CN102605071B

CN102605071B - 鉴别鸡毒支原体强弱毒株的lamp检测试剂盒

Info

Publication number: CN102605071B
Application number: CN 201210075432
Authority: CN
Inventors: 谢芝勋; 罗思思; 谢丽基; 邓显文; 刘加波; 谢志勤; 庞耀珊; 范晴
Original assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Current assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Priority date: 2012-03-21
Filing date: 2012-03-21
Publication date: 2013-08-07
Anticipated expiration: 2032-03-21
Also published as: CN102605071A

Abstract

本发明公开了一种鉴别鸡毒支原体强弱毒株的LAMP检测试剂盒。本发明提供的引物组A，包括引物组a和引物组b；所述引物组a由引物1和引物2组成；所述引物组b由引物3和引物4组成；所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。本发明的实验证明，本发明的引物及方法无需昂贵的PCR仪只需一台普通水浴锅，却比PCR检测有更高的灵敏度，且不必通过凝胶电泳观察结果，操作简单而快速，特别适用于基层现场检测。

Description

鉴别鸡毒支原体强弱毒株的LAMP检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鉴别鸡毒支原体强弱毒株的LAMP检测试剂盒。

背景技术

鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum，MG)是鸡及其它禽类慢性呼吸道疾病的主要病原，感染鸡群常出现啰音、咳嗽、流鼻涕等症状，可引起鸡生长速度下降，肉鸡胴体品质下降和种鸡产蛋率、受精率和孵化率下降等，给养禽业造成较大的经济损失。MG在世界各国广泛存在，我国鸡群中MG的感染率很高，郭锐等通过对湖北、河南两地38个鸡场的162只患呼吸道疾病的鸡进行支原体的分离，结果59个分离物被鉴定为鸡毒支原体。邓显文等对广西不同地区鸡场调查中发现，鸡群MG平均感染率为56.9％。MG既可水平传播，也可经种蛋垂直传播，长期存在于鸡群中，给该病的防控带来困难。目前，防治MG的最有效方法，就是应用弱毒疫苗或灭活油乳剂苗进行预防接种，但鸡群中使用弱毒疫苗，会导致鸡群长期受到疫苗株的污染，干扰MG的检测，影响到鸡群MG的控制和净化，因此，建立一种特异、敏感、快速的鉴别MG强毒株和弱毒疫苗株的检测方法是非常必要的。

传统的MG诊断方法有病原分离鉴定和血清学方法，但这些方法存在耗时长、灵敏度低、操作繁琐等缺点，无法快速鉴别MG强毒株和弱毒株，毒力的测定要通过鸡胚接种和SPF鸡感染等致病性试验，费时、成本比较高，无法满足生产实际的需要。在鉴别鸡毒支原体强毒株和弱毒疫苗株的PCR检测方面，邓显文等根据MG强毒株和弱毒疫苗株基因组结构特点，分别设计合成2对引物XZ1、XZ2和XZ45、XZ46，建立了可检测MG强、弱毒株的PCR方法。谢芝勋等根据对邓显文等设计的引物XZ1、XZ2和XZ45、XZ46，进一步建立了一种多重聚合酶链反应快速鉴别MG强毒株和弱毒疫苗株的方法，即在数小时内，一次多重PCR反应，就能同时检测鉴别MG强、弱毒株的技术。但这些鉴别检测方法存在耗时长、敏感性较低、并且常规PCR需要使用PCR仪和进行凝胶电泳，不能确定鸡毒支原体感染的含量。

环介导等温扩增(LAMP)技术是一种在等温条件下高特异、高效、快速的扩增靶序列的DNA扩增新技术，依赖Bst DNA聚合酶在60-65℃具有核酸双链解链功能和瀑布式核酸扩增功能，进行自动的成环链置换及DNA合成，不需要特殊的仪器设备，仅在可控温水浴锅中45min-60min内即可完成全部反应，反应后，不需打开PCR反应管，肉眼观察颜色，直接判定结果，具有特异性好、灵敏度高(是常规PCR的100倍以上)、操作简单、不会造成PCR产物的污染(不需要EB染色)等优点，省时省力，应用前景广阔。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测鸡毒支原体的环介导等温扩增引物组A。

