KR102137166B1 - 세포배양 기판 - Google Patents

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KR102137166B1
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Abstract

본 발명은 밀착성 고분자 기판을 준비하는 준비 단계; 및 상기 밀착성 고분자 기판 위에 복수의 입자를 압력을 가하여 코팅하는 코팅 단계;를 포함하고, 상기 코팅 단계는 상기 밀착성 고분자 기판에 상기 복수의 입자에 각기 대응하는 복수의 오목부가 형성되면서 코팅되는 입자 정렬을 이용한 세포 배양기판 제조방법 등을 제공한다.

Description

세포배양 기판{Substrate For Cell Culture}
본 발명은 세포 배양 특성이 우수한 미세구조를 갖는 세포배양 기판에 관한 것이다.
의료기술 및 생명공학 기술이 급속히 발전되면서 세포수준에서 생명활동을 관찰하고 특성을 부여하는 기술인 세포공학에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 최근의 세포공학관련 기술은 기초적인 배지조성 조절 및 약물처리를 통한 연구 단계에서 세포가 흡착하고 성장하는 지지체에 특수한 기능을 부여하는 단계로 변화되고 있다. 지지체에 대한 연구 방향은 기존의 세포의 흡착 및 증식을 돕도록 이온성 물질 및 생체 유래 물질을 플라스틱이나 무기물에 코팅하는 방법에서 미세 가공기술을 통해 지지체 표면에 미세구조를 형성시키고 이를 통해 세포의 특성을 조절하는 방법으로 빠르게 발전되고 있다.
세포의 생존을 위해서는 세포막을 통한 물질의 수송 및 세포막에 부유상태로 존재하는 막 단백질을 통한 신호전달이 필요하며, 지지체 표면의 미세구조는 이러한 세포막을 원하는 형태로 변형시켜 세포의 흡착 및 증식, 분화 특성을 조절하는 방법으로 이용이 가능하다. 이미 미세구조에 의해 세포의 흡착 및 증식을 조절하는 연구들이 2000년 중반 이후로 급속히 보고되고 있으며, 이러한 특성 조절이 기존의 약물과 병행하여 적용됨으로써 기존의 세포공학적인 한계점들을 해결할 수 있을 것으로 예견되어진다.
세포 배양을 위한 미세구조 지지체의 제조방법은 3가지 방법이 널리 이용되며 다음과 같은 특징을 지닌다.
1) Photo-lithography method : 기존 반도체 제조공정을 이용하여 원하는 형태로 최소 10 ~ 100 nm 수준의 선폭을 지니는 기판을 제작한다. 보통 수 μm 면적의 소형기판의 제작만이 가능하며, 높은 제조비용으로 인하여 세포 특성연구 분야에 제한적으로 사용된다.
2) Particle-coating method
: 수십 ~ 수백 nm의 구형 파티클을 기판위에 코팅하여 파티클에 의한 불규칙적인 구조를 가지는 기판을 제작한다. 스핀코팅 방법 등을 통해 ~ 15 cm 직경의 대형 기판 제작이 가능하고, 제조비용이 저렴하여 가장 상업적인 응용이 가능하다. 하지만 불규칙적인 구조를 지니며, 기판의 균일도 및 재현성이 떨어지는 문제가 있다.
3) Etching method
: 금속 표면을 전해질용액 상에서 전기를 흘려주어 산화된 금속 표면에 규칙적인 pore를 형성한다. 전압이나 전해질의 조성을 조절하여 다양한 크기의 pore를 제작할 수 있으나, pore의 직경이 증가할수록 세포가 흡착될 수 있는 면적이 급격히 감소되어 지지체로 사용이 어려워진다. 직경 조절 이외의 원하는 형태로의 구조형성은 불가능 하며, 제조비용은 저렴하다.
<특허문헌>
한국특허공개 2011-0094753
종래의 단층배양환경의 세포 배양 기판은 세포배양 중 세포가 빠르게 고유 특성을 상실하는 탈분화 현상 및 줄기세포를 원하는 형태로 분화시키기 어렵다는 한계를 가지고 있다. 이는 생체내 환경과 상이한 배양 환경에서 세포를 배양하기 때문에 나타나는 문제점들로 판단되어 진다. 세포 부착면이 매끈한 평면을 가지는 특징으로 인해 수십 nm 수준의 복잡한 구조 및 3차원적 환경을 가지고 있는 생체 내 세포들과 달리 매끈한 평면 기판상에서 세포들의 골격 구조가 발달되고 이로 인해 세포의 유동성 및 이동성 저하를 비롯한 세포간 상호작용이 감소하는 결과가 나타난다.
본 발명은 상기의 문제점을 개선할 수 있는, 세포 배양시 세포 고유특성을 유지하거나 또는 원하는 방향으로 세포의 분화를 촉진하는 특징을 가지도록 단층배양 환경에서 세포간 상호작용을 강화시키는 미세구조의 세포 배양 기판을 제공하는 것을 목적으로 한다.
세포의 성장 및 분화에 있어서 세포는 수십 nm 이하의 단백질 및 세포막 구조를 통해서 주변 환경을 인식하고 그에 맞추어 자신의 상태를 결정하게 된다. 세포 배양시 탈분화를 억제하고 재분화를 촉진하기 위해서, 세포들이 서로 접촉할 수 있는 3차원적 환경을 제공하는 것이 중요하다.
3차원적 환경을 제공하기 위한 방법으로서, 기판 표면에 미세입자를 도포함으로써 미세구조를 도입하는 것을 고려하였다. 이에 대해 연구하던 중 몇 가지 인자들이 세포 배양에 있어 중요하게 작용할 수 있음을 발견하였다(본 명세서에서의 "미세"란 용어는 나노 크기부터 마이크로 크기 범위내 인 것을 의미한다).
본 발명에서는 도면 1a와 1b에서 보여주는 육방의 벌집구조로 높낮이 단차를 가지는 구조체가 배열됨에 따라서 나타나는 전방향에 대한 반복적인 높낮이 단차형성과 부드러운 곡면 및 사면구조로 인해 세포막이 구조체 사이로 부착될 수 있는 형태가 바람직하다. 기존의 photo lithography를 이용한 패턴된 식각방법 및 전기산화방식을 통해 제작된 틀을 이용한 방식은 경사도가 큰 사면 및 경계면이 제작되어 세포가 구조체 사이로 부착되기 어려우며, 도 1b의 상단그림과 같이 구조체 상단부에만 부착이 집중되어 선형의 골격구조가 형성되게 된다. 하지만, 구형 입자를 이용하여 제작되는 구조체들은 낮은 경사각의 연속적인 곡면 또는 사면구조를 가지게 되면서 상단부의 면적은 적으면서도, 도 1b의 하단과 같이 단위면적 대비 넓은 면적의 부착이 이루어 지게되어 선형 골격구조(stress fiber)가 발달하지 않게 된다. 이러한 선형 골격 구조의 저해는 부착된 세포가 기판상에서 이동하면서 주변 세포와 뭉쳐지게되는 특성을 가져오게 된다. 개별적인 세포들이 기판 전 면적에서 이러한 이동을 하면서 수많은 작은 면적의 미소 세포 펠렛(pellet)들을 만들게 된다. 이러한 미소 세포 펠렛들은 이웃한 세포들간의 상호작용을 강화 시키면서도, 펠렛 외각에 위치한 세포들을 통해 증식은 지속되는 매우 특수한 특성을 지닌다. 미세구조를 통해 수많은 미세 세포 펠렛을 형성되게 함으로써, 생체내 환경과 유사하게 세포의 상호작용이 강화되어 기존 평탄한 구조의 기판 또는 본 발명에서 제안하는 것과는 다른 구조를 지니는 미세구조의 기판에서는 얻을 수 없었던 연골세포의 재분화 및 줄기세포를 연골세포로 분화 시키는 결과를 얻을 수 있었다.
본 발명에서, 상기 3차원적 미소 펠렛 이란 대체로 수십 ㎛ ~ 수 mm의 크기로 세포들이 3차원적으로 뭉쳐서 배양되는 형태를 의미한다. 이러한 3차원적 미소 펠렛이 자라면서 인접 미소 펠렛과 접하게 되고 함께 응집되는 과정을 거치면서 세포가 배양되게 된다.
상기 3차원적 미소 펠렛은 초반에 꽃 유사 형상을 나타낼 수 있다. 꽃 유사 형상이란 중앙에 세포들이 응집되어 있는 코어 영역을 주변 세포들이 삐죽한 형태로 둘러싼 형상을 의미한다. 이러한 형태가 나타나는 이유는 본 발명의 미세구조 특성상 내부 골격 구조의 발달이 억제되고, 세포의 유동성이 증가되어 세포가 뭉쳐지는 특성이 나타나기 때문이다.
본 발명의 세포배양기판의 표면 구조에서 연골세포가 배양되는 경우, 세포 배양 속도는 평탄한 기판에 비하여 떨어지는 면이 있다. 이는 연골세포가 안정적인 내부 골격구조를 이루지 못하여, 세포간 응집체가 이루어진 후 증식이 시작되기 때문인 것으로 예상된다. 그러나 탈분화된 연골세포가 평탄한 2차원 배양기판인 TCPS 기판과 달리 연골세포로 재분화되며, 이를 통해 더 많은 차례의 계대배양을 더 진행할 수 있다. 이러한 특징으로 배양시간이나 계대배양 횟수를 늘림으로써 최종적으로 더욱 많은 유효 세포수를 얻을 수 있다.
일례로, 탈분화가 진행중인 연골세포를 배양하는 경우 콜라겐 type 2의 mRNA 발현값(연골세포 마커임)이 TCPS 기판과는 비교할 수 없을 정도로 우수한 것을 확인할 수 있다. 이는 3차원적 구조의 세포 배양시 분화 특성이 우수한 다른 세포의 경우에도 마찬가지로 적용된다. 일례로 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell, MSC), 근육 유래 줄기세포 등을 들 수 있다.
본 발명의 세포 배양기판의 미세구조는 연골세포 배양 테스트시 콜라겐 type 2의 mRNA 발현값이 초기 계대 단계 세포 (passage 0 ~１） 대비 30% 이상을 제공할 수 있다. 미세입자의 입경에 따라서는 콜라겐 type 2의 mRNA 발현값이 배양 초기 대비 70% 이상, 많기로는 100% 이상의 제공도 가능하다.
본 발명은 세포간 상호작용을 효과적으로 강화시키는 세포 응집을 유도하기에 적합한 미세구조의 세포배양기판의 구조를 제안하는데 목적이 있다. 다양한 제조예 및 실시예를 통해 대면적상 제작된 기판에서 효과적으로 연골세포 및 줄기세포등의 다양한 분화특성 조절을 관찰 하였으며, 그로인해 얻어진 결과가 기존 방법들에 비하여 우수한 결과를 나타냈다. 특히, 모든 결과들이 일반적인 세포배양 환경 (배지, 온도, pH등)에서 이루어졌으며, 약물 및 특별한 장비가 필요하지 않은 일반적 페트리 디쉬를 이용한 단층 배양환경 상에서 적용 가능한 기술이다.
미세구조 기판은 유리재질인 실리카 성분을 포함하여 폴리스티렌 재질일 수 있으며, 다른 세포상 배양이 가능한 다양한 재료로 제작이 가능하다. 면적이 50 ~ 10,000㎠ 인 대면적일 수 있다. 또한, 필요에 의해서 미세구조가 형성된 세포 배양기판은 별도로 유기 분자, 생체 유래 물질, 또는 폴리머로 표면처리될 수 있다. 이 경우에도 세포의 응집이 유도되는 3차원적 배양이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 아민 화합물, 하이드록시 화합물, 카르복실 화합물, 티올 화합물, 콜라겐, 피브로넥틴, 펩타이드, 또는 Poly-L-Lysine 등으로 표면 처리가 가능하다. 또한, 미세 박막상에 세포 배양시 표면 친수성을 증가시키기 위해 UV/Ozone 및 플라즈마를 통한 산화 처리도 가능하며, 추가적으로 생체 고분자 및 전하성 고분자등을 이용한 다양한 표면처리도 가능하다. 다양한 표면 처리는 기판 표면과 세포와의 상호작용에 영향을 주어서 다양한 세포의 성장 및 분화 방향을 제어할 수 있다. 예를 들어, 기판과 강한 결합을 유도하는 물질을 코팅하거나 특정한 분화 유도 물질을 코팅하여 일반적인 평탄한 기판에서는 나타날 수 없는 방향으로 세포의 성장 및 분화를 유도할 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명의 실시예에 따른 세포 배양기판은, 양각의 구조체 중 80% 이상이 규칙적으로 배치되어 존재하는 표면 구조를 갖는 세포 배양기판으로서, 상기 양각의 구조체의 높이를 b라 하고, 구조체의 밑면의 길이를 2a라고 할 때(단, 상기 양각의 구조체가 바닥면에서 멀어질 때 횡단면의 면적이 증가하는 구간이 있는 형상인 경우, 상기 밑면은 횡단면의 면적이 최대인 위치를 의미하고, 상기 높이는 횡단면 면적이 최대인 위치와 구조체 최상부와의 거리를 의미), 0.25a < b < 1.5a를 만족하는 세포 배양기판인 것이 좋다. 양각의 구조체는 규칙적일수록 세포 배양의 균일성, 재현성 등이 우수하여 바람직하다. 실질적으로 양각 구조체 전체가 규칙적으로 배열되는 것이 좋으며, 바람직하기로는 전체 양각 구조체들 중 80% 이상이 규칙적으로 배치되는 것이 좋다.
b의 값이 상기 범위 미만인 경우에는 미세 나노구조의 효과를 얻기가 어려울 수 있으며, b의 값이 상기 범위를 초과하는 경우 양각 구조체의 경사도가 커서 세포가 구조체 사이로 부착되기 어려우며, 구조체 상단부에만 부착이 집중되어 선형의 골격구조가 형성될 수 있다. 보다 바람직하게는, 0.5a < b < 1.3a, 특히 0.8a < b < 1.2a를 만족하는 것이 좋다.
