JP2015221002A - 細胞培養容器 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、側壁部と、該側壁部の下端側に配置され、少なくともその一部が該側壁部の下端側の外縁に対して着脱可能に取り付けられている底部と、該側壁部の上端側の外縁に接合されている天部とを備え、前記天部に、少なくとも1個の天部開口部を有し、前記底部の上面の少なくとも一部に、所定の刺激に応答して細胞接着性から細胞非接着性へと変化することが可能な刺激応答性高分子層を有する、細胞培養容器に関する。
【選択図】図1−1
Description
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
前記天部に、少なくとも1個の天部開口部を有し、
前記底部の上面の少なくとも一部に、所定の刺激に応答して細胞接着性から細胞非接着性へと変化することが可能な刺激応答性高分子層を有する、細胞培養容器。
(2)2個以上の天部開口部を有する、前記(1)に記載の細胞培養容器。
(3)2個以上の前記天部開口部が、前記天部の表面に投影された前記刺激応答性高分子層を囲むように配置されている、前記(2)に記載の細胞培養容器。
(4)前記天部の表面積S0と、前記天部の表面と同一平面における前記少なくとも1個の天部開口部の断面積S1の総和ΣS1とが、下記の関係式:
ΣS1≧a×S0
[式中、aは、0.1以上である。]
を満たす、前記(1)〜(3)のいずれかに記載の細胞培養容器。
(5)前記aが、0.3〜0.7の範囲である、前記(4)に記載の細胞培養容器。
前記刺激応答性高分子層に所定の刺激を付与して細胞接着性から細胞非接着性へと変化させることによって、前記細胞構造体を該刺激応答性高分子層の表面から剥離させる、剥離工程;
前記剥離工程の後に、前記天部開口部から培養液を除去する、培養液除去工程;
前記培養液除去工程の後に、前記底部の少なくとも一部を細胞培養容器から取り外して、前記剥離工程で剥離された細胞構造体を回収する、回収工程;
を含む、細胞構造体の作製方法。
本発明は、細胞培養容器に関する。本発明の細胞培養容器は、側壁部と、該側壁部の上端側の外縁に接合されている天部とを備える。前記天部及び側壁部は、一緒になって収容部を構成する。
ΣS1≧a×S0
を満たすように、前記少なくとも1個の天部開口部の形状が選択されることが好ましい。前記式において、aは、0.1以上であることが好ましく、0.1〜0.7の範囲であることがより好ましく、0.3〜0.7の範囲であることがさらに好ましく、0.4〜0.7の範囲であることが特にに好ましい。以下において説明するように、本発明の細胞培養容器を用いて細胞構造体を作製する場合、底部の上面の少なくとも一部に配置された刺激応答性高分子層の表面に細胞構造体を形成させた後、該刺激応答性高分子層に所定の刺激を付与して細胞接着性から細胞非接着性へと変化させることによって、前記細胞構造体を該刺激応答性高分子層の表面から剥離させる。このような処理により、前記刺激応答性高分子層の表面から剥離した細胞構造体は、剥離前の細胞構造体の水平方向の断面積に対して、通常は30〜70%、典型的には40〜60%の断面積まで収縮する。それ故、前記関係式において、aが前記範囲を満たすように、前記少なくとも1個の天部開口部の形状を選択することにより、収縮後の細胞構造体を損傷することなく、少なくとも1個の天部開口部を介して、側壁部の近傍から、収容部の内部の培養液を容易に除去することができる。
本発明の細胞培養容器は、収容部形成工程、底部形成工程及び接合工程を含む方法により、製造することができる。以下、各工程について説明する。
本発明の細胞培養容器の製造方法は、本発明の細胞培養容器を構成する側壁部及び天部を有する収容部を形成する、収容部形成工程を含む。本発明の細胞培養容器が首部及び/又は凹部を有する実施形態の場合、本工程は、収容部に加えて、首部及び/又は凹部を形成する工程を含むことが好ましい。
本発明の細胞培養容器の製造方法は、刺激応答性高分子層を上面に有する底部を形成する、底部形成工程を含む。
本発明の細胞培養容器の製造方法は、前記収容部形成工程によって得られる収容部と、前記底部形成工程によって得られる底部とを接合する、接合工程を含む。本発明の細胞培養容器が、図4及び5に示す2個以上の異なる形状の天部開口部を有する実施形態の場合、本工程は、収容部の天部と、天部開口閉塞部とを接合する工程をさらに含むことが好ましい。接合工程を実施することにより、本発明の細胞培養容器を得ることができる。
