CN103173564A

CN103173564A - 用于检测高危型hpv 的试剂盒

Info

Publication number: CN103173564A
Application number: CN201110432629XA
Authority: CN
Inventors: 曾庆; 张中满; 张颖芬; 罗晓兰
Original assignee: HELIXGEN (GUANGZHOU) CO Ltd
Current assignee: HELIXGEN (GUANGZHOU) CO Ltd
Priority date: 2011-12-21
Filing date: 2011-12-21
Publication date: 2013-06-26

Abstract

本发明公开了一种特异性检测样品中是否存在HPV16亚型和18亚型的试剂盒，所述试剂盒包括：(i)如SEQ ID NO:1和2所示的用于PCR扩增HPV16亚型DNA的第一引物对；(ii)如SEQ ID NO:3和4所示的用于PCR扩增HPV18亚型DNA的第二引物对；以及(iii)如SEQ ID NO:5和6所示的用于与PCR扩增产物杂交的一对探针或与SEQ ID NO:5和6所示的序列互补的序列的一对探针。本发明在一个实验点上同时检测16型和18型HPVDNA，只要检测样本里包含HPV16型和/或18型DNA并达到一定的检测限，检测结果即为阳性。试剂盒的反应简单，灵敏度高，通量高，并且可减少实验操作时间和杂交试剂用量，适用于HPV16、18型感染的临床筛查。

Description

用于检测高危型HPV 的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于检测高危型HPV的试剂盒和方法，尤其是一种用于检测HPV16亚型和HPV18亚型的试剂盒和方法。

背景技术

临床研究表明，人类乳头状瘤病毒(HPV)是目前为止唯一明确的致癌病毒，其持续性感染将导致宫颈癌变和子宫颈上皮内瘤变。经过近30年的大量研究表明，宫颈的高危型HPV持续感染是引起宫颈癌及癌前病变的直接原因。预防高危型HPV感染就可以预防宫颈癌前病变，从而避免晚期癌症发生。高危型HPV中，其中，HPV16(53%)、HPV18(15%)等的感染是引起宫颈癌变的重要因素，因此进行该病毒的筛查是预防子宫疾病和宫颈癌的最有效方法。

目前，临床上应用的HPV DNA检测方法主要有以下几种：杂交捕获检测法、PCR检测法、PCR结合杂交检测法和ELISA方法。

杂交捕获检测法的代表产品为QIAGEN(Gaithersburg, Inc.)公司的高危型人乳头瘤病毒检测试剂盒(Hybrid Capture2 High-Risk HPV DNA Test)。此种方法检测价格昂贵，无法在基层医院普及应用，且该产品只能对13种高危型HPV的DNA进行定性检测，检测覆盖病毒型别较少，在HPV筛查检测中应用有一定的局限性。

近年来发展了实时荧光PCR(Real-time PCR)检测方法。实时荧光PCR技术使PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行，并通过微机控制，实现了对PCR扩增产物进行实时动态检测和自动分析结果，PCR与杂交共享的方法避免了单纯使用PCR所造成的假阳性，进一步提高了检测的特异性。但此种方法检测HPV的型别一般只包括一部分常见高危型别的HPV，检测型别覆盖范围较小，且配套设备价格昂贵，同样无法在基层医院普及。

PCR结合杂交检测法进行基因诊断灵敏、快捷，结果可靠。核酸杂交法的灵敏度和特异性均显着高于传统的检测方法，并且可应用特异性探针对HPV分型，已有的商业化检测试剂盒产品包括人乳头瘤病毒基因分型检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)和人乳头状瘤病毒核酸扩增分型检测试剂盒。这些试剂盒在检测的同时还对所检测到的病毒进行分型，方便临床诊断，但由于HPV 16和18两种亚型是最主要的高危病毒亚型，因此对于每份样品如果都使用能够区分出各种亚型的试剂盒或基因芯片来检测的话，无疑会造成资源的浪费。

此外，还有欧洲Innogenetics 的INNO-LiPA HPV 分型试剂盒、罗氏(Roche)的Line Blot HPV试剂盒，是以条形膜作传统杂交分型，也相当费时而手段繁复。以ELISA 类型分析方法如罗氏(Roche)的 AMPLICOR HPV MWP 试剂盒因为稳定性、灵敏度等问题，未能得到广泛应用。

