WO2010032595A1 - 任意の分布形状と分布密度を有する分子または粒子の集団を同時に多種大量生成する方法とその方法に使用するマスク材 - Google Patents

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    • C12N2535/10—Patterned coating

Definitions

  • the present invention relates to a method for forming a group of fine particles or molecules on a substrate by defining a distribution shape and distribution density, and more specifically, from a solution or suspension of the substance, Using sedimentation, a method capable of forming a large number of subpopulations of the substance having a distribution shape and distribution density of a plurality of conditions on the same substrate in a single operation, and implementing the method It is related with the device (henceforth a mask material) for doing.
  • the process of forming a group of fine particles or molecules on a substrate with a specified distribution shape and distribution density has become important in many fields.
  • the research to assemble cells in a three-dimensional manner and culture has become active.
  • cells are cultured in a floating state in a container that has been subjected to a surface treatment to prevent cell adhesion, and a method of self-assembling into minute spheres by fluid oscillation and cell adhesion force,
  • a gel material that can freely move in three dimensions and self-organized.
  • biochemical reagents such as gene transfer agents can be applied to cells in culture as a field that requires a process of forming a population of fine particles or molecules with a specified distribution shape and distribution density.
  • a technique of locally acting at a prescribed concentration has become extremely important.
  • a technique for depositing a functional material such as metal nanoparticles on a substrate (base material) with a prescribed pattern and density has attracted attention as a new circuit board manufacturing process. Examples of patent publications related to the above technology include the following. Patent Publication 2006-55069 Patent Publication 2006-122012
  • the distribution shape of the aggregate of target substances and the optimum value of the distribution density differ depending on the target substance and the target function. Therefore, an aggregate must be formed for many combinations of shape and density, and the optimum value must be studied experimentally.
  • the shape of the aggregate it is possible to form a plurality of shapes of aggregates collectively by creating a plurality of hole structures on a single substrate (base material). Is possible.
  • the distribution density it is necessary to prepare a plurality of substrates (base materials) and form aggregates using solutions or suspensions having different concentrations of the target substance for each substrate.
  • one of the problems to be solved by the present invention is to add a mother solution or suspension of one concentration containing the target substance onto a mask material having a predetermined structure placed on the substrate.
  • Another object of the present invention is the method as described above, and a method for improving the utilization efficiency of a substance by reducing the proportion of a substance that is deposited outside a target region and is not used for group formation, and It is to provide a mask material for this purpose.
  • Yet another object of the present invention is the method as described above, wherein in the initial stage, a substance deposited outside the target region enters the target region by the subsequent fluctuation of the fluid or the like.
  • the above problem is to form a large number of subpopulation groups of the substance having a plurality of distribution shapes and distribution densities on the same substrate from a solution or suspension of the substance.
  • a process for producing a mask material having an inclined wall structure designed according to a target distribution shape and distribution density, and a solution or suspension of the substance on a target substrate In addition to the placed mask material, and a process of allowing the substance to settle in an area defined by the sloped wall structure, thereby allowing the substance to settle through the area surrounded by the upper boundary of the wall structure Is achieved by a method characterized in that it is accumulated in a predetermined area surrounded by the lower boundary of the wall structure.
  • the technical solution means adopted by the present invention is: A method of forming a group of fine particles or molecules on a substrate with a specified distribution shape and distribution surface density, and a sloped wall designed according to the target distribution shape and distribution density A mask material in which through-holes having a structure are arranged in parallel is prepared, and a solution or suspension of the substance is placed on the mask material in close contact with the base material, and the mask material has an inclined wall structure. By allowing the material to settle within a defined area, the material that passes through the region surrounded by the upper boundary of the wall structure and settles along the sloped wall is surrounded by the lower boundary of the wall structure.
  • a method of simultaneously producing a large number of molecules or populations of particles having an arbitrary distribution shape and distribution density characterized by being deposited in a predetermined region on a substrate.
  • the fine particles or molecules include any of cells, proteins, nucleic acids, biological polymers, metal fine particles, semiconductor fine particles, ceramic fine particles, and resin fine particles.
  • a large number of molecules or populations of particles having a distribution shape and distribution density are generated simultaneously.
  • the liquid in which the substance is dissolved or suspended is a liquid that does not react with the mask material, and a group of molecules or particles having an arbitrary distribution shape and distribution density is simultaneously obtained. This is a method for producing a large number of types.
  • an arbitrary distribution shape and distribution density characterized by using a groove having an upper surface of the wall structure along the upper boundary line of the wall structure on the mask material.
  • This is a method for simultaneously generating a large number of molecules or particle populations possessed.
  • the entire upper surface of the mask material is a groove or an inclined surface toward one of the lower opening surfaces, and the upper portion does not have a horizontal surface.
  • a large number of molecules or populations of particles having an arbitrary distribution shape and distribution density are simultaneously generated.
  • an arbitrary distribution shape and distribution density characterized in that the surface of the wall structure of the mask material is made of a material that suppresses adhesion of the target substance.
  • the mask material is characterized in that a groove is formed on the upper surface of the wall structure along the upper boundary line of the wall structure of the mask material. Further, the mask material is characterized in that all the upper surfaces of the mask material are inclined surfaces toward the grooves or any of the lower opening surfaces, and the upper surface does not have a horizontal surface. Further, the mask material is characterized in that the surface of the wall structure of the mask material is made of a material that suppresses adhesion of the target substance. In addition, the mask material is characterized in that any one of silicon rubber, fluorine rubber, or a combination thereof is used as the material of the mask material.
