CN103131790B

CN103131790B - 鸡滑液支原体lamp可视化检测试剂盒

Info

Publication number: CN103131790B
Application number: CN201310082818.8A
Authority: CN
Inventors: 谢芝勋; 邓显文; 谢志勤; 刘加波; 庞耀珊; 谢丽基; 范晴; 罗思思
Original assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Current assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2013-03-15
Publication date: 2014-05-07
Anticipated expiration: 2033-03-15
Also published as: CN103131790A

Abstract

本发明公开了一种鸡滑液支原体LAMP可视化检测试剂盒。本发明提供了一种检测鸡滑液支原体的环介导等温扩增引物组，包括引物1、引物2、引物3和引物4；所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的列1、序列2、序列3和序列4。本发明的实验证明，本发明的引物及所建立的MS-LAMP检测试剂和方法具有快速、灵敏、特异、简便的特点，仅需使用一台能控温的水浴锅，并且结果可以无需仪器而仅通过肉眼判定，适合在食品厂、边境口岸、养殖场和基层兽医站中进行快速检测，对MS的有效防制有重要意义,具有较好的应用前景。

Description

鸡滑液支原体LAMP可视化检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鸡滑液支原体LAMP可视化检测试剂盒。

背景技术

鸡滑液支原体(Mycoplasma synoviae MS)是危害鸡最主要的支原体，以侵害关节滑液、腱鞘膜和气囊为主，引起亚临床型的上呼吸道感染和关节滑液囊炎,鸡群感染该病可导致明显的跛行，生长发育迟缓及胴体降级等。快速检测MS，是采取紧急防制措施和净化MS的前提。目前MS-PCR检测技术已有报道，MS-PCR检测方法虽然快速、敏感性较高，但是需要使用昂贵的仪器和试剂等。

LAMP技术是一新型的核酸扩增技术，不需要特殊的仪器设备，仅在水浴锅中就可完成扩增反应，反应产物无需经过电泳就可以直接观察,肉眼可见阳性样品的反应液变成翠绿色，阴性样品的反应液则为桔红色。LAMP反应灵敏度很高，反应产物又易形成气溶胶污染环境，导致出现假阳性，因此应将配制反应体系的区域、加样区域与观察反应结果的区域进行严格分区，防止假阳性结果的出现。

环介导等温扩增技术(LAMP)具有简捷、成本低廉和结果可视化等优点，目前在一些病原微生物的检测中被广泛运用，目前，国内还没有应用LAMP检测鸡滑液支原体的研究报导。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测鸡滑液支原体的环介导等温扩增引物组。

本发明提供的检测鸡滑液支原体的环介导等温扩增引物组，包括引物1、引物2、引物3和引物4；

所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。

上述引物组中，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比为8：8：1：1。

上述引物组中，所述引物组还包括引物5和引物6；所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列5和序列6；

所述引物组具体由所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6组成。

上述引物组中，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比为8：8：1：1：4：4。

含有上述的引物组的检测鸡滑液支原体的环介导等温扩增试剂也是本发明保护的范围。

上述环介导等温扩增试剂由上述的引物组、环介导等温扩增缓冲液、dNTPs、甜菜碱、MgSO₄、MnCl₂、钙黄绿素、DNA聚合酶和水组成。

上述的环介导等温扩增试剂中，所述引物组中的引物1和所述引物2在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为1.6uM；

所述引物组中的引物3和所述引物4在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为0.2uM；

所述引物组中的引物5和所述引物6在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为0.8uM。

本发明的另一个目的是提供一种检测鸡滑液支原体的环介导等温扩增试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述的引物组或上述的环介导等温扩增试剂。

上述的引物组、上述的环介导等温扩增试剂或上述环介导等温扩增试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸡滑液支原体的产品或制备检测和/或辅助检测鸡滑液支原体的产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用采用环介导等温扩增，所述环介导等温扩增的条件具体为62℃反应1h，90℃作用5min灭活。

本发明的实验证明，本发明根据MS热休克ATP依赖的蛋白酶的DNA序列的保守序列设计了6条引物，通过优化反应条件后，建立了MS的LAMP检测方法，只在水浴锅中1小时即可完成检测MS，特异性高、检测灵敏度高，能检测到100fg的MS DNA样品，灵敏度是常规PCR的10倍。另外，本发明使用Calcein+MnCl₂替代了SYBR Green和Gene Finder，在配制LAMP反应液时就加入反应液中，仅在发生LAMP反应时才呈现翠绿色，避免了常规的LAMP方法，需要在反应结束后加入SYBR Green和Gene Finder染料显色造成的假阳性问题，具有更好的特异性，因此应用前景广阔。

总之，本发明的引物及所建立的MS-LAMP检测试剂和方法具有快速、灵敏、特异、简便的特点，仅需使用一台能控温的水浴锅，并且结果可以无需仪器而仅通过肉眼判定，适合在食品厂、边境口岸、养殖场和基层兽医站中进行快速检测，对MS的有效防制有重要意义,具有较好的应用前景。

