CN108342406A - Hpv16-hpv18重组序列、包含其的质粒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子诊断领域，具体涉及HPV16‑HPV18重组序列、包含其的质粒及其应用，应用所述重组序列或包含其的质粒进行实时荧光定量PCR检测HPV16 DNA和HPV18 DNA，特异性好，PCR扩增效率高，敏感性高。

Description

HPV16-HPV18重组序列、包含其的质粒及其应用
技术领域
本发明属于分子诊断领域，具体涉及HPV16-HPV18重组序列、包含其的质粒及其应用。
背景技术
人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是一种嗜上皮性病毒，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖。分子生物学研究结果显示，90％以上的宫颈癌伴有HPV感染。HPV有120多种类型，其中HPV16和HPV18与宫颈癌及宫颈癌前病变的发生发展最为密切，属高危型HPV。高危型HPV的持续性感染是宫颈癌发生的必要条件，HPV感染使得宫颈癌的相对危险性增加250倍，而从高危型HPV的持续感染到一般的宫颈癌前病变最终发展为宫颈癌大约需要5-10年。因此，高危HPV病毒是目前最为明确的致癌病毒，有针对性地对高危型HPV进行全面检测，对宫颈癌的早期诊断和治疗具有重要的意义。
现阶段常采用荧光PCR检测HPV16 DNA和HPV18 DNA，但该方法存在以下缺陷：(1)检测敏感性不够高，无法检测到低浓度的HPV16 DNA和HPV18 DNA；(2)检测特异性不够高，与HPV其他类型存在交叉反应；(3)许多试剂盒采用是定性的方法，无法精确定量测定HPV16DNA和HPV18 DNA浓度。因此，研究开发敏感性高、特异性好且能够定量检测HPV16 DNA和HPV18 DNA浓度的技术，对于分子诊断，尤其是HPV的普查和宫颈癌的防治具有重大意义。
技术方案
本发明的一个目的是提供一种HPV16-HPV18重组序列，所述重组序列用于实时荧光定量PCR检测HPV16 DNA和HPV18 DNA，特异性好，PCR扩增效率高，敏感性高。
本发明的另一个目的是提供含有本发明HPV16-HPV18重组序列的质粒。
本发明的再一个目的是提供本发明HPV16-HPV18重组序列及含有本发明HPV16-HPV18重组序列质粒在实时荧光PCR检测HPV16 DNA和/或HPV18 DNA作为参考标准品或阳性质控品的用途。
为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种HPV16-HPV18重组序列，序列如SEQID NO.1所示：
GAATTCGACGACTATCCAGCGACCAAGATCAGAGCCAGACACCGGAAACCCCTGCCACACCACTAAGTTGTTGCACAGAGACTCCGTGGACAGTGCTCCAATCCTCAAAGCTTGGGTGACACTGTGCCTCAATCCTTATATATTAAAGGCACAGGTATGCGTGCTTCACCTGGCAGCTGTGTGTATTCTCCCTCTCCAAGGATCC。
本发明人在综合分析HPV16、HPV18和HPV多型序列的基础上，发现HPV16 DNA的一段保守序列和HPV18DNA的一段保守序列尽管在基因组的位置相同，但两者有很大差异，与HPV其他型的序列也有较大差异，将这两段保守序列进行重组得到的重组序列，用于实时PCR检测HPV16 DNA和HPV18 DNA的特异性好。此外，针对上述重组序列的引物和探针都结构优良，无二聚体和发夹结构，PCR扩增效率高，检测HPV16 DNA和HPV18 DNA的敏感性也非常高。
第二方面，本发明提供含有本发明HPV16-HPV18重组序列的质粒，将SEQID NO.1所示序列插入到pAC57质粒中构建而成。
所述含有本发明HPV16-HPV18重组序列的质粒，是将pAC57质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切消化后，与上游加入EcoRⅠ酶切位点、下游加入HindⅢ酶切位点、如SEQID NO.2所示的HPV16 DNA保守序列，和上游加入HindⅢ酶切位点、下游引入BamHⅠ酶切位点、如SEQID NO.3所示的HPV18 DNA保守序列在连接酶作用下进行连接而成。