本发明提供的引物组A，包括引物1、引物2、引物3和引物4；

所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。

上述引物组A还包括引物5和引物6；

上述引物5和上述引物6的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列5和序列6；

上述引物组A由所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6组成；

上述引物组A中所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比具体为(7-9)∶(7-9)∶1∶1∶(3-5)∶(3-5)，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比进一步具体为8∶8∶1∶1∶4∶4。

本发明的第二个目的是提供一种检测鸡毒支原体的环介导等温扩增试剂A。

本发明提供的试剂A，由上述的引物组A、环介导等温扩增缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、硫酸镁、钙黄绿素、氯化锰和水组成；

上述的引物组A中的引物1在所述环介导等温扩增试剂A中的终浓度具体为1.4umol/L-1.8umol/L；

上述的引物组A中的引物2在所述环介导等温扩增试剂A中的终浓度具体为1.4umol/L-1.8umol/L；

上述的引物组A中的引物3在所述环介导等温扩增试剂A中的终浓度具体为0.1umol/L-0.4umol/L；

上述的引物组A中的引物4在所述环介导等温扩增试剂A中的终浓度具体为0.1umol/L-0.4umol/L；

上述的引物组A中的引物5在所述环介导等温扩增试剂A中的终浓度具体为0.6umol/L-1umol/L；

上述的引物组A中的引物6在所述环介导等温扩增试剂A中的终浓度具体为0.6umol/L-1umol/L；

上述的引物组A中的引物1在所述环介导等温扩增试剂A中的终浓度进一步具体为1.6umol/L；

上述的引物组A中的引物2在所述环介导等温扩增试剂A中的终浓度进一步具体为1.6umol/L；

上述的引物组A中的引物3在所述环介导等温扩增试剂A中的终浓度进一步具体为0.2umol/L；

上述的引物组A中的引物4在所述环介导等温扩增试剂A中的终浓度进一步具体为0.2umol/L；

上述的引物组A中的引物5在所述环介导等温扩增试剂A中的终浓度进一步具体为0.8umol/L；

上述的引物组A中的引物6在所述环介导等温扩增试剂A中的终浓度进一步具体为0.8umol/L。

本发明的第三个目的是提供一种检测鸡毒支原体的环介导等温扩增试剂盒A。

本发明提供的试剂盒A，包括上述的引物组A或上述的环介导等温扩增试剂A。

本发明的第四个目的是提供一种检测鸡毒支原体强毒株或弱毒株的环介导等温扩增引物组C。

本发明提供的引物组C，由上述的引物组A和引物组B组成；

所述引物组B包括引物7、引物8、引物9和引物10；

所述引物7、所述引物8、所述引物9和所述引物10的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列7、序列8、序列9和序列10。

上述引物组C中，上述引物组B还包括引物11和引物12；

上述引物11和所述引物12核苷酸序列分别依次为序列表中的序列11和序列12；

上述引物组B由所述引物7、所述引物8、所述引物9、所述引物10、所述引物11和所述引物12组成；

上述引物组A和所述引物组B为独立包装；

上述引物组B中所述引物7、所述引物8、所述引物9、所述引物10、所述引物11和所述引物12的摩尔比具体为(7-9)∶(7-9)∶1∶1∶(3-5)∶(3-5)，所述引物7、所述引物8、所述引物9、所述引物10、所述引物11和所述引物12的摩尔比进一步具体为8∶8∶1∶1∶4∶4。

本发明的第五个目的是提供一种检测鸡毒支原体强毒株或弱毒株的环介导等温扩增试剂C。

本发明提供的试剂C，由所述环介导等温扩增试剂A和环介导等温扩增试剂B组成；

所述环介导等温试剂B由上述的引物组C中的所述引物组B、环介导等温扩增缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、硫酸镁、钙黄绿素、氯化锰和水组成；

