CN104195224B - 壶菌的lamp快速检测方法及试剂盒 - Google Patents

壶菌的lamp快速检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明壶菌的LAMP快速检测方法及试剂盒，属于农业科学生物技术应用领域。所述快速检测方法，包括下述步骤：(1)提取待测样本总的DNA核酸作为反应模板；(2)按溶液1∶溶液2∶溶液3＝1∶1∶3的体积比配置LAMP反应溶液；(3)将步骤(1)提取的样本总DNA加入到步骤(2)配制的LAMP反应溶液中，混合；(4)在62℃恒温水浴中反应30分钟；(5)诊断结果：将步骤(4)扩增反应后产物用电泳检测或荧光染料技术进行鉴定。本方法具有操作简单、低成本，反应快速、特异性强、灵敏度高的优点，且用时短，灵敏度比普通PCR高100倍，对壶菌早期诊断准确性更高的特点。

Description

壶菌的LAMP快速检测方法及试剂盒
技术领域
本发明属于农业科学生物技术应用领域，具体涉及壶菌的LAMP快速检测方法以及与该方法配套实用的检测试剂盒。
背景技术
壶菌引发两栖类壶菌病。LAMP技术的全称是环介导恒温扩增技术(Loop-mediatedIsothermal Amplification)。由日本学者Notomi等发明的一种新型的基因扩增技术。但是，目前尚没有将LAMP技术应用在壶菌的检测上。
发明内容
本发明的目的在于公开了壶菌的LAMP快速检测方法。
本发明的第二个目的在于公开了用于壶菌LAMP快速检测方法的试剂盒。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
壶菌的LAMP快速检测方法，包括下述步骤：
(1)、提取待测样本总DNA作为反应模板；
(2)、按溶液1∶溶液2∶溶液3＝1∶1∶3的体积比配置LAMP反应溶液；
(3)、将步骤(1)提取的样本总DNA加入到步骤(2)配制的LAMP反应溶液中，混合；
(4)、在62℃恒温水浴中反应30分钟；
(5)、诊断结果：将步骤(4)扩增反应后产物用电泳检测或荧光染料技术进行鉴定，呈阳性的表示样本含有壶菌，呈阴性的表示样本不含有壶菌。
上述技术方案所述的壶菌LAMP快速检测方法，其中，步骤(2)中的溶液1为2×反应缓冲液，所述2×反应缓冲液由900μL 2×LAMP反应缓冲液和100μL浓度为25mM的dNTP混合液组成；其中2×LAMP反应缓冲液的组成为：1M pH8.8Tris-HCl 40mL，KCl 1.49g，MgSO41.93g，(NH4)2SO4 2.64g，Tween20 2mL和Betaine 187.4g；其中100μL的dNTP混合液由25μLdATP、25μL dCTP、25μL dGTP和25μL dTTP组成；
溶液2为引物混合物，所述引物混合物由20μL FIP、20μL BIP、2.5μL F3和2.5μLB3组成，其中FIP、BIP、F3和B3的浓度均为100μM；
溶液3为超纯水。
上述技术方案所述的壶菌LAMP快速检测方法，其中，步骤(3)中样本总DNA与LAMP反应溶液之间的体积比为1∶25。
上述技术方案所述的壶菌LAMP快速检测方法，其中，步骤(5)中电泳检测的过程为：取产物5μL进行2.0％核酸琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为90V，25min；电泳图出现条带的为阳性，没有出现条带的为阴性。
上述技术方案所述的壶菌LAMP快速检测方法，其中，步骤(5)中的荧光染料技术鉴定过程为：在步骤(2)配置的LAMP反应溶液中加入染色剂，反应后在紫外灯下呈现绿色为阳性，不呈现绿色的为阴性。
上述技术方案中所述的壶菌LAMP快速检测方法，其特征在于：染色剂与步骤(2)配置的LAMP反应溶液的体积比为1∶25。
上述技术方案中任一技术方案所述的壶菌的LAMP快速检测方法的试剂盒，其中，所述试剂盒由溶液1、溶液2和溶液3组成，其中溶液1、溶液2和溶液3之间的体积比为1∶1∶3；