所述SEQID NO.2所示序列如下：
GACGACTATCCAGCGACCAAGATCAGAGCCAGACACCGGAAACCCCTGCCACACCACTAAGTTGTTGCACAGAGACTCCGTGGACAGTGCTCCAATCCTCA，其中，下划线的碱基C也可以为碱基A；
所述SEQID NO.3所示序列如下：
GGGTGACACTGTGCCTCAATCCTTATATATTAAAGGCACAGGTATGCGTGCTTCACCTGGCAGCTGTGTGTATTCTCCCTCTCCAA。
在一些优选的实施方案中，所述含有本发明HPV16-HPV18重组序列的质粒，由如下方法制备得到：
步骤(1)：提取HPV16DNA和HPV18 DNA，PCR扩增，
其中，HPV16 DNA扩增的上游引物序列为：
CGGAATTCGACGACTATCCAGCGACCAAG，CGGAATTC为保护碱基及EcoRⅠ酶切位点，
下游引物序列为：
CCAAGCTTTGAGGATTGGAGCACTGTCC，CCAAGCTT为保护碱基及HindⅢ酶切位点；
HPV18扩增的上游引物序列为：
CCAAGCTTGGGTGACACTGTGCCTCAATCC，CCAAGCTT为保护碱基及HindⅢ酶切位点，
下游引物序列为：
CGGGATCCTTGGAGAGGGAGAATACACAC，CGGGATCC为保护碱基及BamHⅠ酶切位点；
步骤(2)：将HPV16 DNA PCR扩增产物经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切消化，HPV18 DNAPCR扩增产物经HindⅢ和BamHⅠ双酶切消化，pAC57质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切消化；
步骤(3)：将步骤(2)所得消化产物纯化后在连接酶作用下进行连接即得。
第三方面，应用本发明HPV16-HPV18重组序列或含有本发明HPV16-HPV18重组序列的质粒作为参考标准品或阳性质控品，实时荧光PCR检测HPV16 DNA和/或HPV18 DNA，包括以下步骤：
步骤a：配制一系列浓度的含有本发明HPV16-HPV18重组序列质粒的标准溶液；
步骤b：分别以步骤a中不同浓度的含有本发明HPV16-HPV18重组序列质粒的标准溶液为模板，以GACGACTATCCAGCGACCAAG为上游引物，以TGAGGATTGGAGCACTGTCC为下游引物，以FAM-CGGAAACCCCTGCCACAC-MGB为探针，实时荧光PCR，以浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，制得HPV16 DNA检测标准曲线；和/或分别以步骤a中不同浓度的含有本发明HPV16-HPV18重组序列质粒的标准溶液为模板，以GGGTGACACTGTGCCTCAATCC为上游引物，以TTGGAGAGGGAGAATACACAC为下游引物，以VIC-CAGGTGAAGCACGCATA-MGB为探针，实时荧光PCR，以浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，制得HPV18DNA检测标准曲线；
步骤c：提取待测样品的HPV16DNA，同步骤b的方法进行实时荧光PCR，根据步骤b制得的HPV16 DNA检测标准曲线得到待测样品HPV16DNA浓度；和/或提取待测样品的HPV18DNA，同步骤b的方法进行实时荧光PCR，根据步骤b制得的HPV18 DNA检测标准曲线得到待测样品HPV18DNA浓度。
上述方法将HPV16-HPV18重组序列作为实时荧光定量PCR检测HPV16 DNA和HPV18DNA的参考标准品或阳性质控品，不仅敏感特异，而且使用非常简单方便，在一个反应体系内即可完成HPV16 DNA和HPV18 DNA的精确定量测定。
附图说明
图1为含有HPV16-HPV18重组序列的重组质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切消化的电泳图，其中，1是含有HPV16-HPV18重组序列的重组质粒，2是含有HPV16-HPV18重组序列的重组质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ消化的产物，M是DL3000marker，分别为100、250、500、750、1000、1500、2000、3000bp；
