JP2007209203A - リン酸カルシウム系細胞培養担体および培養方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】細胞の侵入性および培地の浸透性に優れ、細胞の3次元培養を容易かつ効率的に行うことができる細胞培養担体およびこれを用いた細胞培養方法を提供する。
【解決手段】複数の球状の気孔が全体にわたって連通した多孔質構造を有し、気孔率が60%以上80%以下、平均気孔径が100μm以上400μm以下、各気孔間の連通部の径が10μm以上100μm以下の多孔体からなり、前記多孔体は、ハイドロキシアパタイトまたは/およびリン酸三カルシウムからなるリン酸カルシウム系セラミックス多孔体であり、直径100μm以上1000μm以下の貫通孔が3mm以上5mm以下の間隔で形成されている培養担体を用いる。
【選択図】なし
【解決手段】複数の球状の気孔が全体にわたって連通した多孔質構造を有し、気孔率が60%以上80%以下、平均気孔径が100μm以上400μm以下、各気孔間の連通部の径が10μm以上100μm以下の多孔体からなり、前記多孔体は、ハイドロキシアパタイトまたは/およびリン酸三カルシウムからなるリン酸カルシウム系セラミックス多孔体であり、直径100μm以上1000μm以下の貫通孔が3mm以上5mm以下の間隔で形成されている培養担体を用いる。
【選択図】なし
Description
本発明は、リン酸カルシウム系セラミックス多孔体からなり、細胞の侵入性および培地の浸透性等に優れた細胞培養担体およびこれを用いた細胞培養方法に関する。
従来から、医療技術や医薬品の開発等を目的として、種々の動物実験や細胞培養実験が行われている。
動物実験は、生体内において反応を解析することができるという利点を有している反面、ヒトと他の動物との種差により、得られた結果が、必ずしも信頼できるとは限らず、また、多くの動物を犠牲にしなければならないという課題を有している。
動物実験は、生体内において反応を解析することができるという利点を有している反面、ヒトと他の動物との種差により、得られた結果が、必ずしも信頼できるとは限らず、また、多くの動物を犠牲にしなければならないという課題を有している。
一方、細胞培養実験は、ヒト、特に、患者自身の細胞を培養して、目的の作用を直接検討することができるという利点を有している。
しかしながら、従来の細胞培養は、2次元培養であるため、実際の生体の器官とは差異が生じていた。
しかしながら、従来の細胞培養は、2次元培養であるため、実際の生体の器官とは差異が生じていた。
このため、ヒトを含めた動物の組織細胞を3次元的に培養し、培養細胞によって生体の器官を再構築しようとする試みが検討されている。
このような3次元細胞培養方法としては、例えば、細胞をコラーゲンゲル内に包埋して、3次元的に培養する方法が知られている。
また、例えば、特許文献1に記載されているような3次元連通構造を有するリン酸カルシウム系セラミックス多孔体を細胞培養担体として用いる研究開発も進められている。
特開昭60−16879号公報
このような3次元細胞培養方法としては、例えば、細胞をコラーゲンゲル内に包埋して、3次元的に培養する方法が知られている。
また、例えば、特許文献1に記載されているような3次元連通構造を有するリン酸カルシウム系セラミックス多孔体を細胞培養担体として用いる研究開発も進められている。
しかしながら、従来の3次元細胞培養方法であるコラーゲンゲル培養法は、細胞数が増加するにつれて、内側の細胞に栄養分を供給が妨げられ、また、同時に、それらの細胞が分泌する細胞代謝物を外部へ放出することも困難となるという課題を有していた。
また、特許文献1に記載されているような3次元連通構造を有するリン酸カルシウム系セラミックス多孔体の細胞培養担体は、細胞播種の際、細胞懸濁液が多孔体内部にまで浸透せず、細胞が内部にまで侵入し難い。また、培養期間が長くなるほど、培地交換の際、培地が多孔体内部に浸透し難くなり、多孔体内部の細胞に栄養分を供給することが困難となるという課題を有していた。
本発明は、上記技術的課題を解決するためになされたものであり、細胞の侵入性および培地の浸透性に優れ、細胞の3次元培養を容易かつ効率的に行うことができる細胞培養担体およびこれを用いた細胞培養方法を提供することを目的とするものである。
