WO2014133051A1 - 細胞を複数の集団へと分けるためのマスク材 - Google Patents

Abstract

　当該マスク材は、目的とする集団の数に対応した複数の貫通孔Ｙが設けられた、熱硬化性樹脂組成物からなるシート状の本体部分Ｘを有する。該貫通孔Ｙは、（ａ）該シート状の本体部分Ｘの一方の主面に存在する第一開口から他方の主面側へと移動するにつれて横断面の面積が減少する角錐台形の漏斗状部分Ｙ１と、（ｂ）前記漏斗状部分Ｙ１の下端部から他方の主面に存在する第二開口に至る、円柱形またはｎ角柱形（ｎ≧８）の直管状部分Ｙ２とを有する。

Description

細胞を複数の集団へと分けるためのマスク材

　本発明は、熱硬化性樹脂組成物からなるシート状の本体部分に微細な貫通孔が多数設けられた構造を有するマスク材に関し、とりわけ、細胞培養などの分野において液体中に分散した細胞を所定の集団へと分けて沈降させるために用いられるマスク材に関する。

　近年、微細な粒子である細胞の集団を、予め定められた分布形状と分布密度にて基材上に形成する過程が多くの分野で重要となってきており、例えば、再生医療研究では、細胞の生体内での機能を生体外で再現するため、粒子状の細胞を３次元的に集合させて培養する研究が盛んになってきている。

　液体中に分散した粒子状の細胞（以下、「細胞粒子」または単に「細胞」と呼ぶ）を所定の密度を持った複数の集団へと分ける操作（以下、「細胞の集団化」と呼ぶ）のための有用な手段として、図６（ａ）に示すように、微小な多数の貫通孔Ｈを互いに隣接させて設けた樹脂製のシート（マスク材と呼ばれる）Ｍを用いる手法が知られている（特許文献１）。
　図６（ａ）に示すように、該手法は、細胞Ｐが分散した液体Ｑの底部にマスク材Ｍを配置し、該マスク材Ｍに多数設けた貫通孔Ｈ内に細胞Ｐを均等に分かれるように沈降させることによって、所定の密度を持った複数の集団へと分ける手法である。図６（ａ）に示すように、マスク材Ｍの各貫通孔は、液体中に分散した細胞が沈降する際に、細胞を誘うようにより上側が広く開口した漏斗状部となっている。図６の例では、各貫通孔Ｈは、上部の逆角錐台形状を呈する漏斗状部Ｈ１と、細胞を集団へと集めるためにより小さい口径となっている下部の角柱状を呈する直管状部分Ｈ２とからなる。
　図６（ｂ）は、液体中を細胞が各貫通孔の直管状部分Ｈ２にほぼ均等に分かれて沈降し、マスク材Ｍの底面に配置された基材Ｂ上に集団（細胞集合体）となって堆積した状態を示している。基材Ｂは、ガラス板や細胞接着性の高い高分子ゲルからなるシートなど、用途に応じて選択される。

　しかしながら、本発明者らが上記のようなマスク材を用いて細胞を多数の集団へと分ける手法を詳細に観察したところ、下記のような問題点が存在することがわかった。
　液体中に分散した細胞を全て貫通孔内に沈降させるためには、シートの上面が平面として残っていないように、図７（ａ）に示すように、該貫通孔を正方行列状に密に配置する必要がある。シートの上面が残っていると、そこに沈降した細胞は貫通孔内に落ちないからである。よって、上部の漏斗状部Ｈ１を逆角錐台形とし上面の開口形状を正方形として、該開口の１辺を隣りの開口の１辺と一致させることによって、稜線状のエッジＪ１を形成することがより好ましい態様となる。上部の漏斗状部Ｈ１が、逆角錐台形であると、該逆角錐台形の下端部の横断面（該貫通孔をシートの厚さの方向に垂直に切断したときの断面）の形状も正方形となるので、そこから下方に延びる直管状部分は四角柱となり、シートの裏面の開口形状も、図７（ａ）に示すように、正方形となっていた。
　しかし、上部の逆角錐台形の漏斗状部Ｈ１によって細胞を誘い込み、下部の四角柱形の直管状部分Ｈ２へと誘導すると、図７（ｂ）に一点鎖線で囲んで示すように、下端の正方形の開口の四隅の部分に細胞（黒い丸で示す）が集中的に集合し堆積する傾向が強くなる。このような下部の直管状部分内における細胞が均等に分散していない状態は、好ましい集合状態であるとは言えない。

国際公開公報ＷＯ２０１０／０３２５９５号

　本発明の課題は、上記問題を解決し、マスク材を用いた細胞の集団化において、該細胞を貫通孔内で好ましく分散させることができるマスク材を提供することにある。

　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、マスク材における上部の逆角錐台形の漏斗状部から下方に延びる下部の直管状部分を円柱状またはそれに近いｎ角柱形（ｎは８以上の整数）とすることで、沈降した細胞が該直管状部分の内部で好ましく分散し、上記従来の問題が緩和されることを見出し、本発明を完成させるに至った。

　本発明の主たる構成は、以下のとおりである。
（１）液体中に分散した細胞を、該液体の底部に配置した基材上に所定の密度を持った複数の集団へと分けて沈降させるために、該基材上に配置されるマスク材であって、
　当該マスク材は、熱硬化性樹脂組成物からなるシート状の本体部分を有し、該シート状の本体部分には、前記集団の数に対応した複数の貫通孔が設けられており、
　該貫通孔が、
　（ａ）該シート状の本体部分の一方の主面に存在する第一開口から他方の主面側へと移動するにつれて横断面の面積が減少する角錐台形の漏斗状部分と、
　（ｂ）前記漏斗状部分の下端部から他方の主面に存在する第二開口に至る、円柱形またはｎ角柱形（ｎ≧８）の直管状部分とを
有してなる形状である、前記マスク材。
（２）シート状の本体部分の厚さが０．０５ｍｍ～５ｍｍであり、第一開口の形状が一辺０．１ｍｍ～１ｍｍの正方形であり、第二開口の形状が直径０．０１ｍｍ～０．９ｍｍの円形であって、１つの貫通孔の第一開口の正方形の辺が、隣の貫通孔の第一開口の正方形の辺と接触している、上記（１）記載のマスク材。
（３）当該マスク材が、シリコーン樹脂組成物からなるものであって、かつ、下記（Ａ）の製造方法によって形成されたものである、上記（１）または（２）記載のマスク材。
　（Ａ）前記シリコーン樹脂組成物が、硬化温度に加熱されるまでは半硬化状態のままとなっている性質を有するものであって、
　当該マスク材の貫通孔を形成するための突起部を備えた押し型と、該押し型に対向する基板との間に、シート状を呈しかつ半硬化状態のシリコーン樹脂組成物を配置し、押し型を基板に押し付けて前記半硬化状態のシリコーン樹脂組成物に貫通孔を形成する押圧工程と、
　前記押圧工程の後、押し型を基板に押し付けた状態のままで、前記半硬化状態のシリコーン樹脂組成物を硬化温度に加熱して完全に硬化させる硬化工程とを有する、
マスク材の製造方法。
（４）液体中に分散した細胞が、哺乳動物の、膵管幹細胞、骨髄幹細胞、胚性幹細胞、体性幹細胞、前駆細胞である、上記（１）～（３）のいずれかに記載のマスク材。

