JP5791176B2 - 細胞培養担体及び細胞培養方法 - Google Patents
細胞培養担体及び細胞培養方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5791176B2 JP5791176B2 JP2011130953A JP2011130953A JP5791176B2 JP 5791176 B2 JP5791176 B2 JP 5791176B2 JP 2011130953 A JP2011130953 A JP 2011130953A JP 2011130953 A JP2011130953 A JP 2011130953A JP 5791176 B2 JP5791176 B2 JP 5791176B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cell culture
- carrier
- mesenchymal stem
- stem cells
- well
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims description 136
- MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N Zirconium dioxide Chemical compound O=[Zr]=O MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 178
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 116
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 107
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims description 97
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 claims description 45
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 44
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 claims description 32
- 210000004276 hyalin Anatomy 0.000 claims description 29
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 claims description 28
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 26
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 25
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 claims description 24
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims description 16
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 13
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 6
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 5
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000007599 discharging Methods 0.000 claims description 3
- 238000005245 sintering Methods 0.000 claims description 3
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 61
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 50
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 49
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 description 37
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 33
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 32
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 29
- 238000010304 firing Methods 0.000 description 28
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 24
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 23
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 21
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 19
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 16
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 16
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 16
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 15
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 13
- 239000011163 secondary particle Substances 0.000 description 13
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 11
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 description 11
- 238000001354 calcination Methods 0.000 description 11
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 9
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 230000003746 surface roughness Effects 0.000 description 8
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 description 7
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 description 7
- 102000030746 Collagen Type X Human genes 0.000 description 7
- 108010022510 Collagen Type X Proteins 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 6
- OARRHUQTFTUEOS-UHFFFAOYSA-N safranin Chemical compound [Cl-].C=12C=C(N)C(C)=CC2=NC2=CC(C)=C(N)C=C2[N+]=1C1=CC=CC=C1 OARRHUQTFTUEOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229950003937 tolonium Drugs 0.000 description 6
- HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M tolonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(C)C(N)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 102000016284 Aggrecans Human genes 0.000 description 5
