KR101387553B1

KR101387553B1 - 암세포와 배양보조세포의 공 배양 시스템

Info

Publication number: KR101387553B1
Application number: KR1020120112136A
Authority: KR
Inventors: 이종호; 강성훈; 이종길; 홍주표
Original assignee: 주식회사 마이크로이즈
Priority date: 2012-10-10
Filing date: 2012-10-10
Publication date: 2014-05-07
Also published as: KR20140046661A

Abstract

본 발명은 배양보조세포를 이용해서 암세포를 배양하는 공 배양 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 배양보조세포와 암세포를 복수의 구멍을 가지는 막을 사이에 두고 접촉하도록 하여 암세포의 성장속도를 빠르게 할 수 있는 공 배양 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 암세포와 배양보조세포의 공 배양 방법은 (a) 내부공간과 개방된 양단을 형성하는 측벽과, 상기 내부공간을 상부공간과 하부공간으로 구별하도록 상기 측벽의 내면 설치되고, 상기 상부공간 측 제1면과 상기 하부공간 측 제2면을 구비하며, 상기 제1면과 제2면을 관통하는 복수의 구멍(pore)이 형성된 막(membrane)을 포함하는 인서트를 준비하는 단계와, (b) 상기 막의 제1면 위에 배양보조세포(feeder cell)를 배양하여, 상기 배양보조세포의 사상위족(Filopodia)이 상기 막의 구멍을 관통하여 상기 막의 제2면 측에 노출되도록 하는 단계와, (c) 상기 인서트의 상기 하부공간이 상기 상부공간의 위에 배치되고, 상기 제2면이 위를 향하도록 상기 인서트를 뒤집는 단계와, (d) 상기 제2면 위에 암세포를 배치하여, 상기 배양보조세포와 공 배양하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따른 암세포와 배양보조세포의 공 배양 방법은 암세포와 배양보조세포가 복수의 구멍(pore)이 형성되어 있는 막(membrane)을 사이에 두고 직접적으로 접촉하기 때문에 암세포가 빠르게 성장할 수 있다.

Description

암세포와 배양보조세포의 공 배양 시스템{System for co-culturing cancer cells with feeder cells}

본 발명은 배양보조세포를 이용해서 암세포를 배양하는 공 배양에 사용되는 시스템에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 배양보조세포와 암세포를 복수의 구멍을 가지는 막을 사이에 두고 접촉하도록 하여 암세포의 성장속도를 빠르게 할 수 있는 공 배양 시스템에 관한 것이다.

세포와 조직을 배양하는 기술은 기초 또는 응용 생명 과학 연구를 위해서 점점 더 중요해지고 있다. 세포 배양이라 함은 일반적으로 다세포 생물의 개체로부터 조직 편을 분리하고, 조직 편을 용기 내에서 배양 및 증식시키는 것을 의미한다

특정한 세포는 다른 종류의 배양보조세포(feeder cell)와의 직접적인 상호작용이 그 세포의 성장, 이동 및 분화에 매우 큰 영향을 미친다. 예를 들어, 암세포의 경우 암 관련 섬유모세포(cancer-associated fibroblast, CAF)와 함께 배양하여야 성장 속도가 빨라진다.

따라서 동일한 배양 접시에 암세포와 CAF를 동시에 배양하는 공 배양 방법이 사용되어왔다. 그러나 동일한 배양 접시에 암세포와 CAF를 동시에 배양하면, 배양된 암세포에 CAF가 섞여 들어가는 일을 피할 수 없다. 특히 임상적용 시 배양보조세포에 의한 암세포의 오염은 심각한 문제를 야기할 수 있다.

공개특허 제2008-0016000호에는 이러한 문제점을 해결하기 위한 수단으로서, 배양보조세포와 줄기세포를 복수의 포어(pores)를 가지는 폴리머 막(membrane)으로 분리하여 두 개의 공간으로 나누어 배양하는 줄기세포의 배양방법이 제시된 바 있다.