　マスク材の貫通孔における上部の漏斗状部は従来どおり逆角錐台形とし、それに接続される下部の直管状部分を円柱形またはｎ角柱形（ｎ≧８）とすることで、従来では、図７（ｂ）のように直交する２つの内壁面に挟まれて溜まりやすくなっていた細胞が、本発明では、図２に示すように、直管状部分の円形（またはｎ角形）断面の内面に沿って、黒い丸で示す細胞がより広い角度に開放され、分散し易くなる。よって、本発明者らが着目した下部の開口（第二開口）における細胞の集中が緩和される。

　また、本発明では、マスク材を製造するに際し、成形型（押し型とそれに対向する基板とからなる型）内に供給する成形材料を半硬化状態の材料シートとすることを推奨する。
　ここでいう半硬化状態の熱硬化性樹脂組成物とは、５℃～３５℃程度の常温において、半硬化状態を保ち続ける性質（硬化温度に加熱されるまでは半硬化状態のままとなっている性質）を有し、硬化温度に加熱されることによって完全に硬化する性質をもった熱硬化性樹脂組成物である。
　熱硬化性樹脂組成物を半硬化状態としていったん硬化を止めかつシート状とし、この段階の材料シートに対して型内で穴あけ成形加工を行いながら同時に加熱硬化させるという手法によって、貫通孔を形成するための突起部が材料シートを押しのけて入り込んでいくので、気泡が含まれず、また、均一な材料分布によってヒケなどの成形不良が生じず、高い寸法精度を持った貫通孔が得られる。
　また、液状の熱硬化性樹脂材料を成形型に注入する場合と比べて、成形現場における材料の取扱いがより容易になるといった利点もある。
　以上の効果によって、例えば、孔径１０μｍ～１０００μｍといった微小な孔径の貫通孔を、熱硬化性樹脂製のシートに高い精度で形成することが可能になる。

図１は、本発明のマスク材の形状を説明するための図である。図１（ａ）は、当該マスク材の上面（角錐台形の漏斗状部分の開口である第一開口が存在する側の面）を見た図である。図１（ｂ）は、図１（ａ）のＡ－Ａ断面矢視図であって、貫通孔の断面を示す図である。 図２は、本発明によるマスク材を用いることによって、細胞（黒い丸で示す）が直管状部分（図の例では断面円形の円管状）の内部において、より好ましく分散し得ることを示す図である。図中の矢印は、細胞が移動する経路を示している。 図３は、本発明のマスク材の好ましい製造方法を説明するための図であって、成形装置（成形金型と材料シートを含む）の断面を示している。 図４は、本発明のマスク材を製造するための押し型の一部を示した斜視図である。 図５は、本発明のマスク材のより好ましい製造方法を説明するための図であって、成形装置（成形金型と材料シートを含む）の断面を示している。 図６は、従来のマスク材を用いて細胞を多数の集団へと分ける手法を説明する断面図である。 図７は、従来のマスク材の形態と、それを用いて細胞を多数の集団へと分ける手法の問題点を説明する図である。図中の矢印は、細胞が移動する経路を示している。

　以下、本発明について図面を参照しながら詳細に説明する。
　本発明のマスク材は、図６（ａ）、（ｂ）を用いて従来技術の説明で述べたように、液体Ｑ中に分散した細胞Ｐを、該液体の底部に配置した基材上に、所定の密度を持った複数の集団へと分けて沈降させるように、該基材上に配置されるシート状の本体部分を有するものであって、熱硬化性樹脂組成物からなり、図１に示すように複数の貫通孔が形成されている。
　当該マスク材は、前記集団の数に対応した複数の貫通孔Ｙを有し、該貫通孔は、次の（ａ）の漏斗状部分Ｙ１と、（ｂ）の直管状部分Ｙ２とを有してなる形状であって、これら２つの部分が共通の中心軸をもって上下で連結したものである。
　（ａ）該シート状の本体部分Ｘの一方の主面に存在する開口（第一開口）から他方の主面側へと移動するにつれて横断面の面積が減少する角錐台形の漏斗状部分Ｙ１。
　（ｂ）前記漏斗状部分の下端部から他方の主面に存在する開口（第二開口）に至る、円柱形またはｎ角柱形（ｎ≧８）の直管状部分Ｙ２。
　上記の形状とした貫通孔によって、直管状部分Ｙ２内に沈降した細胞は、該円柱形またはｎ角柱形の孔内の横断面形状に従って好ましく分散する。

　図１では、説明のために貫通孔の数を少なくしているが、実際には、貫通孔は微細でありその数はより多数である。また、符号Ｘｃで示す部分は、シート状の本体部分Ｘの上面Ｘａの周縁部に設けた壁部である。この壁部は、細胞が分散した液体を溜めるための容器を形成するためのものであって、好ましい態様である。そのような外周の囲いは、別途形成した部品を接着して形成してもよい。
　壁部を一体的に設ける場合、本体部分の上面Ｘａからの壁部Ｘｃの高さは、特に限定はされないが、０．２ｍｍ～１ｍｍ程度であればよい。

　図４に示す押し型の突起部の斜視図からも明らかなとおり、漏斗状部分Ｙ１と直管状部分Ｙ２とは相貫的に交わっており、両者の境界線は立体的な曲線を描いている。よって、図１（ｂ）に示す漏斗状部分Ｙ１の中心軸方向の長さ寸法Ｔ１は、シートの一方の主面（上面）Ｘａから、最下端（先端部分）までの寸法であると規定し、その部分からシートの他方の主面（下面）Ｘｂまでを直管状部分Ｙ２の中心軸方向の長さ寸法Ｔ２と規定する。

　シートの厚さは、特に限定はされないが、微小な細胞粒子の集団化のためには、各開口の大きさや、貫通孔の深さを考慮すると、０．０５ｍｍ～５ｍｍが好ましい厚さであり、０．１ｍｍ～１ｍｍがより好ましい厚さである。

　漏斗状部分Ｙ１の形状は、角錐台状である。シートの上面に存在する第一開口の形状は、長方形であってもよいが、上方に向かって均等に広がる点や、金型の突起部を形成し易いという点からは、正方形が好ましい形状である。
　第一開口の形状が正方形である場合の一辺の長さ（図１の寸法Ｌ）は、特に限定はされないが、細胞培養など（試験や観察などのために液中に分散した細胞をグループ分けするだけの操作をも含む）における細胞の集団化のためには、０．１ｍｍ～１ｍｍ程度が好ましく、０．２ｍｍ～０．７ｍｍがより好ましい長さである。第一開口の形状が長方形の場合には、前記正方形と同程度の開口面積（ただし、その短辺の最小値は前記正方形の１辺の長さＬの最小値と同程度である）であればよい。
　漏斗状部分Ｙ１の対向する２つの斜面の開き角度（図３（ｃ）に示す角度θ）は、沈降する細胞を誘い込んで下方の直管状部分に落とすことができるものであればよく、３０度～１２０度が好ましい角度であり、４５度～９０度がより好ましい角度である。
　漏斗状部分Ｙ１の中心軸方向の長さ寸法Ｔ１は、０．０２ｍｍ～４ｍｍ程度が好ましく、０．０５ｍｍ～３ｍｍがより好ましい。