  • any one of polyethylene glycol, polypropylene glycol, polyvinyl alcohol, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polyacrylamide, or a hydrophilic polymer in combination of these is used. It is a mask material characterized by being.
  • the following excellent effects can be achieved. 1) From a solution or suspension of the substance of one kind of concentration, a large amount of a group of the substance having an arbitrary distribution shape and distribution density on a substrate surface of various materials in one operation. As a result, it becomes possible to efficiently analyze various combinations of shapes and densities. 2) Further, according to the technique of the present invention, almost the entire amount of the substance used for the operation is used for population formation. As a result, the amount of expensive materials and rare materials used can be saved.
  • FIG. 1 is a schematic cross-sectional view showing an example of a mask material having an inclined wall structure according to the present invention and a method for forming a substance group using the same.
  • FIG. 2 is a schematic cross-sectional view showing an example of the mask material having the inclined wall structure shown in FIG. 1 and a substance group forming method using the mask material.
  • FIG. 3 is an electron microscope perspective view of one embodiment of a mask material having an inclined wall structure.
  • FIG. 4 is a graph showing the relationship between the length of one side of the upper boundary region and the number of beads deposited on the lower boundary region surface for the bead population formed using the mask material shown in FIG.
  • FIG. 5 is an optical microscope observation image after the formation of microbead groups.
  • FIG. 6 is a diagram showing cell mass formation in a floating state.
  • FIG. 7 shows that a cell suspension of pancreatic stem cells cultured on a non-adhesive mask material by dropping 200 ⁇ l of a cell suspension at a concentration of 2 ⁇ 10 5 cells / ml at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere for 3 days. It is a photograph shown.
  • FIG. 8 is a schematic cross-sectional view for explaining cell mass formation in the three-dimensional matrix according to this example.
  • FIG. 9 is a photograph showing the cell mass of pancreatic stem cells that were formed on the matrigel surface and cultured for 4 days using the present invention.
  • the invention according to the present invention provides a process for producing a mask material having an inclined wall structure designed according to a target distribution shape and distribution density, and a solution or suspension of the substance on a target substrate.
  • a process of allowing the substance to settle in an area defined by the sloped wall structure thereby allowing the substance to settle through the area surrounded by the upper boundary of the wall structure Are accumulated in a predetermined region surrounded by the lower boundary of the wall structure.
  • FIG. 2 is a schematic cross-sectional view showing an example of a mask material having an inclined wall structure similar to that in FIG. 1 and a method for forming a substance group using the same
  • FIG. 3 is an electron microscope of one embodiment of the mask material having an inclined wall structure
  • 4 is a graph showing the relationship between the length of one side of the upper boundary region and the number of beads deposited on the lower boundary region surface for the bead population formed using the mask material shown in FIG. 3, and FIG. It is an optical microscope observation image after group formation of microbeads.
  • reference numeral 1 denotes a mask material. This mask material arbitrarily defines the shapes of the upper opening surface (upper boundary surface) 2 and the lower opening surface (lower boundary surface) 3 and inclines between them.
  • a substantially inverted quadrangular pyramid-shaped concave portion configured as a shape connected by the attached wall structure (inclined surface) 4 is provided, and a large number of concave portions are arranged in a mask shape on the mask material as shown in FIG.
  • the shape of the recess is not limited to an inverted quadrangular pyramid shape, and an appropriate shape such as an inverted cone shape or an inverted triangular pyramid shape can be selected.
  • the inclined wall structure can change the inclination angle in a plurality of stages as required.
  • an outer peripheral groove 5 is formed on the outer periphery of the mask material 1 as appropriate.
  • the inclined surfaces come into contact with each other to form a knife ridge as shown in FIG.
  • the base material 6 on which the mask material 1 is placed has a wall 7 in the periphery in FIG. 2, and the mask material 1 is placed inside the wall 7 as shown in FIG.
  • the wall 7 formed around the substrate 6 is not always necessary, and can be made unnecessary as appropriate.
  • the distribution shape of the target substance can be defined by the lower boundary (the shape of the lower opening surface) of the wall structure.
  • the area (lower opening area) of the region surrounded by the lower boundary of the wall structure is s (mm 2 )
  • the area (upper opening area) of the region surrounded by the upper boundary of the wall structure is S (mm 2 )
  • the concentration of the solution or suspension of the substance is C (mm-3) and the depth of the liquid to be added is L (mm)
  • a plurality of combinations of the shapes of the upper boundary and the lower boundary are prepared on the same mask material, so that the distribution shape and distribution can be obtained from one type of mother solution or suspension containing the target substance.
  • Forming a subpopulation group of the substances having a plurality of combinations with different densities on the same base material by an operation of adding a single mother solution or suspension to the mask material placed on the target base material. Can do.
  • all the upper surfaces of the sloped wall structure 4 of the mask material 1 are inclined toward any lower boundary surface, deposition of substances outside the target region can be prevented. Thereby, almost the whole amount of the added substance can be used for the group formation.
  • the substance deposited outside the target region at the initial stage is processed in the subsequent process.