溶液1为2×反应缓冲液，所述2×反应缓冲液由900μL 2×LAMP反应缓冲液和100μL浓度为25mM的dNTP混合液组成；其中2×LAMP反应缓冲液的组成为：1M pH8.8Tris-HCl40mL，KCl 1.49g，MgSO4 1.93g，(NH4)2SO42.64g，Tween20 2mL和Betaine 187.4g；其中100μL的dNTP混合液由25μL dATP、25μL dCTP、25μL dGTP和25μL dTTP组成；
溶液2为引物混合物，所述引物混合物由20μL FIP、20μL BIP、2.5μL F3和2.5μLB3组成，其中FIP、BIP、F3和B3的浓度均为100μM；
溶液3为超纯水。
本发明操作步骤中的步骤(1)中待测样本总DNA提取的操作按照TIANGEN组织DNA提取试剂盒说明书进行操作。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明根据GenBank公布的壶菌标准株-AY598034的基因序列，针对壶菌序列保守区域设计了壶菌的lamp检测方法的特异性引物2对，一对外引物F3、B3和一对内引物FIP、BIP，4条引物序列如上图表所示。以提取样本总DNA为模板，建立了快速检测壶菌的LAMP技术。
2、本发明LAMP检测技术利用特异引物(4条)，以识别壶菌靶基因的几个特定区域，特异性更强。反应在等温(62℃)条件下进行，不需要循环仪等昂贵的仪器，扩增反应极快，一般30分钟完成，扩增产物量大，利用电泳检测或荧光染料技术鉴定出待测样本是否含有壶菌；灵敏度高、特异性强，适合壶菌的快速准确检测。
3、本发明LAMP技术不需要单独反转录过程和巢式PCR的二次扩增，减少分子检测的一些环节，降低了检测的污染率。且实验证明检测灵敏度比PCR高100倍，是该方法对两栖类壶菌病的早期诊断更准确。
4、本方法具有操作简单、低成本，反应快速、特异性强、灵敏度高的优点，且用时短，灵敏度比普通逆转录-聚合酶链锁反应(PCR)高100倍，对壶菌早期诊断准确性更高。可广泛用于样本快速检测、壶菌流行监控。
5、本发明还根据检测方法相应地建立了检测试剂盒，本发明方法和试剂盒可快速、准确、灵敏地检测壶菌，适合样本快速检测、壶菌流行监控等。
附图说明：
1、图1为实施例1中LAMP快速检测方法所用试剂盒对壶菌检测的电泳图。
2、图2为壶菌的LAMP快速检测方法所用试剂盒的引物特异性检测电泳图。
3、图3为壶菌的LAMP快速检测方法所用试剂盒的灵敏度实验电泳图。
4、图4为壶菌的LAMP快速检测方法所用试剂盒的灵敏度实验荧光显示图。
具体实施方式：
为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明壶菌的LAMP快速检测方法及试剂盒作进一步的说明。
本发明提供一种壶菌的快速检测方法。根据GenBank公布的壶菌标准株——AY598034的基因序列，针对壶菌保守区域的序列(序列如SEQ No.1所示)设计了壶菌的LAMP检测方法的4条特异性引物分别为外引物F3(序列如SEQ No.2所示)、外引物B3(序列如SEQNo.3所示)、内引物FIP(序列如SEQ No.4所示)和内引物BIP(序列如SEQ No.5所示)，以壶菌标准株——AY598034为模板，建立了检测所有壶菌的LAMP方法。然后依据电泳图谱诊断。
以下实施例中涉及的各种真菌均可从市场直接购买。
实施例1：壶菌的LAMP方法检测
本实施例中待测样本中的阳性样本即壶菌由美国专家Joyce提供，阴性样本为纯水。
具体的检测方法步骤为：
(1)、按照TIANGEN组织DNA提取试剂盒说明书的步骤提取阳性样本和阴性样本的总DNA核酸作为反应模板；
(2)、配置LAMP反应溶液：按总反应体积25μL为例，扩增体系由5μL溶液1、5μL溶液2和15μL溶液3组成；
