JP4888808B2 - 未分化細胞の培養担体および培養方法 - Google Patents
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Description
しかしながら、ハイドロキシアパタイトの主成分であるCa2+イオンやPO4 2-イオンは、骨芽細胞が骨形成を行う際の重要な因子であり、このため、ハイドロキシアパタイト等のリン酸カルシウム系セラミックスを、ES細胞等の未分化な細胞の培養担体として用いた場合、Ca2+イオン等の影響により、他の細胞に分化・誘導され、未分化なまま維持することが難しい。
このため、フィーダ細胞等の支持細胞を使用することなく、培養担体上で、ES細胞を培養させる研究も進められてはいるが、未だ完全な3次元培養塊を形成できるまでには至っていない。
上記のような微小孔は、セラミックスの粒子間に形成されるもので、細胞を撒種する部位に存在することにより、未分化細胞が培養担体に接着しやすく、また、培地の循環の促進も図られ、未分化細胞が3次元細胞塊状に形成されやすくなる。
なお、ここで言う「気孔」は、前記「微小孔」とは、異なるものを指す。
上記のような本発明に係る培養担体を用いることにより、免疫拒絶反応を起こさず、かつ、効率的に、未分化細胞の3次元細胞塊を培養することができる。
培養担体のセラミックスに、フィーダ細胞に代表される支持細胞を介さず、直接、未分化細胞を撒種(導入)させることにより、危険因子の混入や免疫拒絶反応等のおそれのない未分化細胞の3次元細胞塊を得ることができる。
また、本発明によれば、セラミックスの表面や気孔内の細胞に、細胞増殖因子や栄養分を効率的に供給することができ、未分化な細胞の3次元細胞塊を形成することができる。
したがって、本発明は、ES細胞や成体多能性幹細胞等の多能性を有する未分化な細胞の培養技術の発展、ひいては、生体組織の再生治療への応用に貢献し得るものである。
本発明に係る未分化細胞の培養担体は、少なくとも細胞を撒種する部位が、孔径0.1μm以上10μm以下の微小孔を有するセラミックスであることを特徴とするものである。
このような微小孔により、未分化細胞はセラミックスに接着しやすくなり、また、培地の循環の促進が図られ、セラミックスの表面(セラミックスが多孔体である場合には、気孔内も含む)において、未分化細胞の3次元細胞塊の形成が促進される。
前記微小孔の孔径は、細胞と材料の接着に関して意味のある大きさという観点から、上記範囲内であることが好ましく、0.1μm以上5μm以下であることがより好ましい。
なお、前記微小孔の孔径は、水銀圧入法により測定することができる。
これらは、生体安定性、生体親和性に優れ、また、未分化細胞の分化・誘導を起こしにくい。
これらのうち、特に、チタニアが、培養された細胞が球状塊になりやすく、好ましい。
前記微小孔と異なり、より大きな気孔が外部と連通するように存在することにより、未分化細胞が侵入し、定着できる表面積が広がり、また、培養液も3次元状に循環しやすくなる。
前記セラミックスが多孔体である場合は、少なくとも気孔内表面に、前記微小孔を有していることが好ましく、多孔体全体が微小孔を有していることがより好ましい。
なお、前記微小孔による空間は、ここでいう多孔体の気孔部分には含まれないものとする。
ただし、ここで言う平均気孔径には、前記微小孔の孔径は含まず、孔径10μmよりも大きい気孔のみを考慮した気孔径である。
また、略球状の気孔とは、厳密な真球状に限定されるものではなく、真球がやや扁平したり、歪んだりした形状等の気孔も含む意味である。
また、連通部とは、隣り合う略球状の気孔同士が接触して開口した部分をいう。開口が円形でない場合もあるが、ここでは、開口した部分の面積を有する円に置換して、その直径を「連通部の径」として表す。
なお、前記気孔率は、多孔体の密度と理論密度から導くことができる。また、平均気孔径は、特許第3400740号公報に記載の樹脂包埋による方法で求められ、連通部の径は、水銀圧入法により求めることができる。
一方、前記気孔率が95%を超える場合、また、平均気孔径が1000μmを超える場合、多孔体内部に侵入した未分化細胞が流出しやすく、多孔体上に定着し難くなるとともに、培養担体の形状を保つことが難しい。
前記気孔率は、より好ましくは、75%以上90%以下であり、さらに、80%以上90%以下であることが好ましい。また、平均気孔径は、250μm以上800μm以下であることがより好ましい。
一方、前記径が200μmを超える場合、多孔体内部に侵入した未分化細胞が流出しやすく、多孔体上に定着し難くなる。
前記連通部の径は、20μm以上150μm以下であることがより好ましい。