本発明はまた、細胞構造体の作製方法に関する。本発明の細胞構造体の作製方法は、細胞構造体形成工程、剥離工程、培養液除去工程及び回収工程を含む。本発明の細胞構造体の作製方法の概要を図7に示す。以下、図7を参照しながら、各工程を説明する。
本発明の細胞構造体の作製方法は、本発明の細胞培養容器を用いて細胞を培養して、前記細胞培養容器の底部の上面の少なくとも一部に配置された刺激応答性高分子層の表面に細胞構造体を形成させる、細胞構造体形成工程を含むことが必要である(図7A)。本工程において使用される本発明の細胞培養容器は、前記で説明したいずれの実施形態であってもよい。
本発明の細胞構造体の作製方法は、前記刺激応答性高分子層に所定の刺激を付与して細胞接着性から細胞非接着性へと変化させることによって、前記細胞構造体を該刺激応答性高分子層の表面から剥離させる、剥離工程を含むことが必要である(図7B)。
本発明の細胞構造体の作製方法は、前記剥離工程の後に、前記天部開口部から培養液を除去する、培養液除去工程を含むことが必要である(図7C, D)。
本発明の細胞構造体の作製方法は、培養液除去工程の後に、前記底部の少なくとも一部を細胞培養容器から取り外して、前記剥離工程で剥離された細胞構造体を回収する、回収工程を含むことが必要である(図7F)。
以下の手順で、本発明の細胞培養容器1を作製した。以下、図1を参照しながら本発明の細胞培養容器1の作製手順を説明する。3Dプリンターを用いて、ポリスチレン製の収容部110(7.5 cm×5 cm×高さ3 cm)、天部開口部の首部120(内径2.5 cm×高さ1.5 cm)及び首部120に装着される蓋130を成形した。収容部110及び首部120の厚さは1 mmとした。収容部110は、側壁部110と、該側壁部110の下端側に配置され、少なくともその一部が該側壁部110の下端側の外縁によって画定される底部開口部と、該側壁部110の上端側の外縁に接合されている天部103とを有する。首部120は、筒部121と係止部122とを有する。蓋130は、係止部122を介して、首部120に着脱可能に装着される。この場合、天部103の表面積S0は、37.5 cm2であり、前記天部103の表面と同一平面における天部開口部104の水平方向の断面積S1は、4.9 cm2であり、断面積S1の総和ΣS1は、4.9 cm2であり、式ΣS1=a×S0によって定義される定数aは、0.13である。ポリスチレン製のフィルム(厚さ0.05 mm)の上面に、ポリ-N-イソプロピルアクリルアミド(PNIPAAm)製の温度応答性高分子層(厚さ20 nm)を積層した積層フィルムを、8 cm×5.5 cmの長方形状に裁断して、底部102及び温度応答性高分子層105を有する積層フィルムを得た。エポキシ系接着剤(1液型RTVゴム;信越化学)を用いて、裁断された積層フィルムを、収容部110の底部開口部に対して該底部開口部を閉塞するように貼付した。前記積層フィルムは、100 mN/25 mmの引き剥がし強度を有するように貼付した。なお、前記引き剥がし強度は、90°剥離試験によって決定した。
前記と同様の手順で、本発明の細胞培養容器4を作製した。以下、図4を参照しながら本発明の細胞培養容器4の作製手順を説明する。3Dプリンターを用いて、ポリスチレン製の収容部410(7.5 cm×5 cm×高さ3 cm)、天部開口部の首部420(内径2.5 cm×高さ1.5 cm)及び首部420に装着される蓋430を成形した。収容部410及び首部420の厚さは1 mmとした。収容部410は、側壁部410と、該側壁部410の下端側に配置され、少なくともその一部が該側壁部410の下端側の外縁によって画定される底部開口部と、該側壁部410の上端側の外縁に接合されている天部403と、天部403に設けられたさらなる天部開口部406(4.5 cm×4.5 cm)とを有する。首部420は、筒部421と係止部422とを有する。蓋430は、係止部422を介して、首部420に着脱可能に装着される。この場合、天部403の表面積S0は、37.5 cm2であり、前記天部403の表面と同一平面における首部420を有する天部開口部404の断面積S1は、4.9 cm2であり、前記天部403の表面と同一平面におけるさらなる天部開口部406の断面積S1は、20.25 cm2であり、断面積S1の総和ΣS1は、25.15 cm2であり、式ΣS1=a×S0によって定義される定数aは、0.67である。