CN104293954A - 一种金黄色葡萄球菌的lamp引物及其应用方法 - Google Patents

一种金黄色葡萄球菌的lamp引物及其应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种金黄色葡萄球菌LAMP引物，包括两条内引物(FIP和BIP)和两条外引物(F3和B3)，分别为：F3：如SEQ ID NO：1所示；B3：如SEQ ID NO：2所示；FIP：如SEQ ID NO：3所示；BIP：如SEQ ID NO：4所示。本发明针对金黄色葡萄球菌特异性的nuc基因，设计了一组引物，并应用该引物建立了敏感、特异的金黄色葡萄球菌LAMP检测方法。实验证明，本发明的LAMP检测方法的检测灵敏度和检出限是PCR方法的100倍；可以通过肉眼观察是否产生绿色荧光确定反应是否发生，使结果判定简便易行；与PCR技术比较省时省力，不需要昂贵的仪器和繁琐的电泳分析，更适合在基层应用。

Description

一种金黄色葡萄球菌的LAMP引物及其应用方法
技术领域
本发明涉及一种金黄色葡萄球菌的LAMP引物及其应用方法，用于金黄色葡萄球菌的检测。
背景技术
金黄色葡萄球菌的实验室检测方法有：传统分离培养及生化鉴定、免疫检测技术、分子检测技术等。传统检测方法操作繁琐，检测时间长，且灵敏度较低；免疫学方法的特异性和灵敏度都比较低；PCR方法敏感、准确、快速，但由于该检测方法需要昂贵的仪器设备和繁琐的电泳操作，对检测人员有较高的技术要求，使其难以在基层和检测设备较薄弱的地区应用，限制了该方法的普及和推广。
环介导等温扩增(LAMP)是一种新的核酸扩增方法，能够在等温条件下高效扩增靶基因，灵敏度和特异性高。而且，相比PCR需要昂贵的热循环仪，LAMP只需要很简单的设备，如水浴锅即可。目前LAMP已经广泛应用于病毒、细菌和寄生虫等病原的检测。环介导等温扩增技术的原理是利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。利用4条不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，从而保证了其特异性更强、灵敏度更高，进而使反应的稳定性和可重复性更好。具有高特异性和等温快速扩增的特点，可以在1h之内，将靶DNA片段扩增109～1010倍。
目前国内外还缺少一种有效的金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种金黄色葡萄球菌的LAMP引物及其应用方法，特异性强且灵敏度高。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
一种金黄色葡萄球菌LAMP引物，包括两条内引物(FIP和BIP)和两条外引物(F3和B3)，分别为：
F3：如SEQ ID NO：1所示；
B3：如SEQ ID NO：2所示；
FIP：如SEQ ID NO：3所示；
BIP：如SEQ ID NO：4所示。
一种利用上述LAMP引物的金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法，其使用的25μL反应体系包括：按终浓度计，20mmol/L的Tris-HCl(pH8.8)，10mmol/L的氯化钾、10mmol/L的硫酸铵、8mmol/L的硫酸镁、0.1％v/v的Tween20、1mol/L的甜菜碱、FIP和BIP各1.6μmol/L、F3与B3各0.2mol/L，1.4mmol/L的dNTP；8U的Bst大片断DNA聚合酶和1μL的DNA模板；将上述反应体系在62.5℃恒温反应45min，最后在80℃下保持10min后结束反应。
每次反应设阴性对照(用灭菌双蒸水代替DNA模板)。
反应结束后，利用目测和凝胶电泳法检测反应结果。
目测：反应结束后，向各反应小管中加入1μL(1：1000)的SYBRGreen I荧光染料，在自然光下肉眼观察反应小管混合液的外观变化，如果染料颜色由开始的橙色变为绿色，则检测结果为阳性，如果保持染料原有的橙红色，则检测结果为阴性。
凝胶电泳法：反应结束后，产物在1.5％琼脂糖凝胶上80V电泳分离50min，加样量为7μL/上样孔。凝胶置于溴化乙锭(EB)中染色10min，在凝胶成像系统下检测、照像，如出现梯型条带则判断为阳性，没有出现梯型条带则判断为阴性。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
本发明根据LAMP方法的原理，针对金黄色葡萄球菌特异性的nuc基因，设计了一组引物，并应用该引物建立了敏感、特异的金黄色葡萄球菌LAMP检测方法。
本发明的LAMP检测方法的检测灵敏度和检出限是PCR方法的100倍；可以通过肉眼观察是否产生绿色荧光确定反应是否发生，使结果判定简便易行；与PCR技术比较省时省力，不需要昂贵的仪器和繁琐的电泳分析，更适合在基层应用。
附图说明
图1是实施例2中LAMP反应结果；图1中：A为肉眼观察到的反应结果，B为紫外灯下观察到的反应结果(1、阴性反应，2、阳性反应，3-5为检测样品)。
图2是实施例2中LAMP特异性检测结果；图2中：M：marker，1：阴性对照，2：金黄色葡萄球菌，3：大肠杆菌，4：无乳链球菌，5：鼠伤寒沙门氏菌，6：表皮葡萄球菌。
图3是实施例3中LAMP方法与PCR方法灵敏度检测比较结果；图3中，A为LAMP方法灵敏度检测结果(M：Marker；1～4：103、102、101、阴性对照)，B为PCR方法灵敏度检测结果(M：Marker；1～5：106、105、104、103、102)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
本发明各实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。并且各实施例中所用的材料及试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明各实施例中部分材料为：Bst大片段DNA聚合酶购于NewEngland Biolabs公司；甜菜碱(分析纯)购于Sigma公司；Tap DNA聚合酶、dNTP、细菌基因组DNA提取试剂盒购于宝生物工程(大连)有限公司；SYBR Green I荧光染料、琼脂糖购于日本TaKaRa公司。