- 108010067219 Aggrecans Proteins 0.000 description 5
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 5
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 5
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 description 5
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 101710176668 Cartilage oligomeric matrix protein Proteins 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical group CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N Oil red O Chemical compound Cc1ccc(C)c(c1)N=Nc1cc(C)c(cc1C)N=Nc1c(O)ccc2ccccc12 NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 4
- 108010016731 PPAR gamma Proteins 0.000 description 4
- 102000012132 Peroxisome proliferator-activated receptor gamma Human genes 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 4
- 101150106167 SOX9 gene Proteins 0.000 description 4
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 4
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 4
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 4
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 4
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 4
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 4
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100027473 Cartilage oligomeric matrix protein Human genes 0.000 description 3
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 3
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N N-[1-oxo-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propan-2-yl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(C(C)NC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N N-[2-oxo-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 210000003559 hypertrophic chondrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 3
- 102100022525 Bone morphogenetic protein 6 Human genes 0.000 description 2
- 101000899390 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 6 Proteins 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 2
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000280 densification Methods 0.000 description 2
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 2
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 229940000207 selenious acid Drugs 0.000 description 2
- MCAHWIHFGHIESP-UHFFFAOYSA-N selenous acid Chemical compound O[Se](O)=O MCAHWIHFGHIESP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RUDFQVOCFDJEEF-UHFFFAOYSA-N yttrium(III) oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Y+3].[Y+3] RUDFQVOCFDJEEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 1-(3,5-dichloro-2,6-dihydroxy-4-methoxyphenyl)hexan-1-one Chemical compound CCCCCC(=O)C1=C(O)C(Cl)=C(OC)C(Cl)=C1O VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 101000762366 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000762379 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000942967 Homo sapiens Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 1
- MIJPAVRNWPDMOR-ZAFYKAAXSA-N L-ascorbic acid 2-phosphate Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(OP(O)(O)=O)=C1O MIJPAVRNWPDMOR-ZAFYKAAXSA-N 0.000 description 1
- 102100032352 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 1
- 102000004264 Osteopontin Human genes 0.000 description 1
- 108010081689 Osteopontin Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000043168 TGF-beta family Human genes 0.000 description 1
- 108091085018 TGF-beta family Proteins 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- BRPQOXSCLDDYGP-UHFFFAOYSA-N calcium oxide Chemical compound [O-2].[Ca+2] BRPQOXSCLDDYGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000292 calcium oxide Substances 0.000 description 1