有鉴于此，需要提供一种更加便利、实用、稳定和节约型的检测方法和试剂盒。

发明内容

本发明一方面提供了一种特异性检测样品中是否存在HPV 16亚型或18亚型的试剂盒，所述试剂盒包括：(i) 如SEQ ID NO:1和2所示的用于扩增HPV16亚型DNA的第一引物对；(ii) 如SEQ ID NO:3和4所示的用于扩增HPV18亚型DNA的第二引物对；以及(iii) 如SEQ ID NO:5和6所示的用于与扩增产物杂交的一对探针或与SEQ ID NO:5和6所示的序列互补的序列的一对探针。

在优选的实施方式中，本发明的试剂盒中还包含(iv) 如SEQ ID NO: 7和8所示的用于扩增人类β-球蛋白基因的片段的引物对；以及如SEQ ID NO: 9所示的用于与人类β-球蛋白扩增产物特异性结合的探针。

在优选的实施方式中，所述引物均在5’端标记有生物素。

在优选的实施方式中，所述探针均在5’端连接有氨基。

在优选的实施方式中，本发明的试剂盒中还包含(v) 如SEQ ID NO: 10所示的一段3’端经生物素修饰的随机寡核苷酸探针。

在优选的实施方式中，所述样品为宫颈脱落细胞、液基细胞学标本或石蜡组织切片。

在优选的实施方式中，所述PCR扩增所用的模板DNA为5 ng至100 ng。

在优选的实施方式中，所述PCR的扩增条件为95℃ 9 min； 95℃ 20 s、55℃ 30 s 、72℃ 30 s，共40个循环；72℃ 5 min；4 ℃保存。

在优选的实施方式中，所述PCR扩增的各步变温速率为1℃/s。

本发明另一方面提供了一种检测样品中是否存在HPV 16亚型和18亚型的方法，所述方法包括：(a)提取样品的DNA；(b)使用SEQ ID NO: 1至4的引物对所提取的DNA进行PCR扩增；(c)利用导流杂交技术使用SEQ ID NO:5和6的探针与PCR扩增的产物进行杂交；以及(d)通过显色反应识别是否发生杂交反应从而确定样品中是否存在HPV 16亚型和18亚型。

在优选的实施方式中，步骤(b)还包括使用SEQ ID NO: 7和8所示的用于扩增人类β-球蛋白基因的片段的引物对，并在步骤(c)中使用如SEQ ID NO: 9所示的用于与人类β-球蛋白扩增产物特异性结合的探针。

在优选的实施方式中，步骤(c)还包括使用SEQ ID NO: 10所示的一段3’端经生物素修饰的随机寡核苷酸探针作为对照。

本发明方法和试剂盒采用PCR结合杂交检测法，PCR技术扩增HPV DNA，扩增产物通过导流杂交技术与低密度DNA芯片进行反向点杂交，检测结果转化成肉眼可识读信号。此方法和试剂盒用于检测样本中是否含有高危型(包括16型和18型)HPV DNA，但对HPV不作具体分型。本发明在一个实验点上同时检测16型和18型HPVDNA，只要检测样本里包含HPV16型和/或18型 DNA，并达到一定的检测限，检测结果即为阳性。试剂盒的反应简单，灵敏度高，通量高，并且减少实验操作时间和杂交试剂用量，适用于HPV16、18型感染的临床筛查。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式，对本发明及其有益技术效果进行进一步说明。

图1显示HPV检测阴性和阳性结果判读信号位置。

图2是本发明的一个实施例中HPV16、18的临床样本检测结果。

图3是本发明的一个实施例中试剂盒的检测结果。

图4是本发明的另一个实施例中试剂盒的检测结果。

具体实施方式

本发明利用DNA扩增和“导流”反向点杂交技术来实现。首先，利用生物素标记的引物来扩增HPV基因组特异片段；然后，通过“导流”杂交方法，使生物素标记的扩增片段被特异性寡核苷酸探针杂交捕获，而后进行信号放大，以识别检测结果。

实施例

本发明提供一种检测高危型HPV的试剂盒及其检测方法，所述方法主要包括以下步骤：(a)提取样品的DNA；(b)使用SEQ ID NO: 1至4的引物对所提取的DNA进行PCR扩增；(c)利用导流杂交技术使用SEQ ID NO:5和6的探针与PCR扩增的产物进行杂交；以及(d)通过显色反应识别是否发生杂交反应从而确定样品中是否存在HPV 16亚型和18亚型。以下以宫颈脱落细胞为例，具体说明本发明的方法。但应理解的是，本发明的试剂盒和方法仍可适用于其他临床样品。