图2为实施例2制得的线性曲线图；
图3为实施例3制得的实时定量PCR测定HPV16 DNA的标准曲线图；
图4为实施例4制得的线性曲线图；
图5为实施例5制得的实时定量PCR测定HPV16 DNA的标准曲线图。
具体实施方式
以下实施例用于解释说明本发明，并非限制本发明。
分子生物学试剂及材料：核酸提取试剂盒，购于上海透景生命科技；引物；上海生工合成提供；探针，上海辉睿生物合成提供；高保真PCR试剂，购于大连宝生物；PCR产物纯化试剂盒，购于上海生工；限制性内切酶，购于大连宝生物；DNA连接酶，购于大连宝生物；原核克隆质粒pAC57(Ampr)，购于金斯瑞；琼脂糖，购于Biorad；定量PCR检测试剂，购于南京诺唯赞生物；HPV16 DNA液体标准物质，购于广州邦得盛生物；HPV18 DNA液体标准物质，购于广州邦得盛生物。
仪器：伯乐CFX96荧光定量PCR仪。
DNA片段的连接、转化及转化子筛选，限制性内切酶分析等常规方法均参照文献Sambrook J,et al.Molecular Cloning-A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York,2nd edition,1989或厂家提供的产品说明书；DNA序列分析在金斯瑞测序服务中心完成。
实施例1 HPV16-HPV18重组序列及含有HPV16-HPV18重组序列质粒的构建
取HPV16、HPV18阳性标本各一例，用核酸提取试剂盒提取DNA，用高保真PCR试剂盒进行PCR扩增。其中，HPV16扩增的上游引物序列为：
CGGAATTCGACGACTATCCAGCGACCAAG，CGGAATTC为保护碱基及EcoRⅠ酶切位点，
下游引物序列为：CCAAGCTTTGAGGATTGGAGCACTGTCC，CCAAGCTT为保护碱基及HindⅢ酶切位点；
HPV18扩增的上游引物序列为：
CCAAGCTTGGGTGACACTGTGCCTCAATCC，CCAAGCTT为保护碱基及HindⅢ酶切位点，
下游引物序列为：CGGGATCCTTGGAGAGGGAGAATACACAC，CGGGATCC为保护碱基及BamHⅠ酶切位点。
HPV16、HPV18扩增反应体系：PrimeSTAR Max Premix(2×)25μl，上游引物10pmol，下游引物10pmol，DNA模板2μl，灭菌蒸馏水补至50μl。扩增条件为：94℃，5min→94℃，30sec，55℃，20sec，72℃，20sec，35个循环→72℃，5min。
HPV16 PCR扩增产物经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切消化，HPV18 PCR扩增产物经HindⅢ和BamHⅠ双酶切消化，pAC57载体经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切消化，三者消化产物纯化后在连接酶作用下进行连接，转化感受态细胞JM109。筛选阳性克隆，提取重组质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切鉴定，结果见图1，送金斯瑞公司测序。
测得序列如下：
GAATTCGACGACTATCCAGCGACCAAGATCAGAGCCAGACACCGGAAACCCCTGCCACACCACTAAGTTGTTGCACAGAGACTCCGTGGACAGTGCTCCAATCCTCAAAGCTTGGGTGACACTGTGCCTCAATCCTTATATATTAAAGGCACAGGTATGCGTGCTTCACCTGGCAGCTGTGTGTATTCTCCCTCTCCAAGGATCC，
与预期完全相符。
实施例2 HPV16-HPV18重组序列在实时荧光定量PCR检测HPV16 DNA中的应用
实时荧光PCR体系：2×AceQ U+Probe Master Mix 10μl，上游引物：4pmol，下游引物4pmol，探针2pmol，DNA模板2μl，灭菌蒸馏水补至20μl。
HPV16扩增的上游引物序列为：GACGACTATCCAGCGACCAAG，下游引物序列为：TGAGGATTGGAGCACTGTCC，与克隆用的引物相比，去掉了酶切位点与保护碱基。探针序列及标记为：FAM-CGGAAACCCCTGCCACAC-MGB。
扩增条件为：37℃，2min→95℃，5min→95℃，10sec，60℃，30sec，读板，40个循环。