- ODINCKMPIJJUCX-UHFFFAOYSA-N calcium oxide Inorganic materials [Ca]=O ODINCKMPIJJUCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 229910010293 ceramic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003035 hyaline cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001969 hypertrophic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000000395 magnesium oxide Substances 0.000 description 1
- CPLXHLVBOLITMK-UHFFFAOYSA-N magnesium oxide Inorganic materials [Mg]=O CPLXHLVBOLITMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXZKOIWUVFPNLO-UHFFFAOYSA-N magnesium;oxygen(2-) Chemical compound [O-2].[Mg+2] AXZKOIWUVFPNLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000009818 osteogenic differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 238000002459 porosimetry Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 1
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0068—General culture methods using substrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0664—Dental pulp stem cells, Dental follicle stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0666—Mesenchymal stem cells from hair follicles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0676—Pancreatic cells
- C12N5/0677—Three-dimensional culture, tissue culture or organ culture; Encapsulated cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0679—Cells of the gastro-intestinal tract
- C12N5/068—Stem cells; Progenitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/10—Mineral substrates
- C12N2533/14—Ceramic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2535/00—Supports or coatings for cell culture characterised by topography
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
このため、間葉系幹細胞は、再生医療への利用が期待されており、自己再生が難しい部位に間葉系幹細胞を移植する細胞治療の臨床研究が始まっている。
しかしながら、このような2次元的な環境で間葉系幹細胞を分化誘導した場合、3次元的な構造を有する生体内組織の本来の性質とは異なるものとなる。特に、間葉系幹細胞から軟骨への分化誘導をシャーレで行うと、ほとんどの間葉系幹細胞が軟骨細胞へ分化しないことが知られている。
しかしながら、間葉系幹細胞は、シャーレ上では扁平かつ単一でしか増殖せず、肝細胞のように自己凝集する性質は見られない。
また、特許文献1に記載されているような、複数の凹部を有する3次元的な形状の培養担体を用いて培養することも検討されている。
また、ペレット培養法により、凝集化させた間葉系幹細胞を軟骨細胞に分化誘導すると、生体内軟骨細胞(硝子軟骨細胞)が発現している遺伝子である、TypeIIコラーゲンやアグリカンの発現が確認できる。
しかしながら、さらに分化が進んだ肥大軟骨細胞が発現しているTypeXコラーゲンや間葉系幹細胞に特異的なCD105の発現も確認でき、生体内組織に性質が一致した均一な軟骨組織に該凝集塊を分化誘導することができないという問題が見られた。
さらに、特許文献1に記載されているような複数の凹部を有する3次元培養担体を用いた場合も、凹部のみに間葉系幹細胞を凝集化させることができず、生体内組織に性質が一致し、かつ、分化状態がより均一な組織に分化誘導することができないという問題が見られた。
上面がこのような表面状態を有する担体を用いることにより、扁平化した間葉系幹細胞が上面に付着しないため、球状を維持することができる。あるいは、間葉系幹細胞の培養初期段階で、間葉系幹細胞が上面に付着して扁平状になった場合においても、ある程度の時間が経過すると、扁平状になった間葉系幹細胞は球状化する。しかも、この上面に複数のウェルが形成されているため、球状の間葉系幹細胞がウェルに移動、凝集し、間葉系幹細胞の凝集塊を効率的に大量に培養することができるとともに、間葉系幹細胞から、生体内組織と性質が似ている硝子軟骨細胞、脂肪細胞や骨芽細胞等の組織細胞に効率よく分化誘導することができる。
このようなウェル形状及びウェル開口径とすることにより、ウェル内において、間葉系幹細胞を培養する際の凝集塊の3次元構造化及びそのサイズをより適切に制御することができ、また、硝子軟骨細胞へ分化誘導する場合においても、分化状態がより均一な軟骨組織等の生体内組織を得ることが可能となる。
少なくともウェル底面も、担体上面と同様の表面粗さとすることにより、ウェル底面に細胞が扁平状に付着することがなく、ウェル底に接着した細胞が球状になりやすく、細胞凝集塊を形成しやすくなる。
このような間隔を設けることにより、ウェル内により効率的に細胞を入れることができ、かつ、ウェル内で凝集化した細胞塊に酸素や栄養等を安定して供給できる。
前記担体をセラミックス焼結体で構成することにより、上記のような表面粗さの上面を形成しやすくなる。また、このような平均細孔径とすることにより、前記ウェルに形成された細胞凝集塊に対し、担体裏面から分化誘導因子、栄養、酸素等をより効率的に供給することができる。
前記セラミックスにジルコニアを使用することにより、担体表面に対する培養液を介在した状態での間葉系幹細胞の耐変特性を抑制することができる。
このような培養方法によれば、間葉系幹細胞の凝集塊の形成、さらに、該凝集塊から硝子軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞への分化誘導を、同一の担体のままで、簡便かつ効率的に行うことができる。
このような培養方法を行うことにより、ウェル内に複数個の細胞が侵入しやすくなり、細胞凝集塊をより効率的に形成することができる。
また、前記細胞培養担体を用いた本発明に係る細胞培養方法によれば、間葉系幹細胞の凝集塊の形成、及び、該凝集塊から硝子軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞への分化誘導を、同一の担体のままで、簡便かつ効率的に行うことができ、しかも、分化状態が均一な軟骨組織を得ることが可能となる。
本発明に係る細胞培養担体は、間葉系幹細胞の培養に用いられる細胞培養担体であって、上面に細胞を培養するための複数のウェルが形成されており、かつ、前記上面が所定の表面粗さを有しているものである。
本発明において適用される細胞は、間葉系幹細胞(MSC)であり、具体的には、骨髄、臍帯血、脂肪等から採取可能な間葉系幹細胞、又は、組織由来の前駆細胞及びこれらの細胞を不死化した細胞である。
本発明に係る細胞培養担体は、このような均一な形状の間葉系幹細胞の凝集塊を効率的に大量に形成し、また、間葉系幹細胞から硝子軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞を効率よく分化誘導することができるものである。