　直管状部分Ｙ２の形状は円柱形またはｎ角柱形（ｎ≧８）である。よって、下面に存在する第二開口の形状は円形またはｎ角形（ｎ≧８）である。第二開口の形状は、５角形であれば、従来の四角形の場合よりも細胞の集中がより緩和されるが、顕著な効果を得るために、本発明では８角形（特に正８角形）以上の多角形（特に正多角形）に限定している。前記整数ｎの値はより大きい方が細胞の集中が緩和される。よって、第二開口の最も好ましい形状は円形である。
　第二開口の大きさは特に限定はされないが、第二開口の形状が円形の場合の直径（図１の寸法ｄ）は、細胞培養などにおける細胞の集団化のためには、０．０１ｍｍ～０．９ｍｍが好ましく、０．０５ｍｍ～０．５ｍｍがより好ましい寸法である。第二開口の形状がｎ角形（ｎ≧８）の場合には、該ｎ角形に内接する円の直径（その直管状部分Ｙ２を通過することが可能な最も太い円柱の外径）が、前記寸法ｄの範囲であればよい。
　漏斗状部分Ｙ１の第一開口の形状が正方形である場合の一辺の長さ（図１の寸法Ｌ）に対する、第二開口の形状が円形である場合の直径（第二開口の形状がｎ角形（ｎ≧８）の場合には該ｎ角形に内接する円の直径）ｄが占める割合は、１０％～９０％が好ましく、２０％～７０％がより好ましい範囲である。
　直管状部分Ｙ２の中心軸方向の長さ寸法Ｔ２は、シートの厚さから漏斗状部分Ｙ１の中心軸方向の長さ寸法Ｔ１を差し引いた残りの値である。

　貫通孔の数は特に限定はされないが、細胞培養などにおける細胞の集団化のためには、１００個～１０００個程度の多数の貫通孔がシート面に配列された構造が好ましい。
　その場合の貫通孔の配列は、図１のように行列状の配置とすれば、シート面の縁部などに無駄な領域が生じることなく、各貫通孔を密に配列することができるので好ましい。
　また、図１のように、シートの上面において、１つの貫通孔の第一開口の正方形の１辺が、隣の貫通孔の第一開口の正方形の１辺と一致し、その１辺が稜線状のエッジとなっていれば、沈降する細胞がその稜線の両側のどちらかの貫通孔に落ちるので、好ましい態様である。
　また、図１のように、角錐台形の漏斗状部分Ｙ１と円柱形の直管状部分Ｙ２とを組合せた貫通孔をアレイ状に密に配列した構造は、個々の貫通孔毎に分割して製品化しやすく、次に述べる製造方法において、押し型で材料シートを押圧する時の圧力分布にバラツキが少ないという利点もある。

　次に、当該マスク材の好ましい製造方法を説明する。
　図３は、当該マスク材の好ましい製造方法を示した図である。図３（ａ）に示すように、該製造方法は、貫通孔を形成するための突起部１２を備えた押し型１と、該押し型に対向する基板２との間に、半硬化状態の材料シート（シート状を呈しかつ半硬化状態の熱硬化性樹脂組成物）Ｘ１を配置し、図３（ｂ）に示すように、押し型１を基板２に押し付けることによって、突起部１２が該材料シートＸ１を貫通し基板２に達した状態として貫通孔Ｙを形成する押圧工程を有し、さらに該押し型１を基板２に押し付けた状態のままで、該材料シートＸ１を加熱して完全に硬化させ、当該マスク材Ｘとする硬化工程を有する。
　なお、本発明でいう「シート状を呈しかつ半硬化状態の熱硬化性樹脂組成物」とは、完全硬化温度に加熱されるまでは半硬化状態で安定し、半硬化状態のシート状の物品として取扱い可能な状態となっている熱硬化性樹脂組成物をいう。半硬化状態の詳細については後述する。図３（ｂ）中の符号「Ｘ１（→Ｘ）」は、半硬化状態の材料シートＸ１が、加熱によって完全硬化したシート状の本体部分Ｘを有するマスク材となったことを示唆している。

　当該マスク材は、例えば、厚さが０．０５ｍｍ～５ｍｍ程度の薄いシート状の本体に、中心間ピッチ０．１ｍｍ～１ｍｍ程度にて、微細な貫通孔を密に配列した構造となっている。そのため、通常の樹脂成形では許容されるような微細な成形不良であっても、当該マスク材では細胞の均一な分散の障害となってしまい問題となる。例えば、射出成形など従来の樹脂成形法では、微細な貫通孔を多数形成するために金型内に多数の突起部が設けられているので、それら多数の突起部同士の間に成形樹脂が十分に行き渡らず、気泡による欠落が含まれていたり、ヒケによる変形が発生するなど、貫通孔には種々の変形や寸法不良が生じており、細胞の均一な分散の障害となってしまう。
　これに対して、上記した半硬化状態の材料シートを用いた製造方法によれば、押し型の突起部を材料シート内に押し込んだ状態で加熱硬化させるので、材料が行きわたらないということがなく、気泡の混入やヒケによる変形が抑制され、その結果、貫通孔や各部の寸法精度が向上する。このような半硬化状態の材料シートへの加工に起因して、各貫通孔の第二開口の直径の誤差は±１０％以内、とりわけ±５％以内となり、また、第二開口に残膜を持った貫通孔の存在比率は５％以下、とりわけ１％以下となる。
　さらには、成形前の材料の取扱いがより容易になり、また、成形時には打ち抜きカスが発生せず、図３（ｃ）に示すように、貫通孔Ｙが形成されたシート状の本体部分Ｘを有するマスク材を好ましく得ることができる。

　上記の製造方法において、材料シートとして使用可能な、半硬化状態とすることができる熱硬化性樹脂組成物について詳細に説明する。
　熱硬化性樹脂組成物は、モノマー又はオリゴマー（プレポリマー）が不可逆的に重合（架橋）し硬化する樹脂組成物である。
　半硬化状態とすることができる熱硬化性樹脂組成物としては、例えば、シリコーン樹脂、エポキシ樹脂、ジアリルフタレート樹脂、フェノール樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、ポリイミド樹脂、ポリウレタン樹脂、メラミン樹脂、ユリア樹脂等を含む組成物が挙げられる。その中でも、形成される貫通孔の精度の観点から、シリコーン樹脂、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、不飽和ポリエステル樹脂を含む組成物が好適であり、耐薬品性、耐候性、耐光性および耐熱性に優れる点からは、シリコーン樹脂組成物が特に好ましい。
　よって、硬化温度に加熱されるまでは半硬化状態のままとなっている性質を有するシリコーン樹脂組成物からなるシートが好ましい材料シートである。

