JP2010029065A - 細胞培養担体 - Google Patents
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Abstract
【課題】マイクロウェル部が配列された基板中のマイクロウェル部内で3次元凝集体を形成した細胞に対して、マイクロウェル部の底面から栄養や酸素を供給することが可能な細胞培養担体を提供する。
【解決手段】細胞を培養する凹部を備える細胞培養担体であって、細胞培養担体は、セラミックスファイバの集合体で構成されており、集合体にはセラミックスファイバを骨格とする気孔が設けられており、気孔は凹部の内表面から凹部が設けられた面に対向する裏面まで連通された細胞培養担体である。
【選択図】図4
【解決手段】細胞を培養する凹部を備える細胞培養担体であって、細胞培養担体は、セラミックスファイバの集合体で構成されており、集合体にはセラミックスファイバを骨格とする気孔が設けられており、気孔は凹部の内表面から凹部が設けられた面に対向する裏面まで連通された細胞培養担体である。
【選択図】図4
Description
本発明は、細胞の生存に必要な栄養・酸素を培養担体の裏面から供給することが可能な細胞培養担体に関する。
近年、細胞培養技術の向上に伴って、細胞が産生するアミノ酸やタンパク質などを用いた医薬品の開発、更には、細胞自身を患部に移植する再生医療などが行われるようになり、状態が良い細胞が大量に必要とされるようになってきた。
このため、様々な細胞を生体外(in vitro)で効率的に培養する方法が検討されている。
しかし、これらの研究の多くは、ゼラチンなどをコーティングしたシャーレやフラスコ上など、2次元的な環境で行われている。
このため、様々な細胞を生体外(in vitro)で効率的に培養する方法が検討されている。
しかし、これらの研究の多くは、ゼラチンなどをコーティングしたシャーレやフラスコ上など、2次元的な環境で行われている。
近年、細胞を、3次元構造を持たせたバイオマテリアルで培養すると、細胞の生存率や物質生産効率が向上する傾向があることが示されつつある。このため、3次元培養法が注目を集めている。
以上のような現状から、今後は、より生体内(in vivo)環境に酷似した3次元構造を備えたバイオマテリアルの開発が重要になると考えられる。
以上のような現状から、今後は、より生体内(in vivo)環境に酷似した3次元構造を備えたバイオマテリアルの開発が重要になると考えられる。
このようなバイオマテリアルとして、特許文献1には、球状細胞塊の大量培養に適した培養担体として、ガラス等の無機材料、ステンレス綱等の金属材料、合成樹脂、ゴム等からなる基板表面上に、細胞を凝集化させて保持するための、アレイ状やハニカム状に規則配列された細胞培養セルを備えた細胞培養チップが開示されている。
特開2005−27598号公報
このように、特許文献1に示すように、細胞を3次元的に培養するための培養担体として、高分子や金属材料等の基板表面にマイクロウェル部がパターン化された細胞培養担体が開発されている。
しかしながら、細胞培養担体の素材として高分子や金属材料等を用いると、その骨格が連通孔を有していないため、細胞がマイクロウェル部内で3次元凝集体を形成しても、マイクロウェル部の底部に接着している細胞に栄養や酸素が行き渡らず、細胞が死滅、もしくは仮死状態になってしまうという課題を有していた。
このため、基材底部から安定して栄養や酸素が供給可能な3次元構造の細胞培養担体の開発が望まれていた。
しかしながら、細胞培養担体の素材として高分子や金属材料等を用いると、その骨格が連通孔を有していないため、細胞がマイクロウェル部内で3次元凝集体を形成しても、マイクロウェル部の底部に接着している細胞に栄養や酸素が行き渡らず、細胞が死滅、もしくは仮死状態になってしまうという課題を有していた。
このため、基材底部から安定して栄養や酸素が供給可能な3次元構造の細胞培養担体の開発が望まれていた。
本発明は、上記技術的課題を解決するためになされたものであり、マイクロウェル部(凹部)が配列された基板中のマイクロウェル部内で細胞が選択的に接着し、且つマイクロウェル部内で3次元凝集体を形成した細胞に対して、マイクロウェル部の底面から栄養や酸素を供給することが可能な細胞培養担体を提供することを目的とするものである。
本発明に係る細胞培養担体は、細胞を培養する表面を備える細胞培養担体であって、前記細胞培養担体は、セラミックスファイバの集合体で構成されており、前記集合体には前記セラミックスファイバを骨格とする気孔が設けられており、前記気孔は前記表面から前記表面が設けられた面に対向する裏面まで連通されていることを特徴とする。