上面がこのような表面状態を有する担体を用いることにより、扁平化した間葉系幹細胞が上面に付着しないため、球状を維持することができる。あるいは、間葉系幹細胞の培養初期段階に、間葉系幹細胞が上面に付着して扁平状になった場合においても、ある程度の時間が経過すると、扁平状になった間葉系幹細胞は球状化する。しかも、この上面に複数のウェルが形成されているため、球状の間葉系幹細胞が、ウェルに移動、凝集し、間葉系幹細胞の凝集塊を効率的に形成させ、大量に培養することができるとともに、間葉系幹細胞から生体内組織に一致している硝子軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞を効率よく分化誘導することができる。
2乗平均粗さRq及び線密度が上記数値範囲外である場合、細胞が扁平形状となり、該担体上面に接着して、細胞凝集塊を形成しなくなる傾向がある。
担体上面が、マクロなフラット面あるいは所定面積のミクロなフラット面を有する表面状態であると、これに伴い、間葉系幹細胞が扁平化して密着してしまう。しかしながら、このようなフラット面が存在せず、上記の特定の凹凸面である場合には、間葉系幹細胞が扁平化することなく球状を維持することができ、かつ、担体上面に複数のウェルが存在するため、当該球状の間葉系幹細胞がウェル内に移動し、凝集化する。特に、担体上面における凹凸形状の凸部上面に、ミクロなフラット面が存在しないことが重要であると推測される。
ここでいう線密度とは、面方向のパラメータであり、長さ1μmあたりの粗さ曲線が平均面と交差する回数を表している。
なお、本発明における2乗平均粗さRqは、JIS・B 0601により測定したものである。
また、線密度は、原子間力顕微鏡(AFM)により、スケール0.8μm、スキャンサイズ10μm×10μmにて測定したものである。
ウェル開口部の形状は、細胞の播種や細胞塊の形成が容易であること、また、ウェルの加工容易性等の観点から、円形状又は矩形状であることが好ましい。
ここで、ウェルの開口径は、開口部の形状が円形の場合は、この円の直径を意味し、矩形の場合は、対向する辺の間隔を意味する一方、多角形の場合は、1つの辺とこれに対向する頂点に接する平行線との間隔を意味する。
さらに、前記ウェルの深さも、細胞凝集塊のサイズの制御等の観点から、前記ウェル開口径と同様に、70〜500μmであることが好ましい。一方、前記ウェル開口径が70μm未満又は550μmを超える場合は、間葉系幹細胞が所望する3次元細胞凝集塊を形成しにくくなる。
少なくとも前記ウェル底面も上記のような表面状態であれば、細胞が球状に維持されやすく、ウェル内の空間内で、細胞凝集塊をより形成しやすくなる。
一方、前記2乗平均粗さRq及び線密度が上記数値範囲外である場合、細胞が該ウェル底面に扁平形状に接着して、細胞凝集塊が形成されにくくなる。
なお、前記担体のウェル内は、上記底面のみならず、側壁部も前記担体の上面と同じ2乗平均粗さRqと線密度との各数値範囲内であることがより好ましい。
ウェルの中心点の間隔が80μm未満である場合、形成された細胞凝集塊同士の距離が近くなり、培地中の酸素や栄養等が細胞に供給されにくくなる。一方、ウェルの中心点の間隔が700μmを超える場合、球状化した細胞のウェル内への移動が困難となる。
また、上記のようなウェルの間隔を設けることにより、ウェル内に細胞を確実に入れることができる。
また、所定数の細胞を担体に確実に播種するために、前記担体の外周に、上面よりも高い壁が形成されていることが好ましい。
セラミックス焼結体により細胞培養担体を構成することにより、セラミックス粒子が形成する凹凸構造のみで、該細胞培養担体の上面を上記のような表面状態にすることが簡易にできる。
また、セラミックス焼結体は、隣り合うセラミックス粒子間に細孔を有しているが、この細孔は、該細胞培養担体の下面(裏面)からウェル内に、栄養や誘導因子等を毛細管現象によって浸透させて供給する役割を果たす。
なお、前記セラミックス焼結体の気孔率は、上記のような栄養や誘導因子等の浸透性を確保し、また、担体としての強度を保持する等の観点から、10〜50%であることがより好ましい。
上記のような平均細孔径であれば、上記セラミックス焼結体による効果がより顕在化する。
なお、前記平均細孔径は、水銀ポロシメータを用いて、水銀圧入法により測定することができる。
さらに、セラミックス表面で細胞凝集塊を形成させるためには、細胞と接触するセラミックス粒子の2次粒子の平均粒子径が0.6〜1.2μmであることが好ましい。
なお、本発明における2次粒子の平均粒子径は、セラミックス原料を純水に懸濁させて、超音波処理を10分行った後、大塚電子(株)ELSZ−2を用いて、粒度分布の平均値を算出(レーザードップラー法)したものである。
これらの安定化剤を添加することによって、ジルコニアの相転移が抑制され、安定して焼成することができ、上記のような表面粗さを有する担体を好適に得ることができる。
例えば、平均粒子径0.8μmのジルコニア原料粉に、安定化剤としてイットリアを5.6重量%添加して、1050〜1150℃で焼成することにより、好適な表面粗さを有する細胞培養担体を作製することができる。
このような形状とすることにより、ウェル内に侵入した複数の細胞が凝集化して、細胞凝集塊をより形成しやすくなる。
上述した本発明に係る担体を用いて、このような工程を経ることにより、間葉系幹細胞の凝集塊の形成及び該細胞凝集塊からの硝子軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞への分化誘導を、同一の担体のままで、担体上の細胞を移動させることなく行うことができ、硝子軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞の培養を簡便かつ効率的に行うことができる。
本発明の細胞培養方法においては、前記第2の培養液中の間葉系幹細胞数を前記担体1cm2あたり1×104個以上1×106個以下とすることが好ましい。
これによって、前記細胞培養担体を用いて所望サイズの3次元細胞凝集塊をより効率的に培養することができる。
まず、容器内に前記担体の上面を上にして配置して、前記容器と担体との隙間に第1の培養液を供給する。そして、この培養液を、前記担体のウェル開口部付近まで毛細管現象により浸透させる。
上記のようにして、第1の培養液を供給することにより、培養液を前記担体の上面に直に供給するのではなく、該担体の下面(裏面)から担体中の細孔を通じて、毛細管現象により担体に培養液を浸透させることができるため、培養液に培養の阻害要因となり得る気泡を包含させることなく、複数のウェル内に満遍なく培養液を行き渡らせることができる。
また、間葉系幹細胞を細胞治療のツールとして用いる場合は、市販されている無血清培地を用いることがより好ましい。
このようにして、間葉系幹細胞を培養液に懸濁させた状態で前記担体の上面に滴下して播種することにより、間葉系幹細胞を負荷なく、担体上面に沈降させることができ、前記ウェル内でのスムーズな凝集化を達成することができる。ここで用いられる培地の種類は、前記第1の培養液と同様のものでよい。
上記のような密度で間葉系幹細胞を播種することにより、前記細胞培養担体を用いて、所望サイズの3次元細胞凝集塊をより効率的に培養することができる。
上記の第2の培養液の滴下による播種工程においては、ウェル内外を問わず、担体表面のあらゆる箇所に、細胞が付着しているが、本工程において、第1の培養液中に担体全体を浸漬させて、好ましくは48時間以上静置することにより、ウェル外の担体上面に付着していた細胞が、担体から離脱することなく、ウェル内に移動し、ウェル内で凝集塊を形成する。
このように、間葉系幹細胞の培養に用いた担体のままで、培養液を変えることにより、ウェル内において、間葉系細胞から硝子軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞への分化誘導を行うことができる。
TGFβは、TGFβファミリーに属するものであればいずれでもよいが、TGFβ−3を用いることが好ましい。また、TGFβと同様の作用を示す低分子化合物を用いて代替することもできる。添加するTGFβの量は1〜50ng/ml、より好ましくは10ng/mlである。
BMPとしては、BMP2、BMP4、BMP6等が用いられ、BMP6を用いることが好ましい。また、低分子化合物を用いて代替することもできる。添加するBMPの量は、100〜500ng/ml、より好ましくは200ng/mlである。
また、添加するアスコルビン酸(好ましくはアスコルビン酸2−リン酸)の量は、10〜100μg/ml、好ましくは50μg/mlである。
また、添加するプロリンの量は、10〜100μg/ml、好ましくは約40μg/mlである。
また、添加するデキサメタソンの量は、10〜500nM、好ましくは100nMである。
また、添加するインスリン、トランスフェリン、亜セレン酸は、市販のITS溶液を適正濃度になるように添加する。
なお、間葉系幹細胞から軟骨、脂肪、骨芽細胞に誘導する分化誘導培地が市販されており、これらも使用可能であることはいうまでもない。
