微粒的状态的概念图。
图10C为表示借助于目标核酸连接图8所示的容器和图9所示的磁性微粒的状态的概念图。
图11表示图10A～图10C的磁性微粒的分布模式的一个例子的图。
符号说明
30  目标核酸
31  第一配体
32  第二配体
33  第一微粒
331 第一受体
34  第二微粒
341 第二受体
具体实施方式
以下，详细说明本发明。
本发明的目标核酸的检测方法大致分为获得在检测对象的核酸上结合有配体的结构的目标核酸的工序、和借助于该配体来检测该目标核酸的工序。以下详细地说明各工序。
<获得目标核酸的工序>
首先，说明获得目标核酸的工序。
本发明中，检测对象的核酸并无特别限定，为包括cDNA、基因组DNA、合成DNA、mRNA、全RNA、hnRNA、合成RNA等的全部核酸或核酸类似物，可以是生物体来源的核酸，也可以是人工合成的核酸。
结合于检测对象的核酸的配体可以使用以往公知的配体，作为优选的配体，可以使用例如亲水性有机化合物、半抗原、地高辛配基、荧光素、Alexa、异硫氰酸荧光素(FITC)、2，4-二硝基苯酚(DNP)、四甲基罗丹明(TAMRA)、氨基酸残基数为6以上的多肽、2个以上单糖结合而成的糖链、生物素、蛋白质、聚组氨酸、透明质酸(HA)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、由序列号1表示氨基酸序列构成的肽(Flag)以及它们的衍生物等，但并非限定于这些。生物素、地高辛配基、荧光素、Alexa等具有易于从市场获得且廉价的优点。另外，糖链或肽具有化学结构的设计自由度高、容易备齐多种的优点。所用的配体可以根据检测对象的核酸、试样等适当选择。
本发明的检测方法中，首先形成在检测对象的核酸上分别结合有1个以上种类不同的第一配体和第二配体的目标核酸。获得在检测对象的核酸上结合有第一和第二配体的结构的目标核酸的方法如图1A～图1D所示，例如可以使用：(i)在检测对象的核酸10上使用光或铂或者借助于接头而在该核酸的碱基和/或5’末端共价结合第一配体31和第二配体32的方法(图1A)(作为该方法的一个例子，有使核酸的5’末端的碱基的氨基与配体的羧基共价结合的方法)；(ii)在核酸合成时使用结合有第一配体31的第一引物11和结合有第二配体32的第二引物12，通过聚合酶链反应(PCR)法延长碱基序列的方法(图1B)；(iii)在PCR方法中，分别导入至少一个结合有第一配体31的核苷酸13和至少一个结合有第二配体32的核苷酸14，同时延长碱基序列的方法(图1C)；(iv)使用末端脱氧核糖核苷酸转移酶将结合有第一配体31或第二配体32的核苷酸在核酸的3’末端加尾的方法(图1D)等各种方法。
如生物体试样或任意的被检物等那样，在为检测对象的核酸与其它非检测对象的核酸共存的试样时，优选上述(ii)和(iii)的方法。在检测对象的核酸单独存在时，可以使用任何方法。例如生物体试样等所含的检测对象的核酸可以通过PCR法使其扩增后检测，也可以不进行扩增而直接用来检测。
如图1所示，目标核酸30中的配体为第一配体31和第二配体32这两种。核酸的结构柔软，在本发明中，如后所述有必要将目标核酸结合在种类不同的第一微粒和第二微粒上。
另外，目标核酸中的第一配体和第二配体的数量可以分别为1个，也可以分别为2个以上。由于核酸与微粒的体积比极大，因此一个核酸上结合3个以上微粒的可能性很低。因此，在一个目标核酸中即便有多个配体，也认为不会影响结合有目标核酸的微粒的凝集度。
另外，在目标核酸存在多个种类时，例如可以同时进行上述(ii)或(iii)的方法，从而同时制备多种目标核酸。此时，各目标核酸中的第一配体和第二配体中的至少一方优选每种目标核酸都不同。
<检测目标核酸的工序>
接着，说明检测目标核酸的工序。
检测工序大致分为2个方法，可以单独用任一方法进行检测，但通过组合2个方法，可以获得更高精度的检测结果。以下按顺序说明2个方法。
[第一方法](制备第一微粒和第二微粒的工序)
制备结合有多个与第一配体特异性结合的第一受体的第一微粒和结合有多个与第二配体特异性结合的第二受体的第二微粒。
本发明中使用的微粒是指分散性微粒，例如如胶体粒子那样在溶液中分散的微粒，优选使用乳胶粒子，但不限于此。第一微粒和第二微粒的粒径优选为0.1～10.0nm。使用这种粒径的微粒时，易于获得稳定的凝集块。
本发明中，特异性结合(特异性地进行结合)是指例如如抗原和抗体等那样，在特定物质间结构选择性地形成的、基于特异性高的分子间作用力的结合。
胶乳粒子主要由聚苯乙烯构成，与甲基丙烯酸共聚以提高亲水性和分散性。胶乳粒子分为表面上无官能团的单纯型(plain type)和有官能团的官能团型两种。单纯型的表面的电荷因甲基丙烯酸的存在而带负电荷，能够与蛋白质分子中带正电荷的区域形成离子键。另外，还能够与蛋白质分子形成疏水键。单纯型的胶乳粒子仅通过与蛋白质混合即吸附蛋白质，因此蛋白质的固定操作容易。作为受体，可以使用后述的各种受体，当使用各种蛋白质时，如上所述，优选使用单纯型的胶乳粒子作为微粒。
具有官能团的胶乳粒子设计成在表面露出羧基或氨基等的形式，可以使用各种类型的官能团型胶乳粒子。在使官能团型胶乳粒子与受体结合时，只要使官能团型胶乳粒子中的官能团与受体的官能团结合即可，可以采用现有公知的方法。例如有，用水溶性碳二亚胺使羧酸与氨基结合的EDAC方法、将1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)预先混合后使羧酸与氨基结合的方法、使用具有双极性的接头使氨基彼此交联的方法、将活化后的醛基或甲苯磺酰基与受体中的官能团结合的方法等。在本发明中，在不有损本发明效果的范围内可以使用现有公知的任何方法，特别优选EDAC法。而且，与单纯型的胶乳粒子同样，当使用各种蛋白质作为受体时，优选使用官能团型胶乳粒子。
另外，即使是胶乳粒子以外的微粒，也可以根据微粒的种类通过现有公知的方法与受体结合。