また、本発明に係る細胞培養担体は、細胞を培養する凹部を備える細胞培養担体であって、前記細胞培養担体は、セラミックスファイバの集合体で構成されており、前記集合体には前記セラミックスファイバを骨格とする気孔が設けられており、前記気孔は前記凹部の内表面から前記凹部が設けられた面に対向する裏面まで連通されていることを特徴とする。
上記のような培養担体を3次元構造の細胞培養担体として用いれば、マイクロウェル部(凹部)内で3次元凝集体を形成した細胞に対して、マイクロウェル部の底面から栄養や酸素を安定して供給することが可能となり、細胞を長期間、維持することができる。
また、本発明に係る細胞培養担体は、細胞を培養する凹部を備える細胞培養担体であって、前記細胞培養担体は、セラミックスファイバの集合体で構成されており、前記集合体には前記セラミックスファイバを骨格とする気孔が設けられており、前記気孔は前記凹部の内表面から前記凹部が設けられた面に対向する裏面まで連通されていることを特徴とする。
上記のような培養担体を3次元構造の細胞培養担体として用いれば、マイクロウェル部(凹部)内で3次元凝集体を形成した細胞に対して、マイクロウェル部の底面から栄養や酸素を安定して供給することが可能となり、細胞を長期間、維持することができる。
また、前記培養担体の連通性を高めてマイクロウェル部(凹部)内部の細胞塊に栄養や酸素を確実に供給するために、前記気孔は、直径が0.1μm以上10μm以下であることが好ましい。さらに、前記セラミックスファイバは、直径が0.1μm以上1μm未満、長さが0.2μm以上10μm未満であることが好ましい。
また、前記セラミックスファイバは、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム、アルミナ、ジルコニア、チタニア、イットリア、シリカのうち少なくとも1種のセラミックスまたはガラスからなることが好ましい。
これらのセラミックス、ガラスは生体安定性と細胞接着性が確認されているため、好適に用いられる。
これらのセラミックス、ガラスは生体安定性と細胞接着性が確認されているため、好適に用いられる。
上述したとおり、本発明に係る細胞培養担体は、マイクロウェル部(凹部)内で3次元凝集体を形成した細胞に対して、マイクロウェル部(凹部)の底面から栄養や酸素の供給を効率よく行うことができ、細胞を長期間、維持することができる。
以下、本発明についてより詳細に説明する。
図1は、本実施形態に係る細胞培養担体の全体の外観構成の一例を示す概念図である。
本実施形態に係る細胞培養担体1は、例えば、図1に示すように、板状体10の表面10a上に細胞を培養する凹部(マイクロウェル部)12を備える。この凹部12は、図1に示すように、細胞培養担体1の表面10aに、例えば、マトリックス状に複数配列されている。なお、ここでいうマトリックス状とは、行方向および列方向に配列されていることを意味する。
図1は、本実施形態に係る細胞培養担体の全体の外観構成の一例を示す概念図である。
本実施形態に係る細胞培養担体1は、例えば、図1に示すように、板状体10の表面10a上に細胞を培養する凹部(マイクロウェル部)12を備える。この凹部12は、図1に示すように、細胞培養担体1の表面10aに、例えば、マトリックス状に複数配列されている。なお、ここでいうマトリックス状とは、行方向および列方向に配列されていることを意味する。
また、細胞培養担体1は、セラミックスファイバの集合体で構成されている。ここでいうセラミックスファイバとは、長軸(長さ)と短軸(直径)を有する棒状体又は楕円体の形状を備えるセラミックス粒子のことをいい(具体的な外観は図4、図5を参照)、セラミックスファイバの集合体とは、前記セラミックスファイバで構成された焼結体であることを示す。
更に、前記集合体には前記セラミックスファイバを骨格とする気孔が設けられており、前記気孔は前記凹部12の内表面から前記凹部12が設けられた面(表面10a)に対向する裏面10bまで連通された構成を備えている。
このような形状の細胞培養担体1を3次元構造の細胞培養担体として用いることにより、凹部12内で3次元凝集体を形成した細胞に対して、細胞培養担体1の裏面10b側から、すなわち、凹部12の底面から栄養や酸素を安定して供給することが可能になり、細胞を長期間、維持することができる。また、細胞培養担体1は、気孔を有するいわゆる多孔体で構成されているため、凹部12内の内表面で細胞を選択的に接着させることができる。
このような形状の細胞培養担体1を3次元構造の細胞培養担体として用いることにより、凹部12内で3次元凝集体を形成した細胞に対して、細胞培養担体1の裏面10b側から、すなわち、凹部12の底面から栄養や酸素を安定して供給することが可能になり、細胞を長期間、維持することができる。また、細胞培養担体1は、気孔を有するいわゆる多孔体で構成されているため、凹部12内の内表面で細胞を選択的に接着させることができる。