本発明に係るリン酸カルシウム系細胞培養担体は、複数の球状の気孔が全体にわたって連通した多孔質構造を有し、気孔率が60%以上80%以下、平均気孔径が100μm以上400μm以下、各気孔間の連通部の径が10μm以上100μm以下の多孔体からなり、前記多孔体は、ハイドロキシアパタイトまたは/およびリン酸三カルシウムからなるリン酸カルシウム系セラミックス多孔体であり、直径100μm以上1000μm以下の貫通孔が3mm以上5mm以下の間隔で形成されていることを特徴とする。
このような培養担体によれば、細胞の侵入性や培地の浸透性の向上が図られ、リン酸カルシウム系セラミックス多孔体からなる培養担体によって、3次元培養を容易かつ効率的に行うことができる。
このような培養担体によれば、細胞の侵入性や培地の浸透性の向上が図られ、リン酸カルシウム系セラミックス多孔体からなる培養担体によって、3次元培養を容易かつ効率的に行うことができる。
前記セラミックス多孔体は、表面部における気孔率が75%以上80%以下、平均気孔径が300μm以上400μm以下、連通部径が50μm以上80μm以下であり、内部から表面に向かって気孔径および連通部径が増大する傾斜構造を有していることが好ましい。
このような傾斜構造を有する多孔体とすることにより、細胞の侵入および細胞培養時における培地の浸透性をより促進することができる。
このような傾斜構造を有する多孔体とすることにより、細胞の侵入および細胞培養時における培地の浸透性をより促進することができる。
また、本発明に係る細胞培養方法は、上記細胞培養担体を用いる細胞培養方法であって、前記多孔体の浸漬または前記多孔体に形成された貫通孔からの注入により、培地を多孔体内部まで浸透させた後、細胞を播種する。
本発明に係る細胞培養担体を用いることにより、培養担体への細胞播種前の培地の浸透を容易に行うことができる。
本発明に係る細胞培養担体を用いることにより、培養担体への細胞播種前の培地の浸透を容易に行うことができる。
また、前記培地には、FBS、アスコルビン酸、ストレプトマイシン、β−グリセロリン酸およびデキサメタゾンのうちの少なくともいずれか1種が添加されていることが好ましい。
培地中に、上記のような細胞を維持するために必要な物質を添加しておくことにより、細胞の増殖性を促進し、3次元培養を効率的に行うことができる。
培地中に、上記のような細胞を維持するために必要な物質を添加しておくことにより、細胞の増殖性を促進し、3次元培養を効率的に行うことができる。
同様の観点から、前記多孔体内部には、培地を浸透させる前に、多孔体に形成された貫通孔からの注入により、細胞増殖因子を担持させることが好ましい。
上述したとおり、本発明に係るリン酸カルシウム系細胞培養担体を用いれば、細胞の侵入性や培地の浸透性が改善され、培養担体の内部においても、細胞の増殖性を活発化させることができる。
したがって、上記培養担体を用いた本発明に係る細胞培養方法によれば、細胞を3次元的に効率的に増殖させ、かつ、高い生存率で自己組織を形成することが可能となり、生体組織の再生治療への応用に貢献し得るものである。
したがって、上記培養担体を用いた本発明に係る細胞培養方法によれば、細胞を3次元的に効率的に増殖させ、かつ、高い生存率で自己組織を形成することが可能となり、生体組織の再生治療への応用に貢献し得るものである。
以下、本発明についてより詳細に説明する。
本発明に係るリン酸カルシウム系細胞培養担体は、所定の多孔質構造を有するリン酸カルシウム系セラミックス多孔体からなり、所定の貫通孔が形成されているものである。
すなわち、本発明に係る細胞培養担体は、リン酸カルシウム系セラミックス多孔体において、気孔径や連通部径を制御し、また、該多孔体に貫通孔を形成したものであり、これにより、細胞の侵入性や培地の浸透性の改善を図ったものである。
ここで、連通部とは、隣り合う略球状の気孔同士が接触して開口した部分をいう。
本発明に係るリン酸カルシウム系細胞培養担体は、所定の多孔質構造を有するリン酸カルシウム系セラミックス多孔体からなり、所定の貫通孔が形成されているものである。
すなわち、本発明に係る細胞培養担体は、リン酸カルシウム系セラミックス多孔体において、気孔径や連通部径を制御し、また、該多孔体に貫通孔を形成したものであり、これにより、細胞の侵入性や培地の浸透性の改善を図ったものである。
ここで、連通部とは、隣り合う略球状の気孔同士が接触して開口した部分をいう。
本発明においては、前記リン酸カルシウム系セラミックス多孔体は、ハイドロキシアパタイト(HAp)もしくはリン酸三カルシウム(β−TCP)または両者の混合物からなることが好ましい。
HApおよびβ−TCPはいずれも、生体親和性、生体適合性に優れており、細胞の足場としても好適である。