结合于第一微粒的第一受体使用与目标核酸中的第一配体特异性结合的受体，结合于第二微粒的第二受体使用与第二配体特异性结合的受体。作为受体，例如可以使用抗体、凝集素、链霉亲和素等，但并非限定于这些。其中优选使用蛋白质，特别是抗体。
本发明中，作为一个实施方式，在一个微粒上结合单一种类的受体。而且在本实施方式中，目标核酸上结合有至少2种的配体，因此针对1种目标核酸制备至少2种微粒。即，如图2A～图2B所示，制备结合有与第一配体31特异性结合的第一受体331的第一微粒33(图2A)和结合有与第二配体32特异性结合的第二受体341的第二微粒34(图2B)。
另外，作为本发明的另一个实施方式，可以在一个微粒上结合2种以上的受体。而且本实施方式中，在一个目标核酸中的两种以上的配体中，使与一种配体特异性结合的受体和与剩余种类的配体特异性结合的受体以外的受体结合在一个微粒上。即，按照仅目标核酸中的两种以上的配体中的一种结合于一个微粒的方式进行设计。
第一微粒和第二微粒优选在光学上能够相互区分。具体地说，例如优选第一微粒和第二微粒不是同色，而是不同颜色。如此，在操作阶段的微粒识别变得容易，即便在观察凝集像时一种微粒引起了自身凝集，也可以通过颜色容易地区分，因此将自身凝集与第一微粒和第二微粒所发生的凝集误判的可能性降低。即，能够以更高精度进行目标核酸的检测。
另外，本工序的受体与微粒的结合可以在检测目标核酸时实施，也可以将预先结合有受体的微粒用来检测。另外，本工序可以在上述制备目标核酸的工序前后进行实施。
(将可能含有目标核酸的试样、第一微粒和第二微粒进行混合的工序)
接着，对混合可能含有目标核酸的试样、上述第一微粒和第二微粒的工序进行说明。
本工序在后述的底面具有沉降物捕获部的容器内进行。用来检测的可能含有目标核酸的试样如果实际上含有目标核酸，则借助于上述的第一配体与第一受体的结合以及第二配体与第二受体的结合，将目标核酸与微粒连接，如后所述生成凝集物。用来检测的试样如果不含有目标核酸，则不会发生这种结合，也不会生成凝集物。
本发明可以同时混合可能含有目标核酸的试样、第一微粒和第二微粒；或者对可能含有目标核酸的试样按顺序混合第一微粒和第二微粒，依次地进行。可能含有目标核酸的试样、第一微粒和第二微粒优选分别以溶液的形式使用。
本工序中所用的溶液优选为缓冲液，更优选为促进凝集的缓冲液。作为这种优选的缓冲液，例如可列举出具有以下组成的缓冲液：200mMMOPSO(pH为7.4)、4％葡聚糖、100mM NaCl、0.1％叠氮化钠，可以根据目标核酸和微粒的种类适当选择。本工序中混合不同种类的缓冲液时，微粒优选用该不同的缓冲液洗涤2～3次后使用。
用来混合的第一和第二微粒的量若过多，则检测精度降低，因此优选相对于目标核酸稍微过量，具体地说，更优选相对于数十～数百nM的目标核酸为0.01～0.5w/v％的微粒量。
作为上述配体-受体的组合，例如在采用抗原和抗体的情况下，本工序优选在0～37℃下进行5～30分钟。在采用其它的配体-受体的组合的情况下，也可适当选择适于该组合的种类的温度、时间、缓冲液。
图3表示目标核酸与第一和第二微粒连接的样式。在图3中，目标核酸30中的第一配体31借助于第一受体331而与第一微粒33连接。另外，目标核酸30中的第二配体32借助于第二受体341而与第二微粒34连接。即，通过一个目标核酸30与第一微粒33和第二微粒34连接，第一微粒33和第二微粒34相互连接。而且，通过多个目标核酸30连接于一个微粒、该目标核酸30分别与其它微粒连接，从而多个微粒相互连接，结果发生微粒的凝集。另外，图3中从受体延伸的虚线简单地表示结合的核酸。
由此，试样中若含有目标核酸，则发生微粒的凝集。
(观测容器底面的沉降物的捕获分布的工序)
接着，观测容器底面的沉降物的捕获分布。
这里，沉降物是指上述凝集物、或未用来与目标核酸连接而沉降的第一和第二微粒。通过本工序可以检测目标核酸。这里，通过肉眼或图像处理等来判定上述凝集物的有无或其程度。进行图像处理时，例如可以使用对利用CCD相机拍摄的图像数据进行解析等的方法。
接着，详细地说明进行目标核酸检测的具体方法。
使用含有上述配体结合的浓度已知的目标核酸的试样(1)，按照上述方法将该目标核酸与微粒混合，观测容器底面的凝集物的捕获分布，作为阳性对照。进而，按照上述方法将不含有该目标核酸的试样(2)与微粒混合，观察容器底面的沉降物的捕获分布，作为阴性对照。然后，同样按照上述方法将可能含有该目标核酸的试样(3)与微粒混合，观测容器底面的沉降物的捕获分布，通过与上述阳性对照和阴性对照进行比较，确认上述试样(3)中的目标核酸的有无或浓度。具体地说，若使用试样(3)时的捕获分布的模式与阳性对照一致或类似，则判断为阳性，从而确认试样(3)中含有目标核酸。与此相对，若使用试样(3)时的捕获分布的模式与阴性对照一致或类似，则判断为阴性，从而确认试样(3)中不含有目标核酸。另一方面，使用试样(3)时的捕获分布的模式显示在阳性对照和阴性对照之间时，则判断为假阳性。此时，试样(3)中的有可能含有少量目标核酸。如此，能够简便地确认试样(3)中的目标核酸的有无。另外，通过同样地例如将使用试样(3)时的沉降物的捕获量与阳性对照和阴性对照进行比较，能够确认试样(3)中的目标核酸的量。
另外，将使用含有已知的不同浓度的目标核酸的试样而获得的容器底面的凝集物的捕获分布作为对照，通过将采用可能含有该目标核酸的试样(4)时的沉降物的捕获分布与对照进行比较，则与上述同样，也能够确认该试样(4)中目标核酸的有无或浓度。
另外，若预先确认并记录目标核酸的有无或浓度不同所导致的沉降物的捕获分布的不同，则即便不使用上述对照、仅将可能含有该目标核酸的试样用来检测，也可确认该试样中目标核酸的有无或浓度。如此，可以简化检测工序。
另外，当试样中含有多种目标核酸时，例如准备每种目标核酸都不同的第一和第二配体的组，将分别结合有与多个种类中的一种目标核酸中的第一和第二配体组特异性结合的第一和第二受体的微粒分别用来个别混合，可以选择性检测该一种目标核酸。同样，根据目标核酸的种类，按每种目标核酸来制备结合有与该目标核酸中的第一和第二配体特异性结合的第一和第二受体的微粒，并将这些微粒用来混合，能够同时检测两种以上的目标核酸。
