JP5231909B2 - 任意の分布形状と分布密度を有する分子または粒子の集団を同時に多種大量生成する方法とその方法に使用するマスク材 - Google Patents
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Description
例えば、再生医療研究では、細胞の生体内での機能を生体外で再現するため、細胞を3次元的に集合させて、培養する研究が盛んになってきている。そのための一般的手法としては、細胞の接着を防ぐ表面処理を施した容器内で細胞を浮遊状態で培養し、流体の揺動と細胞同士の接着力によって、微小な球状に自己集合させる手法や、細胞が3次元的に自由に移動できるゲル材料内で培養し、自己組織化させる手法などがある。しかし、これらの手法では、集合体の形成がランダムに起こるため、同一の容器内であっても、形成される集合体のサイズは、10μmから数100μmまでと、大きく分散する。
しかし、分布密度に関しては、複数の基板(基材)を用意し、基板ごとに、対象物質の濃度の異なる溶液あるいは懸濁液を用いて集合体を形成させなければならない。
また、従来手法では、隣接する孔構造の間が平坦面となっているため、孔以外の部分にも対象物質が堆積し、それらは集合体形成に利用されないため、対象物質の利用効率が低い。
さらに、従来手法では、初期に微小容器や孔以外の部分に堆積した物質が、周囲の液体の揺動により、その後の集合体形成中に孔内に侵入し、集合体の安定的形成を乱す要因となる。
本発明のもう1つの課題は、上記の如き手法であって、目的とする領域外に堆積する、集団形成に利用されない物質の割合を削減することにより、物質の利用効率を改善する方法及び、そのためのマスク材を提供することである。
本発明のさらにもう1つの課題は、前記の如き方法であって、初期段階で、目的とする領域外に堆積した物質が、その後の流体の揺動などによって、目的領域内に侵入することを防ぐことのできる方法及び、そのためのマスク材を提供することである。
微細な粒子あるいは分子の集団を、分布形状と分布面密度を規定して、基材上に形成する方法であって、目的とする分布形状と、分布密度に応じて設計される、先端がナイフリッジを形成するように接続された傾斜付き壁構造を有する貫通孔を並列配置したマスク材を準備し、当該物質の溶液あるいは懸濁液を、前記基材上に密着させた前記マスク材上に載置し、マスク材の傾斜付き壁構造によって規定される領域内に当該物質を沈降させることにより、前記壁構造の上部境界によって囲まれた領域を通過して、傾斜付き壁面に沿って沈降する物質が、前記壁構造の下部境界によって囲まれる領域の面積(下部開口面積)をs(mm2 )、壁構造の上部境界によって囲まれる領域の面積(上部開口面積)をS(mm2 )、対象物質の溶液又は懸濁液の濃度をC(mm−3)、加える液体の深さをL(mm)としたとき、壁構造の下部境界によって囲まれた所定の領域内に集積する物質の分布面密度D(mm−2)は、式D=CLS/sにしたがって、壁構造の下部境界によって囲まれた、基材上の所定領域内に堆積することを特徴とする任意の分布形状と分布密度を有する微細な粒子あるいは分子の集団を同時に多種大量生成する方法である。
また、前記微細粒子あるいは分子が、細胞、タンパク質、核酸、生体由来高分子、金属微粒子、半導体微粒子、セラミック微粒子、樹脂微粒子のいずれかを含むことを特徴とする任意の分布形状と分布密度を有する微細な粒子あるいは分子の集団を同時に多種大量生成する方法である。
また、当該物質を溶解、あるいは懸濁させる液体が、マスク材と反応しない液体であることを特徴とする任意の分布形状と分布密度を有する微細な粒子あるいは分子の集団を同時に多種大量生成する方法である。
また、前記マスク材上の壁構造の上部境界線に沿って、壁構造の上面に溝を有するものを用いていることを特徴とする任意の分布形状と分布密度を有する微細な粒子あるいは分子の集団を同時に多種大量生成する方法である。
また、前記マスク材の壁構造の表面が、対象物質の接着を抑制する材料で作製されているものを用いていることを特徴とする任意の分布形状と分布密度を有する微細な粒子あるいは分子の集団を同時に多種大量生成する方法である。
また、前記マスク材を載置する前記基板の全部又は一部が、多孔質材、繊維材、ゲル材のいずれか、または、これらの組み合わせたものを用いていることを特徴とする任意の分布形状と分布密度を有する微細な粒子あるいは分子の集団を同時に多種大量生成する方法である。