HApおよびβ−TCPはいずれも、生体親和性、生体適合性に優れており、細胞の足場としても好適である。
前記多孔体の多孔質構造は、複数の球状の気孔が全体にわたって連通しており、気孔率が60%以上80%以下、平均気孔径が100μm以上400μm以下、各気孔間の連通部の径が10μm以上100μm以下であることが好ましい。
上記のように、気孔が内部から表面まで全体に連通して存在していることにより、細胞が多孔体の内部にまで侵入しやすく、また、培地も浸透しやすくなる。また、該多孔体内で増殖した細胞にも、細胞増殖因子や栄養分を効率的に供給することができる。
なお、前記気孔率は、多孔体の密度と理論密度から導くことができる。また、平均気孔径は、特許第3400740号公報に記載の樹脂封埋による方法で求められ、連通孔径は、水銀圧入法により求めることができる。
上記のように、気孔が内部から表面まで全体に連通して存在していることにより、細胞が多孔体の内部にまで侵入しやすく、また、培地も浸透しやすくなる。また、該多孔体内で増殖した細胞にも、細胞増殖因子や栄養分を効率的に供給することができる。
なお、前記気孔率は、多孔体の密度と理論密度から導くことができる。また、平均気孔径は、特許第3400740号公報に記載の樹脂封埋による方法で求められ、連通孔径は、水銀圧入法により求めることができる。
前記セラミックス多孔体の気孔率が60%未満である場合、また、平均気孔径が100μm未満である場合、細胞や培地が容易に侵入できるような連通孔を得ることが難しい。
一方、前記気孔率が80%を超える場合、また、平均気孔径が400μmを超える場合、多孔体内部に侵入した細胞が流出しやすく、多孔体上に定着し難くなるとともに、培養担体の強度が不十分となる。
前記気孔率は65%以上75%以下であり、また、平均気孔径は150μm以上300μm以下であることがより好ましい。
一方、前記気孔率が80%を超える場合、また、平均気孔径が400μmを超える場合、多孔体内部に侵入した細胞が流出しやすく、多孔体上に定着し難くなるとともに、培養担体の強度が不十分となる。
前記気孔率は65%以上75%以下であり、また、平均気孔径は150μm以上300μm以下であることがより好ましい。
また、前記セラミックス多孔体の各気孔間の連通部の径が10μm未満である場合、細胞を培養する担体の連通性が不十分であり、培地に供給した細胞増殖因子や栄養分等が、十分に細胞に行き渡らず、担体内部の細胞が死滅したり、増殖が不十分となる場合がある。
一方、前記径が100μmを超える場合、多孔体内部に侵入した細胞が流出しやすく、多孔体上に定着し難くなる。
前記連通部径は30μm以上80μm以下であることがより好ましい。
一方、前記径が100μmを超える場合、多孔体内部に侵入した細胞が流出しやすく、多孔体上に定着し難くなる。
前記連通部径は30μm以上80μm以下であることがより好ましい。
なお、上記のようなセラミックス多孔体は、スポンジ状の有機多孔体にスラリーを塗布して有機多孔体を焼き抜くセラミックフォームや、スラリーを撹拌起泡して焼結する特許第3400740号に記載されている方法等によって得ることができるが、後者の方法により得ることがより好ましい。
前記多孔体に形成される貫通孔は、直径100μm以上1000μm以下であり、3mm以上5mm以下の間隔であることが好ましい。
この貫通孔により、細胞播種時における細胞の侵入および細胞培養時における培地の浸透性を促進することができ、さらに、多孔体内部に、細胞懸濁液、培地および細胞増殖因子等をシリンジ等を用いて注入することも可能となる。
この貫通孔により、細胞播種時における細胞の侵入および細胞培養時における培地の浸透性を促進することができ、さらに、多孔体内部に、細胞懸濁液、培地および細胞増殖因子等をシリンジ等を用いて注入することも可能となる。
前記貫通孔は、直径100μm未満の貫通孔を形成することは困難である一方、直径100μmを超える場合は、多孔体の強度を十分に保つことが困難となる。
前記貫通孔の直径は、250μm以上750μm以下であることがより好ましい。
また、貫通孔の間隔は、細胞の侵入および培地の浸透性の観点および多孔体の強度保持の観点から、上記範囲内であることが好ましく、その配置は、平行または交差状のいずれでもよく、多孔体の形状に応じて、適宜定めることができる。
前記貫通孔の直径は、250μm以上750μm以下であることがより好ましい。
また、貫通孔の間隔は、細胞の侵入および培地の浸透性の観点および多孔体の強度保持の観点から、上記範囲内であることが好ましく、その配置は、平行または交差状のいずれでもよく、多孔体の形状に応じて、適宜定めることができる。