如此，可以单独检测检测对象的核酸或者同时地检测多个检测对象的核酸。
这里，目标核酸中的第一和第二配体如上所述，可以使用每种目标核酸都完全不同的配体，也可以使第一和第二配体中的一个配体在多种核酸之间通用。如此，能够简化检测工序。
另外，在上述检测方法中，对一种目标核酸使用两种配体，也可使用3种以上的配体。此时，可以按每种配体来制备结合有多个特异性结合于配体的受体的微粒。
(目标核酸的检测中所使用的容器)
以下，详细地说明目标核酸的检测中所使用的本发明的容器。
本发明中，可以单独使用该容器，也可以使用将多个该容器设置在同一板上的器具，作为这样的器具，具体地可列举出将该容器作为孔的96孔微板。当然，孔的数量也并不限定于96个。具备这样的多个容器时，优选一个容器的容量为0.1～0.5ml。
本发明的容器在底面上设有捕获沉降物的部位，可以更简便且高精度地识别通过目标核酸与微粒的连接而产生的凝集物与该凝集物以外的沉降物。具体地说明沉降物捕获部时，例如可列举出如图4所示的在容器40的形成研钵状底面41上以同心圆状配置有径向截面为锯齿状的多个凹凸42的捕获部。这里，优选凹凸42从底面中心43向外侧由峰连接到谷的第一倾斜面的长度(h)为0.2～20μm、优选从中心43向外侧由谷连接到峰的第二倾斜面的长度(1)为0.5～50μm、优选连接峰和中心43的直线与水平面所成的角度(θ1)为15～45°。另外，凹凸42的数量优选为10～50个。
另外，作为沉降物捕获部的另一个具体例子，例如可列举出如图5所示的在容器的形成研钵状的底面51上独立地设置有多个凹部52的捕获部。这里，优选底面51与水平面(容器外底面)所成的角度(θ2)为15～45°。另外，θ2更具体地是指连接底面51的倾斜面的除去凹部52的任意一点和底面51中心的直线与水平面所成的角度。
而且，优选该凹部52为大致半球状、其开口部的直径(L)为0.05～100μm、深度(d)为0.03～60μm。
另外，凹部52的形状并非限定于这里所示的大致半球状，只要能够容纳多个、优选3～7个左右上述第一微粒和/或上述第二微粒，则也可以是不同的形状和尺寸。凹部52的数量优选为数十～数百左右。
沉降物捕获部的上述尺寸和形状是为了可以简便且高精度地进行上述凝集物与该凝集物以外的沉降物的识别而特别地设计的，通过使用具备这样的沉降物捕获部的容器，可以简便且高精度地检测目标核酸。因此，在脱离上述范围的情况下，沉降物的捕获分布的模式在上述凝集物与该凝集物以外的沉降物之间难以区分。
另外，通过并用图4和图5所列举的容器，能够以更高的精度检测目标核酸。
参照图6说明使用具有图4所示的沉降物捕获部的容器40时的沉降物的捕获分布。
当在混合有第一微粒33和第二微粒34的试样中不含有目标核酸时(阴性)，如图6的(a)和(b)所示，未参与和目标核酸的连接的第一微粒33和第二微粒34沉降于底面41，大部分越过凹凸42到达底面最下部附近。另一方面，在含有目标核酸时(阳性)，如图6的(c)和(d)所示，如上所述第一微粒33和第二微粒34借助于目标核酸而相互地连接，产生凝集物并沉降。由于该凝集物的尺寸大，因此不越过凹凸42，而直接滞留在底面41上的沉降位置，在整个底面41上薄薄地堆积。目标核酸的量多时，凝集物的堆积量增多，量少时，堆积量减少，因此根据试样中的目标核酸浓度，容器底面的颜色深浅发生变化。另外，图6中(a)和(c)为凝集物和/或该凝集物以外的沉降物被沉降物捕获部捕获的状态下的容器40的纵截面图，(b)和(d)为从上方观察容器40的底面时的图。
接着，参照图7说明使用底面为图5所示形状的容器50时的沉降物的捕获分布。
当在混合有第一微粒33和第二微粒34的试样中不含有目标核酸时(阴性)，如图7的(a)和(b)所示，未参与和目标核酸的连接的第一微粒33和第二微粒34沉降于底面51，大部分被凹部52捕获，不会到达底面51的最下部附近，而保持在底面51的设有凹部52的几乎整个区域上。另一方面，在含有目标核酸时(阳性)，如图7的(c)和(d)所示，如上所述第一微粒33和第二微粒34借助于目标核酸而相互地连接，产生凝集物并沉降。由于该凝集物的尺寸大，因此不会被凹部52捕获，大部分到达底面51的最下部附近。目标核酸的量多时，底面51的最下部附近的凝集物的堆积量增多，同时覆盖底面51的面积增大，量少时，底面51的最下部附近的凝集物的堆积量减少，同时覆盖底面51的面积减少。因此，根据试样中的目标核酸浓度，容器底面的变色部位的颜色深浅和区域发生变化。另外，图7中(a)和(c)为凝集物和/或该凝集物以外的沉降物被沉降物捕获部捕获的状态下的容器50的纵截面图，(b)和(d)为从上方观察容器50的底面时的图。
如此，根据用来测定的试样中目标核酸的有无或浓度的不同，容器底面的沉降物的捕获分布发生变化，因此可以简便且高精度地检测目标核酸。
另外，例如图4或图5所示的本发明的容器可以通过模具成型等以往公知的方法来制造。
[第二方法](在磁性微粒和容器底面上的受体的结合)
接着，说明检测目标核酸的第二方法。
首先，说明将与目标核酸中的第二配体特异性结合的第二受体结合到磁性微粒上的工序。
作为所用的磁性微粒，例如可列举出由四氧化三铁(Fe3O4)、三氧化二铁(γ-Fe2O3)、各种铁氧体、铁、锰、镍、钴、铬等金属或含有钴、镍、锰等的合金形成的磁性微粒、或在内部含有这些磁性微粒的聚苯乙烯、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈、聚甲基丙烯酸甲酯、聚己内酰胺、聚对苯二甲酸乙二醇酯等疏水性聚合物、或聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚(丙烯酸(2-羟乙基)酯)、聚(甲基丙烯酸(2-羟乙基)酯)、聚(丙烯酸(2，3-二羟丙基)酯)、聚(甲基丙烯酸(2，3-二羟丙基)酯)、聚乙二醇甲基丙烯酸酯等交联得到的亲水性聚合物、或上述聚合物的单体的2-4种左右的共聚物等的胶乳、明胶、脂质体、或将上述磁性微粒固定化到乳胶、明胶、脂质体等表面上而得到的粒子等。