  • the sloped wall structure portion, the upper surface portion, and the bottom surface portion may be made of the same material or different materials.
  • the mask material having a sloped wall structure according to the present invention preferably has a material for suppressing adhesion of the substance at least on the sloped wall portion, and has an appropriate surface modification or coating. This does not apply when the constituent material itself is non-adhesive to the substance.
  • the liquid in which the substance is dissolved or suspended is a liquid that does not react with the mask material.
  • Substances to be formed as a group by the method of the present invention may be cells, proteins, nucleic acids, biological polymers, metal fine particles, semiconductor fine particles, ceramic fine particles, resin fine particles, or a combination thereof. .
  • a mask material having an inclined quadrangular pyramid-shaped inclined wall structure made of PDMS shown in FIG. 3 was prepared using a mold.
  • the mold of the mold was produced by an optical modeling method using an epoxy-based photosensitive resin, but the production method of the mask material of the present invention is not limited to this.
  • One side of the square in the upper boundary region of the sloped wall structure has three patterns of 400 ⁇ m, 600 ⁇ m, and 800 ⁇ m, and one side of the square in the lower boundary region has three patterns of 40 ⁇ m, 80 ⁇ m, and 160 ⁇ m.
  • a large number of attached wall structures were densely arranged on a base of 8 mm square.
  • the mask material was adsorbed on a glass substrate, and 50 ⁇ l of a microbead suspension having a concentration of 2.3 ⁇ 10 5 pieces / ml was dropped thereon.
  • the number of beads deposited in each region surrounded by the wall was directly proportional to the area of the upper boundary region as shown in the theoretical value (see FIG. 4).
  • the distribution surface density of beads in the lower boundary region was inversely proportional to the area of the lower boundary region (FIG. 5). Further, at this time, the deposition of beads outside the target region, that is, other than the lower boundary region was not confirmed.
  • the target substance can be efficiently used for group formation by making the upper part of the wall structure all inclined.
  • the group of microbeads having a prescribed distribution shape and distribution surface density can be collectively formed on the same substrate from one concentration of suspension using the method of the present invention. Indicated.
  • FIG. 6 shows a schematic diagram of an application example of the present invention.
  • This example shows cell clump formation in a floating state, and the cells accumulate on the base material and gather, but the base material is non-cell-adhesive, so the cells adhere to each other and spontaneously A state of forming a spherical cell mass is shown.
  • neighboring cells spontaneously join to form an aggregate of about 200 ⁇ m at the maximum.
  • mouse pancreatic duct-derived stem cells were used.
  • a PDMS mask material having the shape shown in FIG. 3 was prepared by the same method as in Example 1, and then the surface of the mask material was immersed in an amphiphilic high molecular weight PEG solution to make it hydrophilic. Thereby, the adhesion
  • This mask material was placed on a cell non-adhesive substrate.
  • FIG. 7 shows that a cell suspension of pancreatic stem cells cultured on a non-adhesive mask material by dropping 200 ⁇ l of a cell suspension at a concentration of 2 ⁇ 10 5 cells / ml at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere for 3 days.
  • FIG. 8 is a schematic cross-sectional view for explaining cell mass formation in the three-dimensional gel matrix according to this example. After the cells are deposited on the lower opening surface of the mask material, the cells spontaneously move into the three-dimensional gel matrix having high cell adhesion, so that the cell population formed on the substrate surface moves into the gel with time. .
  • the cells grow three-dimensionally and spontaneously form a spherical cell mass.
  • a cell population group formed by defining a distribution shape and a distribution surface density on not only a solid substrate but also various material surfaces. It can also be applied to a gel material suitable for growth.
  • a mouse pancreatic duct-derived stem cell is used as a target substance, and a cell population group is formed on the surface of the Matrigel layer suitable for cell growth using the mask material of the present invention, so that the islet of living organisms in Matrigel
  • the optimum initial conditions for expressing a structure and function similar to those of the above were collectively examined (FIG. 8).
  • a PDMS mask material having the shape shown in FIG. 3 was prepared by molding so that the bottom surface penetrated, and then the surface was hydrophilized by the same method as in Example 2. Then, the said mask material was left still on the surface of a 2 mm thick matrigel layer, and both were adhere
  • the cell population formed on the surface of the Matrigel layer in each region surrounded by the wall spontaneously moves to the inside of the Matrigel layer within several hours, and a spherical cell aggregate is confirmed after one day. It was done.
  • the size of the cell mass is also different (FIG. 9). Compared with the aggregate formation in the floating state of Example 2, the aggregate was formed about 24 hours earlier. This is considered to be because there was abundant Matrigel as a scaffold for migration and proliferation around the cells.
  • a group group in which a combination of a distribution shape (size) and a distribution density of a target substance is defined can be formed on an arbitrary material surface by using the method of the present invention.
  • the present invention has been described with reference to the embodiments, the present invention is not limited to the above embodiments.
  • the material of the mask material, the shape of the recess formed in the mask material, etc. can be freely selected according to the target mother liquor.
  • the present invention can be used in the field of regenerative medicine for reproducing the function of cells in vivo in vitro.