　熱硬化性樹脂組成物は、主成分として、重合（架橋）可能なモノマー又はオリゴマー（プレポリマー）を含むものである。また、これに加えて重合（架橋）反応を制御するための反応抑制剤、触媒等を含有していてもよい。また、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、ヘキサン、イソプロパノール、メチルイソブチルケトン、シクロペンタノン、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート等の溶媒や公知の添加剤を含有していてもよく、溶媒や添加剤は、それぞれ単独で又は二種以上含有していてもよい。

　半硬化状態とすることができるシリコーン樹脂組成物、または、それを用い半硬化状態となった材料シートは、市販品であっても、公知の方法に従って形成したものでもよい。
　公知の材料シートのなかでも、特開２０１０－１５９４１１号公報に記載された半硬化状のシリコーン樹脂シートは、縮合反応が可能な置換基を有するケイ素化合物、および、付加反応が可能な置換基を有するケイ素化合物を含有するシリコーン樹脂組成物（以下「混合型シリコーン樹脂組成物」と略称する場合がある）を縮合反応することにより得られるものであり、安定した半硬化状態を示し、耐光性と耐熱性に優れているので、本発明の製造方法には特に好ましい材料シートである。
　前記公報の半硬化状のシリコーン樹脂シートは、Ａステージと呼ばれる未硬化状態からＢステージと呼ばれる半硬化状態への硬化（一段階目の硬化）と、Ｂステージ（半硬化状態）からＣステージ（全硬化状態）への硬化（二段階目の硬化）とを、それぞれ別々の反応によって行うものである。
　即ち、一段階目の硬化を縮合反応、二段階目の硬化を付加反応によって行うことにより、両反応の反応温度条件が異なることを利用して反応を制御し、それぞれの硬化を段階的に進めて、一段階目の硬化が終了した半硬化状態の樹脂シートを得ている。
　さらに、二段階目の硬化反応が自然要因ではなく外的要因によって進行するものであるので、一段階目の硬化が終了した時点の状態、即ち、半硬化状態を維持することが可能となっている。
　またさらに、各反応に関与する官能基の密度を制御することによって、半硬化物及び全硬化物の粘弾性、強靭性、タック等の物性を制御することが可能となっている。
　なお、該公報では、半硬化物、即ち、半硬化状態（Ｂステージ）の物を、〔溶剤に可溶なＡステージと、完全硬化したＣステージの間の状態であって、硬化、ゲル化が若干進行し、溶剤に膨潤するが完全に溶解せず、加熱によって軟化するが溶融しない状態である物のことを意味し、全硬化物（完全硬化物）とは、完全に硬化、ゲル化が進行した状態である物のことを意味する〕と規定している。
　さらに、混合型シリコーン樹脂組成物は、縮合反応が可能な置換基を有するケイ素化合物および付加反応が可能な置換基を有するケイ素化合物のいずれとも反応し得る化合物を含有することが好ましい。
　また、前記公報のシリコーン樹脂シートの他にも、ＳＹＬＧＡＲＤ１８４（登録商標）（東レ・ダウコーニング株式会社製）等が好ましいシリコーン樹脂組成物として挙げられる。ＳＹＬＧＡＲＤ１８４（登録商標）は、半硬化状態とするために反応抑制剤を添加した付加反応型シリコーン樹脂組成物であって、アルケニル基含有ポリオルガノシロキサン（アルケニル基を有するケイ素化合物）、オルガノハイドロジェンシロキサン（ヒドロシリル基を有するケイ素化合物）、１，３，５，７－テトラメチル－１，３，５，７－テトラビニルシクロテトラシロキサン（反応抑制剤）、白金触媒（反応触媒）、キシレン、エチルベンゼン等を含む。

　上記した各半硬化状態の熱硬化性樹脂組成物のそれぞれの硬化温度（樹脂が完全に硬化する温度）は、各樹脂組成物によって異なるが、当業者が通常用いる熱硬化性樹脂組成物を完全硬化させる際に用いる温度であればよく、樹脂の性質に基づき設定するものであればよい。

　上記製造方法は、半硬化状態の材料シートに対する成形加工を行うという特殊なプロセスに起因して、非常に薄いシートに微細な貫通孔が多数形成された製品（即ち、本発明のマスク材）を形成する場合には、ヒケや気泡の混入がなく、寸法のばらつきが小さく、未貫通（成形不良）が少ないというその特徴が十分に発揮され、微細な貫通孔を多数形成する場合に特有の品質上の問題が解消される。
　また、本発明によって、次のような種々の利点も得られる。成形材料がシート状であるために成形前の段階において液状材料に比べて材料の保管がし易い。型内に挿入する材料の分量が液状材料の場合には重量管理や体積管理であったのに対してシートの場合には厚さで管理することが可能になる。連続プロセスに展開しやすく生産性の向上を図ることができる。射出成形とは異なり、複雑な構造の金型が不要である。
　なお、得られるマスク材のシート面（第一開口、第二開口が存在するシートの表裏の主面）は、平面が代表的で好ましい態様であるが、需要に応じて曲面であっても、階段状となった面などであってもよい。そのようなシート面が得られるように、後述の押し型の本体部分の面や基板面を形成すればよい。

　本発明における押圧工程では、図３（ｂ）に示すように、押し型１を基板２に押し付けるときに、押し型の突起部１２によって材料シートＸ１の材料部分を押しのけて突起部の周囲に排除し、押し型の先端面と基板面との間が材料が膜状に残らないように密着させた状態としたままで、該材料シートを加熱硬化させる。これによって、図３（ｃ）に示すように、当該マスク材のシート状の本体部分Ｘの厚さｔを押し型の突起部の高さｈに応じて高い精度で制御でき、均質で均一厚さの熱硬化シートが得られるので好ましい。
　一方、押し型１を基板に押し付けたときに、突起部１２は材料シートＸ１を貫通しているが、押し型の本体部分１１が材料シートＸ１を圧縮しないという自由な状態で加熱硬化を行ってもよい。
　図３に示すように、材料シートＸ１の厚さｔ１は、前記のように押圧工程～硬化工程においてどの程度の材料を押し型で押しのけるかに応じて適宜決定すればよい。例えば、樹脂のはみ出し量を少なくするには、硬化後のシート状の本体部分Ｘの厚さｔは、突起部１２の突起高さｈによってほぼ決まるので、材料シートの厚さｔ１は、突起部１２の突起高さｈよりも必要量だけ（突起部の体積量を見込んだ分だけ）薄くしておくことが好ましい。例えば、材料シートの厚さｔ１は、押し型を基板に押し付けた状態（突起部によって材料を押しのけた、図１の状態）での厚さと比べて、１０～９５％の厚さとしておくことが好ましく、２０％～９０％の厚さとしておくことがより好ましい。
　また、図３に示すような加熱硬化時に適度な圧縮を行う場合でなくとも、材料シートの厚さｔ１は、押圧後のシート状の本体部分Ｘの厚さｔと同等とするか、または、材料の膨れ上がりを見込んだ分だけ薄くしておくことが好ましい。
　マスク材の外周に壁部を一体的に設ける場合、押し型の外周における材料シートの盛り上りを壁部として利用してもよいし、押し型や基板の外周縁に段差を設け、外周に壁部が成形されるようにしてもよい。