상기 양각 구조체는 다양한 모양으로 제작될 수 있으며, 측단면의 형상이, 구형, 반구형, 타원형, 반타원형, 사다리꼴, 계단형, 삼각형 중 어느 하나일 수 있다. 상기 규칙적인 양각 구조체는 정렬된 구형입자로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 규칙적인 양각 구조체는 세포 배양기판의 기재와 일체형으로 몰드로 제작될 수 있다.
세포 배양기판의 표면에서 상기 양각의 구조체가 차지하는 면적이 전체 면적의 40% 이상, 특히 49% 이상을 차지하는 것이 좋다. 그 미만의 경우에는 평면 면적이 증가하여 세포 골격이 발달할 수 있다. 더욱 좋기로는 세포 배양기판의 표면에서 상기 양각의 구조체가 차지하는 면적이 전체 면적의 70% 이상, 특히 80% 이상을 차지하는 것이 좋다.
한편, 세포 배양기판의 표면 구조는, 200 nm ~ 2 um 이내의 간격으로 170 nm ~ 1 um의 반복적인 높낮이 단차로 인해 선형의 세포골격구조 형성이 억제되도록 하는 것이 좋다.
특히, 2 um × 2 um의 단위면적으로 세포 배양기판을 가상으로 영역 분할할 때, 평탄면을 이루는 단위면적이 단위면적 개수 기준으로 10% 미만, 보다 좋기로는 5% 미만, 더욱 좋기로는 존재하지 않는 것이 좋다. 이로부터 세포 골격구조의 형성이 억제될 수 있으며, 탈분화 효과 등 세포 배양 특성이 우수해질 수 있다.
또한, 2 um × 0.1 um의 단위면적으로 세포 배양기판을 분할할 때, 평탄면을 이루는 단위면적이 단위면적 개수 기준으로 20% 미만, 좋기로는 10% 미만, 보다 좋기로는 5% 미만, 더욱 좋기로는 존재하지 않는 것이 좋다. 이로부터 세포 골격구조의 형성이 억제될 수 있으며, 탈분화 효과 등 세포 배양 특성이 우수해질 수 있다.
한편, 상기 양각 구조체의 존재로 인해 얻어지는 세포 배양기판 표면 특성이 다음을 만족하는 세포 배양기판인 것이 좋다.
Rq ≤0.26b
(여기서, Rq는 표면 거칠기(Surface Roughness)이며, b는 높이를 나타낸다.) 상기 양각 구조체의 높이 b는 50nm ~ 10㎛의 범위일 수 있으며, 특히 양각 구조체의 높이 b는 150nm ~ 3㎛의 범위일 수 있다. 표면 거칠기(Surface Roughness)는 제한되지 않으나 25nm ~ 1000nm일 수 있다. 상기의 범위내에서 세포 골격구조의 형성이 억제될 수 있으며, 탈분화 효과 등 세포 배양 특성이 우수해질 수 있다.
또한, 상기 양각 구조체들은 서로 상하로 중첩되지 않거나 서로 상하로 중첩된 양각 구조체가 2% 미만으로 존재하는 것이 좋다.
기존의 TCPS 기판과 대비할 때 본 발명의 실시예에 따른 세포 배양기판은 다음과 같은 차이점을 가질 수 있다. 즉, 다수의 3차원적 미소 펠렛(pellet)이 형성되면서 세포가 배양되는 특성을 가질 수 있다. 상기 3차원적 미소 펠렛은 초기에 꽃 유사 형상을 가지며, 초기 세포 증식 속도는 늦고, 재분화 또는 분화율이 높은 특성의 미세구조를 갖고, 탈분화가 억제되거나 특정 세포로 분화되도록 하는 특성의 미세구조를 갖고, 연골세포를 배양하는 경우, 콜라겐 type 2의 mRNA 발현값이 배양 초기 (passage 0 ~１） 대비 30% 이상, 특히 70% 이상을 나타내는 특성의 미세구조를 갖고, 세포 골격 구조의 형성이 억제되는 미세 구조를 가질 수 있다. 또한, 첨가물 없이도 줄기세포 배양시 분화과정에서 콜라겐 type 2의 발현이 증가되는 미세구조를 가질 수 있다. 또한, 줄기세포의 분화 특성이 향상 또는 조절되는 특성의 미세구조를 가지며, 분화과정의 세포의 분화능을 향상시키는 특성의 미세구조를 가질 수 있다.
본 발명의 세포 배양기판의 다양한 일례를 이하에서 구체적으로 설명한다.
먼저, 미세입자를 이용한 세포 배양기판을 설명한다.
3차원적 환경을 제공하기 위한 방법의 하나로서, 기판 표면에 도포된 미세입자의 입경과 표면 거칠기의 상관관계가 중요함을 발견하였다. 미세입자의 입경 대비 표면 거칠기가 특정 범위를 넘어서는 경우에는 미세입자의 불규칙한 배열로 인해 세포들에게 고른 표면환경을 제공하기 어려워 우수한 재현성 확보가 어려운 점 등 세포 배양 특성이 떨어지는 것으로 나타났다. 이에 비해 미세입자의 입경 대비 표면 거칠기가 특정값보다 낮은 경우 재현성 등 세포 배양 특성이 우수한 것으로 나타났다.
미세입자의 입경과 표면 거칠기의 상관관계는 다음과 같은 것이 좋다. 즉, 기재상에 미세입자가 배열되어 형성된 박막이 구비된 세포 배양기판으로서, 구형의 미세입자 배열에 의해 얻어지는 표면 특성이 다음을 만족하는 세포 배양기판인 것이 좋다.
Rq ≤0.13D
여기서, Rq는 표면 거칠기(Surface Roughness)이며, D는 미세입자의 평균입경을 나타낸다. 상기 범위를 벗어나는 경우 불규칙한 배열이 늘어나고 배양과정에서 세포 간 노출환경이 변화되어 재현성 있는 결과 도출이 어렵게 된다. 재현성에 문제가 있는 경우에는 상용화에 큰 걸림돌이 될 수 있기 때문에 중요한 요소가 된다.
보다 바람직하기로는 다음의 식을 만족하는 것이 좋다.
Rq ≤0.12D
특히, 탈분화 억제, 재분화 유도, 및/또는 세포 골격 구조 발달의 억제, 3차원 미소 펠렛 형성 유도 등 세포 배양 특성을 더욱 우수하게 가져가기 위해서는 다음의 조건을 만족하는 것이 좋다. 상기 미세입자의 평균입경은 250nm ~ 10㎛의 범위, 더 좋기로는 300nm ~ 3㎛ 범위인 것이 좋다. 상기 범위 미만에서는 도 12에서와 같이 세포의 골격구조 발달 형성 저해 효과가 줄어들어서 연골세포로 재분화 되는 효과가 감소한다. 상기 범위를 초과하는 경우 산란에 의한 위상차 현미경의 관찰이 어려워져서 배양시 세포상태의 실시간 관찰을 할 수 없다. 또한, 세포의 직경(5 ~ 30 ㎛)과 유사한 수준의 구조 직경으로 인해 구조위에 세포가 자라는 형태가 아닌 세포가 구조 사이에 갇힐 가능성이 높아진다.
표면 거칠기(Surface Roughness)는 25nm ~ 1000nm범위가 좋으며, 더욱 바람직하기로는 표면 거칠기가 30nm ~ 300nm 범위가 좋다. 상기 범위 미만에서는 전술한 바와 같이, 세포의 골격구조 발달 형성 저해 효과가 줄어들어서 연골세포로 재분화 되는 효과가 감소하며, 상기 범위를 초과하는 경우 배양시 세포상태의 실시간 관찰이 어렵고, 세포가 구조 사이에 갇힐 가능성이 높아진다.
표면 단차는 170nm ~ 10 ㎛가 좋으며, 특히 200nm ~ 1.5 ㎛ 범위가 좋다. 상기 범위 미만에서는 세포의 골격구조 발달 형성 저해 효과가 줄어들어서 연골세포로 재분화 되는 효과가 감소하며, 상기 범위를 초과하는 경우 배양시 세포상태의 실시간 관찰이 어렵고, 구조위에 세포가 자라는 형태가 아닌 세포가 구조 사이에 갇힐 가능성이 높아진다.
미세입자의 재질은 제한되지 않는다. 무기물, 유기물, 또는 금속이거나 이들의 복합체일 수 있다. 바람직하기로는 실리카 입자가 좋다. 실리카 입자에는 표면 코팅되거나 표면처리되어 개질된 것도 포함된다.
또 다른 인자로서, 미세입자 1개가 6개의 미세입자로 둘러싸여 있는 형상, 특히 헥사고날 형태로 배열되는 것이 세포 골격 구조의 발달을 저하시킬 수 있는 것을 발견하였다. 헥사고날 형태에서는 세포 골격 구조의 형성을 촉진하는 유효한 면적의 일직선 구조가 발달되어 있지 않기 때문에 세포 배양에 좋은 구조로 확인되었다.
또 다른 인자로서, 미세입자의 배열에 있어서, 주로 5~6개의 홀(hole)이 미세입자 주변에 존재하는 구조가 좋을 수 있다. 세포의 포디아(podia)가 상기 홀에 앤코링(anchoring)될 수 있어 세포의 초기 흡착 특성을 우수하게 할 수 있다. 또한, 표면 구조가 더욱 3차원적이므로 세포 골격 구조 형성을 억제시킬 수 있고 3차원 미소 펠렛 형성을 촉진할 수 있다.
또 다른 인자로서, 배열된 미세입자의 전체 개수 대비 50% 이상은 기재와 접촉되어 있는, 더 나아가 미세입자 박막이 실질적으로 단층인 것이 미세입자의 규칙적인 배열 및 재현성을 높이기 위해 유리하다. 또는, 상기 미세입자가 규칙적으로 배열되어 기재와 접촉될 수 있는 이론적인 최대 부착 개수 대비 50% 이상, 특히 80% 이상은 기재와 접촉되어 있는 것이 좋다. 이론적인 최대 부착 개수는 벌집구조의 배열형태에서 나올 수 있다. 이론적인 최대 부착 개수에 근접할수록 미세입자가 결여된 빈공간이 발생하는 것을 줄일 수 있다.
본 발명에서, 상기 3차원적 미소 펠렛(pellet)이란 대체로 수백 ㎛ ~ 수 mm의 크기로 세포들이 3차원적으로 뭉쳐서 배양되는 형태를 의미한다. 이러한 3차원적 미소 펠렛이 자라면서 인접 미소 펠렛과 접하게 되고 함께 응집되어 세포가 배양되게 된다.
상기 3차원적 미소 펠렛은 초반에 꽃 유사 형상을 나타낼 수 있다. 꽃 유사 형상이란 중앙에 세포들이 응집되어 있는 코어 영역을 주변 세포들이 삐죽한 형태로 둘러싼 형상을 의미한다. 이러한 형태가 나타나는 이유는 본 발명의 미세구조 특성상 내부 골격 구조의 발달이 억제되고, 세포의 유동성이 증가되어 세포가 뭉쳐지는 특성이 나타나기 때문이다.
본 발명의 세포배양기판의 표면 구조에서 배양되는 경우, 세포 배양 속도는 평탄한 기판에 비하여 떨어지는 면이 있다. 이는 세포가 안정적인 내부 골격구조를 이루지 못하여, 세포간 응집체가 이루어진 후 증식이 시작되기 때문인 것으로 예상된다. 그러나 탈분화된 세포가 평탄한 2차원 배양기판인 TCPS 기판과 달리 연골세포로 재분화되며, 이를 통해 더 많은 차례의 계대배양을 더 진행할 수 있다. 이러한 특징으로 배양시간이나 계대배양 횟수를 늘림으로써 최종적으로 더욱 많은 유효 세포수를 얻을 수 있다.
일례로, 연골세포를 배양하는 경우 콜라겐 type 2의 mRNA 발현값(연골세포 마커임)이 TCPS 기판과는 비교할 수 없을 정도로 우수한 것을 확인할 수 있다. 이는 3차원적 구조의 세포 배양시 분화 특성이 우수한 다른 세포의 경우에도 마찬가지로 적용된다. 일례로 중간엽 줄기세포, 근육 유래 줄기세포 등을 들 수 있다.
본 발명의 세포 배양기판의 미세구조는 연골세포 배양 테스트시 콜라겐 type 2의 mRNA 발현값이 배양 초기 대비 30% 이상을 제공할 수 있다. 미세입자의 입경에 따라서는 콜라겐 type 2의 mRNA 발현값이 배양 초기 대비 70% 이상, 많기로는 100% 이상의 제공도 가능하다.