将实施例1制得的含有HPV16-HPV18重组序列的质粒分别用灭菌蒸馏水稀释103、104、105、106、107、108、109倍，分别作为DNA模板加入上述实时荧光PCR体系进行PCR扩增，制得线性曲线，结果见图2，结果表明线性优异，有助于精确定量测定HPV16 DNA含量。
实施例3实时定量PCR测定HPV16DNA的标准曲线
将含有HPV16-HPV18重组序列的重组质粒稀释为：1.25×107IU/ml、1.25×106IU/ml、1.25×105IU/ml、1.25×104IU/ml的标准溶液，其中1.25×107IU/ml经HPV16标准品校准，其余浓度10倍递比稀释而成，将上述标准溶液作为DNA模板加入实施例2的实时荧光PCR体系进行PCR扩增，制得标准曲线，结果见图3。
实施例4 HPV16-HP V18重组序列在实时荧光定量PCR检测HPV18中的应用
实时荧光PCR体系：2×AceQ U+Probe Master Mix 10μl，上游引物：上游引物5pmol，下游引物5pmol，探针2.5pmol，DNA模板2μl，灭菌蒸馏水补至20μl。
HPV18扩增的上游引物序列为：GGGTGACACTGTGCCTCAATCC，下游引物序列为：TTGGAGAGGGAGAATACACAC，与克隆用的引物相比，去掉了酶切位点与保护碱基。探针序列及标记为：VIC-CAGGTGAAGCACGCATA-MGB。
扩增条件为：37℃，2min→95℃，5min→95℃，10sec，60℃，30sec，读板，40个循环。
将含有HPV16-HPV18重组序列的重组质粒分别用灭菌蒸馏水稀释103、104、105、106、107、108、109倍，作为DNA模板加入上述实时荧光PCR体系进行PCR扩增，制得线性曲线，结果见图4，结果表明线性优异，有助于精确定量测定HPV18DNA含量。
实施例5实时荧光定量PCR检测HPV18的标准曲线
将含有HPV16-HPV18重组序列的重组质粒稀释为：1.2×107IU/ml、1.2×106IU/ml、1.2×105IU/ml、1.2×104IU/ml的标准溶液，其中1.2×107IU/ml经HPV18标准品校准，其余浓度10倍递比稀释而成，分别将标准溶液作为DNA模板加入实施例4的实时荧光PCR体系进行PCR扩增，制得标准曲线，结果见图5。
序列表
<110> 宁波市凯美生物技术有限公司
<120> HPV16-HPV18重组序列、包含其的质粒及其应用
<130> 2018032701
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 205
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaattcgacg actatccagc gaccaagatc agagccagac accggaaacc cctgccacac 60
cactaagttg ttgcacagag actccgtgga cagtgctcca atcctcaaag cttgggtgac 120
actgtgcctc aatccttata tattaaaggc acaggtatgc gtgcttcacc tggcagctgt 180
gtgtattctc cctctccaag gatcc 205
<210> 2
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacgactatc cagcgaccaa gatcagagcc agacaccgga aacccctgcc acaccactaa 60
gttgttgcac agagactccg tggacagtgc tccaatcctc a 101
<210> 3
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gggtgacact gtgcctcaat ccttatatat taaaggcaca ggtatgcgtg cttcacctgg 60
cagctgtgtg tattctccct ctccaa 86

Claims (7)

1.一种HPV16-HPV18重组序列，序列如SEQID NO.1所示。
2.含有权利要求1所述重组序列的质粒，其特征在于：将SEQID NO.1所示序列插入到pAC57质粒中构建而成。