前記セラミックス多孔体は、表面部における気孔率が75%以上80%以下、平均気孔径が300μm以上400μm以下、連通部径が50μm以上80μm以下であり、内部から表面に向かって気孔径および連通部径が増大する傾斜構造を有していることが好ましい。
ここでいう表面部とは、多孔体の表面から深さ1〜5mm程度の範囲内の部分を指す。
このような多孔体における気孔径および連通部径の傾斜構造は、例えば、セラミックス多孔体作製時において、成形後、焼成する前に減圧状態とすることにより、容易に形成することができる。
このような傾斜構造を有する多孔体とすることにより、細胞の侵入および細胞培養時における培地の浸透性をより促進することができる。
ここでいう表面部とは、多孔体の表面から深さ1〜5mm程度の範囲内の部分を指す。
このような多孔体における気孔径および連通部径の傾斜構造は、例えば、セラミックス多孔体作製時において、成形後、焼成する前に減圧状態とすることにより、容易に形成することができる。
このような傾斜構造を有する多孔体とすることにより、細胞の侵入および細胞培養時における培地の浸透性をより促進することができる。
上記のような多孔体からなる細胞培養担体を用いることにより、該多孔体の浸漬または前記多孔体に形成された貫通孔からの注入により、培地を多孔体内部まで容易に浸透させることができる。
このように、培地が培養担体の内部にまで行き渡らせておくことにより、細胞播種時における細胞の侵入が促進され、細胞の接着性を高めることができる。
このように、培地が培養担体の内部にまで行き渡らせておくことにより、細胞播種時における細胞の侵入が促進され、細胞の接着性を高めることができる。
本発明に係る培養担体を適用する細胞としては、間葉系幹細胞が好ましい。
また、上記のような細胞の培養に用いられる培地は、特に限定されるものではなく、培養する細胞に応じて、適宜選択することができる。例えば、MEM、α−MEM、DMEM、イーグル培地等が好適に用いられる。
これらの培地には、さらに、FBS(fetal bovine serum;ウシ胎児血清)、アスコルビン酸、ストレプトマイシン、β−グリセロリン酸、デキサメタゾン、その他の抗生物質等の細胞を維持するために必要な物質を添加しておくことが好ましい。
培地中に、血清の他、上記のような種々の物質を添加することにより、細胞の増殖性を促進し、3次元培養を効率的に行うことができる。
また、上記のような細胞の培養に用いられる培地は、特に限定されるものではなく、培養する細胞に応じて、適宜選択することができる。例えば、MEM、α−MEM、DMEM、イーグル培地等が好適に用いられる。
これらの培地には、さらに、FBS(fetal bovine serum;ウシ胎児血清)、アスコルビン酸、ストレプトマイシン、β−グリセロリン酸、デキサメタゾン、その他の抗生物質等の細胞を維持するために必要な物質を添加しておくことが好ましい。
培地中に、血清の他、上記のような種々の物質を添加することにより、細胞の増殖性を促進し、3次元培養を効率的に行うことができる。
さらにまた、前記多孔体内部には、培地を浸透させる前に、多孔体に形成された貫通孔からの注入により、細胞増殖因子を担持させておくことが好ましい。
該多孔体に担持させる細胞増殖因子の種類としては、例えば、骨芽細胞の増殖を目的とする場合には、BMP(骨形成因子)、FGF(線維芽細胞成長因子)、TGF−β(トランスフォーミング成長因子)、IGF(インスリン成長因子)、b−FGF(塩基性線維芽細胞成長因子)等、骨形成に寄与する細胞増殖因子を用いることが好ましい。
なお、これらの細胞増殖因子は、水溶液として添加してもよいが、拡散時間の制御の観点から、コラーゲン粒子等に担持させたものも混合して用いることが好ましい。
該多孔体に担持させる細胞増殖因子の種類としては、例えば、骨芽細胞の増殖を目的とする場合には、BMP(骨形成因子)、FGF(線維芽細胞成長因子)、TGF−β(トランスフォーミング成長因子)、IGF(インスリン成長因子)、b−FGF(塩基性線維芽細胞成長因子)等、骨形成に寄与する細胞増殖因子を用いることが好ましい。
なお、これらの細胞増殖因子は、水溶液として添加してもよいが、拡散時間の制御の観点から、コラーゲン粒子等に担持させたものも混合して用いることが好ましい。
以下、本発明を実施例に基づいてさらに具体的に説明するが、本発明は、下記実施例により制限されるものではない。
[実施例1]