본 발명의 미세구조의 세포배양기판의 제조방법으로서, 제조 방법이 제한되지 않으나 랭뮤어-블러젯 기법을 통해 제조하는 것이 좋다. 기존의 스핀코터 방식은 상기 미세구조를 제공하기 어렵다. 랭뮤어-블러젯(Langmuir-Blodgett, LB) 기법은 면적이 50 ~ 200㎠ 범위인 대면적의 배양기판을 쉽고 간편하게 제공할 수 있다. 그 이상의 대면적도 가능하리라 예상된다. 본 발명은 일례로서, 구형의 실리카 파티클을 표면개질하여 실리카 파티클 랭뮤어-블러젯 박막을 기판에 제조하는 방법을 제공한다. 실리카 파티클은 Stober 방법에 기반하여 최소 10 nm에서 최대 3 ㎛의 직경을 가지는 구형의 파티클로 합성되며, 제조 조건에 따라서 다양한 직경을 가진 균일한 파티클을 대량으로 만들 수 있다. 제조된 실리카 파티클은 화학적인 표면처리를 통해 표면 극성 조절 및 기능기의 도입이 가능하며, 열처리 및 자외선(UV) 조사, 강한 산화 조건 등을 통해 수차례의 표면 특성을 원상복구 시킬 수 있다. 열적 안정성이 높아 1500 도 이하의 열처리를 통해 제조된 기판의 물리적 안정성을 높일 수 있으며, 내화학성 및 기계적 강도가 높아서 금속제 몰드 제작도 용이하다. 실리카 파티클의 LB막은 수용액상에 잠길 수 있는 (녹지 않는) 모든 재질 및 형태의 기판상에 코팅이 가능하며, 여러 층의 코팅도 가능하다. 실리카 LB 코팅을 하기 전 기판상에 추후 제거가 가능한 패턴을 미리 형성시키거나 코팅후에 패턴된 폴리디메팅실록산 (polydimethylsiloxane, PDMS) 몰드를 통해 영역별 실리카 파티클의 제거도 가능하다.
한편, 상기 미세입자가 배열되어 미세구조가 형성된 세포 배양기판은 유기 분자, 생체 유래 물질, 또는 폴리머로 표면처리할 수 있다. 이 경우에도 3차원적 배양이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 아민 화합물, 하이드록시 화합물, 카르복실 화합물, 티올 화합물, 콜라겐, 피브로넥틴, 펩타이드, 또는 Poly-L-Lysine 등으로 표면 처리할 수 있다. 또한, 실리카 미세 박막상에 세포 배양시 표면 친수성을 증가시키기 위해 UV/Ozone 처리를 통한 산화 처리도 가능하며, 추가적으로 실란 (silane)계열의 표면처리도 가능하다. 실란 계열의 표면 처리를 비롯하여 다양한 표면 처리는 기판 표면과 세포와의 상호작용에 영향을 주어서 다양한 세포의 성장 및 분화 방향을 제어할 수 있다. 예를 들어, 기판과 강한 결합을 유도하는 물질을 코팅하거나 특정한 분화 유도 물질을 코팅하여 일반적인 평탄한 기판에서는 나타날 수 없는 방향으로 세포의 성장 및 분화를 유도할 수 있을 것으로 기대된다.
이하, 또 다른 실시예로서, 입자 정렬을 이용한 코팅 방법을 이용한 세포 배양기판에 대해 상세하게 설명한다. 아래에 설명하는 입자 정렬을 이용한 코팅방법 및 그 기판은 세포 배양기판으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 49a 내지 도 49c는 본 발명의 실시예에 따른 입자 정렬을 이용한 코팅 방법을 설명하는 단면도들이다.
먼저, 도 49a에 도시한 바와 같이, 준비 단계(ST10)에서는 매끈한 면(smooth surface)(10a)을 가지는 밀착성 고분자 기판(10)을 준비한다. 즉, 밀착성 고분자 기판(10)의 표면이 특정한 패턴이나 굴곡이 형성되지 않은 상태를 가질 수 있으며, 이 위에서 코팅막(도 49c의 참조부호 22)을 형성하는 입자(도 49b의 참조부호 20)의 이동을 제한하지 않는 수준의 표면 거칠기 및 구조를 가질 수 있다.
본 실시예에서 밀착성 고분자 기판(10)은 밀착성이 존재하는 다양한 밀착성 고분자 물질을 포함한다. 밀착성 고분자는 일반적으로 통용되는 점착성을 갖지 않으므로 점착제와는 구별된다. 적어도 밀착성 고분자는 '스카치® 매직™ 테이프'의 (ASTM D 3330 평가) 점착제가 갖는 점착력 약 0.6 kg/inch 보다 낮은 값의 밀착력을 갖는다. 또한, 밀착성 고분자는 별도의 지지체 없이도 상온에서 고체상태(기판 또는 필름 등)의 형상을 유지할 수 있다. 밀착성 고분자 물질로는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS) 등의 실리콘 기반 고분자 물질, 폴리에틸렌(polyethylene, PE), 폴리비닐클로라이드(polyvinylchloride, PVC) 등을 포함하는 랩, 밀착 또는 밀봉을 목적으로 하는 고분자 물질을 포함하는 보호 필름 등을 사용할 수 있다. 특히, 밀착성 고분자로는 경도조절이 용이하며 다양한 형태로 제조가 용이한 PDMS를 사용할 수 있다. 상기 고분자 기판(10)은 베이스 기재에 밀착성 고분자를 코팅하여 제조되거나 시트 또는 필름 형태의 밀착성 고분자가 부착되어 제조될 수 있다.
여기서, 밀착성 고분자 물질이라 함은 일반적으로 고체 상태의 실리콘을 포함하거나, 가소제 첨가 또는 표면 처리를 통해 밀착 특성이 부여된 유기 고분자 물질을 지칭하는 것이다. 이때, 밀착성 고분자 물질은 일반적으로 선형 분자 구조에 의하여 형태의 변형이 용이하며 낮은 표면 장력을 가지는 것을 특징으로 한다. 이러한 밀착성 고분자 물질의 우수한 밀착성은 미세 영역에서의 표면 변형이 용이한 부드러운 (유연성) 표면 재질과 낮은 표면 장력 등에 기인한다. 밀착성 폴리머 물질의 낮은 표면 장력은 부착하고자 하는 입자(20)에 넓게 활착하려는 특성을 가져오며 (용액의 젖음 현상과 유사), 유연성을 지닌 표면은 부착하고자 하는 입자(20)와 빈틈 없는 접촉이 이루어지도록 한다. 이를 통해 상보적인 결합력 없이 가역적으로 고체 표면에 탈부착이 용이한 밀착성 폴리머의 특성을 지니게 된다. 대표적인 밀착성 폴리머 물질인 PDMS와 같은 실리콘 기반 고분자 물질의 표면 장력은 20 ~ 23 dynes/cm 정도로, 가장 낮은 표면 장력 물질로 알려진 Teflon (18 dynes/cm)에 근접한다. 그리고 PDMS와 같은 실리콘 기반 고분자 물질의 표면 장력은 대부분의 유기 폴리머(35 ~ 50 dynes/cm), 천연재료인 면 (73 dynes/cm), 금속(일례로, 은(Ag)은 890 dynes/cm, 알루미늄(Al)은 500 dynes/cm), 무기 산화물(일례로, 유리는 1000 dynes/cm, 철 산화물은 1357 dynes/cm)보다 낮은 값을 보인다. 또한 PE, PVC 등을 포함하는 랩과 같은 경우에도 밀착성 향상을 위해 다량의 가소제가 첨가되어 낮은 표면 장력을 지니게 된다.
이어서, 도 49b 및 도 49c에 도시한 바와 같이, 코팅 단계(ST12)에서는 복수의 입자(20)를 정렬하여 밀착성 고분자 기판(10) 위에 코팅막(22)을 형성한다. 이를 좀더 상세하게 설명한다.
도 49b에 도시한 바와 같이, 밀착성 고분자 기판(10) 위에 건조된 복수의 입자(20)를 올린다. 본 실시예와 달리 용액 상에 분산되어 있는 입자는 밀착성 고분자 표면과 직접적인 접촉이 이루어지기 어려워서 코팅이 잘 이루어 지지 않는다. 따라서, 사용하는 입자의 질량보다 적은 미량의 용액이나 휘발성 용매를 이용한 경우에만 코팅 작업 중 입자가 건조되어 코팅 작업이 가능할 수 있다.
본 실시예에서 복수의 입자(20)는 코팅막(도 49c의 참조부호 22, 이하 동일)을 형성하기 위한 다양한 물질을 포함할 수 있다. 즉, 복수의 입자(20)는 고분자, 무기물, 금속, 자성체, 반도체, 생체 물질 등을 포함할 수 있다. 또한, 다른 성질을 갖는 입자들을 혼합하여 코팅막을 형성할 수도 있다. 전술한 미세입자를 사용할 수 있다.
고분자로는, 예를 들어, 폴리스티렌 (PS), 폴리메틸메타크릴레이트 (PMMA), 폴리아크릴레이트, 폴리바이닐클로라이드 (PVC), 폴리알파스티렌, 폴리벤질메타크릴레이트, 폴리페닐메타클릴레이트, 폴리다이페닐메타크릴레이트, 폴리사이클로헥실메타클릴레이트, 스틸렌-아크릴로니트릴 공중합체, 스틸렌-메틸메타크릴레이트 공중합체 등을 사용할 수 있다.
무기물로는, 예를 들어, 실리콘 산화물(일례로, SiO2),인산은(일례로, Ag3PO4),티타늄 산화물(일례로, TiO2),철 산화물 (일례로, Fe2O3),아연 산화물, 세륨 산화물, 주석 산화물, 탈륨 산화물, 바륨 산화물, 알루미늄 산화물, 이트륨 산화물, 지르코늄 산화물, 구리산화물, 니켈 산화물 등을 사용할 수 있다.
금속으로는, 예를 들어, 금, 은, 동, 철, 백금, 알루미늄, 백금, 아연, 세륨, 탈륨, 바륨, 이트륨, 지르코늄, 주석, 티타늄, 또는 이들의 합금 등을 사용할 수 있다.
반도체로는, 예를 들어, 실리콘, 게르마늄, 또는 화합물 반도체(일례로, AlP, AlAs, AlSb, GaN, GaP, GaAs, GaSb, InP, InAs, InSb 등)을 사용할 수 있다.
생체 물질로는, 예를 들어, 단백질, 펩티드, 리보핵산(RNA), 데옥시리보핵산(DNA), 다당류, 올리고당, 지질, 세포 및 이들의 복합체 물질들의 입자 또는 표면에 코팅된 입자, 내부에 포함한 입자 등을 사용할 수 있다. 일례로, protein A라는 항체 결합 단백질이 코팅된 폴리머 입자를 사용할 수 있다.
입자(20)는 대칭 형상, 비대칭 형상, 무정형, 다공성의 형상을 가질 수 있다. 일례로, 입자(20)는 구형, 타원형, 반구형, 큐브형, 사면체, 오면체, 육면체, 팔면체, 기둥형, 뿔형 등을 가질 수 있다. 이때, 입자(20)는 구형 또는 타원형을 가지는 것이 바람직하다.
이러한 입자(20)는 평균 입경이 10 nm 내지 50 ㎛일 수 있다. 평균 입경이 10 nm 미만일 경우에는 밀착성 고분자 기판(10)에 의하여 전체적으로 감싸지는 형태가 될 수 있어 입자(20)를 단층 수준으로 코팅하는 것이 어려워질 수 있다. 또한, 10nm 미만인 경우에는 건조 상태에서도 입자들이 서로 응집하여 문지르는 힘만으로는 입자가 개별적으로 이동하는 것이 어려울 수 있다. 평균 입경이 50 ㎛을 초과하는 경우에는 입자의 부착이 약하게 나타날 수 있다. 이때, 평균 입경이 50 nm 내지 10 ㎛인 것이 좀더 바람직할 수 있다. 그러나 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며 평균 입경은 입자의 구성 물질, 밀착성 고분자 기판(10)의 물질 등에 의하여 달라질 수 있다. 이때, 입자(20)가 구형일 경우에는 입자(20)의 지름이 입경으로 사용할 수 있다. 입자(20)가 구형이 아닐 경우에는 다양한 계측법이 사용될 수 있는데, 일례로, 장축과 단축의 평균값을 입경으로 사용할 수 있다.
이어서, 도 49c에 도시한 바와 같이, 복수의 입자(20) 위에서 압력을 가하여 코팅막(22)을 형성한다. 압력을 가하는 방법으로는 라텍스, 스폰지, 손, 고무판, 플라스틱 판, 부드러운 표면을 가지는 재료 등을 이용하여 문지르는(rubbing) 방법을 사용할 수 있다. 그러나 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며 다양한 방법에 의하여 입자(20)에 압력을 가할 수 있다.