磁性微粒的粒径优选为0.1μm～20μm。
粒径偏离上述尺寸时，有时沉降物的捕获分布的模式在上述凝集物与该凝集物以外的沉降物之间难以区分。
作为在磁性微粒上结合针对目标核酸中第二配体的第二受体的方法，可列举出物理吸附该受体的方法或使其化学担载的方法。
作为物理吸附的方法，例如可列举出使受体直接吸附于磁性微粒而固定化的方法、使受体与白蛋白等其他蛋白质化学结合后吸附而固定化的方法。
作为化学担载的方法，例如可列举出将存在于磁性微粒表面的氨基、羧基、巯基、羟基、醛基、环氧基等各种官能团活化后，使之与受体上的各种官能团结合从而直接将受体固定在磁性微粒上的方法；通过使磁性微粒和受体通过间隔分子化学结合而固定化的方法；使受体与例如白蛋白等其他蛋白质化学结合后，使该蛋白质与磁性微粒化学结合的方法。这里任一种化学结合方法均采用现有公知的方法即可。
接着，说明在容器底面上结合与目标核酸中的第一配体特异性结合的第一受体的工序。
这里所用的容器可以是透明、半透明、经着色等的任一种。作为材质，可列举出聚苯乙烯、聚丙烯、特氟隆(注册商标)、聚乙烯、甲基戊烯树脂(TPX)、氟树脂、丙烯酸树脂、聚碳酸酯、聚氨酯、氯乙烯树脂等塑料等。而且，可以通过模具成型等以往公知的方法来成型。
作为在容器底面上结合与目标核酸中的第一配体特异性结合的第一受体的方法，可以适用在微粒或磁性微粒上结合受体的方法，根据所结合的受体种类适当选择即可。
作为这些结合于磁性微粒或容器的受体，例如可以使用抗体、凝集素、链霉亲和素、镍等，但并不限定于这些。可以使用镍的原因在于其具有螯合物形成能力。
在本方法中，由于目标核酸上结合有至少2种配体，因此相对于1种目标核酸准备至少2种受体。然后制备在底面上结合有与第一配体31特异性结合的第一受体331的容器80(图8)、和结合有与第二配体32特异性结合的第二受体341的磁性微粒90(图9)。
另外，在本发明中，也可以使两种以上的受体结合于一个磁性微粒或容器。本实施方式中，使与一个目标核酸中的两种以上配体中的一种配体特异性结合的受体和除与剩余种类的配体特异性结合的受体以外的受体结合于一个磁性微粒或容器。即，按照目标核酸中的两种以上配体中的仅一种结合于一个磁性微粒或容器的方式进行设计。
(向容器内添加可能含有目标核酸的试样和上述磁性微粒的工序)
接着，说明添加可能含有目标核酸的试样和上述磁性微粒的工序。
本工序可以在混合可能含有目标核酸的试样和磁性微粒后将该混合物添加于容器中，也可以将可能含有目标核酸的试样和磁性微粒同时添加于容器中，但优选将可能含有目标核酸的试样添加于容器后，将磁性微粒添加于该容器。可能含有目标核酸的试样、磁性微粒优选分别以溶液的形式使用。此时，优选使用缓冲液，作为优选的缓冲液，例如可列举出PBS，但可以根据状况适当选择。
如果用来向容器添加的磁性微粒的量过多，则检测精度降低，因此优选相对于目标核酸稍微过量，具体地说，更优选相对于数十～数百nM的目标核酸为0.01～0.5w/v％的微粒量。而且，结合于容器底面的第一受体的数量多于目标核酸中第一配体的数量即可，优选为配体数量的1.2～2倍左右。
用来检测的可能含有目标核酸的试样实际上含有如图10A所示的目标核酸30时，则如图10B所示，借助于第一配体31和第一受体331的结合将目标核酸30连接于容器80的底面81，如图10C所示，借助于第二配体32和第二受体341的结合将目标核酸30与磁性微粒90连接。即，容器80和磁性微粒90借助于目标核酸30而连接。用来检测的试样若不含有目标核酸，则不会发生这种结合，磁性微粒90不会连接于容器80。
(观测容器底面的磁性微粒的分布的工序)
接着，通过使磁铁等磁性体从容器外侧接触容器底面，使用肉眼或图像处理等方法观察向容器内的磁性微粒施加磁力时的磁性微粒的分布模式。图像处理等可以适用与上述同样的方法。
由此，在试样中含有目标核酸时(阳性)，如图11中的(a)～(c)所示，即便通过磁性体尝试集中磁性微粒90，由于容器80与磁性微粒90借助于目标核酸30而连接，因此无法集中磁性微粒90，磁性微粒90保持在容器80的几乎整个底面81上。目标核酸30的量多时，则覆盖容器80的底面81的磁性微粒90增多，量少时，则覆盖容器底面81的磁性微粒90减少，因此根据试样中的目标核酸30的浓度，底面81的颜色深浅发生变化。另一方面，在试样中不含有目标核酸时(阴性)，如图11中的(d)～(f)所示，通过磁性体磁性微粒90集中于底面81的磁性体附近。
如此，由于根据用来测定的试样中目标核酸的有无或浓度的不同，容器底面的磁性微粒的分布模式发生变化，因此可以简便且高精度地进行目标核酸的检测。其中，图11中，(a)和(b)为磁性微粒90连接于容器80的状态下的容器80的纵截面图、(d)和(e)为磁性微粒90未连接于容器80的状态下的容器80的纵截面图、(c)和(f)为从上方观察容器80的底面时的图。
作为上述配体-受体的组合，例如在采用抗原和抗体的情况下，本工序优选在0～37℃下进行5～30分钟。在其它的配体-受体组合的情况下，也可以适当选择适于该组合的种类的温度、时间、缓冲液。
接着，详细地说明进行目标核酸检测的具体方法。
使用含有上述配体结合的浓度已知的目标核酸的试样(1)，按照上述方法将该目标核酸添加于容器内，然后将磁性微粒添加于容器内，确认施加磁力时的磁性微粒的分布模式，作为阳性对照。进而，按照上述方法将不含有该目标核酸的试样(2)添加于容器内，然后将磁性微粒添加于容器内，确认施加磁力时的磁性微粒的分布模式，作为阴性对照。然后，同样地按照上述方法将可能含有该目标核酸的试样(3)添加于容器内，然后将磁性微粒添加于容器内，通过将容器底面的磁性微粒的分布模式与上述阳性对照和阴性对照进行比较，确认上述试样(3)中目标核酸的有无或浓度。
另外，也可以将使用含有已知的不同浓度的目标核酸的试样而获得的容器底面磁性微粒的分布模式作为对照，通过将使用可能含有该目标核酸的试样(4)时的磁性微粒的分布模式与对照进行比较，也能够确认该试样(4)中目标核酸的有无或浓度。