所述的引物组B中的引物7在所述扩增试剂B中的终浓度具体为1.4umol/L-1.8umol/L；

所述的引物组B中的引物8在所述扩增试剂B中的终浓度具体为1.4umol/L-1.8umol/L；

所述的引物组B中的引物9在所述扩增试剂B中的终浓度具体为0.1umol/L-0.4umol/L；

所述的引物组B中的引物10在所述扩增试剂B中的终浓度具体为0.1umol/L-0.4umol/L；

所述的引物组B中的引物11在所述扩增试剂B中的终浓度具体为0.6umol/L-1umol/L；

所述的引物组B中的引物12在所述扩增试剂B中的终浓度具体为0.6umol/L-1umol/L；

所述的引物组B中的引物7在所述扩增试剂B中的终浓度进一步具体为1.6umol/L；

所述的引物组B中的引物8在所述扩增试剂B中的终浓度进一步具体为1.6umol/L；

所述的引物组B中的引物9在所述扩增试剂B中的终浓度进一步具体为0.2umol/L；

所述的引物组B中的引物10在所述扩增试剂B中的终浓度进一步具体为0.2umol/L；

所述的引物组B中的引物11在所述扩增试剂B中的终浓度进一步具体为0.8umol/L；

所述的引物组B中的引物12在所述扩增试剂B中的终浓度进一步具体为0.8umol/L；

所述环介导等温扩增试剂A和所述环介导等温扩增试剂B均为独立包装。

本发明的第六个目的是提供一种检测鸡毒支原体的环介导等温扩增试剂盒C。

本发明提供的试剂盒C，包括上述的引物组C或上述的环介导等温扩增试剂C。

本发明的第七个目的是提供一种检测鸡毒支原体的环介导等温扩增引物组B。

本发明提供的引物组B，为上述的引物组C中的所述引物组B。

上述的引物组A、上述环介导等温扩增试剂A、上述试剂盒A、上述的引物组C、上述环介导等温扩增试剂C或上述试剂盒C在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸡毒支原体产品中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的引物组C、上述环介导等温扩增试剂C或上述试剂盒C在制备检测和/或辅助检测待测样品中含有鸡毒支原体强毒株或鸡毒支原体弱毒株产品中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的引物组B在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸡毒支原体弱毒株产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述检测和/或辅助检测为分别利用上述的引物组A、上述的试剂A、上述试剂盒A、上述的引物组C、上述的试剂C或上述试剂盒C对所述待测样品进行环介导等温扩增反应。

本发明的实验证明，本研究针对MG强、弱毒疫苗株的共同保守区域，设计了一套强、弱毒通用的特异性LAMP引物，可用于鸡毒支原体的检测；针对MG弱毒疫苗株的保守区域，设计了一套弱毒专用的特异性LAMP引物；通过对两种LAMP反应条件的优化，成功建立了鉴别鸡毒支原体强毒株和弱毒疫苗株的LAMP可视化快速检测方法。该法既可作为常规检测鸡毒支原体的方法，也可区分强毒株和弱毒疫苗株的感染。该法无需昂贵的PCR仪只需一台普通可控温的水浴锅，却比PCR检测有更高的灵敏度，且不必通过凝胶电泳观察结果，操作简单而快速，特别适用于基层现场检测。

在RT-LAMP反应之初Calcein与荧光淬灭剂Mn²⁺结合而不发荧光，反应进行的过程中，随着大量DNA的合成，产生一种副产物焦磷酸根离子，更易与锰离子结合从而释放了钙黄绿素，游离的钙黄绿素就可自发荧光，在镁离子存在的条件下，这种荧光效果得到了加强。因此，本试验在配制LAMP反应液时，就把Calcein+MnCl₂加入反应液中，反应结束后，肉眼观察颜色变化，可直接判定结果，阳性结果为翠绿色，阴性结果仍为桔红色，实现检测的可视化，同时，避免了SYBR Green和GeneFinder染料造成的假阳性问题，肉眼观察结果与电泳鉴定结果一致，具有很好的特异性。

附图说明

图1为MG强、弱毒通用LAMP的特异性试验

图2为MG弱毒LAMP的特异性试验

图3为MG强、弱毒通用LAMP的敏感性试验

图4为MG弱毒LAMP的敏感性试验

图5为MG强、弱毒通用常规PCR敏感性试验

图6为MG弱毒常规PCR敏感性试验

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、引物的设计及其试剂盒的制备

1、引物的设计

根据鸡毒支原体(MG)的强弱毒株通用的基因保守区域(genbank：CP001872.1的第335501-335700位核苷酸)和弱毒专用的基因保守区域(genbank：CP001873.1的第603238-603785位核苷酸)，设计如下引物：