본 실시예에서는 밀착성 고분자 기판(10)의 평면(10a) 위에 입자들(20)을 올린 후에 압력을 가하면 압력이 가해진 부분의 입자들(20)이 밀착성 고분자 기판(10)의 변형을 통해 밀착된다. 이에 의하여 해당 부분에 입자들(20)에 각기 대응하는 오목부(12)가 형성된다. 따라서, 오목부(12)가 입자(20)를 감싼 상태에서 밀착성 고분자 기판(10)에 입자(20)들이 정렬되게 된다. 오목부(12)는 입자와 기판간 상호작용에 의해 형성되는 것으로 가역적이다. 즉 소멸될 수도 있으며, 위치가 이동될 수 있다. 일례로, 문지르는 과정에서 입자가 이동하게 되면 기판의 탄성 복원력에 의해 오목부(12)가 사라지거나 입자의 이동에 따라 오목부(12)도 위치가 변경될 수 있다. 이러한 가역적 작용에 의해 입자가 고르게 정렬될 수 있다(여기서의 "가역적"은 코팅 시 밀착성 고분자 기판 표면의 유연성 및 탄성 복원력에 의해 발생되는 특성이므로, 밀착성 고분자 기판의 복원력이 시간이 지남에 따라 약해지거나 소멸되어 더 이상 가역적이지 않은 경우도 포함되는 넓은 의미이다). 기판과의 결합이 이루어지지 않은 입자들(20)은 문지르는 힘 등에 의하여 입자(20)가 코팅되지 않은 밀착성 고분자 기판(10)의 영역으로 이동하게 되고, 코팅되지 않은 부분에 입자(20)에 의하여 오목부(12)가 형성되고 이 오목부(12)가 입자(20)를 감싼 상태에서 밀착성 고분자 기판(10)과 입자(20)의 결합이 이루어진다. 이러한 과정을 거쳐 밀착성 고분자 기판(10)에 높은 밀도로 단층 수준의 입자 코팅막(22)이 형성된다.
오목부(12)는 입자(20)의 일부를 감싸도록 입자(20)의 형상에 대응하는 형상을 가질 수 있다. 예를 들어, 입자(20)가 구형인 경우에는 오목부(12)도 라운드한 형상을 가져 오목부(12)가 입자(20)의 일부에 밀착될 수 있다. 그리고 오목부(12)의 깊이(L1)는 밀착성 고분자 기판(10)의 경도, 입자(20)의 형태, 경도, 환경 요인(일례로, 온도) 등에 의하여 달라질 수 있다. 즉, 밀착성 고분자 기판(10)의 경도가 커질수록 오목부(12)의 깊이(L1)가 작아지고, 온도가 증가할 수록 오목부(12)의 깊이(L1)가 커질 수 있다.
이때, 입자(20)의 평균 입경(D)에 대한 오목부(12)의 깊이(L1)의 비율(침하율)(L1/D)이 0.02~0.7일 수 있다. 상기 비율(L1/D)이 0.02 미만일 경우에는 입자(20)와 밀착성 고분자 기판(10)과의 결합력이 충분하지 않을 수 있고, 0.7을 초과할 경우에는 입자들(20)이 단층 수준으로 코팅되기 어려울 수 있다. 결합력 및 코팅 특성 등을 좀더 고려하면, 상기 비율(L1/D)은 0.05~0.6, 좀더 상세하게는, 0.08~0.4인 것이 바람직하다.
본 실시예에서는 탄성 변형에 의하여 생긴 오목부(12)에 의하여 각 입자(20)의 일부를 감싸게 되면, 입자(20)와 밀착성 고분자 기판(10)이 좀더 잘 결합할 수 있도록 한다. 그리고, 밀착성 고분자 기판(10)에 결합된 입자(20)들도 주변의 코팅되지 않은 부분으로 이동이 가능하여 새로운 입자(20)가 밀착성 고분자 기판(10)의 표면의 빈 공간에 부착이 가능하도록 한다. 이러한 재배열 특성에 따라 코팅막(22)이 높은 밀도를 가지도록 단층 수준으로 코팅될 수 있다. 일례로, 입자(20)의 중심들이 육각형의 형상을 이루도록 배치될 수 있다. 한편, 입자(20)가 비구형일 경우(예를 들어, Ag3PO4)에는 다양한 방법에 의하여 단층 수준인지 여부를 판별할 수 있다. 일례로, 입자들(20) 중 상위 10% 입자들(20)(즉, 입경이 10% 이내로 큰 입자들(20))의 평균 입경에 대한 코팅막(22) 두께의 평균값의 비율이 1.9 이하일 경우를 단층 수준으로 코팅된 것을 볼 수 있다.
본 실시예에서는 용매를 사용하지 않고 건조 상태의 입자들(20)이 밀착성 고분자 기판(10) 위에 직접 접촉하도록 한 상태에서 압력을 가하여 코팅막(22)을 형성한다. 이에 따라 코팅막(22) 형성 시, 용매 내에서의 입자들(20)의 자기 조립이 요구되지 않으므로 온도, 습도 등을 정밀하게 조절하지 않아도 되며 입자들(20)의 표면 특성에 큰 영향을 받지 않는다. 즉, 입자(20)가 전하성 물질인 경우뿐만 아니라, 비전하성(즉, 전하적으로 중성에 가까운) 물질인 경우에도 높은 밀도로 균일하게 코팅이 이루어질 수 있다. 또한, 친수성 입자뿐만 아니라, 소수성 입자도 균일하게 코팅이 가능하다. 이와 같이 본 실시예에 따르면 단순한 방법에 의하여 밀착성 고분자 기판(10) 위에 입자들을 고르게 분포시켜 높은 밀도를 가지는 단층 수준의 코팅막(22)을 형성할 수 있다.
이러한 코팅막(22)은 밀착성 고분자 기판(10)에 결합한 상태로 사용될 수도 있고, 다른 기판 등에 전사되어 사용될 수도 있다. 이때, 코팅막(22)이 전사되는 다른 기판이 밀착성 고분자 기판(10)보다 높은 밀착성 또는 접착성을 가지면 코팅막(22)이 전체적으로 균일하게 잘 전사될 수 있다.
본 실시예에서 탄성 변형에 의하여 밀착성 고분자 기판(10)에 오목부(12)가 형성되므로 그 이후에 코팅막(22)이 제거되면, 도 50a에 도시한 바와 같이, 밀착성 고분자 기판(10)의 오목부(12)가 없어지고 매끈한면(10a)으로 복귀된다. 그러나 코팅막(22)이 형성된 다음 오랜 시간이 지난 후에 코팅막(22)이 제거된 경우에는, 도 50b에 도시한 바와 같이, 오목부(12)의 형태의 흔적이 밀착성 고분자 기판(10)의 표면에 남아있을 수도 있다.
이와 같이 얻어진 입자 정렬 기판은 세포 배양기판으로 유용하다.
이하, 또 다른 실시예로서, 첨부한 도면을 참조하여 입자 부분 노출형 기재의 제조방법 및 이에 의하여 제조된 입자 부분 노출형 기재를 상세하게 설명한다. 이 입자 부분 노출형 기재는 세포 배양기판으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 입자 부분 노출형 기재는 밀착성 고분자 기판을 준비하는 준비 단계, 상기 밀착성 고분자 기판 위에 복수의 입자를 코팅하는 코팅 단계, 상기 밀착성 고분자 기판 및 상기 복수의 입자 위에 기재를 형성하는 단계, 및 상기 밀착성 고분자 기판을 제거하여 상기 복수의 입자를 부분적으로 노출하는 노출 단계를 포함하여 이루어진다. 여기서, 밀착성 고분자 기판을 준비하는 준비 단계, 상기 밀착성 고분자 기판 위에 복수의 입자를 코팅하는 코팅 단계는 전술한 입자 정렬을 이용한 코팅방법과 동일하므로 설명을 생략한다.
도 1a 내지 도 1f는 본 발명의 일실시예에 따른 입자 부분 노출형 기재의 제조방법을 설명하는 단면도들이다. 마찬가지로, 도 51a 내지 51c에 대한 설명도 전술한 도 49a 내지 도 49c의 내용을 전용하며 설명을 생략한다.
밀착성 고분자 기판(10) 위에 입자들을 고르게 분포시켜 높은 밀도를 가지는 단층 수준의 코팅막(22)을 형성한 후, 밀착성 고분자 기판 및 복수의 입자로 구성된 코팅막 위에 기재를 형성한다. 기재를 형성하는 단계는 바람직하게는, 상기 밀착성 고분자 기판 및 상기 복수의 입자 위에 기재 조성물을 위치시키는 단계, 및 상기 기재 조성물을 경화시켜 기재를 형성하는 경화 단계를 포함할 수 있다. 일례로, 도 51d 및 도 51e에 도시한 바를 들 수 있다. 기재의 재료는 제한되지 않는다. 폴리머 등의 유기 기재일 수 있으며, 실리케이트 등의 무기 기재일 수 있으며, 실리카 유리일 수 있으며, 기타 복합재료로 된 기재일 수 있다. 또한, 기재가 다층으로 이루어질 수 있다. 일례로, 유기 또는 무기 코팅 재료로 입자 위에 도포 후 강도가 충분한 기판과 밀착시키는 방법을 들 수 있다.
밀착성 고분자 기판(10) 및 복수의 입자(20)로 구성된 코팅막(22) 위에 기재(30) 형성을 위한 조성물을 위치시키는 방법으로는 다양한 방법이 사용될 수 있다. 일례로, 기재 조성물을 밀착성 고분자 기판(10) 및 복수의 입자(20) 위에 도포할 수 있다. 또는, 도 51d 및 도 51e에 도시한 바와 같이, 기재 조성물 위에 복수의 입자(20)가 위치하도록 밀착성 고분자 기판(10)을 얹는 방법도 가능하다.
기재(30)의 두께는 2mm 이상일 수 있다. 두께가 2mm 미만이면 기재(30)가 복수의 입자(20)를 안정적으로 고정하기 어려울 수 있다.
폴리머 등의 유기 기재는 복수의 입자(20)를 안정적으로 고정 및 지지할 수 있는 다양한 폴리머를 사용할 수 있다. 그리고 폴리머 기재는 경화 수지를 포함하여 특정 조건에서 경화될 수 있다. 일례로, 본 실시예에서는 폴리머 기재가 자외선 경화 수지를 포함하여 자외선(UV) 등에 의하여 경화될 수 있다. 자외선 경화 수지를 이용하면 자외선 등의 광을 조사하는 것에 의하여 쉽게 경화될 수 있다.
자외선 경화 수지는 자외선을 받아 가교, 경화 작용을 일으킬 수 있도록 다양한 물질을 포함할 수 있는데, 일례로, 자외선 경화 수지는 올리고머(베이스 수지), 모노머(반응성 희석제), 광중합 개시제, 각종 첨가제 등을 포함할 수 있다.
올리고머는 수지의 물성을 좌우하는 중요한 성분으로, 중합 반응에 의해 고분자 결합을 형성하여 경화가 이루어지게 한다. 골격 분자의 구조에 따라 폴리에스테르계, 에폭시계, 우레탄계, 폴리에테르계, 폴리아크릴계 등의 아크릴레이트 등으로 이루어질 수 있다. 모노머는 올리고머의 희석제로서의 역할을 할 수 있으며, 반응에 참여할 수 있다. 가교를 위해서 가교제를 더 포함할 수 있다. 광중합 개시제는 자외선을 흡수하여 라디칼 혹은 양이온을 생성시켜 중합을 개시시키는 역할을 하며 단독 혹은 둘 이상의 물질이 포함될 수 있다. 첨가제는 용도에 따라 추가적으로 첨가되는 것으로, 용도에 따라 광증감제, 착색제, 증점제, 중합 금지제 등이 있다.
무기 기재로는 제한되지 않으나 유리막 코팅제 등을 들 수 있으며, 시중에 유통되고 있는 다양한 유리막 코팅제를 이용할 수 있다. 사용되는 입자가 티탄산화물 등 광촉매 입자인 경우에 유기 재료를 기재로 사용하게 되면 광촉매 반응에 의해 유기 재료가 분해될 수 있다. 이로 인해 기재의 내구성에 손상을 입고 입자가 기재로부터 떨어지는 등 수명에 문제가 발생할 수 있다. 따라서, 입자 부분 노출형 기재를 광촉매 용도로 사용하는 경우에는 기재를 무기 재료로 사용하는 것이 좋다.
이어서, 도 51f에 도시한 바와 같이, 기재 조성물을 경화하고 밀착성 고분자 기판(도 51e의 참조부호 10)을 제거하여 복수의 입자를 부분적으로 노출시켜, 입자 부분 노출형 기재를 제조한다.
복수의 입자(20)에서 밀착성 고분자 기판(10)에 감싸졌던 부분이 기재(30) 상에서 노출될 수 있다. 이에 따라 복수의 입자(20)의 평균 입경(D)에 대한 노출된 부분의 높이(L2)의 비율(L2/D)이 0.02~0.50일 수 있다. 상기 비율(L2/D)이 0.02 미만일 경우에는 입자(20)와 밀착성 고분자 기판(10)과의 결합력이 충분하지 않아 밀착성 고분자 기판(10) 상에 복수의 입자(20)에 의한 코팅막(22)이 안정적으로 형성되지 않을 수 있으며, 입자의 노출이 불충분할 수 있다. 상기 비율(L2/D)이 0.50을 초과할 경우에는 입자들(20)이 기재(30)에 의하여 안정적으로 고정되지 않을 수 있다.