另外，若预先确认并记录目标核酸的有无或浓度不同所导致的磁性微粒分布模式的不同，则即便不使用上述对照、而仅将可能含有该目标核酸的试样用来检测，也能够确认该试样中目标核酸的有无或浓度。如此，可以简化检测工序。
另外，当试样中含有多种目标核酸时，例如使用按每种目标核酸都不同的第一和第二配体，向结合有与多个种类中的一种目标核酸中的第一配体特异性结合的第一受体的容器中仅添加结合有与该一种目标核酸中的第二配体特异性结合的第二受体的磁性微粒时，则可以选择性地检测该一种目标核酸。同样地，当向全部结合有与多个种类的目标核酸中的第一配体特异性结合的第一受体的容器中添加全部结合有与该多种目标核酸中的第二配体特异性结合的第二受体的磁性微粒时，则可以同时检测该多种目标核酸。
如此，能够单独检测检测对象的核酸或者同时地检测多个检测对象的核酸。
这里，目标核酸中的第一和第二配体如上所述，可以使用按每种目标核酸都完全不同的配体，也可以使第一和第二配体中的一个配体在多种核酸之间通用。如此，可以简化检测工序。
另外，在上述检测方法中，对于一种目标核酸使用两种配体，也可使用3种以上的配体。此时，使用与各配体特异性结合的受体，这三种以上的受体中，结合于容器的受体和结合于磁性微粒的受体可以根据目的适当选择。
(检测目标核酸所使用的容器)
本工序中使用的容器考虑到向磁性微粒施加磁力时未连接于该容器的磁性微粒的集中容易性，例如可列举出图8所示的容器。即，优选可列举出底面81为大致半球面状、底面81与水平面所成的角度(θ3)为15～45°的容器。底面81除了这里所示的大致半球面状以外，也可以是大致圆锥面状。其中，θ3更具体地是指连接底面81的倾斜面上的任意一点和底面81中心的直线与水平面所成的角度。
而且，与第一方法同样，可以单独使用这种容器，也可以使用将多个该容器设置在同一板上的器具。作为这样的器具，具体地可列举出例如将该容器作为孔的96孔微板。当然，孔的数量也并不限定于96个。当具备这样的多个容器时，优选一个容器的容量为0.1～0.5ml。第二方法中使用的容器只要通过上述方法在利用模具成型等以往公知的方法成型的容器底面上结合受体即可。
除了之前对第二方法叙述的内容以外，可以将与第一方法大致同样的方法用于第二方法。
本发明中，通过并用第一方法和第二方法，能够更高精度地进行目标核酸的检测。而且，如在第一方法中所述，当并用图4和图5所例举的容器时，能够进一步更高精度地进行目标核酸的检测。
如上所详述，通过本发明的目标核酸的检测方法，能够以低成本、简便且高精度地对检测对象的核酸进行检测。由此，例如在临床检查的低成本化、简便化方面是有效的。
本发明的目标核酸的检测方法例如可以作为对检测对象的核酸进行检测的单碱基多态(SNP：单核苷酸多态性)的方法使用。此时，作为获得结合有多个不同的半抗原的目标核酸的方法，在适用PCR法的情况下，例如可以优选使用PCR-SSP法(聚合酶链反应-序列特异性引物法)。PCR-SSP法是通过按照两种引物的单侧的3’末端与检测对象的核酸中的SNP位点重合的方式设计序列，通过SNP位点与引物的3’末端有无匹配，从而控制利用PCR的扩增的方法。
以下进一步说明原理的详细内容。
作为结合有第一配体的引物，例如分别制作在由序列号2表示的碱基序列构成的引物的5’末端结合有地高辛配基(DIG)的引物、在由序列号3表示的碱基序列构成的引物的5’末端结合有FITC的引物、在由序列号4表示的碱基序列构成的引物的5’末端结合有生物素的引物。接着，对由序列号5表示的碱基序列构成的检测对象的核酸，利用PCR-SSP法进行扩增反应。此时，如在序列号5表示的碱基序列中作为r记载的那样，样品的SNP位点在碱基A(腺嘌呤)和碱基G(鸟嘌呤)的2种类型作为等位基因存在时，等位基因型(日文原文：アリルタイプ)为A/A同型、A/G异型、G/G同型这3种类型。
样品的SNP位点为A/A同型时，经DIG标记的序列号2的引物与SNP位点匹配，与经生物素标记的序列号4的引物一起，利用PCR对检测对象的核酸进行扩增。由于经FITC标记的序列号2的引物无法进行扩增，因此扩增产物成为在两5’末端分别结合有DIG和生物素的双链DNA(目标核酸1)。
出于同样的考虑，样品的SNP位点为G/G同型时，PCR产物成为在两5’末端分别结合有FITC和生物素的双链DNA(目标核酸2)。
进而，当样品的SNP位点为A/G异型时，获得混合有目标核酸1和目标核酸2的扩增产物。通过检测有无这些核酸的扩增，使SNP分型成为可能。
在利用上述原理检测核酸的SNP时，可以获得被对应于该多型的经半抗原修饰的目标核酸。
进而，也可以检测多个检测对象的核酸的SNP。此时，可以准备结合有每个不同SNP位点的不同种类的半抗原的引物，按照上述方法，利用PCR-SSP法扩增检测对象的核酸。
以下，用具体实施例更详细地说明本发明。但本发明不受以下的实施例的任何限制。
这里，示出基于上述原理的SNP分型的实施例。
实施例1
<DNA(检测对象的核酸)的提取>
从人血液提取DNA。具体地说，使用核酸自动提取机“MagtrationSystem6CG(Precision System science株式会社制)”，使用步骤依据该产品操作说明书。
(1)采集被验者的血液5ml。
(2)将采集的血液的全血100μl分别注入旋盖式1.5ml管中。
(3)竖起装置，加入提取试剂、被检物，按照操作规程操作机械开始DNA提取。提取液使用TE(10mM Tris-HCl(pH为8.0或7.5)+1mM EDTA)。
(4)提取后使用分光光度计“nano drop(美国nano drop公司制)”，测定吸光度，计量提取后浓度。
通过上述方法，从预先判定目标SNP的等位基因型的9位被验者采集血液，进行DNA提取，结果从100μl全血中获得表1所示浓度的基因组DNA 100μl。
表1
 
被验者No 1 2 3 4 5 6 7 8 9
等位基因型 A/A A/A A/A A/G A/G A/G G/G G/G G/G