　以下、図３に示すような成形を行う場合について、押し型、基板、押圧工程、硬化工程などを詳細に説明する。
　押し型は、図３（ａ）に示すように、押し型の本体部分１１と、突起部１２とを少なくとも有する熱硬化性樹脂用の成形型であればよい。
　押し型の各部を構成する材料は、熱硬化性樹脂用の成形型として使用可能な機械的強度（引張り強度、剛性、硬さなど）と耐熱性とを少なくとも有し、さらに耐薬品性、該押し型を形成するための加工性、繰り返しの耐久性や耐消耗性などを有する材料であればよい。このような材料としては、ニッケルやニッケル合金、炭素鋼などの金属材料や、アルミナ、ジルコニア、炭化ケイ素などのセラミックスが好ましい材料として挙げられる。

　本体部分１１と突起部１２とは、同じ材料によって一体的に形成されたものであってもよいし、本体部分に突起部となるピン状物を埋め込んだものであってもよい。上記したように非常に薄いシートに微細な貫通孔が多数形成された当該マスク材を成形する場合、押し型の突起部も微細なピン状物となり、別部品としての形成や型の組み立てが困難となる。よって、そのような場合には、本体部分と突起部とが一体的に形成された押し型が好ましい。
　当該マスク材を成形するための微細な押し型において、本体部分と突起部とを一体的に形成する方法としては、特に限定はされず、従来公知の種々のパターン形成技術、微細加工技術を用いてよい。

　押し型の突起部の形状は、上記した貫通孔を形成し得る形状や寸法を持った型であればよい。上記した貫通孔の形状についての説明は、そのまま突起部の形状についての説明でもある（凹凸は互いに反転した関係にある）。ただし、抜き勾配や製造後の収縮などを考慮して、貫通孔の寸法に対して必要な修正を微量だけ加えてもよい。
　図１に示した貫通孔を形成するための突起部の形状は、第二開口が円形の場合、図４に例示するように、各突起部１２は、角錐台部ｙ１と円柱部ｙ２とが相貫的に結合した立体形状となる。

　押し型の本体部分は、シート状の本体部分の主面を形成するための型としての面を有しておればよく、その面に突起部が設けられる。該本体部分の厚さや成形用プレス装置への取り付け構造部分などは、使用時の周囲の装置構成に応じて適宜決定すればよい。例えば、該本体部分は、厚さ５ｍｍ～１００ｍｍ程度の十分に厚い板状物であってもよいし、十分に厚い板状の支持体に表層として形成または接合された厚さ０．５ｍｍ～３ｍｍ程度の薄い板状物であってもよい。

　基板は、半硬化状態の材料シートのシート面を形成する面を少なくとも有し、押し型からの押圧力を受けることができる機械的強度と、熱硬化性樹脂用の成形型として使用可能な耐熱性を少なくとも有する材料であればよい。
　また、当該製造方法の好ましい態様では、基板に比較的大きな弾性を持った緩衝層を設ける態様を推奨する。例えば、押し型や基板の厚さ方向に関する寸法誤差や、成形用プレス装置の上下の型設置用プレートの設置面同士の間の距離の誤差などに起因して、押し型に設けられた複数の突起部の中には基板に接触できないものが存在し、貫通孔の不良（貫通不良）が発生する。このような誤差の影響は、製品シートがより薄くかつ貫通孔がより微細な場合により顕著に現れる。
　これに対して、図５に例示するように、基板２に比較的大きな弾性を持った緩衝層２２を設けることによって、前記のような寸法誤差を該緩衝層２２が吸収するので、圧力が分散し、押し型１の全ての突起部が基板面に接触することができ、貫通不良の発生を抑制することができる。
　一方、本発明者らの研究によれば、単に基板の表面に緩衝層を設けただけでは該緩衝層に突起部が入り込み、シート状の本体部分のシート面に凹凸が生じたり、面内の圧力分布にバラツキが生じて、未貫通孔が形成されるといった問題が生じる。よって、押し型を受ける基板は凹凸やうねりが生じない硬い材料からなる層である方が好ましい。
　以上のような比較的大きな弾性と、硬い性質という相反する特性を、基板に同時に与える点からは、図５に示すように、基板２は、硬い材料からなる表層２１と、比較的大きな弾性を有する緩衝層２２とを有してなる積層体であることが好ましい態様である。

　前記緩衝層は、硬化工程における完全硬化温度に対する耐熱性を有するものであればよく、例えば、プラスチック、ゴム等からなるものを用いることができる。緩衝層に用いられるゴムとしては、例えば、シリコーンゴム、フッ素ゴム、エチレン・酢酸ビニルゴム、アクリルゴム等が挙げられる。
　緩衝層の厚さは、特に限定はされないが、シートがより薄くかつ貫通孔がより微細である場合には、０．１ｍｍ～２ｍｍ程度が好ましく、０．３ｍｍ～１ｍｍがより好ましい。これにより、面内圧力分布をより均一にすることができ、貫通孔の形成が容易になり、貫通不良も減少する。

　前記表層（または、緩衝層を設けず基板を単層とする場合にはその基板自体）は、加圧による押し型の突起部の変形を防止するために、突起部からの押圧を受けて適宜塑性変形する材料であることが好ましく、例えば、突起部よりも硬度の小さい金属（例えば、アルミニウム、銅、ステンレスなど）や、プラスチック（例えば、ポリイミド、シリコーン樹脂、ポリエステル、ポリカーボネートなど）等からなるものが好適に用いることができる。
　また、硬度の高い金属からなる表層であっても、緩衝層上に設けられた薄い表層であれば、押し型の突起部が押し付けられたときに適量だけ変形し得るので、該突起部に損傷を与えることなく、また、硬い材料からなる表層としての役目をも果たすので好ましい。

　基板の厚さは特に限定はされないが、上記積層体とする場合の表層の厚さは、５０μｍ～５００μｍが好ましく、１００μｍ～３００μｍがより好ましい。これにより、加圧分布をより均一にすることができ、貫通孔の形成が容易になる。

　上記した表層と緩衝層とからなる積層体は、押し型の背後にも設けてよく（その場合、表層は押し型に接する側に位置する）、それによって、緩衝層による寸法誤差の吸収や加圧力の均一性はより好ましくなる。

　上記したように、本発明で用いられる半硬化状態の熱硬化性樹脂組成物は、成形時にはシート状とされた物（材料シート）が用いられ、押し型と基板との間に配置される。

　材料シートは、上記した半硬化状態の熱硬化性樹脂組成物だけからなるシート状物であってもよいが、型への配置や取扱い性などの点からは、図５に示すように、該材料シートＸ１がシート用基材Ｓを支持体として伴い、該シート用基材Ｓの上に積層された半硬化状態の熱硬化性樹脂組成物層Ｘ１として押圧工程に提供される態様が好ましい。
　この態様の場合、図５に示すように、シート用基材Ｓが基板２の側となるように半硬化状態の熱硬化性樹脂組成物層Ｘ１を押し型１と基板２との間に配置することによって、押圧工程および硬化工程では、該シート用基材Ｓが押し型の突起部の先端と基板との間に介在する。該シート用基材Ｓには、貫通孔が形成されることはないが、押し型の突起部による押圧痕が残る場合がある。