그러나 도 1에 도시된 바와 같이, 상기 방법에서는 배양보조세포와 줄기세포가 서로 근접되어 있기는 하지만 직접적으로 접촉되어 있지는 않다. 따라서 암세포와 같이, CAF와의 직접적인 접촉이 없이는 성장이 촉진되기 어려운 세포의 공 배양에는 적용하기 어렵다는 문제가 있었다.

공개특허 제2008-0016000호

본 발명은 상술한 문제점을 개선하기 위한 것으로서, 암세포와 배양보조세포가 직접 접촉한 상태로 암세포를 배양할 수 있는 새로운 공 배양 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 공 배양 시스템은 내부공간과 개방된 양단을 형성하는 측벽과, 상기 내부공간을 상부공간과 하부공간으로 구별하도록 상기 측벽의 내면 설치되고, 상기 상부공간 측 제1면과 상기 하부공간 측 제2면을 구비하며, 상기 제1면과 제2면을 관통하는 복수의 구멍(pore)이 형성된 막(membrane)을 포함하는 인서트와, 상기 인서트와 상기 인서트의 막의 제1면에 부착되는 배양보조세포를 배양하기 위한 제1배양액이 수용되도록 형성된 수용공간과 개방된 일단을 형성하는 측면 및 바닥면을 구비한 레저부아와, 상기 인서트를 수용할 수 있도록 오목하게 형성되며, 상기 인서트의 막의 제2면에 부착되는 암세포를 배양하기 위한 제2배양액이 수용되는 웰(well)을 구비한 웹 플레이트를 포함한다.

상술한 공 배양 시스템에서 상기 인서트는 상기 레저부아에는 상기 제1면이 위를 향하도록 수용되고, 상기 웰 플레이트에는 상기 제2면이 위로 향하도록 수용되도록 형성되며, 상기 막의 구멍은 상기 제1배양액 및 제2배양액의 이동 및 상기 제1면의 배양보조세포의 사상위족(Filopodia)이 상기 막의 제2면 측에 노출되는 것을 허용하며, 상기 암세포의 이동을 방지하도록 형성된다.

상기 배양보조세포는 암 관련 섬유모세포(cancer-associated fibroblast, CAF)인 것이 바람직하다.

또한, 상기 막은 바이오 코팅층이 형성된 포토레지스트인 것이 바람직하다. 반도체공정을 통해서 구멍의 크기, 형태 및 분포가 균일하며, 개구율이 매우 높은 막을 쉽게 제조할 수 있다는 장점이 있기 때문이다.

상기 막의 두께는 10㎛이하이며, 구멍의 평균지름은 1 내지 10㎛인 것이 바람직하다. 막의 두께가 10㎛를 초과하고, 구멍의 평균지름이 1㎛미만인 경우에는 배양보조세포의 사상위족이 통과하기 어렵기 때문이다. 또한, 평균지름이 10㎛를 초과하면 배양보조세포가 막을 통과할 수 있기 때문이다.

상기 레저부아의 수용공간의 깊이는 상기 인서트의 측벽의 높이에 비해서 얕은 것이 바람직하다. 제1배양액이 상기 측벽을 넘어서 상기 하부공간으로 유입되지 않고, 상기 막을 통해서만 상기 하부공간으로 유입되어야 암세포가 배양보조세포에 의해서 오염되지 않기 때문이다.

본 발명에 따른 암세포와 배양보조세포의 공 배양 장치는 암세포와 배양보조세포가 복수의 구멍(pore)이 형성되어 있는 막(membrane)을 사이에 두고 직접적으로 접촉하기 때문에 암세포가 빠르게 성장할 수 있다.