본 실시예에 따른 입자 부분 노출형 기재는 단층 수준으로 배열되고 노출될 수 있다. 전술한 방법에 의해 제조됨으로써 기재로부터 노출되지 않는 입자는 개수 기준으로 전체 입자에서 10% 이하일 수 있다. 특히, 5% 이하일 수 있으며, 거의 존재하지 않을 수도 있다. 또한, 입자가 허용될 수 있는 이론 밀도치에 근접하게 존재하여 노출될 수 있다. 일례로, 입자의 평균입경을 D라 하고, 노출된 입자 사이의 평균간격(입자 중심부 간의 거리)을 P라 할 때, D ≤ P ≤ 1.5D 를 만족하면서 노출될 수 있다. 또한, 입자는 전술한 입자 코팅 방법에 의해 정밀하게 정렬될 수 있으며, 특히 헥사고날 형태로 정렬되어 노출될 수 있다. 상기 기재는 두께 방향을 기준으로, 입자가 위치하는 상부 영역과 위치하지 않는 하부 영역으로 구분될 수 있다. 이 영역은 입자가 단층 수준으로 배열됨에 따라 입자의 존재 유무에 의해 구분되는 것이며, 기재의 종류를 달리하는 것으로 구분되는 것은 아니다. 입자가 위치하지 않는 하부 영역이 입자가 위치하는 상부 영역보다 두꺼울 수 있으며, 바람직하기로는 2~50배 두꺼울 수 있다.
또한, 상기 복수의 입자가 비구형일 경우에는, 상기 복수의 입자 중 입경이 상위 10% 입자의 평균 입경에 대한 상기 복수의 입자로 이루어진 코팅층 두께의 평균값의 비율이 1.9 이하로 형성되어 부분 노출될 수 있다.
또한, 기재는 단일 재료로 형성될 수 있으며, 다층으로 이루어질 수도 있다. 다층의 일례로서, 입자와 접하는 코팅층과 코팅층과 접하는 지지 기판을 포함하여 구성될 수 있다. 이 구조는 밀착성 기판 및 복수의 입자로 구성된 코팅막 위에 기재 조성물을 코팅하고 그 위에 지지 기판을 부착한 후 경화시키는 방법으로 얻어질 수 있다. 또 다른 다층의 일례로서, 입자와 접하는 코팅층, 상기 코팅층 상에 도포된 점착층 및 점착층에 부착되고 이형될 수 있는 이형필름을 포함하여 이루어질 수 있다. 기능성 부착 시트의 형태로 제조될 수 있으며 이형필름을 제거하면서 피부착물에 부착할 수 있는 형태로 제조될 수 있다.
이와 같이 본 실시예에 따르면 다양한 기능을 위한 입자(20)를 기재(30)로부터 상당히 균일하게 부분 노출할 수 있게 되어 세포 배양 기능을 좀더 효율적으로 구현할 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 세포 배양기판을 이용하여 세포를 배양하는 방법을 포함한다. 세포 배양 방법은 제한되지 않으며 공지의 방법을 이용할 수 있다. 구체적 일례는 실시예에서 후술한다.
상기의 특징을 갖는 본 발명에 따른 세포배양 기판은, 3차원적 세포 배양 환경을 효과적으로 제공하기 위해 중요하게 고려되어야 할 몇 가지 관점을 만족시키는 미세구조를 갖는다. 이러한 미세구조는 다음의 효과를 선택적으로 제공한다. 첫째, 꽃 유사 형상의 3차원 미소 펠렛 형태로 세포 배양 및 응집이 일어난다. 둘째, 세포 배양시 분화된 세포의 경우 탈분화를 억제하고 재분화 및 분화를 촉진하며, 줄기세포의 경우 특정한 형태의 세포로 분화 특성을 유도 및 촉진 시킨다. 셋째, 세포 골격 구조의 발달을 억제한다. 넷째, 세포의 유동성 및 이동성을 증가시킨다.
본 발명은 특히 실제 임상치료에서 문제가 되는 연골세포 배양의 탈분화 억제 및 줄기세포의 연골세포로의 분화촉진을 기판의 특수 구조설계를 통하여 극복하고, 세포의 성장 및 분화가 조절 가능함을 보여준 가치 있는 결과를 보여주었다.
도 1a는 본 발명에서 설명하는 세포배양용 미세구조 기판의 특징을 보여주는 모식도로 벌집구조로 배치된 구조체가 만드는 전방향에 대한 반복적인 높이 단차를 보여준다. 구조체가 1b와 같이 연속적인 완만한 경사면으로 인해 세포막의 부착은 이루어 지지만 내부 선형의 골격구조를 만들지는 못하게 하여 세포의 골격구조 형성이 억제되고, 이로인해 안정적인 부착상태를 유지하며 세포응집등의 특이적 현상을 만들어 내는 원리를 설명해 주고 있다. 22와 23은 각각 구조체로 인해 형성되는 상층부와 바닥면을 지칭한다.
도 2a는 유리기판과 다양한 직경(60 ~ 700 nm)의 실리카 파티클로 제작된 단층 박막의 atomic force microscpoy (AFM) 이미지(왼쪽)와 기판 별 실리카 파티클 크기에 따른 측정된 표면 거칠기를 정리한 표(오른쪽)이다.
도 2b는 나노구조에 의해서 입자표면을 따라 부착되는 세포막의 부착 단백질 그룹인 focal adhesion이 형성되더라도, 주변 입자에 의한 반복적인 높낮이 단차로 인해 선형의 주요 세포 골격구조 인 stress fiber가 형성되기 어려운 구조적 이유를 설명하기 위한 모식도 이다. a나 b의 위치에 형성된 focal adhesion 단백질들은 세포 골격 구조 형성에 참여가 가능하지만 상당한 면적을 차지하는 c, d의 위치에 부착된 focal adhesion 단백질들은 구조적인 거리로 인해서 세포 골격 구조 형성에 참여가 어려워 진다.
도 3은 제작예 1을 통해 실제 제작되어 실험에 사용된 750 nm 직경의 실리카 파티클이 코팅된 기판 사진이다.
도 4는 각 제작된 기판별로 토끼연골세포를 4시간 동안 배양한 후 측정된 위상차현미경 이미지(왼쪽)와 이미지를 분석한 세포 흡착률을 정리한 표(오른쪽)이다.
도 5는 각 기판별로 토끼연골세포를 1일간 배양 후 측정된 형광염색 현미경 이미지이다. 붉은색은 골격구조(actin), 푸른색은 핵을 나타낸다.
도 6a는 각 기판별로 토끼연골세포를 3일간 배양 후 측정된 형광염색 현미경 이미지이다. 붉은색은 골격구조(actin), 푸른색은 핵을 나타낸다.
도 6b는 TCPS와 본 발명의 세포배양 기판에서 토끼연골세포를 3일간 배양 후 측정된 현미경 이미지이다.
도 7은 각 기판별로 토끼연골세포를 1일간 배양 후 측정된 공초점 레이저 주사 현미경 이미지이다.
도 8은 각 기판별로 토끼연골세포를 1일간 배양 후 측정된 atomic force microscpoy (AFM) 이미지이다.
도 9는 각 기판별로 토끼연골세포를 7일동안 배양 하며 측정된 초기 대비 대사도 평가 그래프이다.
도 10은 각 기판별로 토끼연골세포를 7일동안 배양 하며 측정된 TCPS 기판 대비 대사도 평가 그래프이다.
도 11은 각 기판별로 토끼연골세포를 7일동안 배양후 세포수를 측정한 그래프이다.
도 12는 토끼연골세포의 배양 단계 별 및 passage 3단계에서 각 기판별 세포의 collagen I 과 II의 mRNA 발현양을 정리한 그래프이다.
도 13은 Passage 3 단계에서 토끼연골세포의 배양시 표면의 화학 특성에 대한 영향을 평가하기 위해 glass기판과 700 nm 실리카 기판에 아민기를 코팅한 기판을 추가하여 진행한 collagen I 과 II의 mRNA 발현양을 정리한 그래프이다.
도 14는 Passage 3 단계에서 토끼연골세포의 배양시 미세구조 기판상 표면의 화학 특성에 대한 영향을 평가하기 위해 glass기판과 700 nm 실리카 기판에 아민기를 코팅한 기판을 추가하여 각 기판에서 세포의 분포 형태를 측정한 위상차현미경 이미지이다.
도 15는 Passage 0인 토끼연골세포를 glass기판과 300 nm 실리카 기판상에 1주일마다 1차례 씩 5주간 계대배양하며 collagen II mRNA 발현양의 변화를 측정한 전기영동 이미지이다. 연골세포 마커인 Collagen II 는 위쪽, 보정용 마커인 GAPDH는 아래쪽이다.
도 16은 3차례 TCPS에서 계대배양하여 탈분화된 토끼연골세포를 4번째 계대배양 단계에서 TCPS와 미세구조체 기판에서 배양한 후, 원심분리를 통해 펠렛 (pellet) 형태로 1주일간 배양하여 ECM 형성을 관찰한 이미지이다. ECM은 염색물질인 safranin O를 이용하여 붉게 처리하였다.
도 17은 토끼연골세포의 계대배양 과정 및 배양 기판에 따른 단위 갯수별 세포의 질량 변화를 배양 2일과 7일차에 확인한 결과 그래프이다.
도 18은 TCPS와 표면개질된 유리, 실리카 기판상 토끼연골세포 배양시 1시간동안 흡착되는 세포수를 평가한 그래프이다. 기판 이름에 아민처리기판은 A, 결합유도 펩티드인 RGD는 R로 표기하였다.
도 19는 TCPS와 700 nm, 3,000 nm 직경의 실리카 기판에서 배양 중인 토끼연골세포의 위상차 현미경 이미지 이다.
도 20은 쥐 근육유래 줄기세포를 TCPS기판과 미세구조체 기판에서 14일간 배양 후 측정한 위상차 현미경 이미지이다.
도 21은 PDMS 기판위에 1500 nm 입경의 실리카입자를 단층 코팅한 기판의 AFM 이미지이다. 하단 사진은 150 mm 직경의 페트리뒤쉬에 10% 경화제 비율의 PDMS를 코팅 후, 실리카 750 nm 입경 입자를 단층 코팅 후 촬영한 사진이다.
도 22는 10% 경화제 비율의 PDMS 기판위에 다양한 입경의 실리카 입자를 코팅 후, 측정한 전자현미경 이미지이다.
도 23은 10% 경화제 비율의 PDMS 기판위에 (a) 800 nm, (b) 2010 nm 입경의 폴리스트렌 입자를 코팅 후, 측정한 전자현미경 이미지이다.
도 24는 (a) 10% 경화제 비율의 PDMS 기판, (b) sealing tape, (c) LLDPE 랩, (d) 보호필름, (e) PVC와 같이 밀착성 고분자에 입자가 육방밀집 형태로 단층코팅이 이루어지며, 이러한 점이 (f) 단단한 표면의 PMMA와 (g) 일정한 형태를 가지지 않는 접착성 물질이 코팅된 접착 테이프와 같이 물성이 상이한 필름에서는 이루어지지 않는 독특한 특성이라는 점을 설명하기 위해 각 필름의 전자현미경 이미지와 함께 정리한 사진이다.
도 25는 코팅되는 입자의 재질에 의한 영향을 확인하기 위하여 10% 경화제 비율의 PDMS 기판에 500 및 1000 nm 직경의 구형 폴리스티렌 재질의 입자를 단층코팅하여 세포가 실리카 입자를 이용한것과 유사하게 토끼연골세포가 응집되는 것을 확인한 위상차 현미경 이미지이다.
도 26은 10% 경과제 비율의 PDMS 기판에 다양한 입경의 실리카 입자와 800 nm 입경의 폴리스티렌 입자를 각각 코팅하여 TCPS 및 glass 기판과 함께 passage 3 단계에서 휴먼연골세포를 1주일간 배양하여 얻은 세포들을 TCPS에서 passage 0 ~ 2까지 1주일 씩 배양하여 얻은 세포들과 같이 mRNA 발현양을 real-time PCR로 평가한 그래프이다. 콜라겐 타입 1 및 2의 mRNA 발현양을 passage 3 단계의 TCPS에서의 값을 기준으로 정리하였다.
도 27은 각 기판별로 휴먼연골세포를 3일간 배양 후 측정된 40 x 배율의 형광염색 현미경 이미지이다. 붉은색은 골격구조(actin), 푸른색은 핵을 나타낸다.
도 28은 각 기판별로 휴먼연골세포를 5일간 배양 후 측정된 400 x 배율의 형광염색 현미경 이미지이다. 붉은색은 골격구조(actin)를 나타낸다.
도 29는 10 % 경화제 비율의 PDMS상 1500 nm 입경의 실리카 입자를 코팅한 기판에서 2일간 배양된 휴먼연골세포의 AFM 이미지 및 라인 프로파일이다. 세포의 중심부분이 주변 영역보다 낮게 관찰되었다.
도 30은 세포의 침하현상을 규명하기 위하여 glass 및 LB 방법으로 750 nm 입경 실리카를 코팅한 glass 기판, 경화제 비율이 다른 PDMS 기판에 750 nm 입경의 실리카 입자를 코팅 후, 각 기판에 3일간 휴먼연골세포를 배양하여 측정한 AFM 이미지 및 세포의 중심부 높이를 정리한 그래프이다.
도 31은 휴먼 MSC 세포를 미세구조 기판에 배양시 이루어지는 연골분화 특성을 설명하기 위한 모식도이다. 미세구조로 인해 세포와 기판과의 상호작용이 약화되고, 이웃한 세포와의 상호작용이 강화되는 것을 특징적으로 설명하고 있다.