(I) 样品/标本采集及保存

以无菌棉拭子或宫颈刷刷取患者的宫颈脱落细胞，以及用于活检的组织标本或疣组织，置于低温冰箱(-70℃或-20℃)保存。

(II) DNA提取

加入1ml无菌生理盐水，充分震荡摇匀，吸取全部液体转至1.5ml离心管中，12000rpm离心5分钟，去上清，沉淀用QIAampc Blood Mini 试剂盒(QIAGEN)按照Blood and body Fluid Spin操作规程进行DNA的提取。将提纯DNA存放在-20℃～-15℃备用。

(III)目的DNA的扩增

每个PCR反应的总体积是25μL，反应体系如下表1所示。

表 1. PCR反应体系

组分名称	用量(μL)
		Taq 酶(5U/μL)	0.5
10 ×PCR buffer	2.5
		MgCl₂(25mM)	4
dNTP混合物 (各2.5mM)	2
		ACF(10 μM)	0.5
ACR(10 μM)	0.5
		HPV16F(15 μM)	0.5
HPV16R(15 μM)	0.5
		HPV18F(15 μM)	0.5
HPV18R(15 μM)	0.5
		模板DNA	1-5μL
ddH₂O	加至 25 μL

其中，DNA模板使用范围为5ng～100ng。PCR引物序列：特异性引物包括ACF引物(SEQ ID NO:7)、ACR引物(SEQ ID NO:8)、HPV16F引物(SEQ ID NO:1)、HPV16R引物(SEQ ID NO:2)、HPV18F引物(SEQ ID NO:3)，HPV18R(SEQ ID NO:4)。其中，ACF引物、ACR引物是用于扩增人类β-球蛋白基因中一段约200 bp的片段； HPV16F引物、HPV16R引物、HPV18F引物，HPV18R是扩增HPV DNA L1区一段450 bp左右的片段。

解冻PCR反应液各组分，在移液前混匀并离心各PCR试剂。按上表在冰浴上配制PCR反应体系，充分混匀。快速离心使液体集中在管底。将PCR管放进PCR仪中，按如下设置运行PCR程序。扩增程序如下：(PCR各步变温速率为1℃/s)

(IV) “导流”杂交

杂交和显色过程中所使用的各试剂组成成分如下表2所示。

表2. 导流杂交使用的各试剂成分

试剂名称	组分
		杂交液	2×SSC、0.1%SDS
封闭液	1%脱脂奶粉
		酶联物	SAV-AP、StabilZyme
洗液	TBS、0.1%Tween20
		显色液	BCIP/NBT
终止液	0.2%Tris Base、0.1% 0.5M EDTA
		杂交膜	20μM探针(0.4μL)、Biodyne C膜

将杂交液置于41℃水浴进行预热，其他杂交试剂各组分平衡至室温(20℃～25℃)。将PCR产物置于水浴或PCR仪上，95℃热变性5分钟，迅速将其取出放入冰水浴中快速冷却至少2分钟。参考 “导流”杂交仪使用手册设置杂交仪。按杂交仪使用手册将杂交膜铺于杂交仪的杂交室内，组装完毕进行升温，当温度升至41℃时，取100μL预热好的杂交液到每个样本孔，合盖防止热量散发，进行预杂交至少2分钟。

取100μL已预热的杂交液到已变性的PCR产物中，混匀。开泵吸除预杂交液，关泵。将以上步骤中准备好的各DNA样本(~125μL)加到各样本孔中(一个样本对应一个样本孔)，合盖41℃孵育1 分钟。开泵让样本通过膜。在开泵状态下，用150μL的杂交液洗膜，一共洗2次。关泵。

杂交膜为Biodyne C膜先经0.1M HCl室温孵化2分钟，再转入20%(W/V)EDC溶液中孵化15分钟，然后用超纯水浸泡3次，每次1分钟，取出室温晾干，于2℃～8℃保存备用。已活化的Biodyne C膜，按从上至下次序分别点HC、AC、HPV探针，点完探针晾干后，将膜浸入0.1M NaOH溶液孵化10分钟，再用超纯水浸泡3次，每次1分钟。取出室温完全晾干后包装成HPV杂交膜，储存于2℃～8℃。

特异性探针包括HC探针(SEQ ID NO:10)、AC探针(SEQ ID NO:9)和HPV探针(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)。三种探针合成时均经5’端氨基修饰，有助于固定在Biodyne C膜上。其中AC探针是一段特异性寡核苷酸序列，可以和人类β-球蛋白扩增产物特异性结合；HC探针是3’端经生物素修饰的一段随机寡核苷酸序列，用于控制杂交过程；HPV探针可以与HPV16、18扩增产物进行特异性结合。