DNA浓度(ng/μl) 1.82 1.96 1.83 1.71 1.69 1.92 1.88 1.83 1.85
<结合有配体的检测对象的核酸的扩增>
分别使用在由序列号2表示的碱基序列构成的引物的5’末端结合有DIG的引物、在由序列号3表示的碱基序列构成的引物的5’末端结合有FITC的引物、在由序列号4表示的碱基序列构成的引物的5’末端结合有生物素的引物，通过以上述基因组DNA为模板的PCR，进行具有含SNP的序列号5表示的碱基序列的检测对象的核酸的扩增。
(1)用TE对基因组DNA进行浓度调整，使其达到20ng/μl。
(2)如表2所示，制备各被检物试剂。
(3)将制备的试剂以每个20μl分别注入PCR用管中。
(4)将被检物溶液以每个1μl加入(3)的PCR用管中。
(5)将PCR用管置于热循环仪“Gene AmpPCRsystem9700(AppliedBiosystems公司制)”，采用表3所示的条件进行PCR反应。
表2  每个被检物的试剂制备量
 
10×PCR缓冲液 2μl
dNTP mix 1.6μl
DIG标记正向引物 1μl
FITC标记正向引物 1μl
生物素标记反向引物 1μl
dH2O 13.3μl
ExTaq 0.1μl
|合计 20μl
表3
 
1 94℃ 5分钟
2 94℃ 30秒钟
3 60℃ 30秒钟
4 72℃ 30秒钟
5 72℃ 5分钟   2～4×35
通过上述方法，对被验者1～9的被检物进行目标核酸的扩增反应。
另外，制备由在由序列号6表示的碱基序列构成的核酸的5’末端结合有DIG的核酸、和在由序列号7表示的碱基序列构成的核酸的5’末端结合有生物素的核酸这二者构成的双链人工合成目标核酸(I)，制备在由序列号8表示的碱基序列构成的核酸的5’末端结合有FITC的核酸、和在由序列号9表示的碱基序列构成的核酸的5’末端结合有生物素的核酸这二者构成的双链人工合成目标核酸(II)，混合这些人工合成目标核酸(I)和(II)，用TE进行浓度调整以使人工合成目标核酸(I)和(II)分别达到100nM，以之作为阳性对照。另外，将TE作为阴性对照。
<目标核酸的检测>
进行通过上述工序制作的结合有配体的目标核酸的检测。
以下示出各检测方法的步骤和检测结果。
使用图4所示的容器进行目标核酸的检测。
(1)使用缓冲液(200mM MOPSO(pH为7.4)、4％葡聚糖、100mMNaCl、0.1％叠氮化钠)稀释针对抗DIG抗体(DAKO公司制、目录No：D5105)敏化了的乳胶粒子A(粒径为0.1μm、Seradyn公司制)的溶液，分别注入到将利用模具成型制作的图4所示的容器a(h为0.2μm、l为0.5μm、θ1为30°)作为孔的96孔反应板中，每孔50μl。
(2)使用上述缓冲液稀释抗生物素抗体(DAKO公司制、目录No：M0743)敏化乳胶粒子溶液，分别注入到上述96孔板中，每孔50μl。
(3)以每孔各20μl添加被检物、阳性对照和阴性对照，使它们充分地分散。
(4)在室温下静置5分钟后，与阳性对照、阴性对照进行比较，观测被检物的沉降物在容器底面的捕获分布，判定阳性、阴性。
实施例2
除了用针对抗FITC抗体(DAKO公司制、目录No：D5101)敏化了的乳胶粒子B(粒径为10μm、マグスフエア公司制)的溶液来代替针对抗DIG抗体敏化了的乳胶粒子A的溶液，用将利用模具成型制作的图4所示的容器b(h为20μm、1为50μm、θ1为30°)作为孔的96孔反应板来代替容器a以外，用与实施例1同样的方法，进行目标核酸的检测。
实施例3
使用图5所示的容器进行目标核酸的检测。
除了用将利用模具成型制作的图5所示的容器c(L为0.05μm、d为0.03μm、θ2为30°)作为孔的96孔反应板来代替容器a以外，用与实施例1同样的方法，进行目标核酸的检测。
实施例4
除了用针对抗FITC抗体(DAKO公司制、目录No：D5101)敏化了的乳胶粒子B的溶液来代替针对抗DIG抗体敏化了的乳胶粒子A的溶液，用将利用模具成型制作的图5所示的容器d(L为100μm、d为60μm、O2为30°)作为孔的96孔反应板来代替容器c以外，用与实施例3同样的方法，进行目标核酸的检测。
实施例5
使用图8所示的容器进行目标核酸的检测。
(1)在96孔板“Immobilizer Amino Lock WellTM Module Plate(Nunc公司制、目录No：436023)”的底面上，按照以往公知的方法结合抗生物素抗体。
(2)分别注入上述缓冲液，每孔50μl。
(3)分别注入被检物、上述阳性对照和上述阴性对照，每孔各20μl。
(4)在室温下静置5分钟。
(5)分别注入结合有抗DIG抗体的磁性微粒“Dynabeads M-450 Epoxy(DYNAL公司制、目录No：DB14001)”的溶液，每孔50μl，使它们充分地分散。
(6)在室温下静置5分钟。
(7)从板的底面外侧加以磁铁，比较阳性对照、阴性对照，利用肉眼或图像处理等方法观察磁性微粒在容器底面的分布模式，判定阳性、阴性。
实施例6
除了用结合有抗FITC抗体的磁性微粒来代替结合有抗DIG抗体的磁性微粒以外，用与实施例5同样的方法进行目标核酸的检测。
(判定结果)
以上，将实施例1～6的检测结果和基于该检测结果的综合判定结果示于表4。作为综合的判定，当实施例1～6的判定结果中至少3个检测结果相同时，将其结果作为最终分型结果。而且，确认通过本发明可以高精度地进行目标核酸的检测。
Figure A200780023134D00301
本发明适用于使临床检查简便化、低成本化等，可在医疗相关领域中得到应用。
序列表
<110>奥林巴斯株式会社
<120>目标核酸的检测方法及该检测方法中所使用的容器
<130>07P01685
<160>9
<210>1
<211>8
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Designed peptide to act as a ligand in target nucleic acid.