强弱毒通用内引物1序列为：

CCTTGTTACGACTTAACTCCAATCAGTTGCTAACCGCAAGGAA(序列1)，

强弱毒通用内引物2序列为：

AACGTGGGGGTGGATTACCTACCGTTATATGTAACAGGTGTA(序列2)，

强弱毒通用外引物1序列为：AGCTGGTAATATCTAAAACCGT(序列3)，

强弱毒通用外引物2序列为：CTTGCTGGGTTTTAATTGTTTC(序列4)，

强弱毒通用环引物1序列为：GGCCCTACCCTAGACATGCG(序列5)，

强弱毒通用环引物2序列为：GAGTATATTAATACACTAACAC(序列6)；

弱毒专用内引物1序列为：TCCAATCTAAACCCTTTAACACCAAGATTAAAGCACTTGCTAAAGTGAT(序列7)；

弱毒专用内引物2序列为：AATCAGTATTTTGCTTGGTGTGAAGAAAGCTAATTCTTCAAACGCT(序列8)；

弱毒专用外引物1序列为：GTTGATCTTAATTGAAATCATCCAG(序列9)；

弱毒专用外引物2序列为：CAAGTGTGTAAGCATCTGG(序列10)；

弱毒专用环引物1序列为：TGAATACCAAAAGTC(序列11)；

弱毒专用环引物2序列为：TTCAGTAAAAGCACTAA(序列12)。

2、鸡毒支原体LAMP鉴别检测试剂盒的配制

反应液A每管24uL，其组成为：2.5uL 10×等温反应缓冲液、1.0uL Bst DNA聚合酶(购自New England Biolabs公司，产品目录号：M0275)8U/uL(终浓度0.32U/uL)、3.5uL 10mM dNTPs(每一个终浓度1.4mM)、5uL 25mM硫酸镁(终浓度5mM)、2uL 20uM强弱毒通用内引物1(终浓度1.6uM)、2uL 20uM强弱毒通用内引物2(终浓度1.6uM)、0.25uL 20uM强弱毒通用外引物1(终浓度0.2uM)、0.25uL 20uM强弱毒通用外引物2(终浓度0.2uM)、1.0uL 20uM强弱毒通用环引物1(终浓度0.8uM)、1.0uL 20uM强弱毒通用环引物2(终浓度0.8uM)、3.5uL 5mM甜菜碱(终浓度0.75mM)、1.0uL 625uM钙黄绿素(终浓度25uM)、1.0uL 12.5mM氯化锰(0.5mM)，其余为水。

反应液B每管24uL，其组成为：2.5uL 10×等温反应缓冲液、1.0uL Bst DNA聚合酶8U/uL(终浓度0.32U/uL)、3.5uL 10mMdNTPs(终浓度1.4mM)、5uL 25mM硫酸镁(终浓度5mM)、2uL 20uM弱毒专用内引物1(终浓度1.6uM)、2uL 20uM弱毒专用内引物2(终浓度1.6uM)、0.25uL 20uM弱毒专用外引物1(终浓度0.2uM)、0.25uL 20uM弱毒专用外引物2(终浓度0.2uM)、1.0uL 20uM弱毒专用环引物1(终浓度0.8uM)、1.0uL 20uM弱毒专用环引物2(终浓度0.8uM)、3.5uL 5mM甜菜碱(终浓度0.75mM)、1.0uL 625uM钙黄绿素(终浓度25uM)、1.0uL 12.5mM氯化锰(终浓度0.5mM)，其余为水。

其中，上述10×等温反应缓存液含有200mM pH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％(质量百分含量)曲拉通X-100。

鸡毒支原体LAMP鉴别检测试剂盒包括上述反应液A和反应液B，且各反应液为独立包装。

实施例2、引物及其试剂盒在LAMP检测鸡毒支原体强、弱毒株中的应用

MG的4个强毒株(S6、A5969、K-2221(383T)、K-1501-S)和MG的2个弱毒株(F2F10、K810)记载在如下参考文献1中；MG的另一个强毒株PG31记载在如下参考文献2中；

MG弱毒疫苗株(MG-F-vaccine)和鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)由中国兽药监察所提供；MG弱毒疫苗(MG-F-vaccine-Guangdong)由广东永顺生物工程有限公司提供；

鸡滑液支原体(MS-K1415)、火鸡支原体(MM-TACC)、衣阿华支原体(MI-I695)、新城疫病毒(NDV-Lasota)和鸡传染性支气管炎病毒(IBV Mass 41)记载在如下参考文献3中；