设置杂交仪温度为25℃，等待温度达到设置温度。每孔加封闭液100μL孵育5分钟。开泵完全吸除封闭液，关泵。在25℃(±3℃)时，加100μL 酶联物，孵育3 分钟。将温度设置为36℃，开泵，彻底吸除酶联物溶液。用150μL洗液洗膜2次，关泵。每孔加100μL 封闭液，孵育1 分钟。开泵，完全吸除封闭液，关泵。当温度达到36℃(±1℃)，各孔加100μL显色液。合盖孵育直到显色。开泵，吸除显色液。保持开泵状态，用150μL洗液洗膜1次，关泵。加100μL终止液，合盖孵育1 分钟，开泵，吸除终止液。关泵。移走分隔器，并用洁净干燥的镊子将膜取出放到吸水纸上，判读检测结果。

(V)结果判读

图1和表3显示的是HPV 检测结果示意图和结果判读。膜杂交结果可以由图和表格直接比较分析得出。(清晰可见的点代表阳性结果。1号信号位置：杂交控制(HC)，2号信号位置：扩增控制(AC)，3号信号位置：16/18型HPV检测信号。)

表3. HPV结果判读

信号点(位置)	阴性HPV	阳性HPV	扩增量不足、失败或空白对照(NTC)
				杂交控制(1)	+	+	+
扩增控制(2)	+	+	-
				HPV检测信号(3)	-	+	-

实施例1． HPV16、18检测试剂盒的使用

(1)标本采集及保存：以无菌棉拭子或宫颈刷刷取患者的宫颈脱落细胞，以及用于活检的组织标本或疣组织，置于低温冰箱(-70℃或-20℃)保存。

(2)宫颈刷、宫颈拭子：加入1ml无菌生理盐水，充分震荡摇匀，吸取全部液体转至1.5ml离心管中，12000rpm离心5分钟，去上清，沉淀用QIAampc Blood Mini 试剂盒(QIAGEN)按照Blood and body Fluid Spin操作规程进行DNA的提取。将提纯DNA存放在-20℃～-15℃备用。

(3)PCR扩增和杂交检测

用上述方法进行DNA PCR扩增和杂交，用含HPV16、18的临床样本进行检测，HC、AC、HPV都为阳性，说明可以检测出HPV16和HPV18。结果如图2所示。

实施例2. 本发明试剂盒和方法的特异性实验

用不含HPV16、18，但含其他常见的19种HPV型别(包括6、11、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68、81型)临床样本进行检测，HC、AC阳性，HPV点阴性，说明本检测特异性很好。结果见图3所示。

实施例3. 本发明试剂盒和方法的特异性实验

用不含HPV16、18，但含其他病原体的(支原体、衣原体、淋球菌)阴性样本进行检测，HC、AC显色，HPV点不显色，说明本试剂盒的不会出现假阳性。结果见图4所示。

本发明已结合具体实施例和实验证据进行描述，但应理解的是，本领域技术人员在已公开的实施例的基础上可对本发明进行各种修改或等同替换，而不违背本发明的精神，这些修改和等同替换也被视为本发明的范围之内。

Claims

1.一种特异性检测样品中是否存在HPV16亚型或18亚型的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：(i) 如SEQ ID NO:1和2所示的用于PCR扩增HPV16亚型DNA的第一引物对；(ii) 如SEQ ID NO:3和4所示的用于PCR扩增HPV18亚型DNA的第二引物对；以及(iii) 如SEQ ID NO:5和6所示的用于与PCR扩增产物杂交的一对探针或与SEQ ID NO:5和6所示的序列互补的序列的一对探针。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含(iv) 如SEQ ID NO: 7和8所示的用于PCR扩增人类β-球蛋白基因的片段的引物对；以及如SEQ ID NO: 9所示的用于与人类β-球蛋白扩增产物特异性结合的探针。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述引物均在5’端标记有生物素。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包含(v) 如SEQ ID NO: 10所示的一段3’端经生物素修饰的随机寡核苷酸探针。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述探针均在5’端连接有氨基。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述样品为宫颈脱落细胞、液基细胞学标本或石蜡组织切片。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述样品为宫颈脱落细胞。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增所用的模板DNA为5 ng至100 ng。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述PCR的扩增条件为95℃ 9 min； 95℃ 20 s、55℃ 30 s 、72℃ 30 s，共40个循环；72℃ 5 min；4℃保存。

10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增的各步变温速率为1℃/s。