其中溶液1为2×反应缓冲液，所述2×反应缓冲液由900μL 2×LAMP反应缓冲液和100μL浓度为25mM的dNTP混合液组成；其中2×LAMP反应缓冲液的组成为：1MpH8.8Tris-HCl40mL，KCl 1.49g，MgSO4 1.93g，(NH4)2SO4 2.64g，Tween20 2mL和Betaine 187.4g；其中100μL的dNTP混合液由25μL dATP、25μL dCTP、25μL dGTP和25μL dTTP组成；
溶液2为引物混合物(100μM Primer stock)，所述引物混合物由20μL FIP、20μLBIP、2.5μL F3和2.5μL B3组成，其中FIP、BIP、F3和B3的浓度均为100μM；
溶液3为超纯水；
(3)、取步骤1)提取的样本总DNA 1μL加入到步骤2)配制的LAMP反应溶液中，混合；
(4)、在62℃恒温水浴中反应30分钟；
(5)、诊断结果：取产物5μL进行2.0％核酸琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为90V，25min；电泳图出现条带的为阳性，没有出现条带的为阴性。
凝胶电泳图如图1所示，其中泳道1和2为待测样本，结果为阳性；泳道3为阴性对照，结果为阴性。
实施例2：壶菌的LAMP快速检测方法所用试剂盒的特异性实验：
本实施例中的引物和操作步骤与实施例1完全相同。
用实施例1的引物和操作步骤在壶菌基因组、毛霉菌基因组、水霉菌基因组、青霉菌基因组、酵母菌基因组、虹彩病毒基因组、疱疹病毒基因组共7个样本进行检测，阴性样本为纯水。
具体的检测方法为：
(1)、按照TIANGEN组织DNA提取试剂盒说明书的步骤分别提取壶菌基因组、毛霉菌基因组、水霉菌基因组、青霉菌基因组、酵母菌基因组、虹彩病毒基因组、疱疹病毒基因和纯水的总DNA作为反应模板；
(2)、配置LAMP反应溶液：按总反应体积25μL为例，扩增体系由5μL溶液1、5μL溶液2和15μL溶液3组成；
其中溶液1为2×反应缓冲液，所述2×反应缓冲液由900μL 2×LAMP反应缓冲液和100μL浓度为25mM的dNTP混合液组成；其中2×LAMP反应缓冲液的组成为：1MpH8.8Tris-HCl40mL，KCl 1.49g，MgSO4 1.93g，(NH4)2SO4 2.64g，Tween20 2mL和Betaine 187.4g；其中100μL的dNTP混合液由25μL dATP、25μL dCTP、25μL dGTP和25μL dTTP组成；
溶液2为引物混合物(100μM Primer stock)，所述引物混合物由20μL FIP、20μLBIP、2.5μL F3和2.5μL B3组成，其中FIP、BIP、F3和B3的浓度均为100μM；
溶液3为超纯水；
(3)、分别将步骤(1)提取的总DNA 1μL加入到步骤(2)配制的25μL LAMP反应溶液中，混合；
(4)、在62℃恒温水浴中反应30分钟；
(5)、诊断结果：取产物5μL进行2.0％核酸琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为90V，25min。电泳图出现条带的为阳性，没有出现条带的为阴性。
如图2所示，其中图2中，M：marker(分子标尺)；泳道1：壶菌基因组；泳道2：毛霉菌基因组；泳道3：水霉菌基因组；泳道4：青霉菌基因组；泳道5：酵母菌基因组；泳道6：虹彩病毒基因组；泳道7：疱疹病毒基因组；泳道8：阴性对照。由图2所示，只有壶菌基因组呈阳性，说明该方法对壶菌检测特异。本试验例中的各种真菌及病毒基因均可从市场购买并通过常规方法进行提取或者由东北林业大学保护医学与生态安全研究中心保存和提取，东北林业大学保护医学与生态安全研究中心保证从申请日起二十年内向公众发放生物材料。
实施例3：壶菌的LAMP快速检测方法所用试剂盒的灵敏度实验：
本实施例中的引物和操作步骤与实施例1完全相同，待测样本中的阳性样本即壶菌由美国专家Joyce提供，阴性样本为纯水