なお、上記のようなセラミックス多孔体は、スポンジ状の有機多孔体にスラリーを塗布して有機多孔体を焼き抜くセラミックフォームや、スラリーを撹拌起泡して焼結する特許第3400740号に記載されている方法等によって得ることができるが、気孔の制御がしやすい後者の方法により得ることがより好ましい。
これらの培地には、さらに、FBS(fetal bovine serum;ウシ胎児血清)、KSR(KnockOutTM Serum Replacement)、LIF(leukemia inhibitory factor;白血病阻害因子)、非必須アミノ酸、ピルビン酸、抗生物質等の細胞を維持するために必要な物質を添加することが好ましい。
このような3次元細胞塊状の未分化な培養細胞は、複雑な組織の再生治療に有効活用することができる。
また、前記培養細胞は、図3−2の電子顕微鏡写真に見られるような球状の細胞塊として得ることもできる(下記実施例3参照)。
[実施例1](チタニアセラミックス多孔体(焼結体)の作製)
セラミックス原料として平均粒径180nmのチタニア粉末810gと、分散剤としてポリカルボン酸アンモニウム塩0.41gとポリエチレンイミン32.4gを、分散溶媒として純水270gを、ボールミルで15時間撹拌混合して原料スラリーを調製した。
この原料スラリーに、起泡剤としてエマール(登録商標)4.8gを添加して撹拌し、泡沫状スラリーとした。
さらに、ゲル化剤としてソルビトールポリグリシジルエーテル4.2gを加えて、150mm×150mm×30mmの型に流し込み、加湿乾燥させ、チタニア多孔体の成形体を得た。
この成形体を、1200℃で2時間焼成して、135mm×134mm×21mmのチタニアセラミックス多孔体(焼結体)を得た。
この焼結体の気孔率は84.8%であった。
得られた焼結体の電子顕微鏡写真(10000倍、100倍)を、図1−1、図1−2に示す。
図1−1に示す電子顕微鏡写真から、チタニアセラミックス多孔体の骨格部分に、孔径0.5〜2μmの微小孔が存在することが観察され、これを水銀圧入法により測定したところ、孔径0.4〜1.0μmであった。また、平均気孔径は150〜450μm、連通部の径は40〜60μmであった。
実施例1と同様にして得られたチタニア多孔体の成形体を、1400℃で2時間焼成して、135mm×134mm×21mmのチタニアセラミックス多孔体(焼結体)を得た。
この焼結体の気孔率は80.2%であった。
得られた焼結体の電子顕微鏡写真(10000倍)を、図2に示す。また、平均気孔径は150〜450μm、連通部の径は40〜60μmであった。
図2に示す電子顕微鏡写真においては、図1−1で見られたような微小孔は消失している。
96穴プレートの穴に、実施例1で作製したチタニアセラミックス多孔体を径5mm高さ2mmの円柱状に加工して充填し、このチタニアセラミックス多孔体上に、予め培養されたES細胞を5.0×105個撒種し、KSR、ピルビン酸、非必須アミノ酸、LIF、ストレプトマイシン、ペニシリンを含んだDMEMにおいて、5%CO2インキュベータ内で、37℃で3日間培養した。
培養後の細胞の電子顕微鏡写真(100倍、1000倍)を、図3−1、3−2に示す。
図3−2に示す電子顕微鏡写真から、チタニアセラミックス多孔体上で、ES細胞が未分化な状態を保持したまま、3次元細胞塊を形成していることが確認された。さらに、3次元細胞塊をALP(アルカリフォスターゼ)染色したところ、3次元細胞塊が青紫色に染色され、ES細胞が未分化な状態を保持したまま、増殖していることが確認された。
チタニアセラミックス多孔体に代えて、ハイドロキシアパタイトセラミックス多孔体(気孔率80%)を用いて、実施例3と同様にして、ES細胞を培養した。
培養後の細胞の電子顕微鏡写真(1000倍)を、図4に示す。
図4に示す電子顕微鏡写真から、ハイドロキシアパタイトセラミックス上では、ES細胞の3次元細胞塊の形成は認められなかった。
Claims (3)
- 少なくとも細胞を撒種する部位が、孔径0.1μm以上10μm以下の微小孔を有するセラミックスであり、前記セラミックスが、無数の略球状の気孔が全体にわたって連通しており、気孔率が70%以上95%以下、平均気孔径が50μm以上1000μm以下、各気孔間の連通部の径が10μm以上200μm以下であり、内部に連通する気孔を有するチタニアの多孔体からなることを特徴とする未分化細胞の培養担体。
- 請求項1記載の培養担体が用いられ、前記培養担体の表面または気孔内の少なくとも1ヶ所以上に未分化細胞を撒種して、未分化な状態で3次元細胞塊状に培養することを特徴とする未分化細胞の培養方法。
- 前記培養担体を構成するセラミックスまたはセラミックス多孔体に直接、未分化細胞を撒種し、培養することを特徴とする請求項2記載の未分化細胞の培養方法。
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