なお、細胞培養担体の素材として球状セラミックス粒子(例えば、サブミクロンオーダー)を用いると、球状セラミックス粒子を骨格とした気孔を備えることは可能であるが、培養担体全域にわたって気孔が連通する構造を得ることが困難である。たとえ、気孔率を高くし(多孔質化し)、前記凹部12の内表面から前記裏面10bまで連通した気孔を得ることができたとしても、球状セラミックス粒子間の気孔径は非常に小さいため、マイクロウェル部(凹部)の底面から栄養や酸素の供給を十分に行うことが難しい。
これに対し、本発明に係わる細胞培養担体は、棒状体又は楕円体の形状を有するセラミックスファイバで構成されているため、球状セラミックス粒子を用いるよりも容易に、かつ確実に大きい気孔径を有する連通した気孔を得ることが可能となる。
前記気孔は、直径が0.1μm以上10μm以下である気孔径を備えていることが好ましい。より好ましくは、前記直径が0.1μm以上5μmである気孔径を備えていることがより好ましい。また、前記セラミックスファイバは、直径(短軸)が0.1μm以上1μm未満、長さ(長軸)が0.2μm以上10μm未満であることが好ましい。また、前記細胞培養担体の気孔率は、70%以上90%以下であることが好ましい。
このような気孔径、セラミックスファイバの短軸・長軸及び気孔率を備えていると、より確実に、細胞培養担体の連通性を高めて凹部内部の細胞塊に栄養や酸素を供給することができる。
なお、ここでいう気孔径は、水銀圧入法を用いて測定される値であり、セラミックスファイバの短軸・長軸は、図4や図5に示すようなSEM写真等の画像に確認されるセラミックスファイバの短軸及び長軸の値である。また、ここでいう気孔率は、水銀ポロシメータにより測定される値である。
このような気孔径、セラミックスファイバの短軸・長軸及び気孔率を備えていると、より確実に、細胞培養担体の連通性を高めて凹部内部の細胞塊に栄養や酸素を供給することができる。
なお、ここでいう気孔径は、水銀圧入法を用いて測定される値であり、セラミックスファイバの短軸・長軸は、図4や図5に示すようなSEM写真等の画像に確認されるセラミックスファイバの短軸及び長軸の値である。また、ここでいう気孔率は、水銀ポロシメータにより測定される値である。
また、前記セラミックスファイバは、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム、アルミナ、ジルコニア、チタニア、イットリア、シリカのうち少なくとも1種のセラミックスまたはガラスからなることが好ましい。
これらのセラミックス、特に、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウムは生体親和性と細胞接着性があり、好適に用いられる。
これらのセラミックス、特に、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウムは生体親和性と細胞接着性があり、好適に用いられる。
また、細胞の3次元凝集体を形成させるために用いられる前記凹部12の径は、10μm以上1000μm以下、その深さが10μm以上1000μm以下であることが好ましい。
通常、細胞のサイズは10μm〜20μmであることから、マイクロウェル部で細胞が選択的に接着・増殖することを考慮すると、径・深さともに50μm以上1000μm以下であることがさらに好ましい。
通常、細胞のサイズは10μm〜20μmであることから、マイクロウェル部で細胞が選択的に接着・増殖することを考慮すると、径・深さともに50μm以上1000μm以下であることがさらに好ましい。
本発明において培養する細胞は、肝細胞等に代表される生体由来の細胞、ES細胞に代表される未分化細胞を分化誘導した細胞である。
なお、本実施形態では、細胞を培養する凹部12を備える形態で説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、細胞を培養する凹部12を有しない、すなわち、細胞を培養する表面が平面である細胞培養担体にも好適に適用することができるのは言うまでもない。
なお、本実施形態では、細胞を培養する凹部12を備える形態で説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、細胞を培養する凹部12を有しない、すなわち、細胞を培養する表面が平面である細胞培養担体にも好適に適用することができるのは言うまでもない。
以下、本発明を実施例に基づいてさらに具体的に説明するが、本発明は、下記実施例により限定されるものではない。
[実施例1]