　前記シート用基材の材料としては、支持体として有用な剛性と、熱硬化性樹脂組成物の硬化温度に対する耐熱性を有するものであればよく、例えば、ポリエステル（例、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ））、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリオレフィン等が挙げられる。
　該シート用基材の厚さは、特に限定はされないが、１０μｍ～３００μｍ程度が好ましく、３０μｍ～２００μｍ程度がより好ましい。

　前記シート用基材を用いる場合、材料シートを硬化させた後に剥離し易いように、該シート用基材の表面に剥離処理を施してもよい。
　該剥離処理は、公知の熱硬化性樹脂成形における金型への離型処理を参照してもよく、例えば、フッ素処理やシリコーン処理などが挙げられる。

　本発明の製造方法を実施するための成形用プレス装置は、従来公知のものを用いてよい。図５に示す例では、該成形用プレス装置によって、材料シートＸ１を押し型１と基板２との間に挟んだ状態で、所定の圧力にて押圧する構成例を示している（同図では上下の平行平板ステージ１０、２０だけを図示しており、駆動部は省略している）。上下の平行平板ステージ１０、２０の対向面の平行度は、緩衝層等によって許容できる圧力分布のバラツキ内に抑えることができる範囲であればよい。圧力分布のバラツキは、基板が緩衝層と表層とからなる場合、±１０％以下であることが好ましく、±５％以下であることがより好ましい。

　また、成形用プレス装置としては、例えば、真空加圧ラミネータのダイヤフラムのように、対象形状に対して追従性がある加圧手段を用いれば、圧力分布のバラツキをより小さくすることができるので好ましい。

　硬化工程における硬化温度への加熱や、押圧工程における予備加熱など、材料シートを加熱する場合の加熱方法は、特に限定はされないが、上記した成形用プレス装置の上下の平行平板ステージに設けられた加熱手段（ヒーター）によって該平行平板ステージを加熱し、それによって押し型と基板とを加熱し、それによって材料シートを加熱するという方法や、押し型や基板に直接加熱手段を取り付けて材料シートを加熱する方法などが挙げられる。

　以下、上記製造方法の各工程に沿って加工内容をより詳細に例示する。
　先ず、図３（ａ）または図５に示すように、押し型１と基板２との間に材料シートＸ１を配置する。
　次に、図３（ｂ）に示すように、押圧工程において、押し型を基板に押し付けて、該材料シートＸ１に貫通孔を形成する。このとき、材料シートは変形および／または流動して、押し型１の突起部１２が材料シートＸ１を貫通し基板に到達する。
　以下、押し型を基板に押し付けることを加圧とも呼ぶ。加圧時には、材料シートにも加圧力が作用し、該材料シートに貫通孔が形成され、図３（ｂ）のような状態となる。該シート材料は熱硬化性樹脂であって、熱可塑性樹脂のように熱溶融しにくいので、その流動には限界がある。材料シートの体積が押し型の突起部同士の間の空間の容積よりも過度に大きいと、成形後に樹脂が弾性によって復元し、貫通孔の精度が出ない場合がある。よって、条件（特に押し型の突起部同士の間の空間の容積と、材料シートの体積との関係）を正確に調整することが好ましく、とりわけ、材料シートの体積の変動に大きく関係する材料シートの厚さを正確に調整することが好ましい。

　押圧工程における加圧時の圧力は、特に限定されるものではないが、未貫通孔（突起部と基板面との間に隙間が生じる結果として形成される残膜）の発生を抑えるという点から、１ＭＰａ以上であることが好ましく、３ＭＰａ以上がより好ましい。また、押し型１の破損や基板３の変形を抑えるという点から、６０ＭＰａ以下であることが好ましく、４０ＭＰａ以下であることがより好ましい。
　押圧工程における加圧は、押圧工程から硬化工程が終了するまで、連続的かつ継続的に行われる。

　押圧工程での加圧時における圧力分布のバラツキは、通常、±５％以下であることが好ましく、基板が緩衝層と表層とからなる場合は、該緩衝層による効果で許容できる圧力分布のバラツキが広がり、±１０％以下であることが好ましく、±５％以下であることがより好ましい。

　押圧工程における加圧時間（突起部が基板に到達してから、硬化工程の加熱が開始されるまでの時間）は、加工すべき材料シートの性質等に合わせて設定すればよいが、概して、３０秒～６００秒程度である。例えば、半硬化状態とした上記混合型シリコーン樹脂組成物の場合には、６０秒～５００秒が好ましく、１００秒～３００秒がより好ましい範囲である。本発明では押圧工程において加圧した状態のままで硬化工程を行う。

　押圧工程では、押圧の前に、急激な温度変化による樹脂への熱衝撃の緩和や生産性の向上を目的として、材料シートに予備加熱を加えてもよい。
　予備加熱の温度は、半硬化状態の材料シートを硬化させない温度であればよく、材料によって異なるが、半硬化状態とした上記混合型シリコーン樹脂組成物では、４０℃～１３０℃程度が好ましく、５０℃～１２０℃程度がより好ましい。
　予備加熱は、一時的に行ってもよく、また、押圧工程を通じて継続的に行ってもよい。
　予備加熱は、押圧工程の前に行ってもよいし、材料シートを基板に接触させた後で行ってもよいし、材料シートを挟みこんだ後に行ってもよい。
　予備加熱は、押し型と基板の一方または両方に直接的又は間接的に設置する加熱手段（例、公知のヒーター）により行ってもよい。

　半硬化状態の材料シートを押し型と基板との間に配置する際には、該材料シートの浮き、気泡の混入等を防ぐために、真空条件下で行ってもよいし、材料シートを予め基板上に配置し、十分に浮きや気泡を排除してから、押し型をセットしてもよい。
　また、シート用基材と半硬化状態の材料シート（熱硬化性樹脂組成物層）との積層体をロールとして巻いておき、該ロールからシート用基材と半硬化状態の材料シートとを基板上に供給し、硬化後の製品シートをロールとして巻き取るという連続方式とすることでも、浮きや気泡を抑制することが可能である。

　硬化工程では、図３（ｂ）に示すように、押し型を基板に押し付けた状態のままで材料シートを硬化温度へと加熱して完全に硬化させる。
　硬化温度は、半硬化状態の材料シートを完全に重合（架橋）させ完全硬化させることができる最低温度以上であって、かつ、樹脂組成物が分解して品質が低下しない範囲の温度であればよい。硬化温度は、当業者が通常用いる熱硬化性樹脂組成物を完全硬化させる際に用いる温度であればよく、樹脂の性質に基づき設定するものであればよい。

　硬化工程において、押圧工程での温度条件から硬化温度へ昇温させるための時間（昇温時間）は、特に限定されるものではないが、総じて３０秒間～９００秒間程度が挙げられ、半硬化状態とした上記混合型シリコーン樹脂組成物の場合には、４０秒間～６００秒間の範囲であることが好ましく、６０秒間～３００秒間の範囲であることがより好ましい。

　昇温後に完全硬化温度を保持する時間（保持時間）は、樹脂の性質に基づき設定するものであればよく、特に限定されるものではないが、総じて３０秒間～９００秒間程度が挙げられ、４０秒間～６００秒間の範囲であることが好ましく、６０秒間～３００秒間の範囲であることがより好ましい。