도 32는 휴먼 MSC 세포를 미세구조 기판에서 7일간 배양시 세포들이 연골세포들과 유사하게 응집되는 현상을 보여주는 100x 배율의 위상차현미경 이미지이다.
도 33은 휴먼 MSC 세포를 미세구조 기판에서 7일간 배양시 연골세포특이 염색물질인 alician blue에 의해 염색되어 푸른색을 나타내는 것을 보여주는 200x 배율의 위상차 현미경 이미지이다.
도 34는 휴먼 MSC 세포의 미세구조 기판 배양에 의한 유전자 발현 상태 변화를 확인하고 분화상태를 검증하기 위해 mRNA 발현량을 평가한 RT-PCR 결과이다.
도 35는 도 34의 RT-PCR 결과를 이미지 작업을 통해 세포간 상호작용 관련 mRNA의 발현양을 수치적으로 정리한 그래프이다.
도 36은 도 33의 RT-PCR 결과를 이미지 작업을 통해 연골 특이 단백질 관련 mRNA의 발현양을 수치적으로 정리한 그래프이다.
도 37은 도 33의 RT-PCR 결과를 이미지 작업을 통해 지방 세포 특이 단백질 관련 mRNA의 발현양을 수치적으로 정리한 그래프이다.
도 38은 휴먼 골아세포를 미세구조 기판에서 7일간 배양시 세포들이 연골세포들과 유사하게 응집되는 현상을 보여주는 200x 배율의 위상차현미경 이미지이다.
도 39는 휴먼 골아세포의 미세구조 기판 배양에 의한 분화상태 변화를 검증하기 위해 골세포 관련 mRNA 발현량을 평가한 RT-PCR 결과 이미지 및 이를 정리한 그래프이다.
도 40은 휴먼 골아세포를 미세구조 기판에서 7일간 배양시 골세포 특이 효소인 Alkaline phosphatase 가 염색물질에 의해 염색되어 푸른색을 나타내는 것을 보여주는 사진 이미지이다.
도 41은 휴먼 골아세포의 미세구조 기판 배양에 의한 부착성 및 세포간 상호작용 정도의 변화를 평가하기 위해 부착단백질 (Integrin) 및 상호작용 단백질 (E-cadherin) 관련 mRNA 발현량을 평가한 RT-PCR 결과 이미지 및 이를 정리한 그래프이다.
도 42는 미세구조 기판을 제조하는 예시로 제작한 실리카 750 nm 입자를 PDMS 필름에 단층 코팅 후, UV 경화 고분자를 통해 고분자 기판에 입자를 단층 전이한 기판의 전자현미경 이미지 이다.
도 43은 미세구조 기판을 제조하는 예시로 제작한 실리카 300 nm 입자를 PDMS 필름에 단층 코팅 후, 유리막 코팅제를 통해 무기재질인 유리 기판으로 입자를 단층 전이한 기판의 전자현미경 이미지 이다.
도 44는 미세구조 기판을 제조하는 예시로 제작한 실리카 300 nm 입자를 PDMS 필름에 단층 코팅 후, 유리막 코팅제를 통해 무기재질인 유리 기판으로 입자를 단층 전이한 기판의 AFM 측정 이미지 및 라인 프로파일이다.
도 45는 미세구조 기판을 제작하기 위한 mold의 예시로 도 44과 같은 양각 형태의 유리 기판을 원형틀로 이용하여 제작한 음각 형태의 UV 경화 고분자 기판의 AFM 측정 이미지 및 라인 프로파일이다.
도 46은 미세구조 기판을 제작하기 위한 mold의 예시로 도 44과 같은 양각 형태의 유리 기판을 원형틀로 이용하여 제작한 음각 형태의 UV 경화 고분자 기판의 전자현미경 이미지이다.
도 47은 미세구조 기판을 제작하기 위한 mold의 예시로 500 nm 입경의 폴리스티렌 입자를 4 % 경화제 비율의 PDMS 기판에 단층 코팅 하여 유리막 코팅제로 유리기판에 전이한 기판을, 유기용제로 폴리스티렌 입자를 제거하여 제작한 깊은 음각형태의 유리기판의 전자현미경 이미지 및 AFM 측정 이미지와 라인 프로파일이다.
도 48은 도 47에서 보여준 mold 유리 기판을 통해 제작한 육방밀집형태로 입자 구조체가 형성된 고분자 기판의 전자현미경 이미지이다.
도 49a 내지 도 49c는 본 발명의 실시예에 따른 입자 정렬을 이용한 코팅 방법을 설명하는 단면도들이다.
도 50a 및 도 50b는 본 발명의 실시예에 따른 입자 정렬을 이용한 코팅 방법에 의하여 형성된 코팅막을 제거한 후의 밀착성 고분자 기판의 다양한 예를 도시한 단면도이다.
도 51a 내지 도 51f는 본 발명의 실시예에 따른 입자 부분 노출형 기재의 제조방법을 설명하는 단면도들이다.
대면적으로 제작이 가능한 미세구조 기판상에서 연골세포 및 줄기세포 등을 포함한 다양한 세포에서 세포의 배양 및 특성 조절이 가능함을 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 하나, 하기한 실시예는 본 발명을 예증하기 위한 것일 뿐, 본 발명을 제한하는 것은 아님을 이해하여만 할 것이다.
# 제조예1: 실리카 미세 박막을 구비한 세포 배양기판의 제조
랭뮤어-블러젯(LB) 방법을 통해 실리카 미세 박막을 제조하였다.
랭뮤어-블러젯 방법은 수면 상에 외압을 주는 조건에서 수면 상에 존재하는 물질이 균일한 단층이 형성되도록 유도하는 방법으로서, 다음의 랭뮤어-블러젯 방법을 기초로 하여 실리카 입자를 기판위에 고정한다.
먼저, 실리카 입자를 제조한다. 실리카 입자의 구조를 이루게 되는 단량체인 테트라에틸오르토실리케이트(tetraethylorthosilicate: TEOS)를 활성화하기 위한 촉매인 암모니아수를 에탄올과 물에 희석하고 교반기에 의하여 교반하면서 TEOS 용액을 첨가한다. 2시간 동안 교반을 하면 TEOS의 에톡시기들이 암모니아와 물에 의하여 활성화되면서 자기 조립 반응을 하게 되며, 이로써 실리카 입자가 형성된다. 사용되는 TEOS, 암모니아수등의 상대농도, 비율 및 반응조건을 조절하여 입자의 크기를 조절할 수 있다. 예컨대, 300nm 크기의 실리카 입자를 합성하기 위해서는, 실온에서 에탄올 40㎖에 암모니아수 8.3㎖, 증류수1.7㎖를 섞은 용액을 플라스크 안에서 교반하면서 TEOS 1㎖를 첨가한 후 2시간 동안 반응시켜 제조한다. 이와 유사한 방식으로 700nm 크기의 실리카 입자 및 마이크로 크기의 입자를 제조할 수 있다. 이외에도 공지의 다양한 방법으로 실리카 입자를 제조할 수 있으며 제한되지 않는다.
다음으로, 위에서 형성된 실리카 입자를 원심분리기에 의하여 원심분리하여 침지시킨 후, 상층액을 버리고 오븐에서 110℃로 약 12시간 정도 건조한다.
다음으로, 유기용매에서 분산될 수 있도록 실리카 입자들의 표면을 개질하기 위한 단계를 수행한다. 유기용매로는 클로로포름을 사용하는 것이 특히 적합하다.
실리카 입자의 표면 개질로서, 합성된 실리카 입자 용액에 화학적인 촉매 작용을 위하여 주로 사용되는 EDC/NHS 물질을 아미노벤조싸이올(aminobenzothiol: ABT)이라는 아민기와 싸이올 그룹을 가지고 있는 물질과 초음파를 가하면서 반응시킴으로써 실리카 입자 표면에 ABT가 고정화된 실리카 입자가 제조되고 이에 따라 유기용매에 균일하게 분산된 용액, 즉, 싸이올기를 가진 짧은 유기분자로 표면이 개질된 실리콘입자들이 유기용매 상에 고르게 분산된 용액이 준비된다.
다음으로, ABT가 고정된 실리카 입자 분산용액을 원심분리 과정에 의하여 에탄올과 클로로포름으로 세척함으로써 랭뮤어-블러젯 공정용으로 사용되는 일정한 크기를 가지는 실리카 미세입자-분산 용액이 제조된다. 이와 같은 프로세스를 사용하는 것은 반응 공정이 비교적 간단할 뿐만 아니라 상기한 바와 같이, TEOS 및 암모니아수의 농도와 반응조건들을 조절함에 의하여 다양한 입자 크기의 실리카를 합성할 수 있어 바람직하다.
이로써, 상기 실리카 입자 분산용액을 사용하여 랭뮤어-블러젯 방법을 기초로 유기 기능기 표면 개질된 실리카 입자 단일막을 준비할 수 있다.
먼저, 상기 실리카 입자 분산용액을 수면위에 살포한다. 여기서 상기 실리카 입자 분산용액은 싸이올기를 가진 유기분자로 표면이 개질된 실리카 입자들이 클로로포름에 고르게 분산된 상태이다.
이때, 상기 수면의 표면에 배리어(barrier)를 두고 상기 배리어를 실리카 입자들이 서로 모여지는 방향으로 움직여 실리카 입자가 떠 있는 면적을 서서히 감소시킴으로 인하여 실리카 입자들이 박막형태로 모여진다. 이 때 실리카 입자들의 배열상태와 막 형성상태를 표면압으로 실리카 막의 구조를 조절한다. 배리어에 가해지는 압력을 전이압력이라 칭하는데, 이 압력을 10 mN/m ~ 60 mN/m 범위로 유지하여 실리카 입자를 균일한 단층으로 형성하여 세포 배양기판을 제조한다.
제조된 실리카 미세 기판은 원자력 현미경 (atomic force microscopy)를 이용하여 실리카 파티클 직경별로 표면구조를 측정하고 표면 거칠기를 정량적으로 평가하였다(도 2a). 도 2a에 도시된 바와 같이 본 발명에 따른 실리카 미세 기판은 표면 거칠기 평가 결과가 Rq ≤0.13D, 특히 Rq ≤0.12D 를 만족하였다.
제조된 실리카 미세 기판은 550도에서 3시간동안 열처리를 하여 기계적 내구성을 향상시켰다. 또한, 표면 친수성 향상을 위하여 UV/Ozone 클리너 상에서 1시간 30분 동안 처리하였다. 제작한 미세구조 기판은 매우 균일한 구조를 지니기 때문에 도 3과 같이 7 x 8 cm 너비의 기판에 균일한 간섭현상으로 인한 간섭색이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
#실시예1: 실리카 미세 박막상에서의 토끼 연골세포의 배양
생후 4주경의 토끼연골에서 분리한 연골세포를 콜라겐 분해효소를 통해 개별화 시킨 후, 일반적인 TCPS (tissue-cultured polystyrene) 기판상에서 2차례에 걸쳐 계대배양 하였다. 모든 세포배양은 10% 소혈청과 1 % 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 high glucose 배지를 넣고 37 ℃ 항온 유지와 5% 이산화탄소가 공급되는 배양기에서 진행하였다.
그 후 TCPS 기판에서 2번의 계대배양을 진행한 세포를 가지고 3 번째 계대배양하였으며, 대조군인 TCPS(SPL Life science사, 20100 모델(세포배양 표면 처리된 100 mm 직경의 멸균 디쉬임)), 유리(glass)기판과 제조예1로부터 제조된 60, 300, 700 nm 직경의 실리카 파티클 박막이 구비된 세포 배양기판상에 배양하였다.
배양과정에서 초기 흡착정도에서 큰 직경의 실리카 미세 기판이 우수한 세포 흡착능을 보이는 것을 확인하였고(도 4), 실리카 파티클 직경에 따라서 세포 흡착능이 조절됨을 확인 하였다.
세포의 내부 골격 구조상 차이를 관찰하기 위하여 형광염색 현미경을 통해 1일과 3일의 세포를 관찰하였다. 1일에는 실리카 미세 기판에서 세포들의 actin골격이 세포 말단에 뭉치며 선형으로 성장하지 않는 것을 확인하였다(도 5). 또한 3일에는 실리카 미세 기판에서 세포들이 뭉쳐서 자라는, 3차원 미소 펠렛의 존재를 확인하였으며, 그러한 특성이 실리카 파티클의 직경이 커질수록 증가함을 관찰하였다(도 6a). 3차원 미소 펠렛은 TCPS 기판과 대비하여 보면 확연히 꽃 유사 형상을 띈다(도 6b 참고).
세포의 미세 구조를 확인하기 위하여 공초점 레이저 주사 현미경을 이용하여 고정된 세포를 관찰하였다. 측정된 이미지를 나타낸 도 7에서 평탄한 유리기판상에서 세포들이 넓게 퍼져 자라며 미세한 포디아(podia)들이 형성된 것을 볼 수 있으나, 실리카 기판에서는 굵고 강하게 당겨지는 느낌의 껌과 같은 형태의 두꺼운 포디아(podia)들만이 형성된 채 세포들이 좁게 퍼져 자라는 것을 관찰 하였다. 도 8의 원자력 현미경 (AFM) 이미지를 관찰하면 실리카 기판상 배양된 연골세포가 매우 얇은 두께(30 ~ 200 nm)로 실리카 구조 표면을 따라서 세포막을 형성하는 것을 관찰하였다. 이러한 세포막의 실리카 구조를 따른 휘어짐은 세포막내의 세포골격구조 형성을 억제하여 세포들의 응집을 돕고 탈분화를 억제하는 효과를 나타낸다.