[試験例1−1]ジルコニア原料未焼成粉による細胞培養担体
平均粒子径が0.6〜0.9μmであるジルコニア原料粉を所望のウェル形状より若干小さいサイズとなるパターン化された複数の凸形状を有する特殊鋳型を用いて、開口径100μm、深さ100μmのウェルが配列したジルコニア製の細胞培養担体(直径15mm)を成形し、室温で静置後、前記鋳型から成型体を取り出し、これを所定の温度で24時間乾燥し、1050℃、1150℃、1250℃、1350℃、1500℃でそれぞれ2時間焼成して担体を作製した。
作製した各担体のウェルの平均開口径は、各々82μm、78μm、64μm、60μm、55μmであった。
上記開口径の算出方法は、まず、ウェルの中心点を通る8本の直径線をランダムに引き、ウェルの開口径の平均値を算出する。これを、ウェル20個についてそれぞれ実施した後、ウェル1個あたりの開口径の平均値を算出した。
なお、ウェルの開口径は、マイクロスコープ(VHX−1000:キーエンス)を用いて測定した。
各温度で焼成したジルコニア製細胞培養担体について、表面骨格の電子顕微鏡(SEM)写真を図1、水銀圧入法で測定した細孔径分布を図2に示す。
なお、平均粒子径は、セラミックス原料を純水に懸濁後、超音波処理を10分おこなった後、大塚電子(株)ELSZ-2を用いて粒度分布の平均値を算出(レーザードップラー法)した。
また、図2のグラフに示したように、焼成温度が高くなるにつれて、緻密化が進み、微細孔が小さくなることが確認された。平均細孔径は、それぞれ、1050℃で焼成したものは0.17μm、1150℃で焼成したものは0.15μm、1250℃で焼成したものは0.17μmであり、1350℃及び1500℃で焼成したものは微細孔が測定されなかった。
播種して3日経過後のSEM写真を図3に示す。
試験例1−1で用いたジルコニア原料粉を1150℃で仮焼成して、粒子径の平均値が0.75〜1.2μmの2次粒子を得た。この2次粒子を用いて、試験例1−1と同様にして、開口径100μm、深さ100μmのウェルが配列したジルコニア製の細胞培養担体(直径15mm)を成形し、1050℃、1150℃、1250℃、1350℃、1500℃でそれぞれ2時間焼成して担体を作製した。
作製した各担体のウェルの平均開口径は、各々90μm、85μm、75μm、65μm、55μmであった。上記開口径の算出方法は上記のとおりである。
各温度で焼成したジルコニア製細胞培養担体について、表面骨格のSEM写真を図4、水銀圧入法で測定した細孔径分布を図5に示す。
また、図5のグラフに示したように、試験例1−1と同温度で焼成した担体は、微細孔が若干大きくなることが認められた。平均細孔径は、それぞれ、1050℃で焼成したものは0.25μm、1150℃で焼成したものは0.22μm、1250℃で焼成したものは0.20μmであり、1350℃及び1500℃で焼成したものは微細孔が測定されなかった。
播種して3日経過後のSEM写真を図6に示す。
試験例1−1で用いたジルコニア原料粉を1250℃で仮焼成して、粒子径の平均値が0.8〜1.2μmの2次粒子を得た。この2次粒子を用いて、試験例1−1と同様にして、開口径100μm、深さ100μmのウェルが配列したジルコニア製の細胞培養担体(直径15mm)を成形し、1050、1150、1250、1350、1500℃でそれぞれ2時間焼成して担体を作製した。
作製した各担体のウェルの平均開口径は、各々92μm、88μm、77μm、65μm、57μmとなる。上記開口径の算出方法は上記のとおりである。
各温度で焼成したジルコニア製細胞培養担体について、表面骨格のSEM写真を図7、水銀圧入法で測定した細孔径分布を図8に示す。
また、図8のグラフに示したように、試験例1−1、1−2と同温度で焼成した担体は、微細孔が若干大きくなることが認められた。平均細孔径は、それぞれ、1050℃で焼成したものは0.45μm、1150℃で焼成したものは0.34μm、1250℃で焼成したものは0.42μmであり、1350℃及び1500℃で焼成したものは微細孔が測定されなかった。
播種して3日経過後のSEM写真を図9に示す。
試験例1−1で用いたジルコニア原料粉を1350℃で仮焼成して、粒子径の平均値が1.0〜2.5μmの2次粒子を得た。この2次粒子を用いて、試験例1−1と同様にして、開口径100μm、深さ100μmのウェルが配列したジルコニア製の細胞培養担体(直径15mm)を成形し、1050、1150、1250、1350、1500℃でそれぞれ2時間焼成して担体を作製した。
作製した各担体のウェルの平均開口径は、各々85μm、82μm、75μm、67μm、58μmであった。上記開口径の算出方法は上記の通りである。
各温度で焼成したジルコニア製細胞培養担体について、表面骨格のSEM写真を図10、水銀圧入法で測定した細孔径分布を図11に示す。
また、図11のグラフに示したように、試験例1−1〜1−3と同温度で焼成した担体は、微細孔が若干大きくなることが認められた。平均細孔径は、それぞれ、1050℃で焼成したものは0.64μm、1150℃で焼成したものは0.91μm、1250℃で焼成したものは0.72μmであり、1350℃及び1500℃で焼成したものは微細孔が測定されなかった。
播種して3日経過後のSEM写真を図12に示す。
なお、2乗平均粗さRqは、JIS B 0601により測定したものである。
また、線密度は、原子間力顕微鏡(AFM)により、スケール0.8μm、スキャンサイズ10μm×10μmにて測定したものである。
平均粒子径が0.6〜0.9μmのジルコニア原料粉を用いて、1150℃で焼成して作製した、開口径及び深さが78μm、175μm、510μmのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体に、試験例1−1と同様にして、0.5×104、1×104、2.5×104、5×104個のhMSCを播種して培養した。
播種して7日経過後のSEM写真を図13に示す。
また、ウェル開口径175μm以上の場合、播種細胞数を5×104個以上にすると、細胞が凝集化しやすくなる傾向が認められた。
平均粒子径が0.6〜0.9μmのジルコニア原料粉を用いて、開口径及び深さが175μmのウェルが配列したジルコニア製細胞培養担体を作製した。この担体表面は、2乗平均粗さRq=103.22nm、線密度=2.71であった。
この担体を滅菌処理後、24ウェルプレートに入れた。ここに、ヒト肝ガン由来細胞(HepG2)を5×104個播種して、FBS(ウシ血清)10%を含むDMEMで、37℃、5%CO2の条件下で培養した。
播種して7日経過後のSEM写真を図14に示す。
ゼラチンがコーティングされた直径10cmのシャーレに、不死化されたhMSCを3×105個播種して、FBS(ウシ血清)10%を含むDMEMで、37℃、5%CO2の条件下で培養した。
播種して3日後のシャーレ表面の透過型顕微鏡写真を図15に示す。
成形型を凸形状のないフラットな面を有するものとしたことを除いて、比較例1と同様に、ジルコニア製平板を作製した。この平板表面は、2乗平均粗さRq=100.8nm、線密度=2.01であった。
この平板を滅菌処理後、24ウェルプレートに入れた。ここに、不死化されたhMSCを1×104個播種して、FBS(ウシ血清)10%を含むDMEMで、37℃、5%CO2の条件下で培養した。
播種して3日経過後のSEM写真を図16に示す。
このことから、hMSCの凝集化には、ウェル構造が必要であり、また、効率的な凝集化のためには、ウェル底部も平面でなく、湾曲形状であることが好ましいと考えられる。
平均粒子径が0.6〜0.9μmのジルコニア原料粉を用いて、開口径及び深さが100μmのウェルが配列したジルコニア製の細胞培養担体(直径15mm)を成形し、1150℃で2時間焼成して、開口径及び深さが70μmの担体を作製した。
この担体を滅菌処理後、24ウェルプレートに入れた。ここに、不死化されたhMSCを5×104個播種して、FBS(ウシ血清)10%を含むDMEMで、37℃、5%CO2の条件下で培養した。
播種してから3日目に、TGFβ−3を10ng/ml、DEXを100nM、アスコルビン酸を50μg/ml、プロリンを40μg/ml、ITS及びピルビン酸を含むDMEM(軟骨分化誘導培地)に変え、3週間分化誘導を行った。なお、培地交換は4日おきに行った。
分化誘導を始めて1、2、3週間経過後、それぞれ、担体から分化誘導培地を除去し、PBSで洗浄後直ちにRNAの抽出を行った。RNAの抽出には、RNAisoPlus(Takara社)を用い、そのプロトコルに従って、mRNAを抽出・精製した。
得られたRNAについて、RNA PCR kit(Takara社)を用いて、逆転写後、軟骨分化マーカーであるCD29、CD44、CD105、TypeXコラーゲン、TypeIIコラーゲン、COMP、アグリカン、Sox9、lunx2及びchM1の発現をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって確認した。