附图说明

图1为LAMP方法检测MS的特异性

图2为LAMP方法检测MS的敏感性

图3为PCR方法检测MS的敏感性

图4为LAMP方法检测待测样本是否含有MS

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的鸡滑液支原体（K1415、MS28、FMT、PMS122、PMS156）、鸡毒霉形体（MG-S6），禽衣阿华支原体菌株（K-1805），火鸡支原体(ATCC)均记载在如下文献1中；禽沙门菌（C79_13）、禽大肠杆菌(E.coliO₂)均记载在如下文献2中；上述菌株公众均可从广西壮族自治区兽医研究所获得。

文献1：邓显文，谢芝勋，谢志勤，等.应用多重聚合酶链反应检测四种霉形体的研究[J].中国兽医科技,2003,06:15-18.

文献2：谢志勤，谢芝勋，庞耀珊，等.应用多重聚合酶链式反应检测鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和禽衣阿华支原体的研究[J].畜牧与兽医,2000,05:4-6。

实施例1、引物的设计

参照Genbank中MS热休克ATP依赖的蛋白酶(heat shock ATP-dependentprotease)DNA基因序列，利用Primer Exporer V4在线设计软件，设计LAMP引物，其中包括2条外引物F3/B3和2条内引物FIP/BIP，以及2条用于提高扩增效率的环引物Bloop和Floop，引物由上海Invitrogen公司合成，具体序列见表1所示。

表1为扩增MS的LAMP引物序列

FLoop和BLoop引物不加也可以，加入可以提高检测的速度、敏感性。

实施例2、引物在LAMP检测鸡滑液支原体(MS)中的应用

一、DNA的提取

DNA抽提：将MS菌株分别接种于MS肉汤培养基中，37℃培养至颜色变黄时，离心收集菌体；用PBS缓冲液洗涤2次后，用适当TE缓冲液悬浮沉淀，参照TIANgen DNA提取试剂盒说明书。其它对照菌(毒)株的DNA的抽提方法相同。

二、优化LAMP反应体系及反应条件

反应体系的建立:鸡滑液支原体LAMP的反应体系为25μL：Bst DNA聚合酶（购自New England Biolabs公司，产品目录号：M0275）8U1μL、10ⅹBst polymeraMSbuffer2.5uL、F3和B3各0.2uM、FIP和BIP各1.6uM、FLoop和BLoop各0.8uM、dNTP1.0mM、betaine0.1M、MgSO₄4mM、钙黄绿素5.0uM、MnCl₂0.5mM、模板1uL。

将温度按55℃～67℃依次递增，多次重复试验后确定最佳退火温度。对反应体系在如下范围内进行优化：Betaine(0.06mol/L～0.2mol/L)、MgSO₄(1mmol/L～6mmol/L)、dNTP（0.4mmol/L～1.6mmol/L）。

每次检测时，设置阴性对照；在阴性对照和阳性对照均成立时，整个试验有效，可判定结果。

经过上述实验的摸索最终确定：

通过对各反应条件的优化，最终确定LAMP反应体系为25μL：Bst DNA聚合酶8U1μL、10ⅹBst polymeraMS buffer2.5uL、0.25ulF3和0.25ulB3（浓度为20μmol/L，在反应体系中的终浓度均为0.2uM）、2μLFIP和2μL BIP（浓度为20μmol/L，在反应体系中的终浓度均为1.6uM）、1μL FLoop和1μL BLoop（浓度为20μmol/L，在反应体系中的终浓度均为0.8uM）、2.0μL dNTP（浓度为10mmol/L，在反应体系中的终浓度均为0.8mM）、5.0μL betaine（甜菜碱，浓度为1mol/L，在反应体系中的终浓度为0.2M）、5μL MgSO₄（浓度为25mmol/L，在反应体系中的终浓度为5mM）、1μL钙黄绿素（浓度为625μmol/L，在反应体系中的终浓度为5.0uM）、1μL MnCl₂（浓度为12.5mmol/L，在反应体系中的终浓度为0.5mM）、模板1uL、加水至25μL。

反应条件为61℃-63℃,反应时间为1h，结果均好，最佳反应条件为62℃反应1h，90℃作用5min灭活。

鸡滑液支原体LAMP检测试剂盒包括FIP、BIP、F3、B3的4条引物或FIP、BIP、F3、B3、FLoop、BLoop的6条引物或上述反应体系（除去模板）。

三、特异性检测

按照所建立的鸡滑液支原体LAMP方法，同时对鸡滑液支原体（K1415、MS28、FMT、PMS122、PMS156）、鸡毒霉形体（MG-S6），禽衣阿华支原体菌株（K-1805）、火鸡支原体(ATCC)、禽沙门菌（C79_13）、禽大肠杆菌(E.coliO₂)、阴性对照（水）等DNA进行LAMP检测，验证LAMP方法的特异性。