3.如权利要求2所述的质粒，其特征在于：所述质粒是将pAC57质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切消化后，与上游加入EcoRⅠ酶切位点、下游加入HindⅢ酶切位点、如SEQID NO.2所示的HPV16 DNA保守序列，和上游加入HindⅢ酶切位点、下游引入BamHⅠ酶切位点、如SEQID NO.3所示的HPV18 DNA保守序列，在连接酶作用下进行连接而成。
4.如权利要求2所述的质粒，其特征在于所述质粒是由如下方法制备得到：
步骤(1)：提取HPV16DNA和HPV18 DNA，PCR扩增，
其中，HPV16 DNA扩增的上游引物序列为：
CGGAATTCGACGACTATCCAGCGACCAAG，CGGAATTC为保护碱基及EcoRⅠ酶切位点，
下游引物序列为：
CCAAGCTTTGAGGATTGGAGCACTGTCC，CCAAGCTT为保护碱基及HindⅢ酶切位点；
HPV18扩增的上游引物序列为：
CCAAGCTTGGGTGACACTGTGCCTCAATCC，CCAAGCTT为保护碱基及HindⅢ酶切位点，
下游引物序列为：
CGGGATCCTTGGAGAGGGAGAATACACAC，CGGGATCC为保护碱基及BamHⅠ酶切位点；
步骤(2)：将HPV16 DNA PCR扩增产物经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切消化，HPV18 DNA PCR扩增产物经HindⅢ和BamHⅠ双酶切消化，pAC57质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切消化；
步骤(3)：将步骤(2)所得消化产物纯化后在连接酶作用下进行连接即得。
5.权利要求1所述的重组序列和权利要求2至4任一项所述的质粒在检测HPV16 DNA和/或HPV18 DNA中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：权利要求1所述的重组序列和权利要求2至4任一项所述的质粒作为实时荧光PCR检测HPV16 DNA和/或HPV18 DNA的参考标准品或阳性质控品。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于包括以下步骤：
步骤a：配制一系列浓度的含有本发明HPV16-HPV18重组序列质粒的标准溶液；
步骤b：分别以步骤a中不同浓度的含有本发明HPV16-HPV18重组序列质粒的标准溶液为模板，以GACGACTATCCAGCGACCAAG为上游引物，以TGAGGATTGGAGCACTGTCC为下游引物，以FAM-CGGAAACCCCTGCCACAC-MGB为探针，实时荧光PCR，以浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，制得HPV16 DNA检测标准曲线；和/或分别以步骤a中不同浓度的含有本发明HPV16-HPV18重组序列质粒的标准溶液为模板，以GGGTGACACTGTGCCTCAATCC为上游引物，以TTGGAGAGGGAGAATACACAC为下游引物，以VIC-CAGGTGAAGCACGCATA-MGB为探针，实时荧光PCR，以浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，制得HPV18 DNA检测标准曲线；
步骤c：提取待测样品的HPV16DNA，同步骤b的方法进行实时荧光PCR，根据步骤b制得的HPV16 DNA检测标准曲线得到待测样品HPV16DNA浓度；和/或提取待测样品的HPV18DNA，同步骤b的方法进行实时荧光PCR，根据步骤b制得的HPV18 DNA检测标准曲线得到待测样品HPV18DNA浓度。
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CN104830869A (zh) * 2015-04-30 2015-08-12 珠海雅马生物工程有限公司 与宫颈癌发生相关的hpv整合的基因位点及其应用

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SEAMAN WT等: "Detection and quantitation of HPV in genital and oral tissues and fluids by real time PCR" *

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