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Abstract

　対象物質を含む１種類の濃度の懸濁液を、基材上に載置した所定の構造を有するマスク材上に加えることにより、物質の沈降を利用して、分布形状と分布密度の複数の組み合わせ条件を有する当該物質の子集団群を多種大量に形成すること。　微細な粒子あるいは分子の集団を、分布形状と分布面密度を規定して、基材上に形成する方法であって、目的とする分布形状と、分布密度に応じて設計される、傾斜付き壁構造を有する貫通孔を並列配置したマスク材を準備し、当該物質の溶液あるいは懸濁液を、前記マスク材上に載置し、マスク材の傾斜付き壁構造によって規定される領域内に当該物質を沈降させることにより、前記壁構造の上部境界によって囲まれた領域を通過して、傾斜付き壁面に沿って沈降する物質が、壁構造の下部境界によって囲まれた、基材上の所定領域内に堆積する。

Description

任意の分布形状と分布密度を有する分子または粒子の集団を同時に多種大量生成する方法とその方法に使用するマスク材
　本発明は、微細な粒子あるいは分子の集団を、分布形状と分布密度を規定して、基材上に形成する方法に係り、より詳細には、当該物質の溶液あるいは懸濁液から、物質の沈降を利用して、複数条件の分布形状と分布密度を有する当該物質の子集団群を、１回の操作で、同一の基材上に多種大量形成することができる方法と、その方法を実施するためのデバイス（以下マスク材という）に関するものである。
　微細な粒子あるいは分子の集団を、規定の分布形状と分布密度で基材上に形成する過程は、多くの分野で重要となってきている。
　例えば、再生医療研究では、細胞の生体内での機能を生体外で再現するため、細胞を３次元的に集合させて、培養する研究が盛んになってきている。そのための一般的手法としては、細胞の接着を防ぐ表面処理を施した容器内で細胞を浮遊状態で培養し、流体の揺動と細胞同士の接着力によって、微小な球状に自己集合させる手法や、細胞が３次元的に自由に移動できるゲル材料内で培養し、自己組織化させる手法などがある。しかし、これらの手法では、集合体の形成がランダムに起こるため、同一の容器内であっても、形成される集合体のサイズは、１０μｍから数１００μｍまでと、大きく分散する。
　規定のサイズを有する細胞の集合体を形成する手法として、〔１〕微小な円筒容器を用いるものや、〔２〕微小貫通孔を有する基板（基材）を用いる手法などがある。これらはいずれも、平坦な基材上に微細な孔構造を作製し、その上に対象細胞を懸濁した液体を加えることにより、細胞が基材底面に向かって沈降し、最終的に、孔構造の規定する形状内で細胞集合体を形成させるものである。
　微細な粒子あるいは分子の集団を、規定の分布形状と分布密度で形成する過程が必要となる分野としては、前記以外にも、遺伝子導入剤などの生化学試薬を、培養中の細胞に対して、局所的に規定の濃度で作用させる技術が、細胞の分化を誘導する上で、極めて重要となってきている。あるいは、電子産業分野でも、金属ナノ粒子などの機能性材料を、規定のパターンと密度で基板（基材）上に堆積させる技術が、新たな回路基板作製プロセスとして注目されている。
　上記技術に関連した特許公報の例として以下のものがある。
特許公開２００６−５５０６９ 特許公開２００６−１２２０１２
　対象とする物質や、目的とする機能によって、対象物質の集合体の分布形状及び、分布密度の最適値は異なる。よって、形状と密度の多数の組み合わせについて集合体を形成させ、最適値を実験的に検討しなければならない。従来手法では、原理上、集合体の形状に関しては、１枚の基板（基材）上に複数形状の孔構造を作製することにより、一括して多種類の形状の集合体を形成させることが可能である。
　しかし、分布密度に関しては、複数の基板（基材）を用意し、基板ごとに、対象物質の濃度の異なる溶液あるいは懸濁液を用いて集合体を形成させなければならない。また、従来手法では、隣接する孔構造の間が平坦面となっているため、孔以外の部分にも対象物質が堆積し、それらは集合体形成に利用されないため、対象物質の利用効率が低い。
さらに、従来手法では、初期に微小容器や孔以外の部分に堆積した物質が、周囲の液体の揺動により、その後の集合体形成中に孔内に侵入し、集合体の安定的形成を乱す要因となる。
　従って、本発明が解決しようとしている課題の一つは、対象物質を含む１種類の濃度の母溶液あるいは懸濁液を、基材上に載置した所定の構造を有するマスク材上に加えることにより、物質の沈降を利用して、分布形状と分布密度の複数の組み合わせ条件を有する当該物質の子集団群を、同一の基材上に多種大量形成することができる方法及び、そのためのマスク材を提供することである。
　本発明のもう１つの課題は、上記の如き手法であって、目的とする領域外に堆積する、集団形成に利用されない物質の割合を削減することにより、物質の利用効率を改善する方法及び、そのためのマスク材を提供することである。
　本発明のさらにもう１つの課題は、前記の如き方法であって、初期段階で、目的とする領域外に堆積した物質が、その後の流体の揺動などによって、目的領域内に侵入することを防ぐことのできる方法及び、そのためのマスク材を提供することである。