また、微細な粒子あるいは分子の集団を、分布形状と分布面密度を規定して、基材上に形成する方法に使用するマスク材であって、前記マスク材は上部開口面と下部開口面の形状を独立に任意に規定し、その間を傾斜付き壁構造によって繋いだ形状として構成されていることを特徴とするマスク材である。
また、前記マスク材の壁構造の上部境界線に沿って、壁構造の上面に溝を形成したことを特徴とするマスク材である。
また、前記マスク材の壁構造の表面が、対象物質の接着を抑制する材料で作製されていることを特徴とするマスク材である。
1)1種類の濃度の当該物質の溶液又は懸濁液から、任意の分布形状と分布密度を有する当該物質の集団群を、様々な材料の基材表面に、1回の操作で、多種大量に一括形成することが可能となり、結果として、多種多量の形状と密度の組み合わせ条件の解析を効率的に行うことが可能となる。
2)また、本発明の手法によれば、操作に用いる当該物質のほぼ全量が集団形成に利用される。結果として、高価な物質、希少な物質の使用量を節約できる。
D=CLS/s
よって、傾斜付き壁構造の上部境界と、下部境界を、それぞれ独立に規定することにより、任意の分布形状と分布密度を有する、当該物質の集団を対象基材上に形成することができる。さらに、上部境界と下部境界の形状の複数の組み合わせを、同一のマスク材上に多数作製しておくことにより、対象物質を含む1種類の濃度の母溶液あるいは懸濁液から、分布形状と分布密度の異なる複数の組み合わせを有する当該物質の子集団群を、一度の母溶液あるいは懸濁液を対象基材上に載置した前記マスク材に加える操作で、同一基材上に一括形成することができる。
また、上記の本発明において、マスク材1の壁構造4の上部境界線に沿って、壁構造の上面に溝を設けることにより、初期段階で、目的領域外に堆積した物質が、その後の過程で、意図せず、領域内に侵入することを防ぐことができる。
また、本発明の傾斜付き壁構造を有するマスク材は、少なくとも傾斜壁部分に当該物質の接着を抑制するための物質が、適当な表面修飾あるいはコーティングがなされていることが好ましいが、マスク材を構成する材料自体が当該物質に対して非接着性である場合は、この限りでない。
また、当該物質を溶解、あるいは懸濁させる液体が、マスク材と反応しない液体であることを使用することができる。
本発明の実施例の1つとして、直径10μmのラテックス製マイクロビーズを用いた集団形成について示す。図3に示すPDMS製の、逆四角錐形状の傾斜付き壁構造を有するマスク材をモールドにより作製した。モールドの鋳型は、エポキシ系光感光性樹脂を用いて、光造形法により作製したが、本発明のマスク材の作製方法はこれに限るものではない。
傾斜付き壁構造の上部境界領域の正方形の一辺は、400μm、600μm、800μmの3通り、下部境界領域の正方形の一辺は、40μm、80μm、160μmの3通りとし、合計9種類の組み合わせを有する傾斜付き壁構造を、8mm四方の基材上に密に多数配置した。
図6に本発明の応用例の模式図を示す。この例は、浮遊状態での細胞塊形成を示すものであり、細胞は基材上に堆積して集合するが、基材は細胞非接着性であるため、細胞同士で接着し、自発的に球状の細胞塊を形成する状態を示している。
細胞を浮遊状態で培養すると、近隣の細胞同士が自発的に接合して、最大で200μm程度の凝集塊を形成することが知られている。本発明の方法を用いることにより、初期細胞数、細胞分布密度を規定して、浮遊状態での細胞塊の自発形成過程を観察することが可能となった(図6)。下記実施例では、マウス膵管由来幹細胞を用いた。
以上の結果により、本発明の方法を用いて、対象物質の、分布形状(サイズ)と分布密度の多数の組み合わせによる実験結果が、1回の準備操作で、一括して取得できることが示された。
細胞は生体内では、接着の足場となる高分子に囲まれて生存している。生体外でも、細胞接着性の高い高分子ゲル中で細胞培養することにより、生体内と類似の組織構造を形成させ、同等の機能を発現させることが、再生医療への応用などの観点から検討されている。
図8は本例に係る3次元ゲルマトリックス内での細胞塊形成を説明するための断面模式図を示す。
細胞はマスク材の下部開口面に堆積した後、細胞接着性の高い3次元ゲルマトリックス内に自発的に移動するため、基材表面に形成された細胞集団群は、時間とともにゲル内に移動する。ゲル内では、細胞は3次元的に増殖し、自発的に球状の細胞塊を形成する。