これらの軟骨分化マーカーを図17に示す。なお、比較のため、ペレット法で形成したhMSCの凝集塊を分化誘導して得られた軟骨組織、及び、硝子軟骨由来正常細胞についてのマーカーも併せて示す。
不死化されたhMSC2.5×105個をDMEM5mlで懸濁させて15mlチューブに入れ、遠心分離によって該チューブの底でペレットを形成した。アスピレータでDMEMを吸引後、TGFβ−3を10ng/ml、DEXを100nM、アスコルビン酸を50μg/ml、プロリンを40μg/ml、ITS及びピルビン酸を含むDMEM(軟骨分化誘導培地)に変え、3週間分化誘導を行った。なお、培地交換は4日おきに行った。
分化誘導を始めて1、2、3週間経過後、それぞれ、担体から分化誘導培地を除去し、PBSで洗浄後直ちにRNAの抽出を行った。RNAの抽出及びPCRによる軟骨分化マーカーの確認は、実施例2と同様にして行った。
これらの軟骨分化マーカーを、実施例2の結果と併せて、図17に示す。
このことから、得られた軟骨細胞は、目的の硝子軟骨細胞の他に、成熟・肥大化した軟骨細胞が含まれており、分化状態が均一な軟骨組織ではないことが認められた。
平均粒子径が0.6〜0.9μmのジルコニア原料粉を用いて、開口径及び深さが100μm、200μm、400μm、600μmのウェルが配列したジルコニア製の各細胞培養担体(直径15mm)を成形し、1150℃で2時間焼成して開口径及び深さが78μm、175μm、350μm、510μmの担体を作製した。
上記において作製した各担体を用いて、実施例2と同様にして、hMSCの培養及び分化誘導を行った。
分化誘導を始めて3週間経過後、各担体から分化誘導培地を除去し、PBSで洗浄後直ちにRNAの抽出を行った。RNAの抽出には、RNAisoPlus(Takara社)を用い、そのプロトコルに従って、mRNAを抽出・精製した。
得られたRNAについて、RNA PCR kit(Takara社)を用いて、逆転写後、間葉系幹細胞マーカーであるCD105、成熟・肥大硝子軟骨細胞マーカーであるTypeXコラーゲン、硝子軟骨細胞のマーカーであるTypeIIコラーゲンの発現をPCRによって確認した。
これらのマーカーを図18に示す。なお、比較のため、ペレット法で形成したhMSCの凝集塊を分化誘導して得られた軟骨組織についてのマーカーも併せて示す。
一方、ペレット法で得られた軟骨組織は、TypeIIコラーゲン、TypeXコラーゲン及びCD105が発現していたことから、間葉系幹細胞、硝子軟骨細胞、成熟・肥大軟骨細胞が混在した組織になっていることが確認された。
実施例3において、分化誘導を3週間行った細胞培養担体(ウェル開口径及び深さが510μm)から分化誘導培地を除去し、PBSで洗浄後、4%パラホルムアルデヒド(Wako社)を用いて固定を行った。その後、エタノールを70、80、90、100%の順で加えて脱水を行い、キシレンで置換した。
そして、この担体のウェル内から、ピペッティングにより軟骨組織を回収し、パラフィンを用いて包埋した。この包埋したブロックから、ミクロトーム(Leica社)を用いて、厚さ5μmの切片を切り出した。この切片を、スライドガラスに貼り付け、キシレン、100、90、80、70%エタノールの順で浸液させて脱パラフィン処理を行い、軟骨組織部分を染色できる状態にした。
これを3%酢酸に浸した後、軟骨細胞が産生する細胞外基質であるグリコサミノグリカンを特異的に染色するサフラニンO又はトルイジンブルー液にそれぞれ、5分間浸液させた。そして、エタノール、キシレンで脱水処理を行い、封入剤を用いて封入した。
サフラニンO染色した組織の透過型顕微鏡写真を図19、トルイジンブルー染色した組織の透過型顕微鏡写真を図20に示す。なお、比較のため、ペレット法で形成したhMSCの凝集塊を分化誘導して得られた軟骨組織の染色状態も併せて示す。
比較例4において、ペレット法で形成したhMSCの凝集塊からの分化誘導を3週間行った組織から分化誘導培地を除去し、その後の処理は、実施例4と同様にして、サフラニンO又はトルイジンブルーによる染色を行った。
サフラニンO染色した組織の透過型顕微鏡写真を図19、トルイジンブルー染色した組織の透過型顕微鏡写真を図20に、実施例4の結果と併せて示す。
平均粒子径が0.6〜0.9μmのジルコニア原料粉を用いて、平均開口径及び深さが30μm、70μm、540μm、1410μmのウェルが配列したジルコニア製の各細胞培養担体(直径15mm)を成形し、1150℃で2時間焼成して担体を作製した。
上記において作製した各担体を、滅菌処理後、24ウェルプレートに入れた。ここに、不死化されたhMSC)を5×104個播種して、FBS(ウシ血清)10%を含むDMEMで、37℃、5%CO2の条件下で培養した。
播種して3日経過後のSEM写真を図21に示す。
一方、ウェル開口径が30μmの細胞培養担体は、ウェル外(担体上面)にも扁平細胞が接着しており、細胞凝集塊は十分に形成されていなかった。また、ウェル開口径1410μmの細胞培養担体は、ウェル内に細胞が集まっていたが、凝集塊は十分に形成されていなかった。
原料粉としてアルミナを用いた点、また、2次粒子形成にスプレードライヤーを用いた点を除き、実施例1と同様にして、開口径及び深さが100μmのウェルが配列したアルミナ製の細胞培養担体(直径15cm)を成形し、1000℃で2時間焼成して担体を作製した(特許文献1の実施例1記載のアルミナセラミックス多孔体と同等サンプル)。焼成後の担体上面に形成された開口径は、ウェル数10個の平均値で80μmであった。このアルミナ製細胞培養担体について、表面骨格のSEM写真を図22に示す。
また、この表面状態について、上記試験例1−1〜1−4の各担体と同様にして測定したところ、2乗平均粗さRq=47.40nm、線密度=5.01であった。
播種して3日経過後のSEM写真(100、250、1000倍)を図23に示す。
平均粒子径0.6〜0.9μmのジルコニア原料粉を用いて、開口径及び深さが100、200、400、600μmのウェルが配列した各ジルコニア製細胞培養担体を成形し、1150℃焼成で2時間焼成した。各ジルコニア製細胞培養担体は、焼成により収縮して開口径及び深さが75、175、350、510μmになった。
これらの各担体を滅菌処理後、24ウェルプレートに入れた。ここに不死化されたhMSCを1×105個(ウェル開口径75μm)、2×105個(ウェル開口径175μm)、3×105個(ウェル開口径350μm)、4×105個(ウェル開口径510μm)播種して、FBSを10%含むDMEMで37℃、5%CO2の条件下で培養した。
播種してから4日目に、脂肪細胞分化誘導培地(GIBCO社)に変え、分化誘導を行った。なお、培地交換は4日おきに行った。
分化誘導を始めて7日経過後、各担体から分化誘導培地を除去し、PBSで洗浄後直ちに、RNAiso(Takara社)を用いてRNAの抽出を行った。
得られたRNAについて、RNA PCR kit(Takara社)を用いて、逆転写後、初期脂肪マーカーであるPPARγ(Peroxisome Proliferator−Activated Receptor γ)、MSCマーカーであるCD105の発現をPCRによって確認した。
これらのマーカーを図24に示す。なお、比較のため、シャーレで形成したhMSCの凝集塊を分化誘導して得られた脂肪細胞についてのマーカーも併せて示す。
これらの染色した細胞の透過型顕微鏡写真を図25に示す。
図25に示した顕微鏡写真から分かるように、各細胞培養担体のウェル内で細胞凝集塊が染色されており、脂肪細胞が形成されていることが認められた。
ゼラチンがコーティングされた直径10cmのシャーレに、不死化されたhMSCを7×104個播種して、FBS10%を含むDMEMで、37℃、5%CO2の条件下で培養した。
24時間後、脂肪分化誘導培地(GIBCO社)に変え、分化誘導を行った。なお、培地交換は4日おきに行った。
分化誘導を始めて7日経過後、この担体から分化誘導培地を除去し、PBSで洗浄後直ちにRNAの抽出を行った。RNAの抽出及びPCRによるマーカーの確認は、実施例5と同様にして行った。
これらのマーカーを実施例5の結果と併せて、図24に示す。
このことから、本発明に係る細胞培養担体によれば、脂肪細胞へ効率よく分化誘導可能であることが確認された。
これらの染色した細胞の透過型顕微鏡写真を図26に示す。
実施例5と同様の各担体を滅菌処理後、24ウェルプレートに入れた。ここに不死化されたhMSCを1×105個(ウェル開口径75μm)、2×105個(ウェル開口径175μm)、3×105個(ウェル開口径350μm)、4×105個(ウェル開口径510μm)播種して、FBSを10%含むDMEMで37℃、5%CO2の条件下で培養した。