分别提取鸡滑液支原体（K1415、MS28、FMT、PMS122、PMS156）、鸡毒霉形体（MG-S6），禽衣阿华支原体菌株（K-1805）、火鸡支原体(ATCC)、禽沙门菌（C79_13）、禽大肠杆菌(E.coliO₂)、阴性对照（水）的DNA作为模板。

按照上述二中的最佳反应体系和最佳反应条件进行LAMP反应。

LAMP反应结果的判断如下：

直接用肉眼观察颜色变化：若反应产物颜色变为绿色（翠绿色），则说明样品中含有鸡滑液支原体，反之，则说明样品中不含有鸡滑液支原体；

判断结果如图1所示，1为K1415、2为MS28、3为FMT、4为PMS122、5为PMS156、6为MG-S6、7为K-1805、8为ATCC、9为E.coliO₂、10为C79_13、11为阴性对照；可以看出，只有鸡滑液支原体（K1415、MS28、FMT、PMS122、PMS156）5株MS的DNA为阳性结果（肉眼观察可见翠绿色，琼脂糖凝胶电泳呈现特征性梯形条带），而对MG-S6、K-1805、ATCC、C79_13、E.coliO₂、阴性对照的DNA检测均为阴性（肉眼观察可见桔红色）。

四、灵敏度检测

将鸡滑液支原体K1415的DNA按10倍倍比稀释至10ng/ul、1ng/ul、100pg/ul、10pg/ul、1pg/ul、100fg/ul、10fg/ul和1fg/ul为模板，按照上述中二中的最佳反应体系和最佳反应条件进行LAMP反应。

结果如图2所示，1为10ng/ul、2为1ng/ul、3为100pg/ul、4为10pg/ul、5为1pg/ul、6为100fg/ul、7为10fg/ul、8为1fg/ul、9为阴性对照;可以看出，LAMP对K1415DNA的最小检测限为100fg（肉眼观察可见翠绿色）。

对照组：将K1415的DNA按10倍倍比稀释至10ng/ul、1ng/ul、100pg/ul、10pg/ul、1pg/ul、100fg/ul、10fg/ul和1fg/ul为模板，分别取1uL为模板进行常规的PCR扩增:上游引物F35’-TGTAAAAGGTGTTGCTAAAGC-3’和下游引物B35＇-CTATCGATTAAAGCTTCAGGAA-3’各1uL，扩增程序为94℃5min预变性；94℃变性1min,55℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；最后经72℃延伸10min，4℃结束反应。

琼脂糖凝胶电泳观察结果如图3所示，M为100bp DNA ladder、1为10ng/ul、2为1ng/ul、3为100pg/ul、4为10pg/ul、5为1pg/ul、6为100fg/ul、7为10fg/ul、8为1fg/ul；得到PCR预期扩增片段大小约为236bp（该236bp的PCR产物的核苷酸序列作为序列7，序列7为MS热休克ATP依赖的蛋白酶基因的genbank号JF449893的第1682-1918位核苷酸），常规PCR方法最小检测限为1pg。

可以看出，建立的LAMP敏感性比常规PCR高100倍。

实施例3、临床样品的检测

待测样本为2012年从广西养鸡场采集的10份鸡病料样品（编号为1-10），分别提取鸡病料（病鸡关节滑液及腱鞘膜）的DNA。

分别将编号为1-10各个样本的DNA作为模板，按照实施例2的上述的最佳反应体系和最佳反应条件进行LAMP反应。

结果如图4所示，编号为1-5样本为鸡滑液支原体阳性（肉眼观察可见翠绿色），编号为6-10样本为鸡滑液支原体阴性（肉眼观察可见桔红色）。

将编号为1-10各个样本分别按照实施例2对照组的常规PCR检测鸡滑液支原体，结果与本发明方法的鉴定结果一致，说明本发明的方法正确。

Claims

1.检测鸡滑液支原体的环介导等温扩增引物组，由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成；

所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于：

所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比为8：8：1：1：4：4。

3.含有权利要求1或2所述的引物组的检测鸡滑液支原体的环介导等温扩增试剂。

4.根据权利要求3所述的环介导等温扩增试剂，其特征在于：所述环介导等温扩增试剂由权利要求1或2所述的引物组、环介导等温扩增缓冲液、dNTPs、甜菜碱、MgSO₄、MnCl₂、钙黄绿素、DNA聚合酶和水组成。

5.根据权利要求4所述的环介导等温扩增试剂，其特征在于：所述引物组中的引物1和所述引物2在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为1.6uM；

6.检测鸡滑液支原体的环介导等温扩增试剂盒，包括权利要求1或2所述的引物组或权利要求3-5中任一所述的环介导等温扩增试剂。

7.权利要求1或2所述的引物组、权利要求3-5中任一所述的环介导等温扩增试剂或权利要求6所述环介导等温扩增试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸡滑液支原体的产品或制备检测和/或辅助检测鸡滑液支原体的产品中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述应用采用环介导等温扩增，所述环介导等温扩增的条件具体为62℃反应1h，90℃作用5min灭活。