연골세포의 배양 중 대사도 및 증식 상태를 평가하기 위해 날짜별 MTT 분석을 진행하였으며, 2일 차 대비 TCPS과 다른 기판들이 유사한 양상을 보여주고 있어 정상적인 대사 및 증식이 이루어짐을 확인할 수 있다(도 9). 날짜별 TCPS 대비 대사도 평가 결과에서는 실리카 기판에서 30 ~ 50 % 수준의 대사도 평가가 나타났으며, 이는 상대적인 세포의 증식 속도가 더딘 것이 주요원인으로 해석된다(도 10).
세포 배양 7일 후의 세포의 단위면적당 수를 평가한 결과, 큰 직경의 실리카 기판에서 TCPS 대비 70 % 수준의 세포수를 나타내었으며, 이는 세포가 뭉쳐자라는 과정에서 일부 영역에 세포가 자라지 않은 부분이 존재하였기 때문이다(도 11).
연골세포의 분화특성을 나타내는 collagen I 과 II의 mRNA 분석을 각 계대배양 단계별 세포들과 7일동안 TCPS, 유리, 실리카 미세 기판상에서 배양한 세포들에서 진행하였다. 결과를 정리한 도 12에서 계대배양중 감소하는 collagen II가 실리카 미세 기판상에서 배양됨에 따라 다시 회복되는 것을 관찰할 수 있었으며, 탈분화 진행의 마커인 collagen I은 실리카 미세 기판에서 감소하는 것으로 나타났다. 이를 통해 실리카 미세 기판이 탈분화된 연골세포를 재분화가 되도록 유도하는 것을 확인하였으며, 큰 직경의 실리카 기판이 더욱 효과적임을 확인하였다.
또한 이러한 재분화 유도 특성이 실리카 표면의 화학적 특성에서 나타나는 것이 아님을 확인하기 위하여 유리 기판과 700 nm 실리카 미세 기판상에 aminopropyltriethoxysilane (APTES)처리를 통해 표면상 아민 작용기를 도입하는 기판에서 연골세포의 재분화 특성을 mRNA 분석을 통해 평가하였다. 결과적으로 도 13에서와 같이 아민기가 도입된 기판에서도 표면처리되지 않은 기판과 같이 collagen II가 증가됨을 확인하였다. 또한 도 14을 통해 아민기가 도입된 미세구조 기판에서도 아민기가 도입되지 않은 미세기판 구조와 유사한 세포 응집이 이루어 지는 것을 관찰 할 수 있었다. 이를 통해 다양한 재질 및 특성의 표면에서도 미세구조에 의해 연골세포의 재분화가 유도될 수 있음을 확인하였다.
그리고 이러한 재분화 특성이 여러차례의 계대배양에서도 효과가 있는지 확인하기 위하여 5주간의 유리기판과 300 nm 직경의 실리카 미세 기판상에서 연골세포를 지속적으로 계대배양한 결과 도 15과 같이 실리카 미세 기판상에 배양한 연골세포가 collagen II의 발현이 높게 지속됨을 확인 할 수 있었다. 또한, 도 16에서 나타나듯이 원심분리를 통해 pellet을 형성하여 배양할 경우 미세구조체에서 배양을 거친 경우 연골세포의 특성을 결정하는 세포외기질(ECM)의 분비가 활발해짐을 관찰 할 수 있었다. 미세구조 기판상에서 세포 배양시 연골세포를 탈분화시키지 않고 여러 차례 계대배양 할 수 있음을 확인하였다.
미세구조를 통한 연골세포의 재분화 특성은 각 조건의 배양 단계에서의 배양 2일차와 7일차의 일정 세포당 (10의 6승)질량을 측정해 보았을 때도 도 17과 같이 미세구조 기판에서 탈분화로 인해 증가되는 세포질량이 감소되는 것을 볼 수 있었다. 연골세포의 탈분화시 세포의 크기가 증가하는 것을로 알려져 있기 때문에 이러한 질량 감소 효과는 재분화 효과의 증거로서 참조가 가능하다.
그리고 연골세포의 세포흡착능이 아민표면 처리 및 RGD 펩타이드 처리 등을 통해 더욱 개선될 수 있음을 1시간 배양 후 면적당 흡착 세포수를 평가하여 정리한 도 18에서 확인하였으며, 아민 처리된 700 nm 직경의 실리카 미세 기판의 경우 TCPS 기판 대비 4배 이상의 높은 흡착효율을 나타내었다.
세포배양에 있어서 세포의 실시간적인 상태 분석에 있어서 중요한 위상차 현미경을 통한 관찰은 도 19에서와 같이 700 nm 직경 수준에서는 TCPS와 같이 선명한 이미지를 얻을 수 있었다. 하지만 3,000 nm 이상의 직경의 입자를 사용하면 산란 효과 및 큰 높이 단차 등으로 인해 세포의 관찰이 어려워지는 것으로 나타났다.
한편, 미세구조 기판에서 근육유래 줄기세포를 14일 동안 배양시 TCPS 기판과 달리 신경세포와 같은 외형적인 형태로 세포가 변화됨을 도 20을 통해서 확인하였다. 이를 통해 연골세포가 아닌 다른 다양한 세포에 있어서도 미세구조가 세포상태 변화에 영향을 줌을 예상할 수 있었다.
# 제조예2: 밀착성 고분자 상 입자 코팅을 통한 미세구조 기판 제작
실가드(Sylgard) 184 (미국, 다우코닝)제품 기준 10 % 중량부의 경화제를 포함하여 형성된 Polydimethylsiloxane (PDMS)로 이루어진 밀착성 고분자 기판을 준비하였다.
밀착성 고분자 기판 위에 입자를 올려 놓은 후 라텍스 필름으로 감싼 스폰지를 이용하여 손으로 압력을 가하면서 문질러서 밀착성 고분자 기판의 표면에 오목부를 형성하면서 실리카 및 폴리스티렌 (PS)입자와 밀착성 고분자 기판을 결합하여 실리카코팅막을 형성하였다. 도 21은 약 1500 nm (1480 nm)의 실리카 입자를 PDMS에 코팅 후 측정한 AFM 이미지 및 라인프로파일 자료와 약 750 nm (740 nm) 실리카 입자를 150 mm의 페트리 디쉬상 전면이 고르게 코팅할 수 있다는 사진을 보여준다.
이때, 실리카입자의 평균 입경을 160nm, 330nm, 740nm, 1480nm, 3020nm, 5590 nm으로 달리하여 형성된 코팅막의 전자 현미경 사진을 도 22의 (a), (b), (c), (d), (e), (f)에 각기 나타내었다. 폴리스티렌 입자의 경우 800, 2010 nm 입자를 코팅하여 도 23의 (a), (b) 에 나타내었다. 도 22와 23을 참조하면, 실리카입경들이 높은 밀도를 가지도록 중심들이 육각형의 배열을 이루도록 배치된 것을 알 수 있다(육방밀집). 즉, 본 발명에 따르면 입자들이 높은 밀도의 단층으로 고르게 코팅될 수 있음을 알 수 있다.
밀착성 고분자로는 PDMS 이외의 부드러운 표면과 탄성 및 복원력을 가진 입자 직경 수준에서 매끈한 표면구조를 지니는 고분자 물질들이 사용 가능하다는 것을 도 24를 통해 확인할 수 있다. Sealing tape 과 같은 실리콘 기반의 고분자 및 LLDPE, PVC 랩과 같은 가소제가 첨가된 고분자 들이 입자들을 단층수준의 육방밀집형태로 정렬 시킬 수 있음을 볼 수 있다.
이러한 입자가 코팅된 고분자 물질들은 자체적으로 이용되거나 다른 재질을 포함하는 전사 및 사출공정에서 원형틀로서 이용이 가능하다.
# 실시예2: PDMS 필름상 입자 코팅을 통해 제작된 폴리스티렌 미세 박막상에서의 토끼 연골세포의 배양
제조예 2를 통해 제작된 500, 1000 nm 입경의 폴리스티렌 입자가 코팅된 PDMS 기판에서 실시예 1의 조건으로 토끼 연골 세포를 배야하여 위상차 현미경을 관찰하였다. 도 25에서 나타나듯이 실리카 재질이 아닌 폴리스티렌 재질의 입자에서도 실시예 1과 유사한 세포응집현상이 관찰되었다. 이를 통해 세포의 응집효과의 주요요소는 표면의 화학적, 기계적 특성이 아닌 구조적 특성임을 확인할 수 있다. 일반적인 세포 배양기판 재질로 사용되는 폴리스티렌 재질에서도 나타나는 이러한 특성은 미세구조 기판용 mold 제작등을 통해 저렴하고 대량생산이 가능한 세포의 분화 상태를 조절하는 미세구조 기판의 제작이 가능함을 알려준다.
# 실시예3: PDMS 필름상 입자 코팅을 통해 제작된 미세 박막상에서의 휴먼 연골세포의 배양
휴먼연골에서 분리한 연골세포를 콜라겐 분해효소를 통해 개별화 시킨 후, 일반적인 TCPS (tissue-cultured polystyrene) 기판상에서 2차례에 걸쳐 계대배양 하였다. 모든 세포배양은 10% 소혈청과 1 % 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 high glucose 배지를 넣고 37 ℃ 항온 유지와 5% 이산화탄소가 공급되는 배양기에서 진행하였다.
그 후 TCPS 기판에서 2번의 계대배양을 진행한 세포를 가지고 3 번째 계대배양하였으며, 대조군인 TCPS(SPL Life science사, 20100 모델(세포배양 표면 처리된 100 mm 직경의 멸균 디쉬임)), 유리(glass)기판과 제조예2로부터 제조된 160, 330, 750, 1500, 3010 nm 직경의 실리카 파티클 및 800 nm 직경의 폴리스티렌 파티클 박막이 구비된 세포 배양기판상에 배양하였다.
연골세포의 분화특성을 나타내는 collagen I 과 II의 mRNA 분석을 각 계대배양 단계별 세포들과 7일동안 TCPS, 유리, 실리카 및 폴리스티렌 미세 기판상에서 배양한 세포들에서 진행하였다. 결과를 정리한 도 26에서 실시예 1과 유사하게 계대배양중 감소하는 collagen II가 실리카 및 폴리스티렌 미세 기판상에서 배양됨에 따라 다시 회복되는 것을 관찰할 수 있었으며, 탈분화 진행의 마커인 collagen I은 실리카 미세 기판에서 감소하는 것으로 나타났다. 이를 통해 실리카 미세 기판이 탈분화된 연골세포를 재분화가 되도록 유도하는 것을 확인하였으나, 실리카 기준 입자가 1500, 3010 nm 직경일 경우 재분화 효과가 크게 떨어지는 것으로 나타났다. 실리카 750 nm보다 약간 큰 직경을 가지는 폴리스티렌 800 nm 입자를 이용한 경우는 실험과정의 문제로 collagen I은 분석하지 못하였으나, 중요 연골 마커인 collagen II의 바현값이 TCPS 대비 5배 이상의 높은 값을 보여주었다.
실리카 입경이 750 nm 까지는 연골 재분화 특성이 증가하다가 이후 감소하는 것을 분석하기 위하여 7일간 배양된 각 기판에서의 세포들을 골격구조 염색(actin)하여 형광현미경을 통해 관찰하였다. 도 27에서는 40 x 배율의 저배율로 세포들이 160 ~ 750 nm 의 미세구조 기판에서는 응집을 보이나, 1500 nm 이상의 입자 기판에서는 glass와 같이 고르게 퍼져있는 형태를 나타내었다. 또한 도 28에서와 같이 400 x 배율의 고배율의 이미지에서는 150 ~ 750 nm 입경의 입자 기판에서는 선형의 골격구조가 잘 발달되지 못하였으나, 1500 및 3000 nm 입경의 입자기판에서는 다시 골격구조가 발달된 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 PDMS상에 1500 nm 이상의 큰 입경의 입자가 코팅된 기판에서는 미세구조에 의한 세포골격 구조 형성 억제 효과가 나타나지 못하며, 세포 분화에 큰 영향을 주는 것으로 판단되는 세포 응집도 이루어지지 않는다는 것을 확인할 수 있었다.
이러한 큰 입경에서의 세포 골격구조의 재발달의 원인을 파악하기 위하여 도 29와 같이 AFM 이미지를 측정하고 라인프로파일을 통해 분석하였다. 관찰결과 큰 입경의 기판에서 배양된 세포는 중심 부분이 기판쪽으로 침하되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한 도 30과 같이 750 nm의 동일한 실리카 입자를 이용하더라도 PDMS의 경화제 비율이 감소함에 따라 PDMS의 경도가 감소하여 세포 중심부가 크게 침하되는 것을 관찰 할 수 있었다. 이는 세포의 장력에 의해 탄성체인 PDMS가 입자를 코팅한 채로 기판 쪽으로 침하되는 현상으로 이로 인해 이웃한 입자들의 상대 높이가 감소하게 되어 골격구조 형성 억제 효과가 감소하게 된 것이다. 단단한 재질의 유리기판에 코팅된 LB 조건의 기판에서는 glass와 유사한 500 nm의 높이가 관찰되었으며, 세포 골격구조도 억제되어 있었다. 이러한 결과를 통해 미세구조의 높이 단차가 세포의 골격구조 형성 억제의 주요 요인이고, 이를 통해 분화상태에 영향을 주는 세포 응집이 이루어지게 되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 일정한 경도의 탄성체에 입자를 코팅하여 세포의 장력을 분석하거나 평가하는 용도로 사용이 가능할 것이라는 예상을 하게 되었다. 이는 일반적인 부드러운 탄성체 표면에는 세포 부착이 어렵기 때문에 경질의 입자를 중간 매개체로 이용하는 부분이 특징적이라고 할 수 있다.