セラミックス原料として平均粒径1μmのHAp原料粉末400.00gに、分散媒として15wt%ポリエチレンイミン水溶液327.27gを加え、ボールミルで48時間撹拌混合して原料スラリーを調製した。
この原料スラリー600.00gに、起泡剤としてポリオキシエチレンラウリルエーテル1.20gを添加して撹拌し、泡沫状スラリーとした。
さらに、架橋剤としてソルビトールポリグリシジルエーテル11.74gを添加し、混合後、型に鋳込み、ゲル化体を得た。
得られたゲル化体を減圧し、硬化後、型から取り出し、30℃、湿度90%の加湿乾燥器内で一昼夜乾燥させ、成形体(乾燥体)を得た。
この成形体を、1200℃で1時間焼成して、焼結体を得た。
得られた焼結体に、直径500μmの貫通孔を5mm間隔で開けた後、直径13mm、高さ3mmの円柱状に加工し、培養担体とした。
この培養担体の気孔率は表面部が約80%、内部が約72%、平均気孔径は330μm、連通部径は約60μmであった。
[実施例1]
セラミックス原料として平均粒径1μmのHAp原料粉末400.00gに、分散媒として15wt%ポリエチレンイミン水溶液327.27gを加え、ボールミルで48時間撹拌混合して原料スラリーを調製した。
この原料スラリー600.00gに、起泡剤としてポリオキシエチレンラウリルエーテル1.20gを添加して撹拌し、泡沫状スラリーとした。
さらに、架橋剤としてソルビトールポリグリシジルエーテル11.74gを添加し、混合後、型に鋳込み、ゲル化体を得た。
得られたゲル化体を減圧し、硬化後、型から取り出し、30℃、湿度90%の加湿乾燥器内で一昼夜乾燥させ、成形体(乾燥体)を得た。
この成形体を、1200℃で1時間焼成して、焼結体を得た。
得られた焼結体に、直径500μmの貫通孔を5mm間隔で開けた後、直径13mm、高さ3mmの円柱状に加工し、培養担体とした。
この培養担体の気孔率は表面部が約80%、内部が約72%、平均気孔径は330μm、連通部径は約60μmであった。
培養実験は、12穴の細胞培養用ポリスチレンプレートを用い、播種する細胞は新生児C57BL/6 マウス頭蓋冠由来の骨芽細胞様樹立株MC3T3−E1、培地はFBSを10vol%添加したα−MEM(以下、α−MEM(+)培地という。)を用いた。以下の比較例1〜3においても同様である。
細胞播種前日に、前記培養担体(多孔体)の貫通孔からシリンジを用いて、リン酸緩衝液に溶解した増殖因子rhBMP−2を注入し、多孔体内部に担持させた後、該多孔体をα−MEM(+)培地に浸漬した。
次に、前記多孔体上に、細胞密度3×104個/cm3の細胞懸濁液2cm3を播種し、5%CO2インキュベータ内で37℃で培養を行った。
1日おきに培地交換を行い、培地の一部は、前記貫通孔からシリンジを用いて注入し、多孔体内部にも新しい培地を供給した。この培養期間中の培地には、10vol%FBSの他、50μg/mlアスコルビン酸、50μg/mlストレプトマイシン、10mMβ−グリセロリン酸および1×10-8Mデキサメタゾンを添加したものを用いた。
なお、培養担体を用いず、12穴の細胞培養用ポリスチレンプレートに直接培地を供給し、培養したものを、対照のための標準試料とした。
培養した細胞について、増殖性および形態をSEM観察し、また、ALP活性(Bessey−Lowry法)の評価を行った。
次に、前記多孔体上に、細胞密度3×104個/cm3の細胞懸濁液2cm3を播種し、5%CO2インキュベータ内で37℃で培養を行った。
1日おきに培地交換を行い、培地の一部は、前記貫通孔からシリンジを用いて注入し、多孔体内部にも新しい培地を供給した。この培養期間中の培地には、10vol%FBSの他、50μg/mlアスコルビン酸、50μg/mlストレプトマイシン、10mMβ−グリセロリン酸および1×10-8Mデキサメタゾンを添加したものを用いた。
なお、培養担体を用いず、12穴の細胞培養用ポリスチレンプレートに直接培地を供給し、培養したものを、対照のための標準試料とした。
培養した細胞について、増殖性および形態をSEM観察し、また、ALP活性(Bessey−Lowry法)の評価を行った。
培養1,3,5,7日目の細胞増殖性を調べたところ、培養担体(多孔体)用いた場合においても、標準試料と同様の良好な増殖性を示し、経時的に細胞数が増加していることが認められた。
また、培養1日目で、多孔体表面だけでなく、内部にも細胞が接着し、伸展している様子が観察された。
培養7日目には、細胞が多孔体表面を覆い、コンフルエントに達し、多孔体内部でも細胞が増殖している様子が観察された。
また、培養1日目で、多孔体表面だけでなく、内部にも細胞が接着し、伸展している様子が観察された。