金黄色葡萄球菌(Sta.aureus ATCC 25923)、大肠杆菌(Escherichiacoli ATCC 35218)、无乳链球菌(Str agalactiae CVCC1886)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium CVCC542)购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心；表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidisCICC23664)购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
本发明各实施例中部分仪器为：Thermocell恒温金属水浴锅(杭州博日科技有限公司，中国)；PCR仪My cycler(Bio-Rad公司，美国)；核酸通用型电泳仪JY1000C(北京六一仪器公司，中国)；电泳槽DYCP-31DN(北京六一仪器公司，中国)；紫外凝胶成像系统WD-9413C(北京六一仪器公司，中国)。
实施例1：LAMP引物的设计
引物由宝生物工程(大连)有限公司合成，4条引物序列见表1。
表1LAMP引物序列
实施例2：引物在金黄色葡萄球菌的LAMP检测中的应用
(1)模板DNA制备：将各种菌株培养过夜，取1.5mL菌液用细菌基因组DNA提取试剂盒提取全基因组DNA，-20℃保存。
(2)优化LAMP反应体系及反应条件
25μLLAMP反应体系包括：以终浓度计，20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)、10mmol/L KCl、10mmol/L(NH4)2SO4、8mmol/L MgSO4、0.1％v/v的Tween20、1mol/L的甜菜碱、FIP和BIP各1.6μmol/L、F3和B3各0.2mol/L、1.4mmol/L的dNTP；8U Bst大片断DNA聚合酶和1μL的DNA模板。
反应条件：将上述混合物置于62.5℃恒温反应45min，最后在80℃下保持10min结束反应。每次反应设阴性对照(用灭菌双蒸水代替DNA模板)，严格试验分区，防止反应过程中的交叉污染。
(3)LAMP反应结果检测：
①肉眼检测：扩增反应结束后，观察反应小管混合液的外观变化，向各反应小管中加入1μL(1:1000)的SYBRGreen I荧光染料。SYBRGreen I染料与双链DNA结合会发绿色荧光，所以，在自然光下肉眼观察，如果染料颜色由开始的橙色变为绿色，则说明检测结果阳性。
肉眼检测结果如图1所示：当反应体系中存在靶DNA时，LAMP扩增反应会产生大量的、大小不等的含有靶DNA的重复序列，添加SYBR Green I荧光染料时，阳性产物由橙色变绿色，阴性反应则保持染料原有的橙红色。
②凝胶电泳检测：反应结束后，产物在1.5％琼脂糖凝胶上80V电泳分离50min，加样量为7μL/上样孔。凝胶置于EB中染色10min，在凝胶成像系统下检测、照像，观察是否产生LAMP反应特有的梯型条带，即特异性扩增，如出现梯型条带则判断为阳性，没有出现梯型条带则判断为阴性。凝胶电泳检测如图2所示，呈现在凝胶上就是典型的梯型电泳条带。
③本发明检测的特异性
应用本发明的LAMP检测方法对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌、鼠伤寒沙门氏菌及表皮葡萄球菌进行检测，检测结果如图2所示。从图2可以看出，只有金黄色葡萄球菌出现阳性结果，其他菌株为阴性结果直至反应时间延长至60min。说明本发明的LAMP反应体系只对金黄色葡萄球菌有特异性。
实施例3：本发明的LAMP检测方法与PCR方法的对比
①PCR引物：根据GenBank已发表的编码金黄色葡萄球菌23srRNA的DNA序列(S.aureus，X68425.1)，利用Premier5.0软件设计、合成1对引物(P1：5′-TCTTCAGAAGATGCGGAATA-3′，如SEQ ID NO：5所示；P2：5′-TAAGTCAAACGTTAACATACG-3′，如SEQ ID NO：6所示)，扩增产物长度为420bp，由宝生物工程(大连)有限公司合成。
PCR扩增反应体系：10×PCR buffer 5μL，Mg2+(25mmol/L)3μL，dNTP(25mmol/L)4μL，Taq酶(2.5U)0.5μL，引物P1和P2各1μL，模板2μL，无菌双蒸水补至50μL。循环条件：94℃预变性2min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，扩增30个循环，最后1个循环于72℃延伸5min。取5μL扩增产物，经1.5％琼脂糖凝胶电泳分析。
②LAMP方法与PCR方法检测灵敏度比较
以金黄色葡萄球菌(Sta.aureus ATCC 25923)为检测对象，测量菌液浓度，并将菌液进行10倍稀释度稀释，使得最终稀释梯度为106、105、104、103、102、10CFU/mL，分别提取DNA模板，用于LAMP和PCR扩增反应，并且比较LAMP方法和PCR方法的检出率、最低检出限(CFU/mL)。检测结果见图3，从中可见，LAMP反应产物的电泳结果是梯形条带，PCR反应产物是420bp大小的扩增条带；LAMP检测的最低限是102CFU/mL，PCR检测的最低限是104CFU/mL。
③LAMP方法和PCR方法检测结果评价
用本发明的特异性LAMP引物以及确立的反应条件和程序检测40份乳房炎病牛的牛奶样本进行金黄色葡萄球菌检测，通过凝胶电泳检测是否产生LAMP反应特有的梯型条带，即特异性扩增。并与PCR方法比较检出率。
检测结果：本发明的LAMP方法的检出率为100％，最低检出限达到102CFU/mL；而PCR方法的检出率是85％，最低检出限104CFU/mL。可见LAMP方法在保持100％检出率的同时，检测灵敏度是PCR方法的100倍。