<400>1
Figure A200780023134D00321
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Designed DNA fragment to act as a primer in PCR method for amplification of targetsequence SEQ ID NO：5.
<400>2
Figure A200780023134D00322
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Designed DNA fragment to act as a primer in PCR method for amplification of targetsequence SEQ ID NO：5.
<400>3
<210>4
<211>38
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Designed DNA fragment to act as a primer in PCR method for amplification of targetsequence SEQ ID NO：5.
<400>4
Figure A200780023134D00324
<210>5
<211>87
<212>DNA
<213>human
<400>5
Figure A200780023134D00331
<210>6
<211>87
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>PCR product using primer SEQ ID NO：2 and template SEQ ID NO：5
<400>6
Figure A200780023134D00332
<210>7
<211>87
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>PCR product using primer SEQ ID NO：4 and template SEQ ID NO：5
<400>7
Figure A200780023134D00333
<210>8
<211>87
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>PCR product using primer SEQ ID NO：3 and template SEQ ID NO：5
<400>8
Figure A200780023134D00334
<210>9
<211>87
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>PCR product using primer SEQ ID NO：4 and template SEQ ID NO：5
<400>9
Figure A200780023134D00335

Claims (23)

1.一种目标核酸的检测方法，所述目标核酸在检测对象的核酸上结合有种类不同的第一配体和第二配体，所述检测方法的特征在于，具有以下工序：
制备结合有多个与所述第一配体特异性结合的第一受体的第一微粒和结合有多个与所述第二配体特异性结合的第二受体的第二微粒的工序；
在底面具有沉降物捕获部的容器内混合可能含有所述目标核酸的试样、所述第一微粒和第二微粒的工序；和，
在所述混合工序后，观测由借助于第一配体与第一受体的结合和第二配体与第二受体的结合而分别连接的所述目标核酸与所述第一微粒和第二微粒构成的凝集物以及/或所述第一微粒和第二微粒的沉降物在所述容器底面的捕获分布的工序。
2.一种目标核酸的检测方法，所述目标核酸在检测对象的核酸上结合有种类不同的第一配体和第二配体，所述检测方法的特征在于，具有以下工序：
制备在底面上结合有多个与所述第一配体特异性结合的第一受体的容器的工序；
制备结合有多个与所述第二配体特异性结合的第二受体的磁性微粒的工序；
向所述容器内添加可能含有所述目标核酸的试样和所述磁性微粒的工序；和，
在该添加工序后，从所述容器外侧向所述磁性微粒施加磁力并观测该容器底面的磁性微粒的分布的工序。
3.一种目标核酸的检测方法，其特征在于，权利要求1所述的检测方法和权利要求2所述的检测方法均进行。
4.一种目标核酸的检测方法，其特征在于，在权利要求1～3任一项所述的目标核酸的检测方法中，将使用含有浓度已知的目标核酸的试样(1)时的观测结果、使用不含有该目标核酸的试样(2)时的观测结果和使用可能含有该目标核酸的试样(3)时的观测结果进行比较，确认所述试样(3)中目标核酸的有无或浓度。
5.一种目标核酸的检测方法，其特征在于，在权利要求1～3任一项所述的目标核酸的检测方法中，将使用含有已知的不同浓度的目标核酸的试样时的观测结果和使用可能含有该目标核酸的试样(4)时的观测结果进行比较，确认所述试样(4)中目标核酸的有无或浓度。
6.如权利要求1～5任一项所述的目标核酸的检测方法，其特征在于，所述配体选自亲水性有机化合物、地高辛配基、荧光素、Alexa、异硫氰酸荧光素(FITC)、2，4-二硝基苯酚(DNP)、四甲基罗丹明(TAMRA)、氨基酸残基数为6以上的多肽、2个以上单糖结合而成的糖链、生物素、蛋白质、聚组氨酸、HA、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、由序列号1表示氨基酸序列构成的肽(Flag)以及它们的衍生物。
7.如权利要求1～6任一项所述的目标核酸的检测方法，其特征在于，所述目标核酸为使用结合有第一配体的第一引物和结合有第二配体的第二引物并通过聚合酶链反应法而制备的。
8.如权利要求1～6任一项所述的目标核酸的检测方法，其特征在于，所述目标核酸为使用第一引物引入至少1个结合有第一配体的核苷酸，同时使用第二引物引入至少1个结合有第二配体的核苷酸并同时通过聚合酶链反应法而制备的。
9.如权利要求1～8任一项所述的目标核酸的检测方法，其特征在于，所述目标核酸为多个不同的种类，这些目标核酸中的第一和第二配体中的至少一方在每种目标核酸中都不同。
10.如权利要求1～9任一项所述的目标核酸的检测方法，其特征在于，所述目标核酸为生物体来源。
11.如权利要求1和3～10任一项所述的目标核酸的检测方法，其特征在于，所述第一和第二微粒的粒径为0.1～10μm，且光学上能够相互区分。
12.如权利要求1～11任一项所述的目标核酸的检测方法，其特征在于，多个所述容器设置在同一板上，且各容器的容量为0.1～0.5ml。
13.如权利要求1和3～12任一项所述的目标核酸的检测方法，其特征在于，所述容器的沉降物捕获部在形成研钵状的底面上以同心圆状配置有径向截面为锯齿状的多个凹凸，从中心向外侧由峰连接到谷的第一倾斜面的长度(h)为0.2～20μm、从中心向外侧由谷连接到峰的第二倾斜面的长度(l)为0.5～50μm、连接峰和中心的直线与水平面所成的角度(θ1)为15～45°。
14.如权利要求1和3～12任一项所述的目标核酸的检测方法，其特征在于，所述容器的沉降物捕获部在形成研钵状的底面上独立地设置有多个凹部，且底面与水平面所成的角度(θ2)为15～45°。
15.如权利要求14所述的目标核酸的检测方法，其特征在于，所述凹部的开口部直径(L)为0.05～100μm，深度(d)为0.03～60μm。
16.一种目标核酸的检测方法，其特征在于，权利要求13所述的检测方法和权利要求14或15所述的检测方法均进行。
17.如权利要求2～10和12任一项所述的目标核酸的检测方法，其特征在于，所述磁性微粒的粒径为0.1～20μm。