　硬化工程における加圧条件は、押圧工程における加圧条件と同等であればよく、上述した押圧工程における加圧条件の範囲内で変化させてもよい。硬化工程における加圧は、押圧工程からそのまま硬化工程が終了するまで継続的に且つ連続的に行えばよい。

　押圧工程及び硬化工程は、異物除去、熱硬化性樹脂組成物の充填の観点から真空雰囲気下で行うことが好ましい。

　図３（ｃ）に示すように、完全硬化したマスク材は、硬化工程後の高温の状態で取り出してもよいし、室温へと冷却してから取り出してもよい。

　図５に示すように、基板２が表層２１と緩衝層２２とを有する積層体である場合、該表層２１が貫通孔の形成ごとに変形する場合がある。その場合には、押圧工程及び硬化工程を行うごとに適宜、表層を取り換えることが好ましい。よって、表層２１と緩衝層２２とは、容易に着脱できるように接着、または取り付け構造としておくことが好ましい。
　緩衝層は表層よりも長く繰り返し使用することが可能である。

　細胞の集団化それ自体の手順、液体の種類、細胞の種類については、例えば、特許文献１など従来技術を参照すればよい。
　当該マスク材を用いて集団化を行うべき細胞としては、植物細胞であっても動物細胞であってもよく特に限定はされないが、例えば哺乳動物（ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ等）由来の、膵管幹細胞、骨髄幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、網膜神経細胞、癌細胞、骨軟骨細胞、歯胚細胞、筋芽細胞、心筋細胞、腎臓細胞、胚性幹細胞、体性幹細胞、前駆細胞、人工多能性幹細胞、神経細胞、肝細胞、血管内皮細胞、周皮細胞、表皮角化細胞、皮膚線維芽細胞、角膜上皮細胞などが挙げられる。
　細胞の集団化の目的は、主としてその細胞の培養が挙げられるが、観察、試験、分化誘導、薬効評価、移植用組織作製、遺伝子導入などであってもよい。

　当該マスク材を用いて集団化を行うべき細胞の粒子径は、特に限定はされないが、顕微鏡（透過型電子顕微鏡、光学顕微鏡を含む）によって得られる粒子像のフェレー（Feret）径（１つの細胞粒子を挟む一定方向の二本の平行線の間隔、定方向径とも呼ばれる）で規定する場合、０．０１μｍ～５０μｍ程度のものであれば、当該マスク材が有用となり、なかでも０．０５μｍ～３０μｍ程度のものであれば、当該マスク材の有用性がより顕著となる。

　以下、本発明について、実施例を挙げてさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１
〔金型の製造〕
　押し型の構成は、図４に一部を斜視図として示すように、板状の本体部分（外周形状が１辺１０ｍｍの正方形、厚さ１ｍｍの直方体）１１の主面上に、総突起高さ０．５ｍｍの突起部１２を、中心間ピッチ０．５ｍｍにて、２０行×２０列の正方行列状に配列したものである。
　押し型の個々の突起部１２の形状は、図４に示すように、四角錐台状の部分ｙ１（基部の外形は一辺０．５ｍｍの正方形、四角錐台の高さは０．４ｍｍ、２つの斜面の開き角度θは３２．１度）を基部とし、これに先端側の円柱部分ｙ２（直径０．２７ｍｍ）が相貫的に連結した形状である。この押し型の突起部の側を正視した平面図は、突起部の本数は異なるが、図１（ａ）の貫通孔の平面図と一致し、隣り合った突起部の基部のそれぞれの正方形の１辺が互いに接触している。
　押し型の材料は、ニッケルであり、光造形法で光硬化性樹脂を用いて非導電性マスタを形成し、その後、導電処理を施し、導電性マスタを形成し、電鋳処理を行い、導電性マスタを除去して作製した。
　基板は表層と緩衝層とからなる積層体である。
　表層は、厚さ０．１２５ｍｍのポリイミドフィルム（商品名：カプトン５００Ｖ，東レ・デュポン株式会社製）であって、外周形状は１辺２０ｍｍの正方形である。
　緩衝層は、厚さ１ｍｍのシリコーンゴムシート（ＳＲゴムシート）（商品名：ＳＲ－７０、タイガースポリマー株式会社製）であって、外周形状は１辺２０ｍｍの正方形である。緩衝層のショアＡ硬度は７０であった。
　成形用プレス装置には、精密加熱加圧装置（商品名：ＣＹＰＴ－１０，新東工業株式会社製）を用いた。

〔半硬化状態の材料シートの作製〕
　半硬化状態のシリコーン樹脂組成物を調整するために、混合型シリコーン樹脂組成物を用いた。
　平均分子量１１５００の両末端シラノール型シリコーンオイル（商品名：ｘ－２１－５８４２，信越化学工業株式会社製）１００ｇ、ビニルトリメトキシシラン（商品名：ＫＢＭ－１００３，信越化学工業株式会社製）０．８６ｇ、及び２－プロパノール１０ｍＬを撹拌混合後、縮合触媒として水酸化テトラメチルアンモニウム水溶液（濃度１０重量％）０．１６ｍＬを加え、室温（２５度）で２時間攪拌した。
　得られたオイルに、オルガノハイドロジェンポリシロキサン（商品名：ＫＦ-９９，信越化学工業株式会社製）０．０９０ｇ、及びヒドロシリル化触媒として白金－カルボニル錯体溶液（白金濃度２重量％）０．２６ｍＬを加えて、未硬化状態の混合型シリコーン樹脂組成物を得た。
　上記未硬化状態の混合型シリコーン樹脂組成物を、厚さ５０μｍの２軸延伸ポリエステルフィルム(三菱樹脂株式会社製)上に２５０μｍの厚さに塗工し、８０℃で１０分間加熱して、半硬化状態で且つシート状（厚さ２５０μｍ）の混合型シリコーン樹脂組成物を得、外周形状を１辺２０ｍｍの正方形に加工し、半硬化状態の材料シートを得た。

〔押圧工程～硬化工程〕
　次に、下層側から順に、緩衝層、表層、上記半硬化状態の材料シート、押し型の順に重ねるようにセットし、これを予熱温度５０℃に設定しておいた精密加圧加熱装置にセットし、６０秒間維持し、予熱を行った。
　次に、５０℃のまま、押し型を降下させ、１０ＭＰａの圧力にて、３００秒間保持し、押圧工程を行い、貫通孔を形成した。
　その後、加圧を保持したまま、３００秒かけて５０℃から硬化温度である１８０℃へと昇温し、１８０℃のまま３００秒間保持し、材料シートを熱硬化させ、貫通孔を有する完全硬化状態となったマスク材を得た。