禽流感病毒(AIV H9)记载在如下参考文献4中。

参考文献：[1]Han Wang，A.A.Fadl，M.I.Khan.Multiplex PCR for avian pathogenicmycoplasmas[J].Molecular and Cellular Probes，(1997)11，211-216.[2]邓显文，谢芝勋，谢志勤，等.应用PCR-RELP分析鉴别广西鸡毒霉形体[J].中国兽医科技，2004，34(3)：41-44.[3]谢芝勋，邓显文，谢志勤，等.多重聚合酶链反应快速检测鉴别鸡毒支原体强毒株和弱毒疫苗株的研究[J].中国预防兽医学报，2003，25(6)：476-479.[4]彭宜，谢芝勋，刘加波，等.H9亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立[J].中国人兽共患病学报，19-28.

1、引物及其试剂盒鉴别强弱毒LAMP检测方法的特异性

分别提取MG的5个强毒株(S6、A5969、K-2221、K-1501-S和PG31)、MG的4个弱毒株(K810、F2F10、F-vaccine、F-vaccine-Guangdong)的DNA、滑液囊支原体(MS-K1415)的DNA、火鸡支原体(MM-TACC)的DNA、衣阿华支原体(MI-I695)的DNA、新城疫病毒(NDV-Lasota)的RNA、禽流感病毒(AIV H9)的RNA、鸡传染性支气管炎病毒(IBV Mass 41)的RNA、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的RNA。

将上述新城疫病毒(NDV-Lasota)的RNA、禽流感病毒(AIV H9)的RNA、鸡传染性支气管炎病毒(IBV Mass 41)的RNA和鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的RNA分别反转录，得到新城疫病毒(NDV-Lasota)的cDNA、禽流感病毒(AIV H9)的cDNA、鸡传染性支气管炎病毒(IBV Mass 41)的cDNA和鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的cDNA。

在装有24uL反应液A管和反应液B管中分别均加入1uL上述DNA/cDNA作为模板，构成25uL反应体系，分别进行LAMP反应；LAMP反应程序如下：63℃60min，然后80℃5min。

LAMP反应结果的判断有2种：

1)直接用肉眼观察颜色变化

若反应管A颜色变为绿色，则说明样品中含有鸡毒支原体，反之，则说明样品中不含有鸡毒支原体；

若反应管A和反应管B均变为绿色，则说明样品中含有鸡毒支原体弱毒；

若反应管A变为绿色，反应管B仍为桔红色，则说明样品中含有鸡毒支原体强毒；

2)电泳观察

LAMP反应产物进行琼脂糖电泳检测，并在凝胶成像仪下观察结果，

若反应管A产物有典型的连续梯状条带，则说明样品中含有鸡毒支原体；反之，则样品中不含有鸡毒支原体；

若反应管A和反应管B产物均有典型的连续梯状条带，则说明样品中含有鸡毒支原体弱毒；

若反应管A有典型的连续梯状条带，反应管B无连续梯状条带，则说明样品中含有鸡毒支原体强毒。

反应管A的肉眼观察结果和反应产物电泳结果见图1，为强弱毒通用LAMP试验图，其中上图为电泳图，下图为管的颜色(从左到右依次为1-17)，1为MG-S6、2为MG-A5969、3为MG-K2221(383T)、4为MG-K1501-S、5为MG-PG31、6为MG-K810、7为MG-F2F10、8为MG-F-vaccine、9为MG-F-vaccine-Guangdong、10为MS-K1415、11为MM-TACC、12为MI-I695、13为新城疫病毒、14为禽流感病毒、15为鸡传染性支气管炎病毒、16为鸡传染性喉气管炎病毒、17为阴性对照(水)；可以看出，1-9的颜色为绿色，且产物的电泳条带均为典型的连续梯状条带，10-17的颜色为桔红色，且没有产物条带。说明5个强毒株(MG-S6、MG-A5969、MG-K2221(383T)、MG-K1501-S和MG-PG31)、4个弱毒株(MG-K810、MG-F2F10、MG-F-vaccine 和MG-F-vaccine-Guangdong)的检测为阳性(显示绿色)，而对滑液囊支原体(MS-K1415)、火鸡支原体(MM-TACC)、衣阿华支原体(MI-I695)、新城疫病毒、禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒的检测结果均为阴性(显示桔红色，且无典型的连续梯状条带)，阴性对照成立。LAMP可视化判定结果与电泳结果一致。