ハイドロキシアパタイト製のセラミックスファイバ10gと15%ルパゾール水溶液10gを混合し、超音波処理を10分間行った。ここに、エポキシ樹脂を0.7g添加して均一に攪拌した後、鋳型に流し込み、室温で30分間静置した。30分間静置した後、鋳型より離形した成形体を800℃で2時間焼成して、細胞培養担体を作製した。得られた細胞培養担体の電子顕微鏡写真をそれぞれ図2(50倍)、図3(200倍)、図4(10000倍)、図5(50000倍)に示す。
図4及び図5に示すように、前記作製した細胞培養担体は、セラミックスファイバの集合体で構成されており、前記集合体には前記セラミックスファイバを骨格とする気孔が設けられているのが確認できる。また、セラミックスファイバの各々は、その直径が0.1μm以上1μm未満、長さが0.2μm以上10μm未満であることがわかる。
[実施例1]
ハイドロキシアパタイト製のセラミックスファイバ10gと15%ルパゾール水溶液10gを混合し、超音波処理を10分間行った。ここに、エポキシ樹脂を0.7g添加して均一に攪拌した後、鋳型に流し込み、室温で30分間静置した。30分間静置した後、鋳型より離形した成形体を800℃で2時間焼成して、細胞培養担体を作製した。得られた細胞培養担体の電子顕微鏡写真をそれぞれ図2(50倍)、図3(200倍)、図4(10000倍)、図5(50000倍)に示す。
図4及び図5に示すように、前記作製した細胞培養担体は、セラミックスファイバの集合体で構成されており、前記集合体には前記セラミックスファイバを骨格とする気孔が設けられているのが確認できる。また、セラミックスファイバの各々は、その直径が0.1μm以上1μm未満、長さが0.2μm以上10μm未満であることがわかる。
次に、24ウェルプレートの中に、前記作製したそれぞれの細胞培養担体を浸漬させ、HepG2(ヒト肝がん由来細胞)を5.0×104個撒種し、FBS(血清)を含んだDMEMにおいて5%CO2インキュベータを用い、37℃で3日間培養した。培養後、細胞を固定・凍結乾燥して電子顕微鏡で観察したところ、マイクロウェル内でHepG2がスフェロイドを形成していることを確認した。
さらにマイクロウェル内でHepG2の培養を1ヶ月間続けた。そして、培養1日・5日・10日・20日・30日後の培養液を回収して、細胞の状態を見るために細胞のグルコース消費量を調べた。この結果、マイクロウェル内で増殖した細胞は、高いグルコース消費量を維持しつづけていることがわかった。
[比較例1]
ハイドロキシアパタイト製の球状粒子10gと15%ルパゾール水溶液10gを混合し、超音波処理を10分間行った。ここに、エポキシ樹脂を0.7g添加して均一に攪拌した後、鋳型に流し込み、室温で30分間静置した。30分間静置した後、鋳型より離形した成形体を900℃で2時間焼成して、細胞培養担体を作製した。得られた細胞培養担体の電子顕微鏡写真を図6(10000倍)に示す。
ハイドロキシアパタイト製の球状粒子10gと15%ルパゾール水溶液10gを混合し、超音波処理を10分間行った。ここに、エポキシ樹脂を0.7g添加して均一に攪拌した後、鋳型に流し込み、室温で30分間静置した。30分間静置した後、鋳型より離形した成形体を900℃で2時間焼成して、細胞培養担体を作製した。得られた細胞培養担体の電子顕微鏡写真を図6(10000倍)に示す。
次に、24ウェルプレートの中に、前記作製したそれぞれの細胞培養担体を浸漬させ、HepG2(ヒト肝がん由来細胞)を5.0×104個撒種し、FBS(血清)を含んだDMEMにおいて5%CO2インキュベータを用い、37℃で3日間培養した。培養後、細胞を固定・凍結乾燥して電子顕微鏡で観察したところ、マイクロウェル内でHepG2がスフェロイドを形成していることを確認した。
さらにマイクロウェル内でHepG2の培養を1ヶ月間続けた。そして、培養1日・5日・10日・20日・30日後の培養液を回収して、細胞の状態を見るためにグルコース活性を調べた。この結果、細胞1個あたりのグルコース消費量が5日目以降減少していくことがわかった。
[比較例2]
ハイドロキシアパタイト製の球状粒子10gと15%ルパゾール水溶液10gを混合し、超音波処理を10分間行った。ここに、エポキシ樹脂を0.7g添加して均一に攪拌した後、鋳型に流し込み、室温で30分間静置した。30分間静置した後、鋳型より離形した成形体を1200℃で2時間焼成して、細胞培養担体を作製した。得られた細胞培養担体の電子顕微鏡写真を図7(10000倍)に示す。
ハイドロキシアパタイト製の球状粒子10gと15%ルパゾール水溶液10gを混合し、超音波処理を10分間行った。ここに、エポキシ樹脂を0.7g添加して均一に攪拌した後、鋳型に流し込み、室温で30分間静置した。30分間静置した後、鋳型より離形した成形体を1200℃で2時間焼成して、細胞培養担体を作製した。得られた細胞培養担体の電子顕微鏡写真を図7(10000倍)に示す。