도 1은 종래의 공 배양 방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 암세포와 배양보조세포의 공 배양 시스템의 일실시예를 나타낸 개념도이다.
도 3은 도 2에 도시된 인서트의 사시도이다.
도 4는 도 2에 도시된 인서트의 단면도이다.
도 5는 도 2에 도시된 레저부아의 사시도이다.
도 6은 도 2에 도시된 웰 플레이트의 사시도이다.
도 7은 배양보조세포(feeder cell)를 배양하는 단계를 설명하기 위한 도면이다.
도 8은 배양보조세포의 사상위족이 막을 통과한 상태를 나타낸 도면이다.
도 9는 암세포와 배양보조세포를 공 배양하는 단계를 설명하기 위한 도면이다.
도 10은 배양보조세포의 사상위족이 막을 통과하여 암세포와 접한 상태를 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부된 도면들에 의거하여 상세하게 설명한다. 다음에 소개되는 실시예는 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 암세포와 배양보조세포의 공 배양 시스템의 일실시예를 나타낸 개념도이다.

도 3은 도 2에 도시된 인서트의 사시도이며, 도 4는 도 2에 도시된 인서트의 단면도이다. 도 3과 4를 참고하면, 인서트(10)는 내부공간과 개방된 양단을 형성하는 측벽(11)과 내부공간을 상부공간(12)과 하부공간(13)으로 구별하도록 측벽의 내면에 내부공간을 가로질러 설치되는 막(membrane, 14)을 포함한다. 각각의 인서트(10)들은 모든 인서트(10)들을 한번에 다루기 쉽도록 홀더(20)에 의해서 어레이 형태로 연결되어 있다.

측벽(11)은 생체 친화성 재질로 이루어진다. 특별히 제한되는 것은 아니지만 예를 들면, PDMS, PMMA, PET, PC와 같은 투명한 생체 친화성 플라스틱, 유리 등으로 이루어질 수 있다.

인서트(10)의 막(14)은 암세포와 배양보조세포가 서로 교류하면서도, 서로 분리된 상태를 유지하기 위한 것이다. 암세포와 배양보조세포가 서로 교류하여야 암세포의 성장속도가 빨라지지만, 서로 분리되어 있지 않으면, 암세포의 배양이 완료된 후 암세포와 배양보조세포를 분리할 수 없기 때문에 막(14)을 이용한다.

막(14)은 상부공간(12) 측 제1면(15)과 하부공간(13) 측 제2면(16)을 구비한다. 막(14)에는 배양액과 배양보조세포의 사상위족(Filopodia)은 통과할 수 있으나, 암세포와 배양보조세포 전체는 통과할 수 없는 크기의 복수의 구멍(pore)이 제1면(15)과 제2면(16)을 관통하여 형성되어 있다. 사상위족은 실 모양의 가늘고 투명한 세포소기관이다.

막(14)의 두께는 10㎛이하이며, 구멍(17)의 평균지름은 1 내지 10㎛인 것이 바람직하다. 막(14)의 두께가 10㎛를 초과하고, 구멍(17)의 평균지름이 1㎛미만인 경우에는 배양보조세포의 사상위족이 통과하기 어렵기 때문이다. 또한, 평균지름이 10㎛를 초과하면 배양보조세포가 막(14)을 통과할 수 있기 때문이다.

막(14)은 생체적합성이 있는 고분자로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 합성고분자인 PLA(poly(lactic acid)), PGA(poly(glycolic acid)), Poly(ethylene terephtalate)(PET), 불화에틸렌수지(polytetrafluoroethylene: PTFE), 우레탄수지(polyurethane:PU), 메틸메타아크릴산중합체(PMMA), 폴리에스터(polyester) 또는 폴리카보네이트(polycarbonate) 등으로 이루어질 수 있다.

또한, 막(14)은 표면에 바이오 코팅층이 형성된 포토레지스트로 이루어질 수 있다. 포토레지스트를 이용할 경우에는 반도체 제조 공정을 이용해서 막(14)을 제조할 수 있으므로, 구멍(17)의 크기, 형태 및 분포가 균일하며, 개구율이 매우 높은 막(14)을 제조할 수 있다는 장점이 있다. 단, 포토레지스트는 생체적합성이 떨어지므로, 생체적합성이 있는 바이오 코팅층을 형성하는 것이 바람직하다. 바이오 코팅층으로는 패럴린 코팅(parylene coating) 층을 사용할 수 있다.

도 5는 도 2에 도시된 레저부아의 사시도이다.