本発明の手法によれば、分布形状と、分布面密度を規定して形成された細胞集団群を、固体基材のみならず、様々な素材面上に形成することが可能であり、細胞の成長に好適なゲル材料にも適用できる。下記実施例では、マウス膵管由来幹細胞を対象物質として、前記細胞の成長に適したマトリゲル層の表面に、本発明のマスク材を用いて細胞集団群を形成することにより、マトリゲル内で生体の膵島に類似した構造及び機能を発現させるための、至適初期条件を一括検討した(図8)。
前記のマスク材上に、2×105個/mlの濃度の細胞懸濁液200μlを滴下し、37°C、5%CO2雰囲気下で、4日間培養した。その結果、壁で囲まれた各領域内のマトリゲル層表面に形成された細胞集団は、数時間以内にマトリゲル層の内部に自発的に移動し、1日後には、球状の細胞凝集塊が確認された。応用例2の場合と同様、上部境界領域の面積に正比例して、初期細胞数が決まるため、細胞塊のサイズもことなっている(図9)。実施例2の浮遊状態での凝集塊形成と比べ、24時間程度早く凝集塊が形成された。これは、細胞周囲に移動及び、増殖の足場となるマトリゲルが豊富に存在したためであると考えられる。以上の結果により、本発明の手法を用いて、対象物質の、分布形状(サイズ)と分布密度の組み合わせを規定した集団群が、任意の材料面に形成できることが示された。
2 上部境界面(上部開口面)
3 下部境界面(下部開口面)
4 傾斜付き壁構造
5 外周溝
6 基材
7 壁
Claims (9)
- 微細な粒子あるいは分子の集団を、分布形状と分布面密度を規定して、基材上に形成する方法であって、目的とする分布形状と、分布密度に応じて設計される、先端がナイフリッジを形成するように接続された傾斜付き壁構造を有する貫通孔を並列配置したマスク材を準備し、当該物質の溶液あるいは懸濁液を、前記基材上に密着させた前記マスク材上に載置し、マスク材の傾斜付き壁構造によって規定される領域内に当該物質を沈降させることにより、前記壁構造の上部境界によって囲まれた領域を通過して、傾斜付き壁面に沿って沈降する物質が、前記壁構造の下部境界によって囲まれる領域の面積(下部開口面積)をs(mm2 )、壁構造の上部境界によって囲まれる領域の面積(上部開口面積)をS(mm2 )、対象物質の溶液又は懸濁液の濃度をC(mm−3)、加える液体の深さをL(mm)としたとき、壁構造の下部境界によって囲まれた所定の領域内に集積する物質の分布面密度D(mm−2)は、式D=CLS/sにしたがって、壁構造の下部境界によって囲まれた基材上の所定領域内に堆積することを特徴とする任意の分布形状と分布密度を有する微細な粒子あるいは分子の集団を同時に多種大量生成する方法。
- 請求項1の方法であって、前記微細粒子あるいは分子が、細胞、タンパク質、核酸、生体由来高分子、金属微粒子、半導体微粒子、セラミック微粒子、樹脂微粒子のいずれかを含むことを特徴とする任意の分布形状と分布密度を有する微細な粒子あるいは分子の集団を同時に多種大量生成する方法。
- 請求項1の方法であって、当該物質を溶解、あるいは懸濁させる液体が、マスク材と反応しない液体であることを特徴とする任意の分布形状と分布密度を有する微細な粒子あるいは分子の集団を同時に多種大量生成する方法。
- 請求項1の方法であって、前記マスク材上の壁構造の上部境界線に沿って、壁構造の上面に溝を有するものを用いていることを特徴とする任意の分布形状と分布密度を有する微細な粒子あるいは分子の集団を同時に多種大量生成する方法。
- 請求項1の方法であって、前記マスク材の壁構造の表面が、対象物質の接着を抑制する材料で作製されているものを用いていることを特徴とする任意の分布形状と分布密度を有する微細な粒子あるいは分子の集団を同時に多種大量生成する方法。
- 請求項1の方法であって、前記マスク材を載置する前記基材の全部又は一部が、多孔質材、繊維材、ゲル材のいずれか、または、これらの組み合わせたものを用いていることを特徴とする任意の分布形状と分布密度を有する微細な粒子あるいは分子の集団を同時に多種大量生成する方法。
- 請求項1〜請求項6に記載の微細な粒子あるいは分子の集団を、分布形状と分布面密度を規定して、基材上に形成する方法に使用するマスク材であって、前記マスク材は上部開口面と下部開口面の形状を独立に任意に規定し、その間を傾斜付き壁構造によって繋いだ形状として構成されていることを特徴とするマスク材。
- 前記マスク材の壁構造の上部境界線に沿って、壁構造の上面に溝を形成したことを特徴とする請求項7に記載のマスク材。
- 前記マスク材の壁構造の表面が、対象物質の接着を抑制する材料で作製されていることを特徴とする請求項7または8に記載のマスク材。
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