为壶菌病毒LAMP引物扩增不同浓度梯度基因后核酸电泳检测结果，扩增条件为62℃，扩增时间为30min。1.028×107-1.028×101个拷贝的模板均有特异性产物产生，和对照组均无条带产生，此图可看出本研究所设计的通用LAMP引物在62℃下，扩增30min之后最少可检出1.028×101个拷贝的模板(如附图3和图4)。
具体检测步骤如下：
(1)、按照TIANGEN组织DNA提取试剂盒说明书的步骤提取待测样本总的DNA核酸，将提取的DNA分别加水稀释从107到101，稀释后的DNA作为反应模板；
(2)、配置LAMP反应溶液：按总反应体积25μL为例，扩增体系由5μL溶液1、5μL溶液2和15μL溶液3组成；
其中溶液1为2×反应缓冲液，所述2×反应缓冲液由900μL 2×LAMP反应缓冲液和100μL浓度为25mM的dNTP混合液组成；其中2×LAMP反应缓冲液的组成为：1MpH8.8Tris-HCl40mL，KCl 1.49g，MgSO4 1.93g，(NH4)2SO4 2.64g，Tween20 2mL和Betaine 187.4g；其中100μL的dNTP混合液由25μL dATP、25μL dCTP、25μL dGTP和25μL dTTP组成；
溶液2为引物混合物(100μM Primer stock)，所述引物混合物由20μL FIP、20μLBIP、2.5μL F3和2.5μL B3组成，其中FIP、BIP、F3和B3的浓度均为100μM；
溶液3为超纯水；
(3)、当结果需要用荧光染料技术检测时，在步骤(2)的25μL LAMP反应中加入1μL荧光染料；
(4)、取步骤(1)提取的样本总DNA 1μL加入到步骤(3)配制的LAMP反应溶液中，混合；
(5)、在62℃恒温水浴中反应30分钟；
(6)、诊断结果：1.琼脂糖电泳观察结果；
2.在紫外灯的直接照射下，观察实验结果。
结果如图3所示，其中图3中，M：marker(分子标尺)；泳道1：1.028×107个拷贝；泳道2：1.028×106个拷贝；泳道3：1.028×105个拷贝；泳道4：1.028×104个拷贝；泳道5：1.028×103个拷贝；泳道6：1.028×102个拷贝；泳道7：1.028×101个拷贝；泳道8：1.028×100个拷贝；泳道9：1.028×10-1个拷贝；10泳道：阴性对照。
LAMP反应过程中可通过荧光染料使其显色，如图4可以看出，最低可以看出10个拷贝的壶菌浓度，与灵敏度后琼脂糖电泳结果检测一致。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (1)

1.用于壶菌的LAMP快速检测方法的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由溶液1、溶液2和溶液3组成，其中溶液1、溶液2和溶液3之间的体积比为1:1:3；
溶液1为2×反应缓冲液，所述2×反应缓冲液由900μL 2×LAMP反应缓冲液和100μL浓度为25mM的dNTP混合液组成；其中2×LAMP反应缓冲液的组成为：1M pH8.8Tris-HCl 40mL，KCl 1.49g，MgSO4 1.93g，(NH4)2SO4 2.64g，Tween20 2mL和Betaine187.4g；其中100μL的dNTP混合液由25μL dATP、25μL dCTP、25μL dGTP和25μLdTTP组成；
溶液2为引物混合物，所述引物混合物由20μL FIP、20μL BIP、2.5μL F3和2.5μL B3组成，其中FIP、BIP、F3和B3的浓度均为100μM；外引物F3序列如SEQ No.2所示，外引物B3序列如SEQ No.3所示，内引物FIP序列如SEQ No.4所示和内引物BIP序列如SEQ No.5所示；
溶液3为超纯水。
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