　上記の課題は、本発明によれば、当該物質の溶液あるいは懸濁液から、複数条件の分布形状と分布密度を有する当該物質の子集団群を、同一の基材上に多種大量形成することができる方法であって、目的とする分布形状と分布密度に応じて設計される傾斜付き壁構造を有するマスク材を作製する過程と、当該物質の溶液あるいは懸濁液を、対象基材上に載置した前記マスク材に加え、傾斜付き壁構造によって規定される領域内に当該物質を沈降させる過程とを含み、これにより壁構造の上部境界によって囲まれた領域内を通過して沈降する物質が、壁構造の下部境界によって囲まれた所定の領域内に集積されることを特徴とする方法により達成される。
　このため、本発明が採用した技術解決手段は、
　微細な粒子あるいは分子の集団を、分布形状と分布面密度を規定して、基材上に形成する方法であって、目的とする分布形状と、分布密度に応じて設計される、傾斜付き壁構造を有する貫通孔を並列配置したマスク材を準備し、当該物質の溶液あるいは懸濁液を、前記基材上に密着させた前記マスク材上に載置し、マスク材の傾斜付き壁構造によって規定される領域内に当該物質を沈降させることにより、前記壁構造の上部境界によって囲まれた領域を通過して、傾斜付き壁面に沿って沈降する物質が、壁構造の下部境界によって囲まれた、基材上の所定領域内に堆積することを特徴とする任意の分布形状と分布密度を有する分子または粒子の集団を同時に多種大量生成する方法である。
　また、前記の方法であって、前記微細粒子あるいは分子が、細胞、タンパク質、核酸、生体由来高分子、金属微粒子、半導体微粒子、セラミック微粒子、樹脂微粒子のいずれかを含むことを特徴とする任意の分布形状と分布密度を有する分子または粒子の集団を同時に多種大量生成する方法である。
　また、前記の方法であって、当該物質を溶解、あるいは懸濁させる液体が、マスク材と反応しない液体であることを特徴とする任意の分布形状と分布密度を有する分子または粒子の集団を同時に多種大量生成する方法である。
　また、前記の方法であって、前記マスク材上の壁構造の上部境界線に沿って、壁構造の上面に溝を有するものを用いていることを特徴とする任意の分布形状と分布密度を有する分子または粒子の集団を同時に多種大量生成する方法である。
　また、前記の方法であって、前記マスク材上部の全ての面を、溝または、いずれかの下部開口面へ向かう傾斜面とし、上部には水平面を有しないものを用いていることを特徴とする任意の分布形状と分布密度を有する分子または粒子の集団を同時に多種大量生成する方法である。
　また、前記の方法であって、前記マスク材の壁構造の表面が、対象物質の接着を抑制する材料で作製されているものを用いていることを特徴とする任意の分布形状と分布密度を有する分子または粒子の集団を同時に多種大量生成する方法である。
　また、前記の方法であって、前記マスク材を載置する前記基材の全部又は一部が、多孔質材、繊維材、ゲル材のいずれか、または、これらの組み合わせたものを用いていることを特徴とする任意の分布形状と分布密度を有する分子または粒子の集団を同時に多種大量生成する方法である。
　また、前記の微細な粒子あるいは分子の集団を、分布形状と分布面密度を規定して、基材上に形成する方法に使用するマスク材であって、前記マスク材は上部開口面と下部開口面の形状を独立に任意に規定し、その間を傾斜付き壁構造によって繋いだ形状として構成されていることを特徴とするマスク材である。
　また、前記マスク材の壁構造の上部境界線に沿って、壁構造の上面に溝を形成したことを特徴とするマスク材である。
　また、前記マスク材の上部の全ての面を、溝または、いずれかの下部開口面へ向かう傾斜面とし、上部には水平面を有しないことを特徴とするマスク材である。
　また、前記マスク材の壁構造の表面が、対象物質の接着を抑制する材料で作製されていることを特徴とするマスク材である。
　また、前記マスク材の材料として、シリコンゴム、フッ素ゴムのいずれか、または、これらの組み合わせたものを用いていることを特徴とするマスク材である。
　また、前記マスク材の壁構造の表面修飾材料として、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリルアミドのいずれか、または、これらを組み合わせた親水性高分子を用いていることを特徴とするマスク材である。
　本発明によれば、以下のような優れた効果を奏することができる。
１）１種類の濃度の当該物質の溶液又は懸濁液から、任意の分布形状と分布密度を有する当該物質の集団群を、様々な材料の基材表面に、１回の操作で、多種大量に一括形成することが可能となり、結果として、多種多量の形状と密度の組み合わせ条件の解析を効率的に行うことが可能となる。
２）また、本発明の手法によれば、操作に用いる当該物質のほぼ全量が集団形成に利用される。結果として、高価な物質、希少な物質の使用量を節約できる。
　図１は本発明に係る傾斜付き壁構造を有するマスク材およびそれを用いた物質集団形成方法の一例を示す断面模式図である。
　図２は図１に示す傾斜付き壁構造を有するマスク材およびそれを用いた物質集団形成方法の一例を示す断面模式図である。