反应管B的肉眼观察结果和反应产物电泳结果见图2，弱毒专用LAMP试验的结果，其中上图为电泳图，下图为管的颜色(从左到右依次为1-17)，1为MG-S6、2为MG-A5969、3为MG-K2221(383T)、4为MG-K1501-S、5为MG-PG31、6为MG-K810、7为MG-F2F10、8为MG-F-vaccine、9为MG-F-vaccine-Guangdong、10为MS-K1415、11为MM-TACC、12为MI-I695、13为新城疫病毒、14为禽流感病毒、15为鸡传染性支气管炎病毒、16为鸡传染性喉气管炎病毒、17为阴性对照；可以看出，6-9的颜色为绿色，且产物的电泳条带均为典型的连续梯状条带，1-5和10-17的颜色为桔红色，且没有产物条带。说明4个弱毒株(MG-K810、MG-F2F10、MG-F-vaccine和MG-F-vaccine-Guangdong)的检测为阳性(显示绿色，且产物的电泳条带均为典型的连续梯状条带)，而对5个强毒株(MG-S6、MG-A5969、MG-K2221、MG-K1501-S和MG-PG31)、滑液囊支原体(MS-K1415)、火鸡支原体(MM-TACC)、衣阿华支原体(MI-I695)、新城疫病毒、禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒的检测结果为阴性(桔红色，且无典型的连续梯状条带)。LAMP可视化判定结果与电泳结果一致。

2、引物在LAMP检测中的敏感性试验

将强毒MG-S6的基因组DNA按10倍递减稀释成10ng/ul、1ng/ul、100pg/ul、10pg/ul、1pg/ul、100fg/ul、10fg/ul、1fg/ul；将弱毒F-vaccine的基因组DNA按10倍递减稀释成10ng/ul、1ng/ul、100pg/ul、10pg/ul、1pg/ul、100fg/ul、10fg/ul、1fg/ul，然后按照上述1反应体系和反应程序进行LAMP反应，将上述反应产物用肉眼观察并分别电泳。

反应管A的肉眼观察结果和反应产物电泳结果如图3所示，其中上图为电泳图，下图为管的颜色(从左到右依次为1-8)，MG强、弱毒通用LAMP的敏感性试验，图中1为10ng/管、2为1ng/管、3为100pg/管、4为10pg/管、5为1pg/管、6为100fg/管、7为10fg/管、8为1fg/管，1-7的颜色为绿色，且产物的电泳条带均为典型的连续梯状条带，8的颜色为桔红色，且没有产物条带。可以看出，鸡毒支原体强弱毒LAMP检测方法的检测限为10fg。

反应管B的肉眼观察结果和反应产物电泳结果见图4，其中上图为电泳图，下图为管的颜色(从左到右依次为1-8)，MG弱毒LAMP的敏感性试验，图中1为10ng/管、2为1ng/管、3为100pg/管、4为10pg/管、5为1pg/管、6为100fg/管、7为10fg/管、8为1fg/管，1-7的颜色为绿色，且产物的电泳条带均为典型的连续梯状条带，8的颜色为桔红色，且没有产物条带。可以看出，鸡毒支原体弱毒LAMP检测方法的检测限为10fg。

将鸡毒支原体强、弱毒检测和弱毒检测用常规PCR进行，具体如下：

以鸡毒支原体强弱毒通用常规PCR反应：上游引物5’-GGATCCCATCTCGACCACGAGAAAA-3’和下游引物5′-CTTTCAATCAGTGAGTAACTGATGA-3’各1uL，分别取1uL强毒MG-S6基因组DNA按照上述的方法稀释作为模板，扩增程序为94℃5min预变性；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；最后经72℃延伸8min，结果如图5所示，图中1为10ng/管、2为1ng/管、3为100pg/管、4为10pg/管、5为1pg/管、6为100fg/管、7为10fg/管、8为1fg/管，1-5得到732bp的为鸡毒支原体，可以看出常规PCR的检测鸡毒支原体强毒的检测限为1pg。