培養7日目には、細胞が多孔体表面を覆い、コンフルエントに達し、多孔体内部でも細胞が増殖している様子が観察された。
培養14,21日目の単位DNA量当たりのALP活性は、培養担体を用いた場合の方が、標準試料よりも有意に高かった。標準試料においては、2次元培養であるのに対して、培養担体を用いた場合には、気孔の内部まで細胞が侵入し、多孔体内部においても細胞が増殖し、3次元培養が行われたためであると考えられる。
また、培養14日目の方が、21日目よりも高かったが、これは、21日目には骨芽細胞の分化が進み、ALP活性が低下し始めたためであると考えられる。
また、培養14日目の方が、21日目よりも高かったが、これは、21日目には骨芽細胞の分化が進み、ALP活性が低下し始めたためであると考えられる。
[実施例2]
実施例1と同様にして得られた培養担体(多孔体)に、細胞播種前日に、シリンジを用いて、貫通孔からα−MEM(+)培地を注入した。
実施例2および比較例1のように減圧することなく、多孔体全体に培地を容易に浸透させることができた。
次に、前記多孔体上に、細胞密度3×104個/cm3の細胞懸濁液2cm3を播種し、37℃で5%CO2インキュベータ内で培養を行った。
細胞培養、培地交換、培養した細胞についての観察および評価は、実施例1と同様にして行った。この培養期間中の培地には、α−MEM(+)培地を用いた。
実施例1と同様にして得られた培養担体(多孔体)に、細胞播種前日に、シリンジを用いて、貫通孔からα−MEM(+)培地を注入した。
実施例2および比較例1のように減圧することなく、多孔体全体に培地を容易に浸透させることができた。
次に、前記多孔体上に、細胞密度3×104個/cm3の細胞懸濁液2cm3を播種し、37℃で5%CO2インキュベータ内で培養を行った。
細胞培養、培地交換、培養した細胞についての観察および評価は、実施例1と同様にして行った。この培養期間中の培地には、α−MEM(+)培地を用いた。
培養1,3,5,7日目における細胞増殖性を調べたところ、培養担体(多孔体)用いた場合においても、標準試料と同様の良好な増殖性を示し、また、多孔体内部でも細胞が増殖している様子が観察され、その数は、実施例1と比較すると、全体として約4/5であった。
また、培養14,21日目の単位DNA量当たりのALP活性は、培養担体(多孔体)用いた場合の方が、標準試料よりも高かったが、いずれにおいても、21日目の方が、14日目よりも高く、実施例1よりも全体的に70%程度であった。実施例1において用いられた細胞増殖因子や培地への各種添加物質が、細胞を活性化させ、細胞の分化を促進する効果を有していることによると考えられる。
また、培養14,21日目の単位DNA量当たりのALP活性は、培養担体(多孔体)用いた場合の方が、標準試料よりも高かったが、いずれにおいても、21日目の方が、14日目よりも高く、実施例1よりも全体的に70%程度であった。実施例1において用いられた細胞増殖因子や培地への各種添加物質が、細胞を活性化させ、細胞の分化を促進する効果を有していることによると考えられる。
[比較例1]
実施例1と同様にして得られた焼結体に、貫通孔を形成せずに、直径13mm、高さ3mmの円柱状に加工し、培養担体(多孔体)とした。
細胞播種前日に、前記多孔体をα−MEM(+)培地に浸漬したところ、培地が多孔体表面に溜まり、多孔体内部にまで浸透し難かった。
このため、12穴プレートに多孔体を入れて、培地を満たした状態のまま減圧し、多孔体内部にまで培地を浸透させたところ、実施例2に比べて、容易に浸透させることができた。
細胞培養、培地交換、培養した細胞についての観察および評価は、実施例1と同様にして行った。この培養期間中の培地には、α−MEM(+)培地を用いた。
実施例1と同様にして得られた焼結体に、貫通孔を形成せずに、直径13mm、高さ3mmの円柱状に加工し、培養担体(多孔体)とした。
細胞播種前日に、前記多孔体をα−MEM(+)培地に浸漬したところ、培地が多孔体表面に溜まり、多孔体内部にまで浸透し難かった。
このため、12穴プレートに多孔体を入れて、培地を満たした状態のまま減圧し、多孔体内部にまで培地を浸透させたところ、実施例2に比べて、容易に浸透させることができた。
細胞培養、培地交換、培養した細胞についての観察および評価は、実施例1と同様にして行った。この培養期間中の培地には、α−MEM(+)培地を用いた。
培養1,3,5,7日目における細胞増殖性を調べたところ、培養担体(多孔体)用いた場合においても、標準試料と同様の良好な増殖性を示し、経時的に細胞数が増加していることが認められた。