〔評価〕
　成形前の材料シートの厚さは２５０μｍ（０．２５ｍｍ）であったが、押し型（突起部の総高さは０．５ｍｍ）を押し付けることによって材料が押しのけられた分だけ厚さが増加し、押し型の突起部の間に材料が充填され、結果得られたマスク材の中央領域の厚さは、突起部の総高さと同じ０．５ｍｍとなっていた。
　また、材料シートの外周形状が１辺２０ｍｍの正方形であり、押し型の本体部分（板状部分）の外周形状が１辺１０ｍｍの正方形であることから、得られたマスク材の外周縁には、図１に示すように、全周にわたって壁部Ｘｃが隆起しており、細胞が分散した液体を溜めることが可能となっていた。
　また、得られたマスク材の中央領域には、１辺０．５ｍｍの正方形の第一開口を持った漏斗状部分と、直径０．２５ｍｍの円形の第二開口を持った円柱形の直管状部分とからなる貫通孔が、ピッチ０．５ｍｍで形成されていた。
　前記正方形の第一開口の１辺、および、前記円形の第二開口の直径の寸法精度は、いずれもそれぞれの設計寸法に対して±０．０１ｍｍ以内となっており、高い精度での加工が実現されていることがわかった。また、貫通不良（残膜が残っている穴）は存在しておらず、シート材料中に気泡が含まれていなかったことから、製品にも気泡がなく、ヒケもなかった。

実施例２
　上記実施例１で製作したマスク材を用いてマウス膵臓幹細胞の集団化を行い、貫通孔内に沈降した該細胞の培養の様子を評価した。
〔マスク材の滅菌〕
　クリーンベンチ内でマスク材を消毒用エタノールに浸漬した。
　消毒用エタノールが付着した状態で、該マスク材を６穴プレートのインサート上に貼り合わせた。消毒用エタノールが乾燥すると、マスク材は該インサートに密着した。
　この状態で、マスク材に対してＵＶ照射を１時間行なった。
〔マスク材へのＡｎｔｉ－Ｌｉｎｋコーティング〕
　マスク材にＡｎｔｉ－Ｌｉｎｋ（ＡＬＶ社製；細胞付着防止試薬）を２５０μｌ滴下し、貫通孔内を含んだマスク材全面に対してＡｎｔｉ－Ｌｉｎｋが行きわたるようにし、インキュベータ内で２日間反応させた。
〔マスク材の洗浄〕
　アスピレーターによって前記Ａｎｔｉ－Ｌｉｎｋを除去し、ＰＢＳ（－）によってマスク材を洗浄した。詳細には、ＰＢＳ（－）をマスク材に約３００μｌ滴下してアスピレーターで除去するという洗浄を３回繰り返した。
〔細胞懸濁液の調整〕
　マウス膵臓幹細胞（ＤＳＣ）にＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＧＩＢＣＯ社製；細胞解離剤）を２ｍｌ加え、インキュベータで３分反応させ、培地を３ｍｌ加えてピペッティングし、チューブに移して遠心機にかけた（４℃、１５００ｒｐｍ、３分間）。
　上澄みをアスピレーターによって除去し、培地を１ｍｌ加えて攪拌し、細胞懸濁液とした。
〔細胞数のカウント〕
　上記で得られた細胞懸濁液の細胞濃度を、血球計数器によってカウントしたところ、約１．０×１０⁶（個／１ｍｌ）であった。
〔マスク材への細胞播種〕
　上記細胞懸濁液を、マスク材の壁部で囲まれた中央領域に２５μｌ注入し、全ての貫通孔を細胞懸濁液中に浸漬させた。
〔培養〕
　細胞懸濁液が付与されたマスク材をインキュベータ内に３７℃、９６時間保持した。

〔貫通孔内に沈降した該細胞の培養の様子〕
　マスク材の個々の貫通孔内の様子を上方から観察したところ、各貫通孔内の細胞は、図２に示すように、円形の第二開口内に外周縁を中心として適度に分散した状態で培養されていることがわかった。

比較例１
　本比較例では、先ず、上記実施例１において、マスク材の貫通孔の直管状部分の形状を、四角柱（第二開口の形状は１辺０．２５ｍｍの正方形）としたこと以外は、実施例１と同様にして、比較用のマスク材を形成し、次いで、該比較用のマスク材を用い、上記実施例２と同様にして、細胞培養を行った。
　貫通孔内に沈降した該細胞の培養の様子を観察したところ、各貫通孔内の細胞は、図７（ｂ）に示すように、正方形の第二開口内の四隅に集中した状態で培養されていることがわかった。

　上記実施例１から、本発明のマスク材が、気泡を含まず、均一な材料分布によってヒケなどの成形不良が無く、残膜も無く、高い寸法精度の貫通孔を持った製品であることがわかった。１枚のシート中に多数配置された貫通孔が、ばらつきの少ない均一なものであれば、どの貫通孔においても等しい条件下での培養が可能となる。
　また、上記実施例２と比較例２から、本発明のマスク材であれば、沈降した細胞が該直管状部分の内部で好ましく分散することがわかった。

　上記のように、本発明のマスク材は、細胞粒子を好ましく集団化でき、再生医療等における細胞培養や試験に寄与し得る。

　本出願は、日本で出願された特願２０１３－０３７６２７（出願日：２０１３年２月２７日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含される。

Claims (4)

1. 　液体中に分散した細胞を、該液体の底部に配置した基材上に所定の密度を持った複数の集団へと分けて沈降させるために、該基材上に配置されるマスク材であって、
   　当該マスク材は、熱硬化性樹脂組成物からなるシート状の本体部分を有し、該シート状の本体部分には、前記集団の数に対応した複数の貫通孔が設けられており、
   　該貫通孔が、
   　（ａ）該シート状の本体部分の一方の主面に存在する第一開口から他方の主面側へと移動するにつれて横断面の面積が減少する角錐台形の漏斗状部分と、
   　（ｂ）前記漏斗状部分の下端部から他方の主面に存在する第二開口に至る、円柱形またはｎ角柱形（ｎ≧８）の直管状部分とを
   有してなる形状である、前記マスク材。
2. 　シート状の本体部分の厚さが０．０５ｍｍ～５ｍｍであり、第一開口の形状が一辺０．１ｍｍ～１ｍｍの正方形であり、第二開口の形状が直径０．０１ｍｍ～０．９ｍｍの円形であって、１つの貫通孔の第一開口の正方形の辺が、隣の貫通孔の第一開口の正方形の辺と接触している、請求項１記載のマスク材。
3. 　当該マスク材が、シリコーン樹脂組成物からなるものであって、かつ、下記（Ａ）の製造方法によって形成されたものである、請求項１記載のマスク材。
   　（Ａ）硬化温度に加熱されるまでは半硬化状態のままとなっている性質を有するシリコーン樹脂組成物を用い、
   　当該マスク材の貫通孔を形成するための突起部を備えた押し型と、該押し型に対向する基板との間に、シート状を呈しかつ半硬化状態の前記シリコーン樹脂組成物を配置し、押し型を基板に押し付けて前記半硬化状態のシリコーン樹脂組成物に貫通孔を形成する押圧工程と、
   　前記押圧工程の後、押し型を基板に押し付けた状態のままで、前記半硬化状態のシリコーン樹脂組成物を硬化温度に加熱して完全に硬化させる硬化工程とを有する、
   マスク材の製造方法。
4. 　液体中に分散した細胞が、哺乳動物の、膵管幹細胞、骨髄幹細胞、胚性幹細胞、体性幹細胞、前駆細胞である、請求項１記載のマスク材。

Images