鸡毒支原体弱毒专用常规PCR反应：上游引物5′-CTGTTTGCTAAAGAACAAGTTGATC-3′和下游引物5′-TAACCCTTCATCACCTCATCTAGAG-3′各1uL，分别取1uL弱毒MG-F-vaccine按照上述的方法稀释作为模板，双蒸水9.5uL。扩增程序为94℃5min预变性；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；最后经72℃延伸8min，结果如图6所示，图中1为10ng/管、2为1ng/管、3为100pg/管、4为10pg/管、5为1pg/管、6为100fg/管、7为10fg/管、8为1fg/管，1-5得到525bp的为鸡毒支原体弱毒，可以看出常规PCR的检测鸡毒支原体弱毒的检测限为1pg。

可见，LAMP方法敏感性比常规PCR高100倍。

Claims

1.检测鸡毒支原体的环介导等温扩增引物组A，由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成；

所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6；

所述引物组A中所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比为8：8：1：1：4：4。

2.检测鸡毒支原体的环介导等温扩增试剂A，由权利要求1所述的引物组A、环介导等温扩增缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、硫酸镁、钙黄绿素、氯化锰和水组成；

所述引物组A中的引物1在所述环介导等温扩增试剂A中的终浓度为1.6umol/L；

所述引物组A中的引物2在所述环介导等温扩增试剂A中的终浓度为1.6umol/L；

所述引物组A中的引物3在所述环介导等温扩增试剂A中的终浓度为0.2umol/L；

所述引物组A中的引物4在所述环介导等温扩增试剂A中的终浓度为0.2umol/L；

所述引物组A中的引物5在所述环介导等温扩增试剂A中的终浓度为0.8umol/L；

所述引物组A中的引物6在所述环介导等温扩增试剂A中的终浓度为0.8umol/L。

3.检测鸡毒支原体的环介导等温扩增试剂盒A，包括权利要求1所述的引物组A或权利要求2所述的环介导等温扩增试剂A。

4.检测鸡毒支原体强毒株或弱毒株的环介导等温扩增引物组C，由权利要求1所述的引物组A和引物组B组成；

所述引物组B由引物7、引物8、引物9、引物10、引物11和引物12组成；

所述引物7、所述引物8、所述引物9、所述引物10、所述引物11和所述引物12的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列7、序列8、序列9、序列10、序列11和序列12；

所述引物组A和所述引物组B为独立包装；

所述引物组B中所述引物7、所述引物8、所述引物9、所述引物10、所述引物11和所述引物12的摩尔比为8：8：1：1：4：4。

5.检测鸡毒支原体强毒株或弱毒株的环介导等温试剂C，由权利要求2所述环介导等温扩增试剂A和环介导等温扩增试剂B组成；

所述环介导等温试剂B由权利要求4所述的引物组C中的所述引物组B、环介导等温扩增缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、硫酸镁、钙黄绿素、氯化锰和水组成；

所述引物组B中的引物7在所述环介导等温扩增试剂B中的终浓度为1.6umol/L；

所述引物组B中的引物8在所述环介导等温扩增试剂B中的终浓度为1.6umol/L；

所述引物组B中的引物9在所述环介导等温扩增试剂B中的终浓度为0.2umol/L；

所述引物组B中的引物10在所述环介导等温扩增试剂B中的终浓度为0.2umol/L；

所述引物组B中的引物11在所述环介导等温扩增试剂B中的终浓度为0.8umol/L；

所述引物组B中的引物12在所述环介导等温扩增试剂B中的终浓度为0.8umol/L；

所述环介导等温扩增试剂A和所述环介导等温扩增试剂B为独立包装。

6.检测鸡毒支原体的环介导等温扩增试剂盒C，包括权利要求4所述的引物组C或权利要求5所述的环介导等温扩增试剂C。

7.检测鸡毒支原体的环介导等温扩增引物组B，为权利要求4所述的引物组C中的所述引物组B。

8.权利要求1所述的引物组A、权利要求2所述环介导等温扩增试剂A、权利要求3所述试剂盒A、权利要求4所述的引物组C、权利要求5所述环介导等温扩增试剂C或权利要求6所述试剂盒C在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸡毒支原体产品中的应用。

9.权利要求4所述的引物组C、权利要求5所述环介导等温扩增试剂C或权利要求6所述试剂盒C在制备检测和/或辅助检测待测样品中含有鸡毒支原体强毒株或鸡毒支原体弱毒株产品中的应用。

10.权利要求7所述的引物组B在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸡毒支原体弱毒株产品中的应用。