播種してから4日目に、骨形成分化誘導培地(GIBCO社)に変え、分化誘導を行った。なお、培地交換は4日おきに行った。
分化誘導を始めて14日経過後、各担体から分化誘導培地を除去し、PBSで洗浄後直ちに、RNAiso(Takara社)を用いてRNAの抽出を行った。
得られたRNAについて、RNA PCR kit(Takara社)を用いて、逆転写後、骨芽細胞マーカーであるColI(1型コラーゲン)、SppI(オステオポンチン)、MSCマーカーであるCD105の発現をPCRによって確認した。
これらのマーカーを図27に示す。なお、比較のため、シャーレで形成したhMSCの凝集塊を分化誘導して得られた骨芽細胞についてのマーカーも併せて示す。
ゼラチンがコーティングされた直径10cmのシャーレに、不死化されたhMSCを7×104個播種して、FBS10%を含むDMEMで、37℃、5%CO2の条件下で培養した。
24時間後、骨分化誘導培地(GIBCO社)に変え、分化誘導を行った。なお、培地交換は4日おきに行った。
分化誘導を始めて7日経過後、この担体から分化誘導培地を除去し、PBSで洗浄後直ちにRNAの抽出を行った。RNAの抽出及びPCRによるマーカーの確認は、実施例5と同様にして行った。
これらのマーカーを実施例6の結果と併せて、図27に示す。
このことから、本発明に係る細胞培養担体によれば、骨芽細胞へ効率よく分化誘導可能であることが確認された。
Claims (9)
- 間葉系幹細胞の培養に用いられる細胞培養担体であって、上面に開口径が少なくとも70μmの複数のウェルが形成されており、前記上面は、2乗平均粗さRqが100〜280nm、かつ、長さ1μmあたりの線密度が1.6〜3.0であることを特徴とする細胞培養担体。
- 前記ウェルは、開口部が円形状又は矩形上であり、開口径が550μm以下であることを特徴とする請求項1記載の細胞培養担体。
- 前記ウェルの少なくとも底面は、2乗平均粗さRqが100〜280nm、長さ1μmあたりの線密度が1.6〜3.0であることを特徴とする請求項1又は2に記載の細胞培養担体。
- 近隣する前記ウェルの中心点の間隔が、80〜700μmであることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の細胞培養担体。
- セラミックス焼結体からなり、かつ、該セラミックス焼結体の平均細孔径が0.15〜0.45μmであることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の細胞培養担体。
- 前記セラミックスがジルコニアであることを特徴とする請求項5記載の細胞培養担体。
- 前記上面がセラミックス焼結後の非加工面であることを特徴とする請求項5又は6に記載の細胞培養担体。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の細胞培養担体を用いた細胞培養方法であって、
容器内に前記細胞培養担体の上面を上にして配置した後、前記容器内に第1の培養液を供給し、該第1の培養液を前記細胞培養担体のウェル開口部付近まで毛細管現象により浸透させる工程と、
前記第1の培養液を浸透させた細胞培養担体の上面に未分化の間葉系幹細胞を含む第2の培養液を滴下して、間葉系幹細胞を播種する工程と、
前記容器内に前記第1の培養液をさらに供給し、前記細胞培養担体全体を前記第1の培養液に浸漬させて、前記ウェル内で間葉系幹細胞の凝集化を進行させる工程と、
前記容器内から、前記第1の培養液と、前記間葉系幹細胞を除いた前記第2の培養液とを排出した後、凝集化した前記間葉系幹細胞を硝子軟骨細胞、脂肪細胞及び骨芽細胞等の組織細胞に分化誘導するための第3の培養液を前記容器内に供給し、前記細胞培養担体全体を前記第3の培養液に浸漬させて、前記ウェル内で間葉系幹細胞を、硝子軟骨細胞、脂肪細胞及び骨芽細胞のうちいずれかの組織細胞に分化誘導する工程と、
を備えていることを特徴とする細胞培養方法。 - 前記第2の培養液中の間葉系幹細胞数を前記担体1cm2あたり1×104個以上1×106個以下とすることを特徴とする請求項8記載の細胞培養方法。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2011130953A JP5791176B2 (ja) | 2010-08-06 | 2011-06-13 | 細胞培養担体及び細胞培養方法 |
GB1113641.3A GB2482612B (en) | 2010-08-06 | 2011-08-05 | Cell culture support for culturing mesenchymal stem cells |
US13/204,324 US8673638B2 (en) | 2010-08-06 | 2011-08-05 | Cell culture support and cell culture method |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010178181 | 2010-08-06 | ||
JP2010178181 | 2010-08-06 | ||
JP2011130953A JP5791176B2 (ja) | 2010-08-06 | 2011-06-13 | 細胞培養担体及び細胞培養方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2012050426A JP2012050426A (ja) | 2012-03-15 |
JP5791176B2 true JP5791176B2 (ja) | 2015-10-07 |
Family
ID=44735593
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011130953A Active JP5791176B2 (ja) | 2010-08-06 | 2011-06-13 | 細胞培養担体及び細胞培養方法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8673638B2 (ja) |
JP (1) | JP5791176B2 (ja) |
GB (1) | GB2482612B (ja) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5868244B2 (ja) * | 2012-03-30 | 2016-02-24 | クアーズテック株式会社 | 細胞培養担体 |
ES2609242T3 (es) | 2012-06-28 | 2017-04-19 | Wolfgang Parak | Soporte de cultivo celular biomimético |
JP6081276B2 (ja) * | 2013-04-10 | 2017-02-15 | クアーズテック株式会社 | 細胞培養担体 |
JP6223178B2 (ja) * | 2013-12-27 | 2017-11-01 | クアーズテック株式会社 | 細胞培養モジュール及び細胞培養方法 |
JP2017104106A (ja) * | 2015-12-07 | 2017-06-15 | 株式会社Cells Power | 単一種幹細胞 |
JP7003763B2 (ja) * | 2018-03-19 | 2022-02-04 | 凸版印刷株式会社 | 試薬カートリッジ |
CN115197902A (zh) * | 2022-06-29 | 2022-10-18 | 华中科技大学 | 一种基于表面粗糙培养基底加速获取去分化脂肪细胞的方法 |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2501500B2 (ja) * | 1991-09-30 | 1996-05-29 | 積水化学工業株式会社 | 顆粒球吸着用担体及び顆粒球除去装置 |
US5407001A (en) * | 1993-07-08 | 1995-04-18 | Precision Castparts Corporation | Yttria-zirconia slurries and mold facecoats for casting reactive metals |
WO2001011007A2 (en) | 1999-08-10 | 2001-02-15 | Acorda Therapeutics, Inc. | Bioartificial device for propagation of tissue, preparation and uses thereof |
GB0115204D0 (en) | 2001-06-21 | 2001-08-15 | Zellwerk Gmbh | Ceramic materials, method for their production and use thereof |