また、培養1日目に、多孔体内部にも細胞が侵入し、培養7日目には、内部においても細胞が増殖している様子が観察されたが、その数は、実施例1と比較すると、全体として約3/5であった。
このことから、培養担体に貫通孔が形成されている場合(実施例2)の方が、貫通孔が形成されていない場合(比較例1)よりも、内部にまで培地や細胞が侵入しやすく、内部でもより細胞が増殖しやすいと言える。
また、培養1日目に、多孔体内部にも細胞が侵入し、培養7日目には、内部においても細胞が増殖している様子が観察されたが、その数は、実施例1と比較すると、全体として約3/5であった。
このことから、培養担体に貫通孔が形成されている場合(実施例2)の方が、貫通孔が形成されていない場合(比較例1)よりも、内部にまで培地や細胞が侵入しやすく、内部でもより細胞が増殖しやすいと言える。
[比較例2]
実施例1と同様にして得られたゲル化体を、減圧せずに、均一な気孔構造を有する成形体を作製した。この成形体を、実施例1と同様にして焼成し、得られた焼結体には貫通孔を形成せずに、直径13mm、高さ3mmの円柱状に加工し、培養担体(多孔体)とした。
細胞播種前日に、前記多孔体をα−MEM(+)培地に浸漬したところ、培地は、多孔体表面に溜まり、多孔体内部にまで浸透し難かった。
このため、12穴プレートに多孔体を入れて、培地を満たした状態のまま減圧して、多孔体内部まで培地を浸透させた。
次に、前記多孔体上に、細胞密度3×104個/cm3の細胞懸濁液2cm3を播種し、5%CO2インキュベータ内で37℃で培養を行った。
1日おきに培地交換を行い、培養した細胞について、実施例1と同様にして、観察および評価を行った。この培養期間中の培地には、α−MEM(+)培地を用いた。
実施例1と同様にして得られたゲル化体を、減圧せずに、均一な気孔構造を有する成形体を作製した。この成形体を、実施例1と同様にして焼成し、得られた焼結体には貫通孔を形成せずに、直径13mm、高さ3mmの円柱状に加工し、培養担体(多孔体)とした。
細胞播種前日に、前記多孔体をα−MEM(+)培地に浸漬したところ、培地は、多孔体表面に溜まり、多孔体内部にまで浸透し難かった。
このため、12穴プレートに多孔体を入れて、培地を満たした状態のまま減圧して、多孔体内部まで培地を浸透させた。
次に、前記多孔体上に、細胞密度3×104個/cm3の細胞懸濁液2cm3を播種し、5%CO2インキュベータ内で37℃で培養を行った。
1日おきに培地交換を行い、培養した細胞について、実施例1と同様にして、観察および評価を行った。この培養期間中の培地には、α−MEM(+)培地を用いた。
培養1,3,5,7日目における細胞増殖性を調べたところ、培養担体(多孔体)用いた場合においても、標準試料と同様の良好な増殖性を示し、経時的に細胞数が増加していることが認められたが、多孔体の表面付近に細胞が密集しており、細胞数は、培養7日目においても、多孔体の内部(深部)では少なく、実施例1と比較すると、全体として約1/2であった。
このことから、均一な気孔構造の多孔体は、内部にまで培地や細胞が侵入し難く、3次元培養は困難であると言える。
このことから、均一な気孔構造の多孔体は、内部にまで培地や細胞が侵入し難く、3次元培養は困難であると言える。
Claims (5)
- 複数の球状の気孔が全体にわたって連通した多孔質構造を有し、気孔率が60%以上80%以下、平均気孔径が100μm以上400μm以下、各気孔間の連通部の径が10μm以上100μm以下の多孔体からなり、前記多孔体は、ハイドロキシアパタイトまたは/およびリン酸三カルシウムからなるリン酸カルシウム系セラミックス多孔体であり、直径100μm以上1000μm以下の貫通孔が3mm以上5mm以下の間隔で形成されていることを特徴とするリン酸カルシウム系細胞培養担体。
- 前記セラミックス多孔体は、表面部における気孔率が75%以上80%以下、平均気孔径が300μm以上400μm以下、連通部径が50μm以上80μm以下であり、内部から表面に向かって気孔径および連通部径が増大する傾斜構造を有していることを特徴とする請求項1記載のリン酸カルシウム系細胞培養担体。
- 請求項1または請求項2に記載の細胞培養担体を用いる細胞培養方法であって、前記多孔体の浸漬または前記多孔体に形成された貫通孔からの注入により、培地を多孔体内部まで浸透させた後、細胞を播種することを特徴とする細胞培養方法。
- 前記培地には、FBS、アスコルビン酸、ストレプトマイシン、β−グリセロリン酸およびデキサメタゾンのうちの少なくともいずれか1種が添加されていることを特徴とする請求項3記載の細胞培養方法。
- 前記多孔体内部には、培地を浸透させる前に、多孔体に形成された貫通孔からの注入により、細胞増殖因子を担持させることを特徴とする請求項3または請求項4記載の細胞培養方法。
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JP2008306987A (ja) * | 2007-06-15 | 2008-12-25 | Covalent Materials Corp | 細胞培養担体および細胞の培養方法 |
JP2011190843A (ja) * | 2010-03-12 | 2011-09-29 | Toto Ltd | セラミック管部材 |
JP2013208086A (ja) * | 2012-03-30 | 2013-10-10 | Covalent Materials Corp | 細胞培養担体 |
US9096826B2 (en) | 2005-11-22 | 2015-08-04 | Covalent Materials Corporation | Culture substrate and culture method for undifferentiated cell and undifferentiated cultured cell |
US9428728B2 (en) | 2006-11-21 | 2016-08-30 | Coorstek Kk | Carrier for undifferentiated cell culture and subculture method thereof |
CN109749119A (zh) * | 2019-01-31 | 2019-05-14 | 济南大学 | 聚乳酸-羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球材料及应用 |
CN114981403A (zh) * | 2020-03-19 | 2022-08-30 | 国峯工业株式会社 | 球状体形成促进剂 |
-
2006
- 2006-02-07 JP JP2006029136A patent/JP2007209203A/ja not_active Withdrawn
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9096826B2 (en) | 2005-11-22 | 2015-08-04 | Covalent Materials Corporation | Culture substrate and culture method for undifferentiated cell and undifferentiated cultured cell |
US9428728B2 (en) | 2006-11-21 | 2016-08-30 | Coorstek Kk | Carrier for undifferentiated cell culture and subculture method thereof |
JP2008306987A (ja) * | 2007-06-15 | 2008-12-25 | Covalent Materials Corp | 細胞培養担体および細胞の培養方法 |
JP2011190843A (ja) * | 2010-03-12 | 2011-09-29 | Toto Ltd | セラミック管部材 |
JP2013208086A (ja) * | 2012-03-30 | 2013-10-10 | Covalent Materials Corp | 細胞培養担体 |
CN109749119A (zh) * | 2019-01-31 | 2019-05-14 | 济南大学 | 聚乳酸-羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球材料及应用 |
CN109749119B (zh) * | 2019-01-31 | 2021-11-02 | 济南大学 | 聚乳酸-羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球材料及应用 |
CN114981403A (zh) * | 2020-03-19 | 2022-08-30 | 国峯工业株式会社 | 球状体形成促进剂 |
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