次に、24ウェルプレートの中に、前記作製したそれぞれの細胞培養担体を浸漬させ、HepG2(ヒトがん細胞)を5.0×104個撒種し、FBS(血清)を含んだDMEMにおいて5%CO2インキュベータを用い、37℃で3日間培養した。培養後、細胞を固定・凍結乾燥して電子顕微鏡で観察したところ、マイクロウェル内でHepG2がスフェロイドを形成していることを確認した。
さらにマイクロウェル内でHepG2の培養を1ヶ月間続けた。そして、培養1日・5日・10日・20日・30日後の培養液を回収して、細胞の状態を見るためにグルコース活性を調べた。この結果、細胞1個あたりのグルコース消費量が5日目以降減少していき、10日目で細胞が仮死状態になっていることを確認した。
上記実施例1、比較例1、比較例2においてそれぞれ作製した細胞培養担体の気孔径を、水銀圧入法を用いて測定したデータを図8に示す。図8において、細実線が実施例1において作製した細胞培養担体の気孔径の分布を示し、点線が比較例1において作製した細胞培養担体の気孔径の分布を示し、太実線が比較例2において作製した細胞培養担体の気孔径の分布を示す。
この測定データにより、実施例1で作製した細胞培養担体の気孔径は0.1μm以上10μm以下に分布し、比較例1で作製したセラミックス担体の気孔径は0.05μm以上0.1μm以下に分布し、比較例2で作製したセラミックス担体では気孔が形成されないことを確認した。
このことから、実施例1で作製したセラミックス担体の気孔径は、マイクロウェル部内で3次元凝集体を形成した細胞に対して栄養や酸素を供給することに適したサイズであると言える。
この測定データにより、実施例1で作製した細胞培養担体の気孔径は0.1μm以上10μm以下に分布し、比較例1で作製したセラミックス担体の気孔径は0.05μm以上0.1μm以下に分布し、比較例2で作製したセラミックス担体では気孔が形成されないことを確認した。
このことから、実施例1で作製したセラミックス担体の気孔径は、マイクロウェル部内で3次元凝集体を形成した細胞に対して栄養や酸素を供給することに適したサイズであると言える。
1 細胞培養担体
10 板状体
12 凹部(マイクロウェル部)
10 板状体
12 凹部(マイクロウェル部)
Claims (5)
- 細胞を培養する表面を備える細胞培養担体であって、
前記細胞培養担体は、セラミックスファイバの集合体で構成されており、前記集合体には前記セラミックスファイバを骨格とする気孔が設けられており、前記気孔は前記表面から前記表面が設けられた面に対向する裏面まで連通されていることを特徴とする細胞培養担体。 - 細胞を培養する凹部を備える細胞培養担体であって、
前記細胞培養担体は、セラミックスファイバの集合体で構成されており、前記集合体には前記セラミックスファイバを骨格とする気孔が設けられており、前記気孔は前記凹部の内表面から前記凹部が設けられた面に対向する裏面まで連通されていることを特徴とする細胞培養担体。 - 前記気孔は、直径が0.1μm以上10μm以下であることを特徴とする請求項1または2に記載の細胞培養担体。
- 前記セラミックスファイバは、直径が0.1μm以上1μm未満、長さが0.2μm以上10μm未満であることを特徴とする請求項1乃至3いずれか一項に記載の細胞培養担体。
- 前記セラミックスファイバは、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム、アルミナ、ジルコニア、チタニア、イットリア、シリカのうち少なくとも1種のセラミックスまたはガラスからなることを特徴とする請求項1乃至4いずれか一項に記載の細胞培養担体。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012050426A (ja) * | 2010-08-06 | 2012-03-15 | Covalent Materials Corp | 細胞培養担体及び細胞培養方法 |
JP2013208086A (ja) * | 2012-03-30 | 2013-10-10 | Covalent Materials Corp | 細胞培養担体 |
-
2008
- 2008-07-25 JP JP2008191761A patent/JP2010029065A/ja active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012050426A (ja) * | 2010-08-06 | 2012-03-15 | Covalent Materials Corp | 細胞培養担体及び細胞培養方法 |
JP2013208086A (ja) * | 2012-03-30 | 2013-10-10 | Covalent Materials Corp | 細胞培養担体 |
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