18.如权利要求2～10、12和17任一项所述的目标核酸的检测方法，其特征在于，所述容器的底面为大致半球面状或大致圆锥面状，底面与水平面所成的角度(θ3)为15～45°。
19.一种目标核酸的检测用容器，其用于权利要求1和3～12任一项所述的目标核酸的检测方法中，其特征在于，在形成研钵状的底面上以同心圆状配置有径向截面为锯齿状的多个凹凸，从中心向外侧由峰连接到谷的第一倾斜面的长度(h)为0.2～20μm，从中心向外侧由谷连接到峰的第二倾斜面的长度(1)为0.5～50μm，且连接峰和中心的直线与水平面所成的角度(θ1)为15～45°。
20.一种目标核酸的检测用容器，其用于权利要求1和3～12任一项所述的目标核酸的检测方法中，其特征在于，在形成研钵状的底面上独立地设置有多个凹部，且底面与水平面所成的角度(θ2)为15～45°。
21.如权利要求20所述的目标核酸的检测用容器，其特征在于，所述凹部的开口部直径(L)为0.05～100μm，深度(d)为0.03～60μm。
22.一种目标核酸的检测用容器，其用于权利要求2～10、12和17任一项所述的目标核酸的检测方法中，其特征在于，底面为大致半球面状或大致圆锥面状，且底面与水平面所成的角度(θ3)为15～45°。
23.一种目标核酸的检测用容器，其特征在于，多个权利要求19～22任一项所述的容器设置于同一板上。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103290487A (zh) * 2012-02-29 2013-09-11 科美仪器 生物反应装置芯片
CN107208143A (zh) * 2014-11-20 2017-09-26 安普里怀斯公司 用于核酸扩增和分析的组合物、方法、系统和试剂盒
CN109804081A (zh) * 2018-11-08 2019-05-24 廖世奇 一种复合靶标-肿瘤血清核酸配基检测方法及试剂盒
US11016087B2 (en) 2016-02-09 2021-05-25 Sekisui Chemical Co., Ltd. Implement for inspection, inspecting device and inspecting method

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009157510A1 (ja) * 2008-06-27 2009-12-30 株式会社日立製作所 菌捕集担体カートリッジ、担体処理装置および菌の計測方法
JP5231909B2 (ja) 2008-09-17 2013-07-10 独立行政法人科学技術振興機構 任意の分布形状と分布密度を有する分子または粒子の集団を同時に多種大量生成する方法とその方法に使用するマスク材
JP5077472B2 (ja) * 2011-10-27 2012-11-21 株式会社日立プラントテクノロジー 被検出物捕集具の使用方法
JP2014077665A (ja) * 2012-10-09 2014-05-01 Aoi Seiki Kk 分取用容器
JPWO2020013133A1 (ja) * 2018-07-09 2020-07-16 Ｉｄａｃセラノスティクス株式会社 単一細胞解析のための可搬式マイクロウェルプレート及びゲル化剤含有細胞溶解液
JP7345782B2 (ja) * 2018-07-31 2023-09-19 積水化学工業株式会社 検査方法、検査用器具及び検査装置

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS561352A (en) * 1979-06-20 1981-01-09 Olympus Optical Co Ltd Container for corpuscular cohesion judgement
JPH0659954B2 (ja) 1986-08-29 1994-08-10 日本発条株式会社 巻取装置
JPH01267459A (ja) * 1988-04-19 1989-10-25 Olympus Optical Co Ltd 粒子凝集判定容器
WO1990002205A1 (en) * 1988-08-25 1990-03-08 Angenics, Inc. Detection of nucleic acid sequences using particle agglutination
JPH0751099A (ja) 1993-08-11 1995-02-28 Toyobo Co Ltd 核酸配列検査方法及び検査装置
JPH07191031A (ja) * 1993-12-27 1995-07-28 Olympus Optical Co Ltd 検査容器および検査方法
USRE38442E1 (en) * 1994-06-22 2004-02-24 Mount Sinai School Of Medicine Nucleic acid amplification method hybridization signal amplification method (HSAM)
AU1450699A (en) * 1997-10-31 1999-05-24 Gen-Probe Incorporated Methods of nucleic acid detection
JP2001330614A (ja) * 2000-05-24 2001-11-30 Olympus Optical Co Ltd 生物活性を付与した固相およびその製造方法
US20050118589A1 (en) * 2001-11-21 2005-06-02 Vann Charles S. Digital array
JP2004154074A (ja) * 2002-11-07 2004-06-03 Mitsubishi Kagaku Iatron Inc マイコバクテリウム・ツベルクローシスの分析方法
JPWO2006129770A1 (ja) * 2005-06-01 2009-01-08 オリンパス株式会社 核酸の検出方法

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103290487A (zh) * 2012-02-29 2013-09-11 科美仪器 生物反应装置芯片
CN107208143A (zh) * 2014-11-20 2017-09-26 安普里怀斯公司 用于核酸扩增和分析的组合物、方法、系统和试剂盒
US11016087B2 (en) 2016-02-09 2021-05-25 Sekisui Chemical Co., Ltd. Implement for inspection, inspecting device and inspecting method
CN109804081A (zh) * 2018-11-08 2019-05-24 廖世奇 一种复合靶标-肿瘤血清核酸配基检测方法及试剂盒
WO2020093308A1 (zh) * 2018-11-08 2020-05-14 廖世奇 一种复合靶标-肿瘤血清核酸配基检测方法及试剂盒
GB2591009A (en) * 2018-11-08 2021-07-14 Liao Shiqi Composite target-tumor serum nucleic acid ligand detection method and kit

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