　図３は傾斜付き壁構造を有するマスク材の１実施形態の電子顕微鏡斜視像である。
　図４は図２に示すマスク材を使用して形成したビーズ集団について、上部境界領域の一辺の長さと、下部境界領域面に堆積したビーズの数の関係を示すグラフである。
　図５はマイクロビーズの集団形成後の光学顕微鏡観察像である。
　図６は浮遊状態での細胞塊形成を示す図である。
　図７は非接着性マスク材上に、２×１０５個／ｍｌの濃度の細胞懸濁液２００μｌを滴下し、３７°Ｃ、５％ＣＯ２雰囲気下で、３日間培養した膵幹細胞の細胞塊を示す写真である。
　図８は本例に係る３次元マトリックス内での細胞塊形成を説明するための断面模式図である。
　図９は本発明を用いて、マトリゲル面上に集団形成された後、４日間培養した膵幹細胞の細胞塊を示す写真である。
　１　　　マスク材
　２　　　上部境界面（上部開口面）
　３　　　下部境界面（下部開口面）
　４　　　傾斜付き壁構造
　５　　　外周溝
　６　　　基材
　７　　　壁
　本発明に係る発明は、目的とする分布形状と分布密度に応じて設計される傾斜付き壁構造を有するマスク材を作製する過程と、当該物質の溶液あるいは懸濁液を、対象基材上に載置した前記マスク材に加え、傾斜付き壁構造によって規定される領域内に当該物質を沈降させる過程とを含み、これにより壁構造の上部境界によって囲まれた領域内を通過して沈降する物質が、壁構造の下部境界によって囲まれた所定の領域内に集積されることを特徴とするものである。
　実施形態
　本発明の１実施形態について、図に基づいて説明すると、図１は本発明に係る傾斜付き壁構造を有するマスク材およびそれを用いた物質集団形成方法の一例を示す断面模式図、図２は図１と同様の傾斜付き壁構造を有するマスク材およびそれを用いた物質集団形成方法の一例を示す断面模式図、図３は傾斜付き壁構造を有するマスク材の１実施形態の電子顕微鏡斜視像、図４は図３に示すマスク材を使用して形成したビーズ集団について、上部境界領域の一辺の長さと、下部境界領域面に堆積したビーズの数の関係を示すグラフ、図５はマイクロビーズの集団形成後の光学顕微鏡観察像である。
　図１、図２において、１はマスク材であり、このマスク材は上部開口面（上部境界面）２と下部開口面（下部境界面）３の形状を独立に任意に規定し、その間を傾斜付き壁構造（傾斜面）４によって繋いだ形状として構成された略逆四角錐状の凹部を有し、マスク材にはこの凹部が図３に示すように枡目状に多数配列されている。なお、凹部の形状は逆四角錐状に限定することはなく、逆円錐形、逆三角錐形等適宜の形状を選択することができる。また、傾斜付き壁構造は、必要に応じて複数段階に傾斜角度を変更することができる。
　マスク材１の外周には図２に示すように適宜外周溝５が形成されており、また凹部同士を連結する境界部は図２に示すように傾斜面同士が当接してナイフリッジを形成するように接続されている。このように壁上部を全て傾斜面とすることにより、目的領域外への対象物質の堆積を防ぐことができ、また外周に外周溝を形成することにより容器側面の影響による不均等な物質侵入を防止することができる。
　前記マスク材１を載置する基材６は図２では周囲に壁７を有しており、この壁７の内側に前記マスク材１が図２に示すように載置される。なお、前記基材６の周囲に形成する壁７は、必ずしも必要ではなく、適宜不要とすることができる。
　上述したように本発明によれば、対象物質の分布形状は、壁構造の下部境界（下部開口面の形状）によって規定することができる。即ち、前記壁構造の下部境界によって囲まれる領域の面積（下部開口面積）をｓ（ｍｍ２）、壁構造の上部境界によって囲まれる領域の面積（上部開口面積）をＳ（ｍｍ２）、対象物質の溶液又は懸濁液の濃度をＣ（ｍｍ−３）、加える液体の深さをＬ（ｍｍ）とすると、壁構造の下部境界によって囲まれた所定の領域内に集積する物質の分布面密度Ｄ（ｍｍ−２）は、下式で表される。
　Ｄ＝ＣＬＳ／ｓ
　よって、傾斜付き壁構造の上部境界と、下部境界を、それぞれ独立に規定することにより、任意の分布形状と分布密度を有する、当該物質の集団を対象基材上に形成することができる。さらに、上部境界と下部境界の形状の複数の組み合わせを、同一のマスク材上に多数作製しておくことにより、対象物質を含む１種類の濃度の母溶液あるいは懸濁液から、分布形状と分布密度の異なる複数の組み合わせを有する当該物質の子集団群を、一度の母溶液あるいは懸濁液を対象基材上に載置した前記マスク材に加える操作で、同一基材上に一括形成することができる。
　上記の本発明において、マスク材１の傾斜付き壁構造４の上面を全て、いずれかの下部境界面へ向か傾斜面とすれば、目的領域外への物質の堆積を防ぐことができる。これにより、加えた物質のほぼ全量を集団形成に利用することができる。
　また、上記の本発明において、マスク材１の壁構造４の上部境界線に沿って、壁構造の上面に溝を設けることにより、初期段階で、目的領域外に堆積した物質が、その後の過程で、意図せず、領域内に侵入することを防ぐことができる。
　本発明の傾斜付き壁構造を有するマスク材１は、傾斜付き壁構造部分と、上面部分と、底面部分とが、それぞれ同一材料もしくは、異なる材料で作製されていてよい。