도 5를 참고하면, 레저부아(30)는 내부 수용공간(32)과 개방된 일단(33)을 형성하는 측면(34) 및 바닥면(35)을 구비한다. 레저부아(30)는 인서트(10)를 수용한다. 인서트(10)는 제1면(15)이 위를 향하도록 레저부아(30)에 수용된다. 레저부아(30)는 배양보조세포를 배양하는 단계에서 제1배양액을 수용하는 역할을 한다.

도 6은 도 2에 도시된 웰 플레이트의 사시도이다.

도 6에 도시된 바와 같이, 웰 플레이트(40)는 인서트(10)를 수용할 수 있도록 오목하게 형성된 복수의 웰(41)을 포함한다. 웰(41)은 인서트(10)의 막(14)의 제2면(16)에 부착되는 암세포를 배양하기 위한 제2배양액을 수용한다. 인서트(10)는 제2면(16)이 위를 향하도록 뒤집힌 상태로 웰 플레이트(40)의 웰(41)에 삽입된다.

이하, 상술한 암세포와 배양보조세포의 공 배양 시스템를 이용한 공 배양 방법에 대해서 설명한다.

우선, 도 7과 8을 참고하여, 막의 제1면 위에 배양보조세포(feeder cell)를 배양하는 단계에 대해서 설명한다.

인서트(10)를 레저부아(reservoir, 30)의 내부에 배치한 후 레저부아(30)에 배양보조세포 배양에 적합한 제1배양액(31)을 투입한다. 제1배양액(31)은 인서트(10)의 측벽(11)을 넘지 않을 정도로 투입하는 것이 바람직하다. 배양보조세포가 포함되어 있는 제1배양액(31)이 인서트(10)의 측벽(11)을 넘어서 흐르면, 암세포가 배양되는 인서트(10)의 하부공간(13)이 배양보조세포에 의해서 오염될 수 있기 때문이다.

다음, 인서트(10)의 막(14)의 제1면(15) 위에 배양보조세포(A)를 깐다. 그리고 레저부아(30)를 인큐베이터에 투입하여 배양보조세포(A)를 배양한다. 배양보조세포(A)가 배양되는 과정에서 도 6에 도시된 바와 같이, 배양보조세포(A)의 사상위족(C)이 인서트(10)의 막(14)의 구멍(17)들을 통과하여 제2면(16) 위로 노출된다. 그리고 배양보조세포(A)가 제1면(15)에 부착되어 고정된다.

다음, 인서트를 뒤집는 단계를 설명한다.

배양보조세포(A)가 충분히 성장하여, 제2면(16) 위로 배양보조세포(A)의 사상위족(C)이 노출되고, 배양보조세포(A)가 제2면(16)에 부착되어 고정되면, 인서트(10)를 레저부아(30)에서 분리시킨다. 다음, 인서트(10)가 삽입될 수 있는 복수의 웰(well, 41)을 구비한 웰 플레이트(well plate, 40)에 암세포의 배양에 적합한 제2배양액(42)을 투입한다. 제2배양액(42)은 인서트(10)의 측벽(11)을 넘지 않을 정도로 투입하는 것이 바람직하다. 암세포(B)와 배양보조세포(A)의 공 배양 과정에서 배양보조세포(A)가 포함되어 있는 제2배양액(42)이 인서트(10)의 측벽(11)을 넘어서 흐르면, 암세포(B)가 배양되는 인서트(10)의 하부공간(13)(인서트를 뒤집은 후에는 도면상 상부에 위치함)이 배양보조세포(A)에 의해서 오염될 수 있기 때문이다. 그리고 인서트(10)를 뒤집어서 웰 플레이트(40)에 끼운다(도 9 참조).

마지막으로, 도 9와 10을 참고하여, 막의 제2면 위에 암세포를 배치하여, 상기 배양보조세포와 공 배양하는 단계에 대해서 설명한다.