ポリスチレン製のフィルム(厚さ0.05 mm)の上面に、ポリ-N-イソプロピルアクリルアミド(PNIPAAm)製の温度応答性高分子層(厚さ20 nm)を積層した積層フィルムを、8 cm×5.5 cmの長方形状に裁断して、底部402及び温度応答性高分子層405を有する積層フィルムを得た。エポキシ系接着剤(1液型RTVゴム;信越化学)を用いて、裁断された積層フィルムを、収容部410の底部開口部に対して該底部開口部を閉塞するように貼付した。前記積層フィルムは、100 mN/25 mmの引き剥がし強度を有するように貼付した。また、ポリスチレン製のフィルム(厚さ0.05 mm)を、4.75 cm×4.75 cmの長方形状に裁断した。エポキシ性医療用接着剤(1液型RTVゴム;信越化学)を用いて、裁断されたフィルム440を、収容部410のさらなる天部開口部406に対して該天部開口部を閉塞するように貼付した。前記フィルムは、100 mN/25 mmの引き剥がし強度を有するように貼付した。なお、前記引き剥がし強度は、90°剥離試験によって決定した。
以下、図7を参照しながら本発明の細胞培養容器を用いる細胞構造体の作製方法の手順を説明する。前記の手順で作製した本発明の細胞培養容器5の収容部510に、天部開口部504を介して7.5 mlの10%FBS含有DMEM培地を加えた。前記培地中に、マウス横紋筋芽細胞を播種した。前記細胞を、所定の条件下で、100%コンフルエントの状態となるまで培養を行った。なお、細胞のコンフルエンシーは、培養中の細胞培養容器内を顕微鏡下で観察し、視野内における総面積に対する細胞の専有面積を評価することによって、決定した。
101, 201, 301, 401, 501…側壁部
102, 202, 302, 402, 502…底部
103, 203, 303, 403, 503…天部
104, 204, 304, 404, 504…少なくとも1個の天部開口部
105, 205, 305, 405, 505…刺激応答性高分子層
306, 307, 308, 406, 506…さらなる天部開口部
440, 540…天部開口閉塞部
110, 210, 310, 410, 510…収容部
121, 221, 321, 421, 521…筒部
122, 222, 322, 422, 522…係止部
120, 220, 320, 420, 520…首部
130, 230, 330, 430, 530…蓋
240…少なくとも1個の凹部
S0…天部の表面積
S1…天部の表面と同一平面における天部開口部の断面積
a…培養液
b…細胞構造体
b’… 刺激応答性高分子層から剥離された細胞構造体
Claims (6)
- 側壁部と、該側壁部の下端側に配置され、少なくともその一部が該側壁部の下端側の外縁に対して着脱可能に取り付けられている底部と、該側壁部の上端側の外縁に接合されている天部とを備え、
前記天部に、少なくとも1個の天部開口部を有し、
前記底部の上面の少なくとも一部に、所定の刺激に応答して細胞接着性から細胞非接着性へと変化することが可能な刺激応答性高分子層を有する、細胞培養容器。 - 2個以上の天部開口部を有する、請求項1に記載の細胞培養容器。
- 2個以上の前記天部開口部が、前記天部の表面に投影された前記刺激応答性高分子層を囲むように配置されている、請求項2に記載の細胞培養容器。
- 前記天部の表面積S0と、前記天部の表面と同一平面における前記少なくとも1個の天部開口部の断面積S1の総和ΣS1とが、下記の関係式:
ΣS1≧a×S0
[式中、aは、0.1以上である。]
を満たす、請求項1〜3のいずれか1項に記載の細胞培養容器。 - 前記aが、0.3〜0.7の範囲である、請求項4に記載の細胞培養容器。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の細胞培養容器を用いて細胞を培養して、前記細胞培養容器の底部の上面の少なくとも一部に配置された刺激応答性高分子層の表面に細胞構造体を形成させる、細胞構造体形成工程;
前記刺激応答性高分子層に所定の刺激を付与して細胞接着性から細胞非接着性へと変化させることによって、前記細胞構造体を該刺激応答性高分子層の表面から剥離させる、剥離工程;
前記剥離工程の後に、前記天部開口部から培養液を除去する、培養液除去工程;
前記培養液除去工程の後に、前記底部の少なくとも一部を細胞培養容器から取り外して、前記剥離工程で剥離された細胞構造体を回収する、回収工程;
を含む、細胞構造体の作製方法。
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