　また、本発明の傾斜付き壁構造を有するマスク材は、少なくとも傾斜壁部分に当該物質の接着を抑制するための物質が、適当な表面修飾あるいはコーティングがなされていることが好ましいが、マスク材を構成する材料自体が当該物質に対して非接着性である場合は、この限りでない。
　また、当該物質を溶解、あるいは懸濁させる液体が、マスク材と反応しない液体であることを使用することができる。
　本発明の手法で集団形成させる対象となる物質は、細胞、タンパク質、核酸、生体由来高分子、金属微粒子、半導体微粒子、セラミック微粒子、樹脂微粒子のいずれかまたは、これらを組み合わせた系であってよい。
マイクロビーズの集合体形成
　本発明の実施例の１つとして、直径１０μｍのラテックス製マイクロビーズを用いた集団形成について示す。図３に示すＰＤＭＳ製の、逆四角錐形状の傾斜付き壁構造を有するマスク材をモールドにより作製した。モールドの鋳型は、エポキシ系光感光性樹脂を用いて、光造形法により作製したが、本発明のマスク材の作製方法はこれに限るものではない。
　傾斜付き壁構造の上部境界領域の正方形の一辺は、４００μｍ、６００μｍ、８００μｍの３通り、下部境界領域の正方形の一辺は、４０μｍ、８０μｍ、１６０μｍの３通りとし、合計９種類の組み合わせを有する傾斜付き壁構造を、８ｍｍ四方の基材上に密に多数配置した。
　前記マスク材をガラス基材上に吸着させ、その上に、２．３×１０５個／ｍｌの濃度のマイクロビーズ懸濁液５０μｌを滴下した。その結果、壁で囲まれた各領域内に堆積したビーズ数は、ほぼ理論値どおり、上部境界領域の面積に正比例することが確認された（図４参照）。また、その結果、下部境界領域内のビーズの分布面密度は、下部境界領域の面積に反比例することも確認された（図５）。さらに、この時、目的領域外、すなわち、下部境界領域以外での、ビーズの堆積は確認されなかった。これにより、壁構造の上部を全て傾斜面とすることにより、対象物質を効率よく集団形成に利用できることが示された。
　以上の結果により、本発明の手法を用いて、規定の分布形状、分布面密度を有するマイクロビーズの集団群を、１種類の濃度の懸濁液から、同一の基材上に一括形成できることが示された。
細胞非接着性でありプラスチック基材上での細胞の集合体形成
　図６に本発明の応用例の模式図を示す。この例は、浮遊状態での細胞塊形成を示すものであり、細胞は基材上に堆積して集合するが、基材は細胞非接着性であるため、細胞同士で接着し、自発的に球状の細胞塊を形成する状態を示している。
　細胞を浮遊状態で培養すると、近隣の細胞同士が自発的に接合して、最大で２００μｍ程度の凝集塊を形成することが知られている。本発明の方法を用いることにより、初期細胞数、細胞分布密度を規定して、浮遊状態での細胞塊の自発形成過程を観察することが可能となった（図６）。下記実施例では、マウス膵管由来幹細胞を用いた。
　図３に示す形状のＰＤＭＳ製マスク材を、実施例１と同様の方法により作製した後、マスク材表面を両親媒性の高分子量ＰＥＧ溶液に浸漬し、親水化した。これにより、細胞のマスク材表面への接着が抑制される。このマスク材を細胞非接着性の基材上に載置した。
　図７は非接着性マスク材上に、２×１０５個／ｍｌの濃度の細胞懸濁液２００μｌを滴下し、３７°Ｃ、５％ＣＯ２雰囲気下で、３日間培養した膵幹細胞の細胞塊を示す写真である。その結果、壁で囲まれた各領域内で、２日後に球状の細胞凝集塊が確認された。凝集塊のサイズは、上部境界領域の面積、即ち、初期細胞数に比例して大きくなっていた（図７）。また、今回の条件範囲内では、初期分布密度の有意な影響は見られなかった。
　以上の結果により、本発明の方法を用いて、対象物質の、分布形状（サイズ）と分布密度の多数の組み合わせによる実験結果が、１回の準備操作で、一括して取得できることが示された。
細胞接着性ゲル基材上での細胞の集合体形成
　細胞は生体内では、接着の足場となる高分子に囲まれて生存している。生体外でも、細胞接着性の高い高分子ゲル中で細胞培養することにより、生体内と類似の組織構造を形成させ、同等の機能を発現させることが、再生医療への応用などの観点から検討されている。
　図８は本例に係る３次元ゲルマトリックス内での細胞塊形成を説明するための断面模式図を示す。
　細胞はマスク材の下部開口面に堆積した後、細胞接着性の高い３次元ゲルマトリックス内に自発的に移動するため、基材表面に形成された細胞集団群は、時間とともにゲル内に移動する。ゲル内では、細胞は３次元的に増殖し、自発的に球状の細胞塊を形成する。
　本発明の手法によれば、分布形状と、分布面密度を規定して形成された細胞集団群を、固体基材のみならず、様々な素材面上に形成することが可能であり、細胞の成長に好適なゲル材料にも適用できる。下記実施例では、マウス膵管由来幹細胞を対象物質として、前記細胞の成長に適したマトリゲル層の表面に、本発明のマスク材を用いて細胞集団群を形成することにより、マトリゲル内で生体の膵島に類似した構造及び機能を発現させるための、至適初期条件を一括検討した（図８）。
　図３に示した形状のＰＤＭＳ製マスク材を、底面が貫通するように、モールドにより作製した後、実施例２と同様の方法により、表面を親水化した。その後、厚さ２ｍｍのマトリゲル層の表面に前記マスク材を静置し、ゲルの吸着力により両者を接着した。