US9096826B2 (en) * | 2005-11-22 | 2015-08-04 | Covalent Materials Corporation | Culture substrate and culture method for undifferentiated cell and undifferentiated cultured cell |
JP4888808B2 (ja) * | 2005-11-22 | 2012-02-29 | コバレントマテリアル株式会社 | 未分化細胞の培養担体および培養方法 |
JP4936937B2 (ja) * | 2006-11-21 | 2012-05-23 | コバレントマテリアル株式会社 | マウスes細胞培養用未分化細胞培養担体 |
JP5252411B2 (ja) | 2007-06-15 | 2013-07-31 | コバレントマテリアル株式会社 | 細胞培養担体および細胞の培養方法 |
ES2672525T3 (es) | 2008-06-20 | 2018-06-14 | Universiteit Maastricht | Módulos de tejido auto-ensamblables |
JP2010029065A (ja) * | 2008-07-25 | 2010-02-12 | Covalent Materials Corp | 細胞培養担体 |
-
2011
- 2011-06-13 JP JP2011130953A patent/JP5791176B2/ja active Active
- 2011-08-05 US US13/204,324 patent/US8673638B2/en active Active
- 2011-08-05 GB GB1113641.3A patent/GB2482612B/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US8673638B2 (en) | 2014-03-18 |
US20120034694A1 (en) | 2012-02-09 |
JP2012050426A (ja) | 2012-03-15 |
GB201113641D0 (en) | 2011-09-21 |
GB2482612B (en) | 2018-01-24 |
GB2482612A (en) | 2012-02-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5791176B2 (ja) | 細胞培養担体及び細胞培養方法 | |
Zhang et al. | The effects of pore architecture in silk fibroin scaffolds on the growth and differentiation of mesenchymal stem cells expressing BMP7 | |
Mangano et al. | The osteoblastic differentiation of dental pulp stem cells and bone formation on different titanium surface textures | |
CA2669589C (en) | In vitro expansion of postpartum-derived cells using microcarriers | |
Hildebrandt et al. | A scaffold-free in vitro model for osteogenesis of human mesenchymal stem cells | |
Schumacher et al. | Static and dynamic cultivation of bone marrow stromal cells on biphasic calcium phosphate scaffolds derived from an indirect rapid prototyping technique | |
Yuste et al. | Mimicking bone microenvironment: 2D and 3D in vitro models of human osteoblasts | |
Zheng et al. | Hierarchical micro-nano topography promotes cell adhesion and osteogenic differentiation via integrin α2-PI3K-AKT signaling axis | |
Ren et al. | Enhancement of osteogenesis using a novel porous hydroxyapatite scaffold in vivo and vitro | |
JP6690001B2 (ja) | 細胞組織の製造方法、及び多孔フィルム | |
JP5252411B2 (ja) | 細胞培養担体および細胞の培養方法 | |
CN106414722B (zh) | 红系细胞的体外扩增 | |
JP2015511482A (ja) | 3dインビトロ二相性軟骨構造物 | |
Kurzyk et al. | Characterization and optimization of the seeding process of adipose stem cells on the polycaprolactone scaffolds | |
TW201014914A (en) | Materials and methods for cell growth | |
Pensabene et al. | Flexible polymeric ultrathin film for mesenchymal stem cell differentiation | |
JP2012080874A (ja) | 擬微小重力環境下での三次元組織構築方法 | |
JP4936937B2 (ja) | マウスes細胞培養用未分化細胞培養担体 | |
JP4888808B2 (ja) | 未分化細胞の培養担体および培養方法 | |
JP6081276B2 (ja) | 細胞培養担体 | |
Kotlarz et al. | Cell seeding via bioprinted hydrogels supports cell migration into porous apatite-wollastonite bioceramic scaffolds for bone tissue engineering | |
US9428728B2 (en) | Carrier for undifferentiated cell culture and subculture method thereof | |
Suck et al. | A rotating bed system bioreactor enables cultivation of primary osteoblasts on well‐characterized sponceram® regarding structural and flow properties | |
JP6756368B2 (ja) | 細胞の調製方法、細胞培養装置及びキット | |
JP7355577B2 (ja) | 多能性幹細胞由来の分化誘導細胞を含有するシート状物の作製方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20130919 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20141201 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20141224 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150115 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150316 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150731 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150803 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5791176 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |