CN103320533A - 一种hpv dna基因分型的方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种HPV DNA基因分型的方法及其试剂盒。本发明所提供的方法可对46种HPV的DNA进行分型，具有操作简单，经济实用，快速高效，结合芯片毛细管电泳检测可高通量分析HPV DNA类型；在医学领域的应用中，结合现有的薄层液基细胞形态诊断，有助于宫颈癌的早期防治、预后及针对性基因疫苗的研制，因可检测多种型别和发现未知型别的特点尤其适用于研究HPV有关疾病如喉咽癌，头颈癌等的发病机制和流行病学的调查研究。

Description

一种HPV DNA基因分型的方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及一种HPV DNA基因分型的方法及其试剂盒。

背景技术

宫颈癌已经成为世界范围内威胁女性健康的主要问题之一。据统计，每年大约有231,000的女性死于宫颈癌，其中，超过80%的新增病例发生在发展中国家。导致宫颈癌的主要病因是感染人乳头状瘤病毒(简称HPV)。有大约99.7%的宫颈癌病例都被检出携带HPV DNA，其中尤以16,18,31,45型最为常见。HPV从其致病程度上可分为四类，分别是高危型（16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58和59型），可能高危型（26,53,66,68,73和82型），低危型（6,11,13,40,42,43,44,54,61,70,72,81和89型），以及未明确型（30,32,34,62,67,69,71,74,83,84,85,86,87,90,91型等）。其中，高危型因其易致宫颈癌发生而受到关注，而低危型尤其是6和11型易致尖锐湿疣等病变。HPV感染型存在多样性和地区差别。世界癌症组织的多中心研究提示，包含7种最常见型的疫苗可以保护世界上87%的患者。因此对HPV类型进行分型研究对于研究HPV相关疾病的发病机制，流行病学调查，判断宫颈癌病变风险，确定治疗方案，评价治疗效果和研究疫苗上都有重要价值。

目前，常用的HPV DNA检测的方法主要分为目标放大和信号放大。前者的最广泛的应用即是第二代杂交捕获法。后者则主要是基于PCR的方法，包括DNA直接测序法，DNA杂交法，PCR-RFLP法，反向线性杂交法等，这类方法灵敏度高，检测限可低至10到100个目标分子。酶联免疫和反向线性杂交等检测方法所需仪器和操作简单，但需要特异性的探针，成本相对昂贵，且有的不能检测出具体类型，或者只能检测出已知类型，不能达到良好的预测其致病程度的作用。相比之下，PCR-RFLP的方法具有可以检测出已知具体类型和未知类型的优势，有助于研究发病机制和流行病学的调查。

目前，对RFLP的检测方法多是基于不同长度FLP具有不同的大小，在筛分介质中具有不同的迁移时间而得以分离。最常用的筛分介质尤以琼脂糖或者聚丙烯酰胺为主。这种传统的凝胶电泳的方法操作繁琐，耗时，难以实现高通量和自动化。且对结果的分析，此种方法多用紫外检验荧光信号，灵敏度不高，再者因操作不当或条件控制不好致使条带的模糊或者弥散容易导致误差。

毛细管电泳法灵敏度高，可以实现对DNA的自动分离分析，并且自动收集检测峰信号，对核酸的分离分析十分适合。但传统的毛细管电泳仪器较大，且检测耗时较长，结果稳定性受环境影响也较大。近年来，核酸的芯片毛细管电泳以其微量快速自动化的特点成为核酸、蛋白质等生物分子毛细管电泳分析的发展趋势。芯片毛细管电泳又称毛细管芯片电泳或芯片电泳，该仪器以芯片为载体，毛细管为上样分离通道，使用聚合物溶液为无胶筛分介质对分析物质进行无胶筛分电泳，与常规的凝胶电泳不同在于，可对分析物质采用在线荧光标记激光诱导荧光检测，因芯片载体小，通道短，具有分析时间短，自动化程度高和分析通量大等优势。

发明内容

本发明的目的是提供一种HPV DNA基因分型检测方法及其试剂盒。

所述方法为一种鉴定或辅助鉴定HPV DNA基因型的方法，包括如下步骤：

1）取待测DNA，用引物组X进行PCR扩增，若扩增产物中存在449bp-458bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有HPV DNA的DNA；若扩增产物中不存在449bp-458bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为不含有HPV DNA的DNA；

所述引物组X由上游引物和下游引物组成；

所述上游引物由引物PGMY11-A、PGMY11-B、PGMY11-C、PGMY11-D和PGMY11-E中的五种、任意四种、任意三种、任意两种或任一种组成；

所述下游引物由引物PGMY09-F、PGMY09-G、PGMY09-H、PGMY09-I、PGMY09-J、PGMY09-K、PGMY09-L、PGMY09-M、PGMY09-N、PGMY09-P、PGMY09-Q、PGMY09-R和HMB01组成；

所述引物PGMY11-A、PGMY11-B、PGMY11-C、PGMY11-D和PGMY11-E分别为序列表序列1、2、3、4和5所示的单链DNA；

所述引物PGMY09-F、PGMY09-G、PGMY09-H、PGMY09-I、PGMY09-J、PGMY09-K、PGMY09-L、PGMY09-M、PGMY09-N、PGMY09-P、PGMY09-Q、PGMY09-R和HMB01分别为序列表序列6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18所示的单链DNA；

2）将步骤1）候选为含有HPV DNA的DNA经所述PCR扩增获得的所述449bp-458bp的DNA片段用Rsa Ⅰ酶切，获得酶切产物a；

A）若所述酶切产物a中存在135bp、125bp、85bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有18型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中存在138bp、125bp、117bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有54型HPV DNA的DNA；

B）若所述酶切产物a中存在216bp、161bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有32型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中存在221bp、161bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有44型HPV DNA的DNA；

C）若所述酶切产物a中存在365bp、72bp和18bp的DNA片段，或365bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有26、69和72型HPV DNA中至少一种的DNA；

若所述酶切产物a中存在359bp、72bp和18bp的DNA片段，或359bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有62型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中存在365bp和90bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有40型HPV DNA的DNA；

D）若所述酶切产物a中存在201bp、161bp和96bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有73型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中存在186bp、161bp、96bp和15bp的DNA片段，或186bp、161bp和96bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有34型HPV DNA的DNA；

E）若所述酶切产物a中存在310bp和70bp—73bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有16、82、67和56型HPV DNA中至少一种的DNA；若所述酶切产物a中还存在49bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有56型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中存在310bp和142bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有84型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中存在338bp、72bp和48bp的DNA片段，或338bp和72bp的DNA片段则将所述待测DNA候选为含有45型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中存在332bp、72bp和45bp的DNA片段，或332bp和72bp的DNA片段则将所述待测DNA候选为含有43型HPV DNA的DNA；

F）若所述酶切产物a中存在449—455bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有52、91、53、30、66、59和81型HPV DNA中至少一种的DNA；

G）若所述酶切产物a中存在236bp、102bp、72bp和39bp的DNA片段，或236bp、102bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有33型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中存在242bp、135bp、72bp和26bp的DNA片段，或242bp、135bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有42型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中存在216bp、135bp、72bp和26bp的DNA片段，或216bp、135bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有11型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中存在231bp、123bp、72bp和29bp的DNA片段，或231bp、123bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有70型HPV DNA的DNA；

H）若所述酶切产物a中存在380—383bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有31、85、89、51、87、83、71和86型HPV DNA中至少一种；

I）若所述酶切产物a中存在171bp、161bp、72bp和42bp的DNA片段，或171bp、161bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有35型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中存在181bp、161bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有64型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中存在165bp、161bp、72bp和57bp的DNA片段，或165bp、161bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有55型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中存在185bp、180bp、72bp和18bp的DNA片段，或185bp、180bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有61型HPV DNA的DNA；

J）若所述酶切产物a中存在260bp、123bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有39型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中存在260bp、85bp、72bp和38bp的DNA片段，或260bp、85bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有68型HPV DNA的DNA；

K）若所述酶切产物a中存在161bp、149bp、72bp和67bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有6型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中存在175bp、135bp和73bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有13型HPV DNA的DNA；

L)若所述酶切产物a中存在306bp、111bp和32bp的DNA片段,或存在306bp和111bp的DNA片段,则将所述待测DNA候选为含有58型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中的DNA片段大小不符合上述A）—L）中任一种时，则将所述待测DNA候选为不含有所述6、11、13、16、18、26、30、31、32、33、34、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、55、56、58、59、61、62、64、66、67、68、69、70、71、72、73、81、82、83、84、85、86、89、87、91型HPV DNA中任一种的DNA；所述方法为非疾病诊断治疗方法。

在上述方法中，所述步骤2）后，还包括如下步骤3）：

A-1）将步骤2）的所述A）中候选为含有18和54型HPV DNA中至少一种的待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在455bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有18型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在217bp、127bp和108bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有54型HPV DNA的DNA；

或，将步骤2）的所述A）中候选为含有18和54型HPV DNA中至少一种的待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用Pst Ⅰ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在452bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有54型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在242bp和213bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有18型HPV DNA的DNA；

B-1）将步骤2）的所述B）中候选为含有32和44型HPV DNA中至少一种的待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在317bp、124bp和8bp的DNA片段，或317bp和124bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有32型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在223bp、124bp和108bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有44型HPV DNA的DNA；

C-1）将步骤2）的所述C）中候选为含有26、62、69、40和72型HPV DNA中至少一种的待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在455bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有26型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在232bp和217bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有62型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在223bp、183bp和49bp的DNA片段，或223bp和183bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有69型HPVDNA的DNA；若该酶切产物中存在447bp和8bp的DNA片段，或447bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有40型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在220bp、211bp和24bp的DNA片段，或220bp和211bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有72型HPV DNA的DNA；

或，将步骤2）的所述C）中候选为含有26、62、69、40和72型HPV DNA中至少一种的待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用DdeⅠ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在297bp—300bp和155—158bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有40和72型HPV DNA中至少一种的DNA；若该酶切产物中存在449—455bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有26、62和69型HPV DNA中至少一种的DNA；

D-1）将步骤2）的所述D）中候选为含有73和34型HPV DNA中至少一种的待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在458bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有73型HPVDNA的DNA；若该酶切产物中存在334bp和124bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有34型HPV DNA的DNA；

E-1）将步骤2）的所述E）中候选为含有16、82、67、56、84、45和43型HPV DNA中至少一种的待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449—458bp的DNA片段用DdeⅠ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在220bp、142bp和90bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有84型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在307bp、92bp和50bp的DNA片段，或307bp和92bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有67型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在447—455bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有16、82和43型HPV DNA中至少一种的DNA；若该酶切产物中存在324bp和131bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有45型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在307bp和142bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有56型HPV DNA的DNA；

F-1）将步骤2）的所述F）中候选为含有52、91、53、30、66、59和81型HPV DNA中至少一种的待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用Dde Ⅰ酶切，获得酶切产物f；或用Pst Ⅰ酶切，获得酶切产物g；

若该酶切产物f中存在206bp、158bp和85bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有53型HPV DNA的DNA；若该酶切产物f中存在357bp和92—98bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有52和91型HPV DNA中至少一种的DNA；若该酶切产物f中存在291bp和158bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有30和66型HPV DNA中至少一种的DNA；若该酶切产物f中存在452—455bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有59和81型HPV DNA中至少一种的DNA；

若该酶切产物g中存在341bp和111bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有81型HPV DNA的DNA；若该酶切产物g中存在423—426bp和26bp的DNA片段，或423—426bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有52和59型HPV DNA中至少一种的DNA；若该酶切产物g中存在449—455bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有53和91型HPV DNA中至少一种的DNA；若该酶切产物g中存在242bp和207bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有30型HPV DNA的DNA；若该酶切产物g中存在150bp、207bp、66bp和26bp的DNA片段，或150bp、207bp和66bp的DNA片段，或150bp和207bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有66型HPV DNA的DNA；

G-1）将步骤2）的所述G）中候选为含有33、42、11和70型HPV DNA中至少一种的待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用Dde Ⅰ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在320bp、77bp和52bp的DNA片段，或320bp和77bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有33型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在341bp和108bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有42型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在447—455bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有11和70型HPV DNA中至少一种的DNA；

H-1）将步骤2）的所述H）中候选为含有31、85、89、51、87、83、71和86型HPV DNA中至少一种的待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用Dde Ⅰ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在283bp和167bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有31型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在297bp和158bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有85型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在246bp、152bp和54bp的DNA片段，或246bp和152bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有89型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在362bp和90bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有51和87型HPV DNA中至少一种的DNA；若该酶切产物中存在452bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有83型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在310bp、125bp和17bp的DNA片段，或310bp和125bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有86型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在310bp和132bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有71型HPV DNA的DNA；

I-1）将步骤2）的所述I）中候选为含有35和64型HPV DNA中至少一种的待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用Dde Ⅰ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在294bp、135bp和23bp的DNA片段，或294bp和135bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有35型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在211bp、151bp、87bp和9bp的DNA片段，或存在211bp、151bp和87bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有64型HPV DNA的DNA；

和/或，将步骤2）的所述I）中候选为含有35和64型HPV DNA中至少一种的待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用Pst Ⅰ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在426bp和26bp的DNA片段，或426bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有35型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在253bp、179bp和26bp的DNA片段，或253bp和179bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有64型HPV DNA的DNA；

J-1）将步骤2）的所述J）中候选为含有39和68型HPV DNA中至少一种的待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用Dde Ⅰ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在324bp和131bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有39型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在455bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有68型HPV DNA的DNA；

K-1）将步骤2）的所述K）中候选为含有6和13型HPV DNA中至少一种的待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用Pst Ⅰ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在449bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有6型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在242bp和213bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有13型HPV DNA的DNA。

在上述方法中，所述步骤3）后，还包括如下步骤4）：

C-2）在步骤3）的C-1）中所述用Dde Ⅰ酶切后，

将所述候选为含有26、62和69型HPV DNA中至少一种的DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在455bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有26型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在232bp和217bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有62型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在223bp、183bp和49bp的DNA片段，或223bp和183bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有69型HPV DNA的DNA；

E-2）在步骤3）的E-1）中所述用DdeⅠ酶切后，

将所述待测DNA候选为含有16、82和43型HPV DNA中至少一种的DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在444—447bp和8bp的DNA片段，或存在444—447bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有16和82型HPV DNA中至少一种的DNA；若该酶切产物中存在331bp和118bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有43型HPV DNA的DNA；

将所述待测DNA候选为含有45和56型HPV DNA中至少一种的DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在447bp和8bp的DNA片段，或447bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有45型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在275bp、166bp和8bp的DNA片段，或275bp和166bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有56型HPV DNA的DNA；

F-2）在步骤3）的F-1）中所述用DdeⅠ酶切后，

将所述候选为含有52和91型HPV DNA中至少一种的所述待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在455bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有91型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在258bp、183bp和8bp的DNA片段，或258bp和183bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有52型HPV DNA的DNA；

将所述候选为含有30和66型HPV DNA中至少一种的所述待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在449bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有66型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在232bp和217bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有30型HPV DNA的DNA；

将所述候选为含有59和81型HPV DNA中至少一种的所述待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在396bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有59型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在127bp、121bp、108bp和96bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有81型HPV DNA的DNA；

在步骤3）的F-1）中所述用PstⅠ酶切后，

将所述候选为含有52和59型HPV DNA中至少一种的所述待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在396bp和56的DNA片段，或396bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有59型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在258bp、183bp和8bp的DNA片段，或258bp和183bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有52型HPV DNA的DNA；

将所述候选为含有53和91型HPV DNA中至少一种的所述待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在455bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有91型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在232bp和217bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有53型HPV DNA的DNA；

将所述候选为含有30和66型HPV DNA中至少一种的所述待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中含有449bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有66型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中含有232bp和217bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有30型HPV DNA的DNA；

G-2）在步骤3）的G-1）中所述用DdeⅠ酶切后，

将所述候选为含有11和70型HPV DNA中至少一种的所述待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中含有217bp、124bp和108bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有11型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中含有232bp、117bp和106bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有70型HPV DNA的DNA；

H-2）在步骤3）的H-1）中所述用DdeⅠ酶切后，

将所述候选为含有31、85和89型HPV DNA中至少一种的所述待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用PstⅠ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在216bp、210bp和26bp的DNA片段，或216bp和210bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有31型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在452—455bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有85和89型HPV DNA中至少一种的DNA；

将所述候选为含有51和87型HPV DNA中至少一种的所述待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在379bp和73bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有51型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在232bp、209bp、8bp和3bp的DNA片段，或232bp和209bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有87型HPV DNA的DNA；

或，将所述候选为含有51和87型HPV DNA中至少一种的所述待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用PstⅠ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在452bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有51型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在351bp和101bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有87型HPV DNA的DNA；

将所述候选为含有83型HPV DNA的所述待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用PstⅠ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在317bp和135bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有83型HPV DNA的DNA；

将所述候选为存在71和86型HPV DNA中至少一种的所述待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用PstⅠ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在360bp和92bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有71型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在317bp和135bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有86型HPV DNA的DNA。

在上述方法中，所述步骤4）后，还包括如下步骤5）：

在步骤4）的E-2）后，将所述候选为含有16和82型HPV DNA中至少一种的待测DNA用PstⅠ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在455bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有82型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在216bp、210bp和26bp的DNA片段，或216bp和210bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有16型HPV DNA的DNA；

在步骤4）的H-2）后，将所述候选为含有85和89型HPV DNA中至少一种的所述待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中含有455bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有85型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中含有325bp和127bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有89型HPV DNA的DNA。

在上述方法中，若步骤2）中所述酶切产物a中存在135bp、125bp、85bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有18型HPV DNA的DNA；

若步骤2）中所述酶切产物a中存在310bp、70bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有16型HPV DNA的DNA；

为了进一步地验证所述候选为含有18型HPV DNA的待测DNA，还可将所述待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在455bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有18型HPVDNA的DNA；

为了进一步地验证所述候选为含有16型HPV DNA的待测DNA，还可将该待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用DdeⅠ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在452bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有16型HPVDNA的DNA；和/或，将该待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在444bp和8bp的DNA片段，或存在444bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有16型HPV DNA的DNA；和/或，将该待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用Pst Ⅰ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在216bp、210bp和26bp的DNA片段，或存在216bp和210bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有16型HPV DNA的DNA。

在上述方法中，所述DNA片段的大小是通过芯片毛细管电泳的方法进行检测得到的，具体使用仪器MCE-202MultiNA(Shimadzu,日本)进行检测；也可以使用其它方法如毛细管电泳、聚丙烯凝胶电泳，或其它仪器进行检测。

本发明还提供一种鉴定或辅助鉴定HPV DNA基因型的试剂盒，含有所述引物组X和限制性内切酶Rsa Ⅰ、Dde Ⅰ、HaeⅢ和Pst Ⅰ；还可含有记载上述任一所述方法的说明书。

本发明还提供一种筛选或辅助筛选宫颈癌或对宫颈癌进行预后的试剂盒，含有所述引物组X和限制性内切酶Rsa Ⅰ、Dde Ⅰ、HaeⅢ和Pst Ⅰ，还可含有记载上述任一所述方法的说明书。

本发明所提供的方法操作简单，经济实用，快速高效，结合芯片毛细管电泳检测可高通量分析HPV DNA类型；在医学领域的应用中，结合现有的薄层液基细胞形态诊断，有助于宫颈癌的早期防治、预后及针对性基因疫苗的研制，因可检测多种型别和发现未知型别的特点尤其适用于研究HPV有关疾病如喉咽癌，头颈癌等的发病机制和流行病学的调查研究。

附图说明

图1为46种HPV基因型的酶切优化方案。其中，括号中的数字为经过相应的酶酶切后产生的DNA片段的大小，括号前的数字为HPV的基因型。

图2为16型HPV的PCR结果和酶切片段芯片电泳图。

图3为18型HPV的PCR结果和酶切片段芯片电泳图。

图4为13种未知样本的目的片段PCR扩增产物的芯片电泳图。其中，上一幅图为同时检测25bp梯度标准分子量的结果，下一幅图为所有样本13种未知样本的目的片段PCR扩增产物的检测图；图中右侧的不同数字编号代表不同样本，其中样本1050,1058,2867,2877,2882和2885可见449-458bp的片段，可判明这6个样本是HPV感染阳性。

图5为样本1050的PCR产物由Rsa Ⅰ和HaeⅢ分别酶切后产物的芯片电泳图。

图6为样本1058的PCR产物由Rsa Ⅰ和Pst Ⅰ分别酶切后产物的芯片电泳图。

图7为样本2867的PCR产物由Rsa Ⅰ和Pst Ⅰ分别酶切后产物的芯片电泳图。

图8为样本2877的PCR产物由Rsa Ⅰ和HaeⅢ分别酶切后产物的芯片电泳图。

图9为样本2882的PCR产物由Rsa Ⅰ、HaeⅢ和Dde Ⅰ分别酶切后产物的芯片电泳图。

图10为样本2885的PCR产物由Rsa Ⅰ、Dde Ⅰ和HaeⅢ分别酶切后产物的芯片电泳图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的DNA片段的大小均通过仪器MCE-202MultiNA(Shimadzu,日本)按照说明进行检测得到的结果，对于同一次分析，分辨率可达到±5bp，即相差5个bp的片段可以被分开，但因实验时每一次电泳都受到缓冲液浓度，粘度，电极电压，芯片冲洗情况，加样泵泵压等的影响，会产生一定误差,根据实际情况设定，以下实施例实际测量值与理论值相比允许的误差范围为±15bp。

实施例1、本发明HPV基因分型的PCR-RFLP方法的建立

1、PCR引物的选择

迄今已发现HPV的DNA有120多种分型，如针对不同分型HPV特异序列，合成特异性引物进行PCR反应，则工作量大，消耗多。为避免此弊端，本发明依据HPV各型具有高度保守的衣壳蛋白L1基因一段较为保守的区域，采用PGMY09/11通用引物，对样本基因组DNA进行热启动PCR，获得长度为449bp-458bp的片段。

所述PGMY09/11通用引物由上游引物和下游引物组成；

所述上游引物由引物PGMY11-A、PGMY11-B、PGMY11-C、PGMY11-D和PGMY11-E组成；

所述下游引物由引物PGMY09-F、PGMY09-G、PGMY09-H、PGMY09-I、PGMY09-J、PGMY09-K、PGMY09-L、PGMY09-M、PGMY09-N、PGMY09-P、PGMY09-Q、PGMY09-R和HMB01组成；

所述引物PGMY11-A、PGMY11-B、PGMY11-C、PGMY11-D和PGMY11-E分别为序列表序列1、2、3、4和5所示的单链DNA；

所述引物PGMY09-F、PGMY09-G、PGMY09-H、PGMY09-I、PGMY09-J、PGMY09-K、PGMY09-L、PGMY09-M、PGMY09-N、PGMY09-P、PGMY09-Q、PGMY09-R和HMB01分别为序列表序列6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18所示的单链DNA。

2、酶切优化方案

一种限制性内切酶不能对所有HPV基因型产生有效地分析片段，使用多种酶又会增加分析成本和次数。本发明根据美国国家生物技术信息中心的Genbank中检索46种HPV型的序列信息中的上述PCR扩增的449bp-458bp目标区域序列（表1），结合四种限制性内切酶Rsa Ⅰ、HaeⅢ、Dde Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位点，获得相应的184种酶切片段组合，基于这些酶切的情况，以提高分析效率为目的设计了图1所示的优化的酶切流程图。

按照图1所示的流程图进行酶切和分析，可降低选择使用内切酶的盲目性，减少酶切分析次数，降低分析难度。流程图根据每一步酶切产生条带的不同，将待测DNA中含有的HPV候选为不同的基因型组或基因型，每进行一步酶切，可大大缩小HPV基因分型可能的范围，同时对上一步初步确定的分型进行进一步验证。

表1.46种HPV型全序列信息及PCR扩增衣壳蛋白L1开放阅读框结果

3、建立HPV基因分型的PCR-RFLP方法

根据步骤1和2的方案，建立鉴定或辅助鉴定HPV DNA基因型的方法，包括以下步骤：1）取待测DNA，用所述PGMY09/11通用引物进行PCR扩增，若扩增产物中存在449-458bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有HPV DNA的DNA，再进行步骤2）；若扩增产物中不存在449-458bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为不含有HPV DNA的DNA；

2）将步骤1）候选含有HPV DNA的DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用Rsa Ⅰ酶切，获得酶切产物a；根据酶切产物a中各DNA片段的大小，结合图1所示Rsa Ⅰ酶切的片段，判断是否可分析出HPV基因型（46种，分别为18、54、32、44、26、62、69、40、72、73、34、16、82、43、45、56、67、84、52、91、53、30、66、59、81、33、42、11、70、31、85、89、51、87、82、83、71、86、35、34、44、61、39、68、6、13）及相应风险分类（四种，可能高危型（为26,53,66,68,73和82型），低危型（为6,11,13,40,42,43,44,54,61,70,72,81和89型），未明确型（为30,32,34,62,67,69,71,74,83,84,85,86,87,90,91型），高危型（为16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58和59型），再确定是否将所述449bp-458bp的DNA片段再进行第三次酶切分析、第四次酶切分析，直到按照图1所示的方法得出待测DNA中所含HPV的所述基因型及相应风险分类。

实施例2、本发明HPV基因分型检测方法的应用

一、对已知HPV基因分型样本的检测

1、细胞的培养

培养Caski细胞（含有16型HPV基因组DNA）（样品1）和Hela细胞（含有18型HPV基因组DNA）（样品2）（购自中国医学科学院肿瘤细胞库）。前者DMEM培养基添加10%胎牛血清，后者采用采用RPMI-1640培养基添加10%胎牛血清。培养气相环境：空气，95%；二氧化碳，5%。37℃恒温培养至生长对数期。

2、DNA的制备

采用常规的DNA提取方法或者DNA提取试剂盒对步骤1的细胞进行DNA提取，将产物在4℃短期保存，-20℃长期保存。

3、PCR扩增

取步骤2提取的DNA，按照如下反应体系和反应条件进行PCR扩增：

目的片段的扩增体系（25μl）：2.5μl10×PCR缓冲液（ExCell Bio），200μM dNTPs（鼎国昌盛），1.75U HotStart Taq DNA聚合酶（ExCell Bio），2.5mM Mg²⁺（ExCell Bio），上游引物PGMY11-A,PGMY11-B,PGMY11-C,PGMY11-D,PGMY11-E和下游引物PGMY09-F,PGMY09-G,PGMY09-H,PGMY09-I,PGMY09-J,PGMY09-K,PGMY09-L,PGMY09-M,PGMY09-N,PGMY09-P,PGMY09-Q,PGMY09-R和HMB01各12.5pmol，模板DNA0.1-1μg，用水补足至25μl；

以另单管同时扩增内参基因β-globin为对照，内参基因的扩增体系（25μl）：2.5μl10×PCR缓冲液（ExCell Bio），200μM dNTPs（鼎国昌盛），1.75U HotStartTaq DNA聚合酶（ExCell Bio），2.5mM Mg²⁺（ExCell Bio），引物PC04和GH20各5pmol，模板DNA0.1-1μg，用水补足至25μl；

引物PC04和GH20的序列(5’到3’)分别为CAACTTCATCCACGTTCACC和GAAGAGCCAAGGACAGGTAC，用于扩增内参基因β-globin的扩增产物大小为268bp；内参的设定是为了保证扩增样本细胞基因组提取的完整性和PCR进行的有效性。

以不加模板的扩增体系做阴性对照。

上述体系分别混匀后放入PCR仪进行扩增，扩增条件如下：首先95℃变性5min；之后进行38个循环的反应，95℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸40s，最后一步延伸温度72℃，时间为7min。

4、PCR产物的检测与分析

取步骤3获得的PCR产物，使用MCE-202MultiNA(Shimadzu,日本)按照仪器操作说明对产物中DNA片段的大小进行检测；

结果：样品1和2的DNA的PCR扩增内参基因的大小均为268bp（如图2和3中的从上至下第2幅图所示）；样品1和2的DNA的PCR产物中均存在长度为449-458bp的片段（如图2和3中的从上至下第3幅图所示），将样品1和2的DNA候选为含有HPV DNA的DNA。

5、酶切及芯片电泳检测与分析

将2μl酶切缓冲液，1μl的限制性内切酶RsaⅠ和步骤4获得的10μl PCR产物混匀，37℃恒温反应5-15min，获得酶切产物；

使用MCE-202MultiNA(Shimadzu,日本),按照仪器操作说明检测酶切产物中DNA片段的大小；

结果：样品1的DNA的PCR产物经Rsa Ⅰ酶切的产物电泳图（如图2中的从上至下第4幅图所示）上可见310bp和72bp片段的峰；在误差允许±8bp范围内，该结果与图1所示的16型的Rsa Ⅰ酶切结果相符。

样品2的DNA的PCR产物经Rsa Ⅰ酶切的产物电泳图（如图3中的从上至下第4幅图所示）上可见134bp、120bp、78bp和69bp片段的峰；在误差允许±8bp范围内，该结果与图1所示的18型的RsaⅠ酶切结果相符。

二、对未知样本的检测

对13个未知HPV感染情况的宫颈脱落细胞样本进行基因分型检测，检测出6个HPV阳性，并对其型别进行了鉴定具体检测方法如下：

1、样本处理

用薄层液基细胞保存液以及与之配套的宫颈刷收集保存宫颈脱落细胞，取保存液1.5ml转至1.5ml离心管中，1500rpm离心15min。去上清，沉淀直接用于DNA提取。

2、DNA提取

采用常规的DNA提取方法，产物4℃短期保存，-20℃长期保存。

3、提取DNA的PCR扩增

与步骤一中的3相同。

4、PCR产物的检测与分析

方法与步骤一中的4相同；

结果：PCR扩增内参基因的大小均为268bp；其中，有6个样本的DNA的PCR产物中存在长度为449-458bp的片段，记为HPV感染阳性，其余记为HPV感染阴性，如表2所示。

5、酶切及芯片电泳检测

对步骤4的HPV感染阳性样本的DNA的PCR产物按照实施例1步骤3中的2）进行酶切、产物中DNA片段大小检测（结果如图5—10所示）和分析，结果如表2所示。

6、各样品的细胞形态检查结果如表2所示。

表2、对未知样本的检测的结果

细胞形态结果是目前临床上通过验证的常规初步筛查宫颈癌的方法，将本发明的分析方法与之对比，验证我们的方法不仅能查出细胞形态学查出有问题的结果，也能查出细胞形态学筛查查不出明显问题的样本，证明本发明方法更灵敏，能够弥补细胞形态学存在的漏诊，有利于辅助宫颈癌的初筛检查。

Claims (9)

1.一种鉴定或辅助鉴定HPV DNA基因型的方法，包括如下步骤：

1）取待测DNA，用引物组X进行PCR扩增，若扩增产物中存在449bp-458bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有HPV DNA的DNA；若扩增产物中不存在449bp-458bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为不含有HPV DNA的DNA；

所述引物组X由上游引物和下游引物组成；

所述上游引物由引物PGMY11-A、PGMY11-B、PGMY11-C、PGMY11-D和PGMY11-E中的五种、任意四种、任意三种、任意两种或任一种组成；

所述下游引物由引物PGMY09-F、PGMY09-G、PGMY09-H、PGMY09-I、PGMY09-J、PGMY09-K、PGMY09-L、PGMY09-M、PGMY09-N、PGMY09-P、PGMY09-Q、PGMY09-R和HMB01组成；

所述引物PGMY11-A、PGMY11-B、PGMY11-C、PGMY11-D和PGMY11-E分别为序列表序列1、2、3、4和5所示的单链DNA；

所述引物PGMY09-F、PGMY09-G、PGMY09-H、PGMY09-I、PGMY09-J、PGMY09-K、PGMY09-L、PGMY09-M、PGMY09-N、PGMY09-P、PGMY09-Q、PGMY09-R和HMB01分别为序列表序列6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18所示的单链DNA；

2）将步骤1）候选为含有HPV DNA的DNA经所述PCR扩增获得的所述449bp-458bp的DNA片段用Rsa Ⅰ酶切，获得酶切产物a；

A）若所述酶切产物a中存在135bp、125bp、85bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有18型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中存在138bp、125bp、117bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有54型HPV DNA的DNA；

B）若所述酶切产物a中存在216bp、161bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有32型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中存在221bp、161bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有44型HPV DNA的DNA；

C）若所述酶切产物a中存在365bp、72bp和18bp的DNA片段，或365bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有26、69和72型HPV DNA中至少一种的DNA；

若所述酶切产物a中存在359bp、72bp和18bp的DNA片段，或359bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有62型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中存在365bp和90bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有40型HPV DNA的DNA；

D）若所述酶切产物a中存在201bp、161bp和96bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有73型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中存在186bp、161bp、96bp和15bp的DNA片段，或186bp、161bp和96bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有34型HPV DNA的DNA；

E）若所述酶切产物a中存在310bp和70bp—73bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有16、82、67和56型HPV DNA中至少一种的DNA；若所述酶切产物a中还存在49bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有56型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中存在310bp和142bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有84型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中存在338bp、72bp和48bp的DNA片段，或338bp和72bp的DNA片段则将所述待测DNA候选为含有45型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中存在332bp、72bp和45bp的DNA片段，或332bp和72bp的DNA片段则将所述待测DNA候选为含有43型HPV DNA的DNA；

F）若所述酶切产物a中存在449—455bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有52、91、53、30、66、59和81型HPV DNA中至少一种的DNA；

G）若所述酶切产物a中存在236bp、102bp、72bp和39bp的DNA片段，或236bp、102bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有33型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中存在242bp、135bp、72bp和26bp的DNA片段，或242bp、135bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有42型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中存在216bp、135bp、72bp和26bp的DNA片段，或216bp、135bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有11型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中存在231bp、123bp、72bp和29bp的DNA片段，或231bp、123bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有70型HPV DNA的DNA；

H）若所述酶切产物a中存在380—383bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有31、85、89、51、87、83、71和86型HPV DNA中至少一种；

I）若所述酶切产物a中存在171bp、161bp、72bp和42bp的DNA片段，或171bp、161bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有35型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中存在181bp、161bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有64型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中存在165bp、161bp、72bp和57bp的DNA片段，或165bp、161bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有55型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中存在185bp、180bp、72bp和18bp的DNA片段，或185bp、180bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有61型HPV DNA的DNA；

J）若所述酶切产物a中存在260bp、123bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有39型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中存在260bp、85bp、72bp和38bp的DNA片段，或260bp、85bp和72bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有68型HPV DNA的DNA；

K）若所述酶切产物a中存在161bp、149bp、72bp和67bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有6型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中存在175bp、135bp和73bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有13型HPV DNA的DNA；

L)若所述酶切产物a中存在306bp、111bp和32bp的DNA片段,或存在306bp和111bp的DNA片段,则将所述待测DNA候选为含有58型HPV DNA的DNA；

若所述酶切产物a中的DNA片段大小不符合上述A）—L）中任一种时，则将所述待测DNA候选为不含有所述6、11、13、16、18、26、30、31、32、33、34、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、55、56、58、59、61、62、64、66、67、68、69、70、71、72、73、81、82、83、84、85、86、89、87、91型HPV DNA中任一种的DNA；

所述方法为非疾病诊断治疗方法。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2）后，还包括如下步骤3）：

A-1）将步骤2）的所述A）中候选为含有18和54型HPV DNA中至少一种的待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在455bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有18型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在217bp、127bp和108bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有54型HPV DNA的DNA；

或，将步骤2）的所述A）中候选为含有18和54型HPV DNA中至少一种的待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用Pst Ⅰ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在452bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有54型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在242bp和213bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有18型HPV DNA的DNA；

B-1）将步骤2）的所述B）中候选为含有32和44型HPV DNA中至少一种的待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在317bp、124bp和8bp的DNA片段，或317bp和124bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有32型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在223bp、124bp和108bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有44型HPV DNA的DNA；

C-1）将步骤2）的所述C）中候选为含有26、62、69、40和72型HPV DNA中至少一种的待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在455bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有26型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在232bp和217bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有62型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在223bp、183bp和49bp的DNA片段，或223bp和183bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有69型HPVDNA的DNA；若该酶切产物中存在447bp和8bp的DNA片段，或447bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有40型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在220bp、211bp和24bp的DNA片段，或220bp和211bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有72型HPV DNA的DNA；

或，将步骤2）的所述C）中候选为含有26、62、69、40和72型HPV DNA中至少一种的待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用Dde Ⅰ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在297bp—300bp和155—158bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有40和72型HPV DNA中至少一种的DNA；若该酶切产物中存在449—455bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有26、62和69型HPV DNA中至少一种的DNA；

D-1）将步骤2）的所述D）中候选为含有73和34型HPV DNA中至少一种的待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在458bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有73型HPVDNA的DNA；若该酶切产物中存在334bp和124bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有34型HPV DNA的DNA；

E-1）将步骤2）的所述E）中候选为含有16、82、67、56、84、45和43型HPV DNA中至少一种的待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449—458bp的DNA片段用DdeⅠ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在220bp、142bp和90bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有84型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在307bp、92bp和50bp的DNA片段，或307bp和92bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有67型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在447—455bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有16、82和43型HPV DNA中至少一种的DNA；若该酶切产物中存在324bp和131bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有45型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在307bp和142bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有56型HPV DNA的DNA；

F-1）将步骤2）的所述F）中候选为含有52、91、53、30、66、59和81型HPV DNA中至少一种的待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用Dde Ⅰ酶切，获得酶切产物f；或用Pst Ⅰ酶切，获得酶切产物g；

若该酶切产物f中存在206bp、158bp和85bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有53型HPV DNA的DNA；若该酶切产物f中存在357bp和92—98bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有52和91型HPV DNA中至少一种的DNA；若该酶切产物f中存在291bp和158bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有30和66型HPV DNA中至少一种的DNA；若该酶切产物f中存在452—455bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有59和81型HPV DNA中至少一种的DNA；

若该酶切产物g中存在341bp和111bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有81型HPV DNA的DNA；若该酶切产物g中存在423—426bp和26bp的DNA片段，或423—426bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有52和59型HPV DNA中至少一种的DNA；若该酶切产物g中存在449—455bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有53和91型HPV DNA中至少一种的DNA；若该酶切产物g中存在242bp和207bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有30型HPV DNA的DNA；若该酶切产物g中存在150bp、207bp、66bp和26bp的DNA片段，或150bp、207bp和66bp的DNA片段，或150bp和207bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有66型HPV DNA的DNA；

G-1）将步骤2）的所述G）中候选为含有33、42、11和70型HPV DNA中至少一种的待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用DdeⅠ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在320bp、77bp和52bp的DNA片段，或320bp和77bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有33型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在341bp和108bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有42型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在447—455bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有11和70型HPV DNA中至少一种的DNA；

H-1）将步骤2）的所述H）中候选为含有31、85、89、51、87、83、71和86型HPV DNA中至少一种的待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用DdeⅠ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在283bp和167bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有31型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在297bp和158bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有85型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在246bp、152bp和54bp的DNA片段，或246bp和152bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有89型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在362bp和90bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有51和87型HPV DNA中至少一种的DNA；若该酶切产物中存在452bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有83型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在310bp、125bp和17bp的DNA片段，或310bp和125bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有86型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在310bp和132bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有71型HPV DNA的DNA；

I-1）将步骤2）的所述I）中候选为含有35和64型HPV DNA中至少一种的待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用DdeⅠ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在294bp、135bp和23bp的DNA片段，或294bp和135bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有35型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在211bp、151bp、87bp和9bp的DNA片段，或存在211bp、151bp和87bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有64型HPV DNA的DNA；

和/或，将步骤2）的所述I）中候选为含有35和64型HPV DNA中至少一种的待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用PstⅠ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在426bp和26bp的DNA片段，或426bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有35型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在253bp、179bp和26bp的DNA片段，或253bp和179bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有64型HPV DNA的DNA；

J-1）将步骤2）的所述J）中候选为含有39和68型HPV DNA中至少一种的待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用DdeⅠ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在324bp和131bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有39型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在455bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有68型HPV DNA的DNA；

K-1）将步骤2）的所述K）中候选为含有6和13型HPV DNA中至少一种的待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用PstⅠ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在449bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有6型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在242bp和213bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有13型HPV DNA的DNA。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤3）后，还包括如下步骤4）：

C-2）在步骤3）的C-1）中所述用Dde Ⅰ酶切后，

将所述候选为含有26、62和69型HPV DNA中至少一种的DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在455bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有26型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在232bp和217bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有62型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在223bp、183bp和49bp的DNA片段，或223bp和183bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有69型HPV DNA的DNA；

E-2）在步骤3）的E-1）中所述用Dde Ⅰ酶切后，

将所述待测DNA候选为含有16、82和43型HPV DNA中至少一种的DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在444—447bp和8bp的DNA片段，或存在444—447bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有16和82型HPV DNA中至少一种的DNA；若该酶切产物中存在331bp和118bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有43型HPV DNA的DNA；

将所述待测DNA候选为含有45和56型HPV DNA中至少一种的DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在447bp和8bp的DNA片段，或447bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有45型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在275bp、166bp和8bp的DNA片段，或275bp和166bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有56型HPV DNA的DNA；

F-2）在步骤3）的F-1）中所述用Dde Ⅰ酶切后，

将所述候选为含有52和91型HPV DNA中至少一种的所述待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在455bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有91型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在258bp、183bp和8bp的DNA片段，或258bp和183bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有52型HPV DNA的DNA；

将所述候选为含有30和66型HPV DNA中至少一种的所述待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在449bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有66型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在232bp和217bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有30型HPV DNA的DNA；

将所述候选为含有59和81型HPV DNA中至少一种的所述待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在396bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有59型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在127bp、121bp、108bp和96bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有81型HPV DNA的DNA；

在步骤3）的F-1）中所述用Pst Ⅰ酶切后，

将所述候选为含有52和59型HPV DNA中至少一种的所述待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在396bp和56的DNA片段，或396bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有59型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在258bp、183bp和8bp的DNA片段，或258bp和183bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有52型HPV DNA的DNA；

将所述候选为含有53和91型HPV DNA中至少一种的所述待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在455bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有91型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在232bp和217bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有53型HPV DNA的DNA；

将所述候选为含有30和66型HPV DNA中至少一种的所述待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中含有449bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有66型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中含有232bp和217bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有30型HPV DNA的DNA；

G-2）在步骤3）的G-1）中所述用Dde Ⅰ酶切后，

将所述候选为含有11和70型HPV DNA中至少一种的所述待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中含有217bp、124bp和108bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有11型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中含有232bp、117bp和106bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有70型HPV DNA的DNA；

H-2）在步骤3）的H-1）中所述用Dde Ⅰ酶切后，

将所述候选为含有31、85和89型HPV DNA中至少一种的所述待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用Pst Ⅰ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在216bp、210bp和26bp的DNA片段，或216bp和210bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有31型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在452—455bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有85和89型HPV DNA中至少一种的DNA；

将所述候选为含有51和87型HPV DNA中至少一种的所述待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在379bp和73bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有51型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在232bp、209bp、8bp和3bp的DNA片段，或232bp和209bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有87型HPV DNA的DNA；

或，将所述候选为含有51和87型HPV DNA中至少一种的所述待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用Pst Ⅰ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在452bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有51型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在351bp和101bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有87型HPV DNA的DNA；

将所述候选为含有83型HPV DNA的所述待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用PstⅠ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在317bp和135bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有83型HPV DNA的DNA；

将所述候选为存在71和86型HPV DNA中至少一种的所述待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用Pst Ⅰ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在360bp和92bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有71型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在317bp和135bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有86型HPV DNA的DNA。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤4）后，还包括如下步骤5）：在步骤4）的E-2）后，将所述候选为含有16和82型HPV DNA中至少一种的待测DNA用Pst Ⅰ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中存在455bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有82型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中存在216bp、210bp和26bp的DNA片段，或216bp和210bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有16型HPV DNA的DNA；

在步骤4）的H-2）后，将所述候选为含有85和89型HPV DNA中至少一种的所述待测DNA的经所述PCR扩增获得的所述449-458bp的DNA片段用HaeⅢ酶切，获得酶切产物；若该酶切产物中含有455bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有85型HPV DNA的DNA；若该酶切产物中含有325bp和127bp的DNA片段，则将所述待测DNA片段候选为含有89型HPV DNA的DNA。

5.根据权利要求1—4中任一所述的方法，其特征在于：所述DNA片段的大小是通过芯片毛细管电泳的方法进行检测得到的。

6.一种鉴定或辅助鉴定HPV DNA基因型的试剂盒，含有权利要求1中的所述引物组X和限制性内切酶Rsa Ⅰ、Dde Ⅰ、HaeⅢ和Pst Ⅰ。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括记载权利要求1—5中任一所述方法的说明书。

8.一种筛选或辅助筛选宫颈癌或对宫颈癌进行预后的试剂盒，含有权利要求1中的所述引物组X和限制性内切酶Rsa Ⅰ、Dde Ⅰ、HaeⅢ和Pst Ⅰ。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括记载权利要求1—5中任一所述方法的说明书。

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