Claims (5)

1.一种金黄色葡萄球菌的LAMP引物，其特征在于：所述引物为：
F3：如SEQ ID NO：1所示；
B3：如SEQ ID NO：2所示；
FIP：如SEQ ID NO：3所示；
BIP：如SEQ ID NO：4所示。
2.一种利用如权利要求1所述LAMP引物的金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法，其特征在于：所述LAMP检测方法使用的25μL反应体系包括：按终浓度计，20mmol/L的Tris-HCl，pH8.8，10mmol/L的氯化钾、10mmol/L的硫酸铵、8mmol/L的硫酸镁、0.1％v/v的Tween20、1mol/L的甜菜碱、FIP和BIP各1.6μmol/L、F3与B3各0.2mol/L，1.4mmol/L的dNTP；8U的Bst大片断DNA聚合酶和1μL的DNA模板；将上述反应体系在62.5℃恒温反应45min，最后在80℃下保持10min后结束反应。
3.根据权利要求2所述的金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法，其特征在于：每次反应设阴性对照，用灭菌双蒸水代替DNA模板。
4.根据权利要求2所述的金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法，其特征在于：反应结束后，向各反应小管中加入1μL的SYBRGreenI荧光染料，在自然光下肉眼观察反应小管混合液的外观变化，如果染料颜色由开始的橙色变为绿色，则检测结果为阳性，如果保持染料原有的橙红色，则检测结果为阴性。
5.根据权利要求2所述的金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法，其特征在于：反应结束后，产物在1.5％琼脂糖凝胶上80V电泳分离50min，加样量为7μL/上样孔；凝胶置于溴化乙锭中染色10min，在凝胶成像系统下检测、照像，如出现梯型条带则判断为阳性，没有出现梯型条带则判断为阴性。
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