　前記のマスク材上に、２×１０５個／ｍｌの濃度の細胞懸濁液２００μｌを滴下し、３７°Ｃ、５％ＣＯ２雰囲気下で、４日間培養した。その結果、壁で囲まれた各領域内のマトリゲル層表面に形成された細胞集団は、数時間以内にマトリゲル層の内部に自発的に移動し、１日後には、球状の細胞凝集塊が確認された。応用例２の場合と同様、上部境界領域の面積に正比例して、初期細胞数が決まるため、細胞塊のサイズもことなっている（図９）。実施例２の浮遊状態での凝集塊形成と比べ、２４時間程度早く凝集塊が形成された。
これは、細胞周囲に移動及び、増殖の足場となるマトリゲルが豊富に存在したためであると考えられる。以上の結果により、本発明の手法を用いて、対象物質の、分布形状（サイズ）と分布密度の組み合わせを規定した集団群が、任意の材料面に形成できることが示された。
　以上実施例をあげて本発明について説明したが、本発明は上記実施例に限定されることはない。例えば、マスク材の材質、マスク材に形成する凹部形状等は対象とする母液にあわせて自由に選択することができる。
　本発明は、細胞の生体内での機能を生体外で再現するための再生医療分野に利用することができる。

Claims (13)

  1. 微細な粒子あるいは分子の集団を、分布形状と分布面密度を規定して、基材上に形成する方法であって、目的とする分布形状と、分布密度に応じて設計される、傾斜付き壁構造を有する貫通孔を並列配置したマスク材を準備し、当該物質の溶液あるいは懸濁液を、前記基材上に密着させた前記マスク材上に載置し、マスク材の傾斜付き壁構造によって規定される領域内に当該物質を沈降させることにより、前記壁構造の上部境界によって囲まれた領域を通過して、傾斜付き壁面に沿って沈降する物質が、壁構造の下部境界によって囲まれた、基材上の所定領域内に堆積することを特徴とする任意の分布形状と分布密度を有する分子または粒子の集団を同時に多種大量生成する方法。
  2. 請求項１の方法であって、前記微細粒子あるいは分子が、細胞、タンパク質、核酸、生体由来高分子、金属微粒子、半導体微粒子、セラミック微粒子、樹脂微粒子のいずれかを含むことを特徴とする任意の分布形状と分布密度を有する分子または粒子の集団を同時に多種大量生成する方法。
  3. 請求項１の方法であって、当該物質を溶解、あるいは懸濁させる液体が、マスク材と反応しない液体であることを特徴とする任意の分布形状と分布密度を有する分子または粒子の集団を同時に多種大量生成する方法。
  4. 請求項１の方法であって、前記マスク材上の壁構造の上部境界線に沿って、壁構造の上面に溝を有するものを用いていることを特徴とする任意の分布形状と分布密度を有する分子または粒子の集団を同時に多種大量生成する方法。
  5. 請求項１の方法であって、前記マスク材上部の全ての面を、溝または、いずれかの下部開口面へ向かう傾斜面とし、上部には水平面を有しないものを用いていることを特徴とする任意の分布形状と分布密度を有する分子または粒子の集団を同時に多種大量生成する方法。
  6. 請求項１の方法であって、前記マスク材の壁構造の表面が、対象物質の接着を抑制する材料で作製されているものを用いていることを特徴とする任意の分布形状と分布密度を有する分子または粒子の集団を同時に多種大量生成する方法。
  7. 請求項１の方法であって、前記マスク材を載置する前記基材の全部又は一部が、多孔質材、繊維材、ゲル材のいずれか、または、これらの組み合わせたものを用いていることを特徴とする任意の分布形状と分布密度を有する分子または粒子の集団を同時に多種大量生成する方法。
  8. 請求項１~請求項７に記載の微細な粒子あるいは分子の集団を、分布形状と分布面密度を規定して、基材上に形成する方法に使用するマスク材であって、前記マスク材は上部開口面と下部開口面の形状を独立に任意に規定し、その間を傾斜付き壁構造によって繋いだ形状として構成されていることを特徴とするマスク材。
  9. 前記マスク材の壁構造の上部境界線に沿って、壁構造の上面に溝を形成したことを特徴とする請求項８に記載のマスク材。
  10. 前記マスク材の上部の全ての面を、溝または、いずれかの下部開口面へ向かう傾斜面とし、上部には水平面を有しないことを特徴とする、請求項８または請求項９に記載のマスク材。
  11. 前記マスク材の壁構造の表面が、対象物質の接着を抑制する材料で作製されていることを特徴とする請求項８~１０のいずれかに記載のマスク材。
  12. 前記マスク材の材料として、シリコンゴム、フッ素ゴムのいずれか、または、これらの組み合わせたものを用いていることを特徴とする請求項８~１１のいずれかに記載のマスク材。
  13. 前記マスク材の壁構造の表面修飾材料として、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリルアミドのいずれか、または、これらを組み合わせた親水性高分子を用いていることを特徴とする請求項８~１２のいずれかに記載のマスク材。
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