웰 플레이트(40)에 뒤집어서 끼워진 인서트(10)의 막(14)의 제2면(16) 위에 암세포(B)를 깐다. 웰 플레이트(40)를 인큐베이터에 투입하여 암세포(B)와 배양보조세포(A)를 공 배양한다. 이때, 배양보조세포(A)의 사상위족(C)이 제2면(16) 측으로 노출되어 있으므로, 암세포(B)와 사상위족(C)이 직접 접촉한다(도 10 참조). 배양보조세포(A)는 사상위족(C)을 통해서 암세포(B)에 암세포(B)의 성장에 필요한 영양분을 공급하여, 암세포(B)의 성장을 촉진하다.

암세포(B)의 성장이 완료되면, 암세포(B)를 인서트(10)의 막(14)에서 분리한다. 이 과정에서 배양보조세포(A)의 사상위족(C)이 암세포(B)에 부착될 수 있으나, 사상위족(C)은 암세포(B)를 오염시키지 않는다고 알려져 있다. 따라서 암세포(B)를 빠르게 성장시키면서도, 배양보조세포(A)에 의한 오염을 막을 수 있다.

이상에서 설명된 실시예는 본 발명의 바람직한 실시예를 설명한 것에 불과하고, 본 발명의 권리범위는 설명된 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상과 특허청구범위 내에서 이 분야의 당업자에 의하여 다양한 변경, 변형 또는 치환이 가능할 것이며, 그와 같은 실시예들은 본 발명의 범위에 속하는 것으로 이해되어야 한다.

10: 인서트 11: 측벽
12: 상부공간 13: 하부공간
14: 막 15: 제1면
16: 제2면 17: 구멍
20: 홀더 30: 레저부아
31: 제1배양액 40: 웰 플레이트
41: 웰 42: 제2배양액

Claims

내부공간과 개방된 양단을 형성하는 측벽과, 상기 내부공간을 상부공간과 하부공간으로 구별하도록 상기 측벽의 내면 설치되고, 상기 상부공간 측 제1면과 상기 하부공간 측 제2면을 구비하며, 상기 제1면과 제2면을 관통하는 복수의 구멍(pore)이 형성된 막(membrane)을 포함하는 인서트와,
상기 인서트와 상기 인서트의 막의 제1면에 부착되는 배양보조세포를 배양하기 위한 제1배양액이 수용되도록 형성된 수용공간과 개방된 일단을 형성하는 측면 및 바닥면을 구비한 레저부아와,
상기 인서트를 수용할 수 있도록 오목하게 형성되며, 상기 인서트의 막의 제2면에 부착되는 암세포를 배양하기 위한 제2배양액이 수용되는 웰(well)을 구비한 웹 플레이트를 포함하며,
상기 인서트는 상기 레저부아에는 상기 제1면이 위를 향하도록 수용되고, 상기 웰 플레이트에는 상기 제2면이 위로 향하도록 수용되도록 형성되며, 상기 막의 구멍은 상기 제1배양액 및 제2배양액의 이동 및 상기 제1면의 배양보조세포의 사상위족(Filopodia)이 상기 막의 제2면 측에 노출되는 것을 허용하며, 상기 암세포의 이동을 방지하도록 형성된 암세포와 배양보조세포의 공 배양 시스템.
제1항에 있어서,
상기 배양보조세포는 암 관련 섬유모세포(cancer-associated fibroblast, CAF)인 암세포와 배양보조세포의 공 배양 시스템.
제1항에 있어서,
상기 막은 바이오 코팅층이 형성된 포토레지스트인 암세포와 배양보조세포의 공 배양 시스템.
제1항에 있어서,
상기 막의 두께는 10㎛이하이며, 구멍의 평균지름은 1 내지 10㎛인 암세포와 배양보조세포의 공 배양 시스템.
제1항에 있어서,
상기 제1배양액이 상기 측벽을 넘어서 상기 하부공간으로 유입되지 않고, 상기 막을 통해서만 상기 하부공간으로 유입되도록, 상기 레저부아의 수용공간의 깊이는 상기 인서트의 측벽의 높이에 비해서 얕은 암세포와 배양보조세포의 공 배양 시스템.