# 실시예4: PDMS 필름상 입자 코팅을 통해 제작된 미세 박막상에서의 휴먼 mesenchymal stem cell (MSC)의 배양
휴먼 MSC를 passge 6 단계까지 일반적인 TCPS (tissue-cultured polystyrene) 기판상에서 계대배양 하였다. 모든 세포배양은 10% 소혈청과 1 % 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 low glucose 배지를 넣고 37 ℃ 항온 유지와 5% 이산화탄소가 공급되는 배양기에서 진행하였다.
그 후 대조군인 TCPS(SPL Life science사, 20100 모델(세포배양 표면 처리된 100 mm 직경의 멸균 디쉬임)), 유리(glass)기판과 제조예2로부터 제조된 60, 150, 300, 700 nm 직경의 실리카 파티클 박막이 구비된 세포 배양기판상에 배양하였다.
이번 실험은 도 31에서와 같이 미세구조에 의해 발생되는 세포와 기판간의 상호작용 약화와 그로인한 세포간 상호작용의 강화 부분을 MSC라는 대표적인 줄기세포를 이용하여 검증하고자 하였다. 발생학 관점에서 연골세포는 일부 세포들의 응집체를 형성하는 과정을 통해 연골로 분화되는 것으로 알려져 있으며, 이러한 관점에서 연골세포로의 분화라는 임상학적으로 효용성이 높은 연골세포를 얻을 수 있으나 기술적으로 어렵다고 알려진 목표가 수행 가능할 것으로 기대하였다.
MSC 의 미세구조 기판에서의 배양 특성을 확인하기 위해 배양 7일차에 위상차 현미경을 통해 관찰하였다. 도 32과 같이 실시예 1과 유사하게 미세구조 기판에서 세포가 응집되어 있는 것을 확인할 수 있었다. MSC 세포의 분화 특성을 평가하기 위하여 연골세포 특이 염색인 alcian-blue 염색을 수행한 결과 도 33와 같이 미세구조 기판에서 높은 파란색의 염색상태를 확인할 수 있었으며, 실시예 1과 같이 큰 입경에서 높은 효과를 보였다. 보다 명확한 MSC의 분화상태 확인을 위하여 mRNA 발현양을 RT-PCR을 통해 분석하였다. 도 34과 같이 8개의 mRNA가 평가되었다. 이를 세포 상호작용 관련 유전자 (도35), 연골 세포 특이 마커 유전자 (도 36), 지방 세포 특이 마커 유전자 (도 37)를 정량적으로 분석하였다. 이를 통해 미세구조 기판에서 세포간 상호작용은 강화되고 지방세포가 아닌 연골세포로 특이적으로 분화되는 것을 확인할 수 있었다. 이번 실험에서 MSC를 연골세포로 분화시키기 위한 분화 특이 배지인 (Dexamethazone, high glucose DMEM, proline, pyruvate, ascorbate-2-phosphate, glutamax, ITS + premix, TGF-b)의 첨가물등은 일체 이용되지 않았으며, MSC의 일반적인 배양 배지만이 이용되었다. 이는 도 31과 같이 미세구조에 의한 MSC 응집이 분화유도 약물을 이용하지 않고도 선택적으로 연골로 세포 분화를 유도할 정도로 매우 효과적이고 우수한 방법이라는 것을 보여준다.
# 실시예5: 실리카 미세 박막상 휴먼 골아 세포의 배양
휴먼 골아세포 (MG-63, cellline)를 일반적인 TCPS (tissue-cultured polystyrene) 기판상에서 계대배양 하였다. 모든 세포배양은 10% 소혈청과 1 % 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 high glucose 배지를 넣고 37 ℃ 항온 유지와 5% 이산화탄소가 공급되는 배양기에서 진행하였다.
그 후 대조군인 TCPS(SPL Life science사, 20100 모델(세포배양 표면 처리된 100 mm 직경의 멸균 디쉬임)), 유리(glass)기판과 제조예1로부터 제조된 60, 120, 300, 700 nm 직경의 실리카 파티클 박막이 구비된 세포 배양기판상에 배양하였다.
골아세포의 미세구조 기판에서의 배양 특성을 확인하기 위해 배양 7일차에 위상차 현미경을 통해 관찰하였다. 도 38과 같이 실시예 1과 유사하게 미세구조 기판에서 세포가 응집되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 골아세포의 분화상태 확인을 위하여 mRNA 발현양을 RT-PCR을 통해 분석하였다. 도 39와 같이 4개의 골분화 관련 mRNA가 평가되었다. 골아 세포의 분화 촉진 여부를 이미지 적으로 평가하기 위하여 골세포 분화 관련 효소인 ALP 염색을 수행한 결과 도 40과 같이 미세구조 기판에서 높은 파란색의 염색상태를 확인할 수 있었으며, 실시예 1과 같이 큰 입경에서 높은 효과를 보였다.
골아세포의 골분화 특성 향상 원인을 파악하기 위하여 RT-PCR을 이용하여 부착성 단백질인 integrin과 세포 상호작용관련 단백질인 E-Cadherin의 mRNA 발현양을 분석하였다. 도 41과 같이 미세구조의 입경이 증가할 수록 integrin의 값은 감소하였으며, 세포간 상호작용은 강화되는 것으로 나타났다. 다만, 이는 7일동안 배양한 세포를 이용한 분석결과이므로, 큰 입경의 미세구조 기판에서 초기 세포의 흡착이 낮다는 것을 의미하는 것은 아니며, 세포가 배양과정에서 응집됨에 따라서 얻어진 차이를 설명하는 자료로서 의미를 가진다.
# 제조예3: 세포배양용 미세구조 기판 제작을 위한 몰드 기판 예시
실가드(Sylgard) 184 (미국, 다우코닝)제품 기준 3 ~ 20 % 중량부의 경화제를 포함하여 형성된 Polydimethylsiloxane (PDMS)로 이루어진 밀착성 고분자 기판을 준비하였다.
밀착성 고분자 기판 위에 입자를 올려 놓은 후 라텍스 필름으로 감싼 스폰지를 이용하여 손으로 압력을 가하면서 문질러서 밀착성 고분자 기판의 표면에 오목부를 형성하면서 실리카 및 폴리스티렌 (PS)입자와 밀착성 고분자 기판을 결합하여 실리카코팅막을 형성하였다.
도 42은 약 750 nm (740 nm)의 실리카 입자를 5 % 경화제 비율의 PDMS에 코팅 후 UV 경화 고분자를 통해 고분자 기판에 입자를 전사한 샘플의 전자현미경 사진이다. 도 43은 약 300 nm의 실리카 입자를 5 % 경화제 비율의 PDMS에 코팅 후 유리막 코팅제 (실리케이트 용액)를 이용하여 유리 기판에 입자를 전사한 샘플의 전자현미경 사진이다. 도 44는 AFM을 통한 이미지 측정 및 라인 프로파일을 통해 약 70 nm 높이의 구조체가 형성된 것을 확인해 준다. 무기재질로 이루어져서 매우 높은 강도를 보이며, 유기용제 또는 열을 통해 고분자 성형제의 몰드로 쉽게 이용이 가능하다. 도 45, 46은 도 44 에서 이용한 방법으로 제작된 미세구조의 유리 기판을 이용하여 음각형태로 UV 경화 고분자로 2차 몰드를 제작한 샘플의 AFM 이미지 및 라인프로파일 결과와 전자현미경 이미지이다. 매우 일정한 형태로 음각의 몰드가 제작된 것을 볼 수 있으며, 이를 mold로 이용하여 폴리스티렌 및 다른 재료들로 이루어진 성형체를 제작할 수 있다.
무기재질의 몰드를 제작하는 방법을 보여주기 위하여 500 nm의 폴리스티렌 입자를 4 % 경화제 비율의 PDMS에 코팅 후 유리막 코팅제를 통해 유리기판에 전이하였다. 폴리스티렌 입자가 전이된 유리기판을 유기용제인 클로로포름에 담가서 폴리스티렌 입자를 용해한 후 전자현미경을 측정하여 도 46과 같은 일정한 깊이의 음각 미세 구조 기판을 제작하였다. 도 46의 AFM 이미지를 확인하면 입자의 입경인 500 nm의 절반이 넘는 270 nm 의 음각구조가 형성된 것을 확인 할 수 있다. 음각 구조 기판에 UV 경화 고분자를 경화시킨 후 분리한 결과 도 47과 같이 고분자로 이루어진 구형입자 정렬 미세구조 기판이 제작됨을 확인하였다. 이러한 방법을 통해 구형입자의 절반이 넘는 깊이를 가지는 몰드도 제작이 가능함을 알 수 있다. 위에서 언급한 방법들을 이용하여 입자가 정렬되어 형성되는 육방밀집 구조의 고분자 기판등을 간단히 제작할 수 있다는 것을 알수 있다. 도 21과 같이 150 mm 이상의 대면적 상에서도 위에 방법들이 쉽게 구현이 가능하며, 최대 수 m 크기로도 제작이 가능하다. 그리고 복잡한 공정없이 몇개의 재료들로 간단히 세포배양용 미세구조 기판을 제작할 수 있다. 이러한 입자 코팅 및 사출형 미세구조 기판은 약물을 이용한 실험방법들의 부작용 우려나 고비용의 부담을 줄여주는 우수한 세포배양 관련 기술로 판단된다.

Claims (12)

  1. 밀착성 고분자 기판을 준비하는 준비 단계; 및
    상기 밀착성 고분자 기판 위에 복수의 입자를 압력을 가하여 코팅하는 코팅 단계;를 포함하고,
    상기 코팅 단계는 상기 밀착성 고분자 기판에 상기 복수의 입자에 각기 대응하는 복수의 오목부가 형성되면서 코팅되는 입자 정렬을 이용한 세포 배양기판 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 코팅 단계에서는 상기 복수의 입자를 문질러서 상기 압력을 가하는 입자 정렬을 이용한 세포 배양기판 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 오목부 각각의 형상은 입자의 일부를 감싸도록 입자의 형상에 대응하는, 입자 정렬을 이용한 세포 배양기판 제조방법.
  4. 밀착성 고분자 기판;
    상기 기판에 형성된 복수의 오목부; 및
    상기 오목부 각각에 위치하여 단층 코팅되어 정렬된 복수의 입자;를 포함하여 이루어지고,
    상기 오목부 각각의 형상은 입자의 일부를 감싸도록 입자의 형상에 대응하는, 입자 코팅 세포 배양기판.
  5. 밀착성 고분자 기판을 준비하는 준비 단계;
    상기 밀착성 고분자 기판 위에 복수의 입자를 코팅하는 코팅 단계;
    상기 밀착성 고분자 기판 및 상기 복수의 입자 위에 기재를 형성하는 단계; 및
    상기 밀착성 고분자 기판을 제거하여 상기 복수의 입자를 부분적으로 노출하는 노출 단계;
    를 포함하는 입자 부분 노출형 세포 배양기판의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 기재를 형성하는 단계는,
    상기 밀착성 고분자 기판 및 상기 복수의 입자 위에 기재 조성물을 위치시키는 단계; 및
    상기 기재 조성물을 경화시켜 기재를 형성하는 경화 단계;를 포함하는 입자 부분 노출형 세포 배양기판의 제조방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 코팅 단계는 상기 밀착성 고분자 기판에 상기 복수의 입자에 각기 대응하는 복수의 오목부가 형성되면서 코팅하는 입자 부분 노출형 세포 배양기판의 제조방법.
  8. 삭제
  9. 기재; 및
    상기 기재에 일부분이 함입되어 부분적으로 노출되고, 단층 정렬된 복수의 입자;를 포함하고,
    상기 부분적으로 노출되는 복수의 입자는,
    밀착성 고분자 기판을 준비하는 준비 단계;
    상기 밀착성 고분자 기판 위에 복수의 입자를 코팅하는 코팅 단계;
    상기 밀착성 고분자 기판 및 상기 복수의 입자 위에 기재를 형성하는 단계; 및
    상기 밀착성 고분자 기판을 제거하여 상기 복수의 입자를 부분적으로 노출하는 노출 단계;를 통해 형성되는, 입자 부분 노출형 세포 배양기판.
  10. 제9항에 있어서,
    기재로부터 노출되지 않는 입자는 개수 기준으로 전체 입자에서 10% 이하인 입자 부분 노출형 세포 배양기판.
  11. 제9항에 있어서,
    입자의 평균입경을 D라 하고, 노출된 입자 사이의 평균간격(입자 중심부 간의 거리)을 P라 할 때, D ≤ P ≤ 1.5D 를 만족하는 입자 부분 노출형 세포 배양기판.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 기재는 두께 방향을 기준으로, 입자가 위치하는 상부 영역과 위치하지 않는 하부 영역으로 구분되는 입자 부분 노출형 세포 배양기판.
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